KR100839984B1

KR100839984B1 - 시토신 메틸화 패턴의 탐지를 위한 고민감 방법

Info

Publication number: KR100839984B1
Application number: KR1020037011825A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 올렉; 커트 베를린
Original assignee: 에피제노믹스 아게
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2008-06-19
Also published as: EP1818414A3; HK1069604A1; US20120107807A1; IL157080A0; RU2003126575A; EP1370691A2; DE10112515B4; WO2002072880A2; CA2435917A1; RU2332462C2; DK1370691T3; CA2435917C; AU2002253108B2; WO2002072880A3; JP2004527241A; DE10112515A1; ES2287269T3; CN100347314C; NZ527350A; DE50210199D1

Abstract

본 발명은 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화의 검출을 위한 방법에 관한 것으로서 다음과 단계에 따라 수행된다.

조사되는 DNA와 배경 DNA로 구성되는 게놈 DNA샘플은, 5-메틸시토신 염기가 변화되지 않는 반면에, 모든 비메틸화된 시토신 염기들이 우라실로 변화되는 것과 같은 방법으로 화학적으로 처리된다.

화학 처리된 DNA 샘플은, 조사되는 DNA가 배경 DNA에 대한 주형으로서 양호하게 실시되는 반면에, 폴리머라아제와 더불어 적어도 하나의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 사용으로 확대된다.

확대된 생성물은 분석되고 조사되는 DNA에서의 메틸화 상태는 확대된 생성물의 존재로부터 그리고/또는 부가적인 위치의 분석으로부터 종결된다.

DNA, 메틸화, 비메틸화, 프라이머 올리고뉴클레오티드

Description

시토신 메틸화 패턴의 탐지를 위한 고민감 방법{HIGHLY SENSITIVE METHOD FOR THE DETECTION OF CYTOSINE METHYLATION PATTERNS}

본 발명은 DNA 샘플안에 시토신 메틸화의 검출 방법에 관한 것이다.

최근 몇 년간 분자생물학에서 방법 발전 때문에 연구가 활발한 관찰의 레벨은 유전자 자체뿐 아니라 이러한 유전자들의 RNA로의 전사, 번역 및 이로부터 생성되는 단백질을 포함한다. 한 개체의 발전과정 동안, 특정 세포 및 조직내에서 한 유전자가 언제 개시되고, 특정 유전자가 어떻게 활성화되고 저해되는가 하는 것은 유전자 내지 게놈의 메틸화된 범위 및 특성과 관련돼 있을 수 있다. 병적 상태 또한 개별적 유전자 또는 게놈의 수정된 메틸화 패턴에 의해 표현된다.

5-메틸시토신은 진핵세포의 DNA에서 가장 빈번하게 공유결합적으로 개질된 염기이다. 예를 들면, 그것은 전사의 조절, 유전적 각인 및 종양 발생에 있어서 중요한 역할을 한다. 따라서, 유전적인 정보의 한 구성으로서 5-메틸시토신의 동정적 확인은 대단히 중요한 의의가 있다. 그러나 5-메틸시토신의 위치는 시퀀싱에 의해서 동정될 수 없다. 5-메틸시토신은 시토신과 동일한 염기쌍 형성 행동을 갖기 때문이다. 게다가 PCR 증폭의 경우 5-메틸시토신이 보유하던 후생유전학적(epigenetic) 정보는 완전히 소실된다.

비교적 최근에 새로이 개발되어 자주 사용되는 5-메틸시토신에 대한 DNA 연구방법은 중아황산염과 시토신과의 특이적 반응에 기초한 것으로, 시토신은 상기 반응 및 후속하는 알칼리 가수분해에 의해, 염기쌍 형성 행동에서 티미딘에 상당하는 우라실로 전환된다. 대조적으로 5-메틸시토신은 이러한 상태에서 변화되지 않는다. 따라서, 원래의 DNA는 전환되어, 시토신과 그 혼성화 행동에서 구별될 수 없었던 메틸시토신이 유일하게 잔여 하는 시토신으로서, 예컨대 증폭 및 혼성화 또는 시퀀싱 등의 "표준" 분자생물학 기술로 검출될 수 있다. 이러한 모든 기술들은 염기쌍 형성에 기초한 것으로, 현재 널리 사용되고 있다. 민감성에 관련된 선행 기술은 연구 대상 DNA를 아가로즈 매트릭스에 포함함으로써, DNA의 확산과 재복원을 방지 시키고(중아황산염은 단일 가닥 DNA에만 반응한다), 침전 및 정제 단계가 신속한 투석 방법에 의해 대체되는(Olek A. , Oswald J. , Walter J. 수정된 그리고 향상된 중황산염의 방법은 시토신 메틸화 분석에 기초한다. 핵산 Res. 1996년 12월 15일; 24 (24) : 5064-6)방법으로 정의된다. 개별적 세포는 상기 방법에 의해 연구될 수 있으며, 이는 상기 방법의 잠재력을 설명한다. 지금까지 약 3000개의 염기쌍 길이의 개별적 영역만이 연구되었고, 수천 개의 가능한 메틸화 분석을 위한 광범위한 세포 연구는 불가능하였다. 물론 상기 방법 또한 매우 작은 단편의 소량의 시료도 신뢰성 있게 분석할 수 없다. 이들은 매트릭스를 통한 확산 방지에도 불구하고 소실된다.

5-메틸시토신을 검출하기 위한 공지된 다른 가능한 방법에 대한 개요는 하기 평론 기사에서 얻을 수 있다(Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-메틸시토신 그리고 DNA 게놈안에서 관련된 수정. Nucleic Acids Res. 1998년 5월 15일 ; 26 (10) : 2255-64).

중아황산염 기술은 오늘날까지 소수의 예외(예를 들면, Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Drfler W, Horsthemke B. Angelman 과 Prader- Willi 신드롬의 진단을 위한 싱글 튜브 PCR 테스트는 SNRPN 유전자 좌에서 대립유전자 메틸화 차이에 기초했다. Eur J Hum Genet. 1997년 3-4월 ; 5 (2) : 94-8)가 있을 뿐, 대부분 연구에만 한정되어 응용되어 왔다. 그렇지만 알려진 유전자의 짧고 특이적인 조각들만이 중아황산염으로 처리된 후 증폭되어, 완전히 시퀀싱 되거나(Olek A, Walter J. H19 메틸화 자국의 선-이식 개체발생론. Nat Genet. 1999년 11월 ; 17 (3) : 275-6) 또는 개개의 시토신 위치(Gonzalgo ML, Jones PA. 메틸화에 민감한 싱글 뉴클레오티드 프라이머 확장을 사용하는 명확한 장소에서 메틸화 차이의 빠른 정량화 (Ms-SnuPE). 핵산 Res. 1997년 6월. 15; 25 (12) : 2529-31, WO Patent 95 00669) 또는 효소 분해(Xiong Z, Laird PW. COBRA: 민감하고 정량적인 DNA 메틸화 분석. 핵산 Res. 1997년 6월. 15; 25 (12) : 2532-4)는 "프라이머 확장 반응"에 의해 검출된다. 또한 혼성화에 의한 검출 또한 개시되었다(Olek et al., WO 99/28498).

요소는 게놈 DNA 안에 있는 5-메틸시토신의 시퀀싱 이전에 중아황산염 처리의 효율을 향상시킨다(Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. 요소는 게놈 DNA 핵산 Res 안에 있는 5'-메틸시토신의 중아황산염-매개 시퀀싱의 효율을 향상시킨다. 1998년 11월 1;26 (21) : 5009-10).

개별적 유전자 안에 있는 메틸화의 감지를 위한 중아황산염 기술의 적용과 관계되는 다른 출판물에는 : Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methycytosine residues in genomic DNA . Bioassays . 1994년 6월. ; 16 (6) : 431-6, 431 ; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Drfler W. Imprinted segments in the human genome : 게놈 시퀀싱 방법에 의해 결정된 Prader-Willi/Angelman 신드롬 지역에 있는 다른 DNA 메틸화 패턴 Hum Mol Genet. 1997년 3월 ; 6(3) : 387-95 : Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. 개개의 염색체위에 메틸화 분석 : 중황산염 게놈 시퀀싱을 위한 향상된 프로토콜. 핵산 Res. 1994년 2월. 25; 22 (4) : 695-6 ; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. 게놈 시퀀싱은 pS2 유전자의 5`지역안에 있는 그리고 인간의 가슴 암세포 라인안에 있는 그것의 유전자 발현안에 있는 DNA 하이포메틸레이션사이에 있는 상관관계를 가리킨다. Gene. 1995년 5월 19일 ; 157 (1-2) : 261-4 ; WO 97/46705, WO 95/15373 및 WO 45560이다.

삭제

또다른 알려진 방법은 소위 메틸화-민감 PCR(Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), 메틸화-특성 PCR : CpG 세포군의 메틸화 상태를 위한 새로운 PCR 분석. Proc Natl Acad Sci USA. 9월 3일 ; 93 (18) : 9821-6)이다. 이 방법을 위해 프라이머가 사용되는데, 각각의 위치에서 메틸화되지 않은 DNA의 중아황산염 처리에 의해 형성된 시퀀스에만 혼성화하거나, 또는 반대로, 프라이머는 각각의 위치에서 메틸화되지 않은 DNA의 중아황산염 처리에 의해 이루어진 핵산에만 결합한다. 이후 이러한 프라이머를 가지고 증폭된 산물들이 생산될 수 있는데, 차례로 이의 감지는 프라이머가 결합하는 샘플안에 메틸화된 또는 메틸화되지 않은 자리의 존재의 힌트를 제공한다.

더욱 최근의 방법은 또한 "메틸-라이트(methyl-light)" (WO 00/70090)로 알려진 TaqMan PCR에 의해 시토신 메틸화를 감지하는 것이다. PCR 과정에서 이러한 방법으로 직접 개별 위치 또는 수개의 위치의 메틸화 상태를 감지하고, 후속하여 산물을 분석한다.

올리고머 어레이 제조에 대한 선행 기술의 평론은 1999년 1월 출간된 Nature Genetics 특별판 (Nature Genetics Supplement, 21권, 1999년 1월), 및 상기 간행물에서 인용된 문헌 그리고 감소된 비특이적 배경 신호를 갖는 올리고뉴클레오티드와 같은 타겟 분자를 위한 고체 운반자의 제조방법에 관한 US 특허 5,994,065에서 볼 수 있다.

많은 형광 라벨을 가진 프로브는 고정화 DNA 배열의 스캐닝을 위해 사용될 수 있다. 특히, 형광 라벨을 위한 적당한 것은 각각의 프로브의 5'-OH 에 Cy3 그리고 Cy5 염료를 간단히 도입한 것이다. 혼성화된 프로브의 형광은 예를 들면, 공유초점 현미경에 의해 감지된다. 다른 많은 것과, 염료 Cy3 과 Cy5 는 상업적으로 입수가능하다.

매트릭스가 장착된 레이저 탈착/이온화 질량 분석기(MALDI-TOF)는 생물 분자의 분석에 강력한 도구이다(Karras M, Hillenkamp F. Laser 10000 달톤이 넘는 분자의 덩어리를 가진 단백질의 레이져 탈착 이온화. Anal Chem. 1998년 10월. 15; 60 (20) : 2299-301). 분석 시료는 광 흡수 매트릭스 속에 매립된다. 매트릭스는 단파 레이저 펄스에 의하여 기화되며, 분석되는 분자는 단편화되지 않은 채 기체 상태로 운반된다. 상기 분석물은 매트릭스 분자와의 충돌에 의해 이온화된다. 인가된 전압은 장이 걸리지 않는 비행관내의 이온을 가속화시킨다. 이온들은 그들의 상이한 질량에 기초하여 다양한 정도로 가속화된다. 크기가 작은 이온은 큰 이온보다 먼저 검출기에 도달한다.

MALDI-TOP 분석기는 단백질 및 펩티드의 분석에 매우 적합하다. 핵산의 분석은 다소 어렵다(Gut, I. G. and Beck, S. (1995), DNA and Matrix assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. 분자생물학 : Current Innovation and Future Trends 1 : 147-157.). 핵산은 펩티드 보다 감수성이 100배 더 낮고, 시료 조각이 클수록 과도한 비율로 나빠진다. 핵산은 다수의 음전하를 띤 백본을 갖고 있기 때문에, 매트릭스를 통한 이온화 과정은 근본적으로 큰 효율을 기대하기 어렵다. MAlDI-TOP 분석기에서는 매트릭스의 선정이 주요한 역할을 한다. 펩티드를 탈착하기 위하여 매우 미세한 결정을 생성하는 효과적인 매트릭스가 발견되었다. DNA 분석에 효율적인 매트릭스들이 개발되었으나, 결과적으로 감도의 차이를 낮추지 못하였다. 감도의 차이를 낮추려면 DNA를 펩티드와 화학적으로 유사해지도록 전환시켜야 한다. 포스포티오에이트 핵산은 백본의 일반 인산을 티오포스페이트로 치환시킨 것이며, 단순히 알킬화시켜 전하가 중성인 DNA로 전환된 것이다(Gut, I. G. and Beck, S. (1995), 메스분광분석법에 의해 선택적인 DNA 알킬화와 감지를 위한 절차. 핵산 Res. 23: 1367-1373). 이 개질된 DNA에 "전하 태그(charge tags)"를 결합시킴으로써 거의 펩티드 정도로 감도가 증가하였다. "전하 태그"의 또 다른 장점은 개질 되지 않은 기질의 검출을 매우 어렵게 하는 불순물의 존재하에서 분석의 안정성을 증가시키는 것이다.

게놈 DNA 는 세포의 DNA, 조직 또는 다른 테스트 샘플 등으로부터 표준화된 방법에 의해 얻어진다.

이런 표준 방법론은 Fritsch amd Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989 와 같은 참고자료에서 보여진다.

따라서, 지금까지 이전의 기술에는 메틸화분석을 위한 많은 방법이 있었다. 그러나, 현재의 발명은 현재의 방법이 문제를 해결할 수 없는 그러한 문제를 해결할 것이다. 즉 다시 말하면, 다른 기원의 시퀀스 상동 DNA 조각들이 존재하는 상태에서, 체액 또는 혈청안에서 발견되는 조사될 DNA를 표적화된 방법으로 증폭하는 것이다.

조사될 DNA 뿐 아니라, 아래에서 배경(background) DNA로 명명되는 존재하는 핵산은 통상 동등하게 증폭된다. 왜냐하면 사용된 프라이머는 조사될 DNA와 배경 DNA를 구별할 수 없기 때문이다. 이들 DNA들을 구별할 수 있는 하나의 가능성은 메틸화 패턴의 차이이다. 현재의 방법은 메틸화-민감 PCR, 약칭 MSP이다(Herman JG, Graff JR, myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR : CpG islands의 메틸화 상태의 새로운 PCR 분석. Proc Natl Acad USA. 9월 3일 ; 93 (18) : 9821-6). 이 방법은 몇 단계로 구성된다. 먼저, 이전의 기술에 따라 중아황산염 처리가 행해지고, 이는 차례로 메틸화된 시토신 염기(5-메틸시토신)가 변화되지 않고 남아있는 반면 모든 시토신 염기는 우라실로 전환되는 환경으로 인도한다. 다음 단계는 중아황산염으로 전환된 메틸화된 DNA와는 완전히 상보적이나 원래 메틸화되지 않은 상태로 존재했던 상응하는 DNA와는 상보적이지 않은 프라이머를 사용한다. PCR이 그러한 프라이머로 행해졌을 때 이것은 원래 메틸화된 DNA가 독점적으로 증폭된다는 사실을 이끌어낸다. 또한 반대로 오직 메틸화되지 않은 DNA만을 증폭하는 프라이머를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 방법으로, 배경 DNA뿐만 아니라 조사될 DNA가 존재할 때, 조사될 DNA는 CpG 위치의 메틸화 상태에 대해 배경 DNA와 차이가 있는 한, 선택적으로 그리고 독점적으로 생산될 것이다. 이전의 기술은 이러한 조사될 DNA의 감지로부터 메틸화 상태나 또는 조사될 DNA의 존재를 추론하는 것이다. 그것은 차례로 원칙적으로 진단을 (예를 들면, 환자에게 종양의 진단) 허락한다. 예를 들면 혈청 DNA 농도가 부분적으로 종양 환자에서 상당히 증가된다는 것이 알려져 있기 때문이다. 단지 종양으로부터 기원 되는 DNA가 배경 DNA에 더하여져 감지될 것이다. 원칙적으로 DNA분석은 다른 체액과 유사하다.

그러나, 여기서 언급되는 그리고 가장 밀접한 선행기술로 생각되는 상기 방법은 몇 가지의 단점이 있다. 예를 들면, 조사되는 DNA의 증폭된 조각들을 감지하는 것으로부터 혈청안에 존재하는 양을 추론하는 것이 불가능하다. 극히 최소량의 DNA로부터도 양성 결과를 얻을 수 있게 되는데, 이는 한편으로는 이점이 되나, 만약 예를 들어 혈청 DNA에서 종양 절제의 효과가 평가되길 바란다면, 이는 매우 바람직하지 못하게 작용할 수 있다. 가장 큰 단점은 조사되는 DNA와 배경 DNA가 단지 정도가 다를 뿐인 수많은 메틸화 위치가 존재한다는 것이다. 거짓된 양성 결과를 원하지 않는다면, 현재의 MSP 방법은 배경 DNA가 관심의 CpG 위치에서 조사되는 DNA와 명확하게 그리고 100% 에 달하는 정도로 차이가 난다는 것을 아는 경우에만 수행될 수 있다. 대조적으로, 종양조직에서는 통상 어떤 특정 위치가 메틸화된 상태로, 예를 들면, 종양세포의 95%에서 메틸화된 상태로 존재하고, 배경 DNA는 단지 최대 5%로 메틸화된 상태로 존재하는 것이 보통이므로, 원칙적으로 PCR에 의해 주형 DNA의 정량이 불가능하거나 단지 증가된 지출로 달성될 수 있기 때문에 MSP 방법으로 유익한 결과를 생산하는 것은 불가능하다. 또한, 이러한 발명은 종양세포와 같은 특이적 타입의 세포에 전형적인 DNA 조각들에 존재하는 메틸화 패턴에 대한 지식에 기초한다.

또한 선행기술은 후생유전학에 의해 발전된 과정을 포함한다. 그것은 중아황산염 처리 후 조사될 DNA 그리고 배경 DNA를 동등하게 증폭하고, 이후 혼성화 기술에 의해, 미니-시퀀싱(mini-sequencing)에 의해 양자택일적으로 또는 또 다른 현재의 방법에 의해, 조각들에 포함된 조사될 DNA의 CpG 위치를 검사한다. 이것은 조사된 메틸화 위치와 관계되어 정량적 패턴이 얻어지는, 다시 말하면, 복수 위치의 메틸화 정도의 결정이 성공적으로 얻어지는 이점을 가진다. 예를 들면 그것은 고체 종양의 경우 정확한 분류를 가능하게 한다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 배경 DNA가 대단히 우세한 그런 상황에서는 정확한 정보를 제공할 수 없는데, 이러한 정보는 조사된 DNA와 함께 정확하게 증폭되고 양쪽 모두 혼합물에서 분석되기 때문이다. 이러한 문제는 조사될 재료가 표적화된 방법으로 선택될 수 있는 그런 고체종양의 분석에서는 존재하지 않는다. 그러나, 예를 들면 혈청 DNA의 분석과 같은 것은 매우 어렵게 된다.

현재의 발명의 목적은 선행기술의 단점을 제거하고 체액과 혈청 안에서 검출을 위해 두 방법의 장점을 결합하는 것이다.

목적은 다음의 단계에서 실행되는 시토신 메틸화의 감지를 위해 창조된 방법으로 해결된다.

조사될 DNA와 배경 DNA로 구성된 게놈 DNA 샘플이 화학적으로 처리되어 모든 메틸화되지 않은 시토신 염기는 우라실로 전환된다. 그러나 5-메틸시토신 염기는 변화되지 않고 남아있다.

화학적으로 처리된 DNA 샘플이 폴리머라아제 뿐만 아니라 적어도 2 프라이머 올리고뉴클레오티드가 사용되여 증폭되며, 여기에서 조사될 DNA는 주형으로서 배경 DNA 보다 우선된다.

증폭 생성물을 분석하고, 증폭 생성물의 존재로부터 그리고/또는 다른 위치의 분석으로부터 조사되어야 할 DNA의 메틸화 상태에 관한 결론이 도출된다.

샘플 DNA는 혈청이나 개체의 다른 체액에서 채취되는 것이 발명에 따라 바람직하다.

샘플 DNA는 세포선(cell lines), 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 뇌척수액, 파라핀에 넣은 조직 즉, 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 위, 폐, 가슴 또는 간 조직, 조직학적 슬라이드(histological slides), 그리고 위의 것들의 모든 가능한 조합에서 채취되는 것이 발명에 따라 또한 바람직하다.

가장 바람직하게 상기 화학적 처리는 중아황산염(=이아황산염, 수소아황산염)으로 행해진다. 또한 바람직하게 상기 화학적 처리는 아가로스에 DNA를 집어 넣은 후 행해진다. 또한 바람직하게 DNA 이중나선 변성 시약 및/또는 유리기 트랩(radical trap)이 상기 화학적 처리 중에 존재한다.

삭제

바람직하게 상기 2단계의 증폭은 5'-CG-3' 디뉴클레오티드, 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드와 결합하는 적어도 하나의 부가적인 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 행해지며, 이로써 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드는 배경 DNA와 우선적으로 결합하고 그 증폭에 반대로 즉 불리하게 영향을 미친다.

특히 바람직하게는 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머의 이러한 결합 사이트는 배경 DNA상의 프라이머들의 결합 사이트와 겹치고, 부가적인 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 프라이머 올리고뉴클레오티드가 배경 DNA에 결합되는 것을 방해한다.

또한 특히 바람직하게는, 적어도 두 개의 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 사용되고, 그에 의하여 그들의 결합 사이트 각각은 차례로 배경 DNA상의 하나의 프라이머의 결합 사이트와 겹치고 부가적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA 올리고머는 배경 DNA에 양 프라이머 올리고뉴클레오티드의 결합을 방해한다.

특히 바람직하게는 부가적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA 올리고머는 중 하나는 정 프라이머의 결합을 저지하고 다른 하나는 역 프라이머의 결합을 저지한다.
특히 바람직하게는 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도의 적어도 5배로 존재한다.

또 다른 바람직한 본 발명의 변형된 실시 형태에서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 배경 DNA와 결합하고, 폴리머라아제(polymerase) 반응에서 프라이머 올리고뉴클레오티드의 완벽한 신장(elongation)을 방해하게 하는 것이다. 사용된 폴리머라아제가 5'-3' 익소뉴클레아제(exonclease) 활성을 가지고 있지 않은 경우에 특히 그러하다. 또 다른 바람직한 변형은 부가적인 올리고뉴클레오티드가 5' 끝이 변형되어 존재하고, 그래서 5'-3' 익소뉴클레아제 활성을 가진 폴리머라아제에 의하여 결코 분해되지 않게 하는 것이다.

또한, 바람직하게 화학적으로 처리된 DNA 샘플은 제2단계에서 적어도 2개의 프라이머 올리고뉴클레오티드와, 5'-CG-3' 디뉴클레오티드, 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화하는 다른 올리고뉴클레오티드, 그리고 폴리머라아제 뿐만 아니라 5'-CG-3' 디뉴클레오티드, 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화하는 적어도 하나의 리포터(reporter) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭된다. 그에 의하여 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드는 배경 DNA에 우선적으로 결합하여, 반대로 그 확대에 영향을 미치고, 리포터 올리고뉴클레오티드는 조사되어야 할 DNA에 우선적으로 결합하고 그 증폭을 나타낸다. 또한 리포터 올리고뉴클레오티드이외에 형광 염료로 라벨된 다른 올리고머를 사용하고, 이 다른 올리고머가 리포터 올리고뉴클레오티드에 직접 인접하여 혼성화되며, 이러한 혼성화를 형광 공진 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer)에 의하여 추적되도록 하는 것이 유리하다. 또한, 바람직하게 타크만(TaqMan)분석이 수행된다. 또한 바람직하게 라이트사이클러(LightCycler)분석이 수행된다.

또한 바람직한 본 발명의 실시형태에서, 프라이머들에 부가하여 사용되는 올리고뉴클레오티드는 3'-OH 작용기가 이용가능하지 않다. 또한, 리포터 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 형광 라벨(florescent label)을 갖는 것이 바람직하다. 또한 바람직하게 리포터 분자는 형광의 증가나 감소에 의하여 증폭을 나타낸다. 특히 바람직하게는 형광의 증가나 감소가 직접 분석을 위해 사용되고, 분석되어야 할 DNA의 메틸기 상태가 형광 신호로부터 결정된다.

배경 DNA는 조사 대상 DNA 농도의 100배로 존재하는 것이 발명에 따라 바람직하다. 배경 DNA는 검사되어야 할 DNA 농도의 1000배로 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 바람직하게 상기 분석 또는 경우에 따라서는 부가적인 분석은 올리고머 배열에로의 혼성화에 의하여 행해지며, 상기 올리고머들은 핵산 또는 혼성특성이 유사한 PNA와 같은 분자가 될 수 있다.

본 발명에 따라 바람직하게 상기 올리고머는 분석 대상 DNA에 12~22의 염기 길이 세그먼트(base long segment)에 의해 혼성화되며, CG(시토신-구아닌), TG(티민-구아닌), 또는 CA(시토신-아데닌) 디뉴클레오티드를 포함한다.

분석될 DNA의 적어도 20개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험으로 검출되는 것이 바람직하다.

또한 바람직하게, 분석될 DNA의 60개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험에서 검출된다.

뿐만 아니라 본 발명에 의하면, 그러한 분석 또는 부가적인 분석을 위한 측정방법으로서 조사대상의 증폭된 DNA의 길이 측정법(length measurement)을 적용하는데, 구체적으로는 겔 전기영동(gel electrophoresis), 모관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis), 크로마토그래피(예, HPLC), 질량분석법 그리고 다른 적절한 방법들이 가능하다. 또한 생거(Sanger)의 방법, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 및 혼성화에 의한 시퀀싱(SBH; sequencing by hybridization)과 같은 시퀀싱 방법을 통해 수행될 수 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 방법에서, 각각의 CpG 위치 또는 이들 위치의 소그룹에 대한 시퀀싱은 매번 개별적인 프라이머 올리고뉴클레오티드로 수행되고, 상기 프라이머의 신장이 단지 한개 또는 몇개의 염기들을 구성하여, 조사대상 DNA의 각 위치에서의 메틸화 상태가 프라이머 연장 타입으로부터 추론된다.

환자의 질병의 존재 또는 기타 건강상태는 조사된 상이한 CpG위치들의 메틸화 정도에 의해 결정지어지는 것이 바람직하다.

바람직하게 증폭된 생성물에는 검출의 편의를 위해 구별 가능한 라벨을 장착한다. 유용한 라벨로는 형광라벨, 방사성핵종, 제거가능한 질량라벨(이것은 질량분석계에서 검출된다) 등이 있다.

바람직하게, 증폭과정에서 프라이머들 중 하나는 고체상에 결합되어 있다.

또한 바람직하게 본 발명에서 증폭된 생성물들은 질량분석계에서 전체적으로 검출되고, 그것들의 질량에 의해 각각 명확하게 특성화된다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 환자, 또는 개인의 하기 카테고리에 속하는 고통의 진단 및/또는 예후의 진단에 사용하는 방법을 제공하며, 이는 원치않는 약물 상호작용; 암 질병; CNS 비정상 기능, 손상, 또는 질병; 공격 증상 또는 행동장애; 뇌손상의 임상적, 심리적 및 사회적 장애; 심리적 장애 및 인격 장애; 치매 및/또는 관련 신드롬; 심혈관계의 질병, 비정상 기능 및 손상; 위장관계의 비정상기능, 손상 또는 질병; 호흡계의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 장해, 염증, 감염, 면역 및/또는 회복; 성장 과정 중 기형(불구)으로서의 신체의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 피부, 근육, 결체 조직 또는 뼈의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 내분비선 및 신진대사의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 두통 또는 성적 비정상 기능을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 세포의 형태나 조직을 식별하거나 세포의 파생(cell differentiation)을 조사하는데 유용하다.

또한 본 발명은 증폭 생성물의 제조를 위한 중아황산염(bisulfite), 프라이머들, 그리고 3'-OH 작용이 없는 기타 올리고뉴클리오티드들을 포함하고 있는 시약과, 경우에 따라 본 발명에 따른 시험을 수행하기 위한 지시사항이 기록된 서류(지침서)로 이루어진 키트(kit)를 제공한다.

본 발명은 유전자 DNA 샘플의 메틸화(methylation)된 정도를 검출하는 방법을 기술하고 있다. 기존에 알려진 방법들과는 달리, 본 발명에서 일련의 CpG 위치에 대한 메틸화 정도는, 예를 들어 혈청(serum)에서처럼 선택된 하위그룹의 DNA 조각에서 결정되기 때문에, 진단적으로 관련이 없는 배경 DNA가 과량으로 존재하는 경우에도 분석이 가능하다.

바람직하게 본 발명의 방법은 하기와 같이 요약되는 단계로 이루어진다.

첫째, 혈청 혹은 다른 체액을 환자로부터 얻고, 필요하다면 거기서 발견된 DNA를 분리해 놓는다. 다음으로, 두 번째 단계에서는 화학적인 처리가 이루어지는데 주로 중아황산염을 가지고 한다. 예를 들어, 전혀 메틸화되지 않은(all unmethylated) 시토신 염기들은 우라실로 변환되지만, 메틸화된(methylated) 시토신 염기들(5-methylcytosine)은 변화 없이 그대로 남겨지는 것을 말한다. 세 번째 단계에서는 증폭과정이 이루어지는데, 주로 조사를 감행할 DNA를 증폭시키고, 배경 DNA는 증폭하지 않는다. 혹여 증폭이 되더라도 소량에 그친다. 네 번째 단계에서는 증폭된 조각들을 분석하여 메틸화된 자리에 대한 정보(메틸화 시그니쳐)를 얻고, 증폭된 생성물에서의 기존의 몇 가지 CpG 위치에서의 메틸화 정도가 결정된다. 다섯 번째 단계에서는 조사 대상이 된 상이한 CpG 위치에서의 메틸화 정도에 대한 정보를 근거로 환자의 이상유무 혹은 다른 의학적 상태가 결정되는 것이다.

본 발명의 핵심은 두 타입의 CpG 위치가 분석에 동등하게 역할 및 공헌하는 것이며, 이들은 아래와 같이 "한정자(qualifier)"위치와 "분류자(classifier)"위치로 명명된다.

한정자 위치는 증폭(amplification)에서 배경 DNA로부터 분석될 DNA를 구별하는 목적을 수행한다. 이것은 기술적으로는 아래에 자세히 기술된 바와 같이 상이한 방법들로 행해질 수 있다. 이러한 위치의 성질은 조사될 DNA에서 이들의 메틸화 정도가 배경 DNA에서 이들의 메틸화 정도와 가능한 한 다르며, 그리고 이것은 증폭에서 조사될 DNA에 우선성을 주는 결과를 가져온다. 반면, 분류자 위치는 조사될 DNA로부터 지배적으로 생성된, 증폭된 생성물로부터의 이들 위치의 메틸화의 정도에 의해 진단를 위해 중요한 정보를 추출하는 목적을 수행한다. 비록 자주 필요한 것은 아니지만, 예를 들어 올리고머 배열 상에서 분석이 행해지는 경우, 수백개에 이르는 이러한 분류자 위치가 하나의 분석을 위해 사용될 수 있다.

그러나, 이 경우에 조사 결과를 위해 중요한 것은 어떤 특정 증폭 산물의 형성이 아니라, 동일한 증폭 산물에서 CpG 위치의 분석이다. 그러나, 몇 경우에는, 분석에서 증폭 산물의 형성에서 유래된 정보를 관련시키는 것은 확실히 가능하며 의미 있는 일이다. 이 경우 수개의 위치는 분류자인 동시에 한정자이다.

이 방법에서 첫 단계인, 샘플의 획득은 바람직하게는 예를들어 타액(sputum) 등의 체액(body fluid), 또는 혈청 등을 얻음으로써 행해지나, 그러나 이 방법은 그들의 완전성에 관해 클레임이 없이 리스트될 수 있는 다른 소스에서부터의 많은 종류의 샘플로 행해질 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 사용된 게놈(genomic) DNA는, DNA를 위한 소스가 예를 들어, 셀 라인, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 뇌-척수액, 파라핀상에 내재된 조직, 예를 들어 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 가슴, 간장, 조직학적(histological) 슬라이드, 그리고 그들로부터 가능한 모든 조합으로부터 얻어진다.

몇 경우에는, 지나치게 높은 정도의 불순물에 의해 중아황산염 반응 그리고/또는 후속 PCR이 제대로 이루어지지 않는 것을 방지하기 위하여, DNA의 정제(purification) 또는 농축이 중아황산염(bisulfite) 처리 전에 행해진다. 그러나 예를 들어 단백질 가수 분해 효소 K를 사용하여, 추가적인 정제 없이 처리 후 조직에서 PCR을 진행할 수 있음이 공지되어 있고, 이는 중아황산 처리 및 후속의 PCR을 위해서도 의미있는 방법이다.

화학처리는 바람직하게는 중아황산염(수소아황산염(hydrogen sulfite), 이아황산염(bisulfite))을 가지고 행해지며, 또한 바람직하게 나트륨아황산염(sodium bisulfite)으로 수행한다(암모늄 중아황산염은 덜 적합하다). 상기 반응은 간행된 변형에 따라, 처리 동안 DNA를 단일 가닥 상태로 유지하기 위해 DNA가 바람직하게는 아가로스안에 묻혀지거나, 또는 새로운 변형에 따라, 유리기 트랩 그리고 바람직하게는 올리고에틸렌 글리콜 다이알킬에테르(oligoethylene glycol dialkyl ether) 또는 예를 들어 다이옥산(dioxane)과 같은 변성 시약의 존재하에서 수행된다. PCR 반응 이전에, 상기 시약들은 아가로즈 방법의 경우 세척으로, 또는 DNA 정제(purification) 방법으로(종래기술에서는, 침전 또는 고상으로의 결합(binding) , 멤브레인(membrane) ), 또는 PCR에 중대한 영향을 미치지 않는 농축영역을 단순히 희석하는 방법에 의해 제거한다.

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이 세번째 단계를 위해서는, 조사될 DNA의 선택적인 증폭를 허용하는 한정자 위치가 선택되고 그리고 조사될 DNA를 선택적으로 증폭할 수 있는 적절한 방법이 선택되는 것이 근본적으로 필요하다. 이러한 위치의 선택은 그들의 메틸화에 관련하여 조사될 DNA와 배경 DNA 사이를 가능한 많이 구별시켜야 한다는 전제에 의해 이루어진다. 이 목적을 위해서, 건강한 인간으로부터의 배경 DNA 뿐 아니라 조사될 종양 양쪽을 위해 매번 고려되어야 할 유전자 조각의 메틸화 프로필이 결정된다. 종양 DNA와 배경 DNA(예를 들어, 세륨에서의)사이의 가장 큰 차이를 가지는 이러한 위치들이 한정자 위치로 선택된다. 이러한 위치는 복수의 유전자, 예를 들면 GSTpi에 대한 유전자, HIC-1과 MGMT에 대한 유전자들에 이미 알려져 있다(von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts. Oncol Res.; 4 (4-5): 167-74; Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000), Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis. Cancer Res. May 1; 60 (9): 2368-71). 이러한 한정자 위치를 사용하여, 조사될 DNA가 우선적으로 증폭될 수 있는 전체적으로 선호되는 몇 가지 방법이 있다.

먼저 중아황산염 처리 후, 유사하게 처리된 배경 DNA가 아닌 조사될 DNA에 대응한 배열에 완전히 혼성화(hybridize)하는 프라이머를 이용하여 MSP에 대응하는 반응을 수행하는 것이 가능하다. 즉, 프라이머가 하나 또는 그 이상의 한정자 포지션이 발견되는 DNA 조각에 혼성화하고, 원래 DNA에서의 그들의 메틸화 상태가 조사될 DNA를 위한 특징에 대응하는 경우에만 상당한 정도로의 증폭이 일어난다. 이것은 원칙에서는 단순한 변형이지만, 한정자 위치가 매번 DNA 조각의 일단 또는 양단에 놓여져야 하는 즉, 분류자 위치가 반드시 한정자 위치 사이에 위치하여야 하는 불리한 점을 가지고 있다(또는, 그러나 오직 하나의 한정자 위치가 있는 경우, 한정자 위치는 분류자 위치의 중간에 위치되어서는 안된다). 실제 이러한 MSP 변형은 본 발명에 따라 바람직하지만, 이는 단지 상대적으로 적은 경우에 사용될 수 있다. 한정자와 분류자 위치의 분포가 단지 몇 경우에만 이상적이기 때문이다. 그러나, 원칙적으로는 실행은 단순하기 때문에, 그것은 어떠한 경우에도 바람직한 것으로 여기에 리스트된다.

특히 바람직한 변형은 프라이머가 한정자 위치와 겹쳐지지 않거나, 또는 프라이머가 한정자 위치와 혼성화하지만, PCR 증폭이 프라이머로서 기능할 수 없으며 한정자 위치와 결합하는 적어도 하나의 다른 올리고뉴클레오티드에 의해 영향을 받는 것이다.

이것은 화학적으로 처리된 DNA가, 원칙적으로 종래의 기술에서와 같이 두개의 프라이머에 의해 증폭된다는 것을 뜻한다. 하나 이상의 한정자 위치가 두개의 프라이머에 의해 결합되는 DNA 조각 내에 발견된다. 이제, 표준 PCR에 대조적으로, 한정자 위치에 결합하는 부가적인 올리고뉴클레오티드가 부가되고, 실제로 상기 한정자 위치가 중아황산염 처리 전에 메틸화된 상태로 존재하였는지 또는 비메틸화된 상태로 존재하였는지에 의존하여 선택적으로 한정자 위치에 결합한다. 따라서, 조사될 DNA는 부가될 올리고뉴클레오티드가 배경 DNA 보다 그들의 한정자 포지션에 덜 효과적으로 결합하는 경우 우선적으로 증폭된다. 즉, 부가된 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 배경 DNA의 확대를 막는다.

바람직하게 이러한 부가된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 CG, 하나의 TG, 또는 하나의 CA 디뉴클레오티드를 포함한다. 그들은 PCR 반응에서 이용되는 폴리머라제(polymerase)에 의해 연장될 수 없는 성질을 부가적으로 가져야 한다. 이것은 3'-데옥시올리고뉴클레오티드(3'-deoxyoligonucleotide)의 이용, 또는, 예를 들어 3'-O-아세틸 올리고뉴클레오티드(3'-O-acetyl oligonucleotide)와 같이 3' 위치에 다른 작용기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용으로 바람직하게 행해진다.

부가적으로, 폴리머라제에 의한 이들 뉴클레오티드의 분해는 예방될 수 있다. 이것은 바람직하게 뉴클라제 활성이 없는 폴리머라제의 사용으로, 또는 바람직하게는 예를 들어 5' 말단에 티오에이트 브리지(thioate bridges)를 가져 분해에 저항성이 있는 변형된 올리고뉴클레오티드의 사용으로서 바람직하게 행해질 수 있다.

다른 특히 바람직한 변형은 실험에서 올리고뉴클레오티드로서 의미있는 방법으로 사용되는 PNA(Peptide Nucleic Acid)의 사용이다. PNA 올리고머(oligomer)는 폴리머라제에 의해 분해되지 않고, 그리고 그들은 폴리머라제에 의해 연장되지 않으며, 따라서 그들은 본 변형 방법에 이상적으로 적합하다. DNA 올리고머(oligomers)의 디자인과 합성을 위한 방법은 선행기술이다.

상술한 바와 같이, 각각이 배경 DNA에서 나타나는 메틸화 상태에 특정된 몇 가지 한정자 위치와 그리고 또한 몇 가지 올리고뉴클레오티드가 그러한 방법에서 사용된다.

조사될 DNA의 선택적인 증폭 후, 그들에게 그리고 그들의 알려진 방법에 따라 몇가지 분류자 위치의 메틸화 정도가 바람직하게 결정된다.

그러나, 심지어는 이 경우에도, MSP에게는 또한 맞는 것으로, 한정자 위치가 예를 들어 배경 DNA에 실질적으로 100% 까지 비메틸화된 상태로 존재하고, 조사될 DNA에서는 메틸화된 상태로 존재하는 상황이라면, 개별적 경우에서 [어떤] PCR 조각 형성 자체가 충분한 정보 가치가 있음이 명백하다. 만일 중아황산염 처리에서 비메틸화된 배경 DNA로부터 형성되는 시퀀스에 우선적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 PCR에서 사용한다면, 적어도 조사될 DNA가 소량으로라도 일반적으로 존재하는 한, 오직 하나의 생성물이 PCR에서 형성된다. 이것은 개별적인 경우 진단에 있어 충분할 수 있으며, MSP 방법과 유사한 성질을 갖는 방법을 사용하는 것이 될 것이다. 비록 그러한 절차가 직접적으로 선호되지 않지만, 그러한 방법은 지금까지도 아직 알려져 있지 않으므로 본 발명에 속하는 것으로 간주된다.

바람직하게 몇 개의 조각들이 PCR 반응에서 동시에 생성되고, 즉 멀티플렉스 PCR이 수행된다. 이 때, 프라이머 뿐만 아니라, 사용되는 부가적인 올리고뉴클레오티드 역시 서로 상보적으로 되지않도록 설계에 주의가 기울여져야 한다. 그렇지 않다면 높은 멀티플레싱의 정도는 평상시의 케이스보다 이 케이스에서 더욱 어려울 것이다. 그러나, 중아황산염 처리 DNA의 경우에는, 두 DNA 가닥의 G와 C 함량에 기초하여 정 프라이머가 또한 역 프라이머로서의 역할을 하지 못하는 장점을 가지고 있고, 이것은 차례로 멀티플렉싱을 용이하게 하며 실질적으로 이러한 단점을 보상한다.

가장 단순한 예에서, 형성된 조각들은 이제 탐지된다. 겔 전기이동(electrophoresis), 시퀀싱, 액체 크로마토그래피 또는 혼성화(hybridizations)등의 모든 가능한 알려진 분자생물학적 방법이 이러한 검출을 위해 분류자 올리고뉴클레오티드의 분석 없이 고려된다. 이것은 선행 방법의 단계의 품질 제어를 위해 또한 고려 가능하다. 그러나, 위에서 상술한 바와 같이, 분류자 위치의 메틸화 정도의 후속 분석은 특히 바람직하다.

상술한 방법에 의한 조사될 DNA의 우선적인 증폭과 분류자 올리오뉴클레오티드를 위한 검출 기술을 바람직하게 결합하는 몇가지 가능성이 있다.

특히 적합한 검출 기술은 올리고머 배열로의 혼성화와 예를들어, 프라이머 연장(미니 시퀀싱) 반응이 있다. 올리고머 배열로의 혼성화는 가장 가까운 선행기술의 프로토콜을 부가적인 변화없이 사용할 수 있다(Olek A, Olek S, Walter J; WO Patent 99 28498). 그러나, 바람직하게는 증폭된 생성물을 고체상에 고정된 올리고뉴클레오티드의 쌍들로 이루어지는 올리고머의 배열에 혼성화하며, 그중 하나는 매번 원래 비메틸화된 CpG(분류자 포지션)을 포함하는 DNA 조각에 가장 우선적으로 혼성화하며, 다른 하나는 매번 중아황산염 처리와 증폭 전에 원래 메틸화된 CpG가 포함된 대응하는 조각에 가장 우선적으로 혼성화한다. 이 경우에서, 가장 바람직하게는 상기 증폭 생성물은 형광으로 또는 방사성으로 라벨링되거나, 제거가능한 질량 태그(mass tag)로 라벨링되어 혼성화 후 한 쌍의 두개의 올리고뉴클레오티드에 결합된 조각이 검출되고, 이 라벨을 기초로 정량된다. 얻어진 강도 비율(intensity ratio)로부터, 완전히 메틸화된 그리고 비 메틸화된 DNA로의 실험의 조정 후, 예를 들어 각각의 분류자 위치에서의 메틸화 정도를 결정할 수 있다. 복수의 조각과 분류자 위치는 이러한 올리고머 어레이 상에서 동시에 검출될 수 있다(도 1). 상기 어레이는 또한 바람직하게 실험을 모니터링하기 위한 한정자 위치를 검출하는 올리고머를 포함하며, 이로써 분석에 들어가는 조사될 DNA의 배경 DNA에 대한 비율이 결정될 수 있다.

프라이머 연장 반응은 고체상에서 고정된 올리고뉴클레오티드 상에서 또한 행해질 수 있다. 비록 필수적인 것은 아니지만, 이들 프라이머는 고정화된 것이 바람직하며, 보통 몇 개의 증폭된 생성물로 이루어진 복수의 분류자 위치가 조사되고, 이 조사는 고체상, 따라서 올리고머 배열상에서 상당히 더욱 간단하게 하나의 실험으로 수행될 수 있기 때문이다. 특히 바람직하게는 프라이머가 분류자 위치 바로 다음에서 발견되고 그리고 오직 하나의 뉴클레오티드가 연장되도록 진행된다.

특히 바람직하게는 오직 디데옥시티미딘(dideoxythymidine)과 디데옥시시티딘(dideoxycytidine)이 뉴클레오티드로서 부가되고, 이들 각각이 다른 형광염료로 라벨링되며, 여기에서 물론 다른 라벨도 또한 고려 가능하며, 질량 태그 같은 것은 오히려 더 바람직하다. 중아황산염(bisulfite) 처리와 확대 후, 전에 비 메틸화된 CG가 TG로 나타나는 반면, 이전에 메틸화된 CG는 CG로 나타난다. 프라이머 연장 반응은 따라서 디데옥시시티딘(dideoxycytidine) 또는 디데옥시티미딘(dideoxythymidine)을 포함시키게 된다. 각각의 위치에서 메틸화 정도는 매번 이러한 두개의 종결부위(terminators)에서 감지되는 형광 라벨의 비율로부터 결정될 수 있다. 만일 구아닌 유도체가 존재하지 않고 따라서 프라이머 연장이 한 염기 후에도 더이상의 TG나 CG 시퀀스 없이 끝난다면, 이 경우에는 디데옥시시티딘 그리고 디데옥시티미딘과 함께 프라이머 연장을 행하는 것이 또한 가능하며 바람직하다. 디데옥시-ATP 그리고 디데옥시-GTP 또는 그들의 유도체로 CA와 CG를 적절하게 구별함으로써 반대가닥(counterstrand)상에서 이러한 분석을 유사하게 행하는 것도 또한 바람직하다.

그러나, 본 방법의 특별히 바람직한 변형은, 하나의 실험에서 한정자 위치와 분류자 위치를 동시에 검출하는 것인데, 이는 타크만(TaqMan) 또는 라이트사이클러(LightCycler) 기술을 변형하여 사용함으로써 달성될 수 있다. 부가적인 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드에 부가될 수 있으며, 이것은 조사될 DNA의 우선적인 증폭을 제공하며, 형광의 변화가 PCR 반응 동안 측정된다. 원칙적으로, 조사될 DNA가 증폭되므로, 다른 분류자 CpG 위치의 메틸화 상태에 대한 정보가 형광의 변화로부터 직접 또한 지배적으로 얻어진다. 다른 올리고뉴클레오티드들은 각각 바람직하게 서로 다른 형광 물질이 제공되기 때문에, PCR 동안 서로 다른 위치에 대해 독립적으로 형광의 변화를 구별하는 것이 가능하다.

메틸화 상태에 의존하는 형광의 이러한 변화는 여러가지 방법에 의해 달성될 수 있는데 그 중 두가지가 예시로서 기술된다.

우선, 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)가 이용될 수 있는데, 이것은 상응하는 위치에서 비 메틸화된 DNA의 화학적 처리에 의해 발생하는 서열, 또는, 상응하는 위치에서 메틸화된 DNA의 화학적 처리에 의해 형성되는 서열에 상응하는 서열에 특이적으로 결합한다. 이러한 프로브는 가장 바람직하게 두개의 형광 염료, 즉 냉각자 염료(quencher dye) 및 마커로 작용하는 염료를 구비한다. 이러한 두개의 형광염료는 동일한 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합된다. 만일 조사될 DNA이 주형으로서 PCR 반응이 일어난다면, PCR 반응은 형광 라벨된 올리고머 프로브에 의해 차단된다. 그러나, 형광 라벨된 올리고머 프로브는 폴리머라제의 뉴클레아제 활성에 저항적이지 않기 때문에 주형 DNA에 결합된 프로브는 PCR 반응 동안 분해되고, 이는 주형에 대한 프로브의 결합 효율과 관련되며, 결합되지 않는 프로브는 폴리머라제에 의해 분해되지 않기 때문이다. 마커로서 작용하는 형광 염료과 냉각자 염료가 서로로부터 분리되는 사실로 인해, 프로브의 분해는 마커 염색의 형광성의 증가로 인해 직접 시각적으로 보여진다. 원칙적으로, 이것은 이른바 TaqMan 분석(assay)의 변형을 포함한다.

결과적으로, 측정되는 것은 조사될 DNA로부터의 PCR 생성물의 형성이며, 조사된 분류자 포지션이 메틸화 상태로 또한 존재하는 경우에는 프로브가 이 화학적으로 처리된 DNA에 혼성화됨으로써 감지된다. 다른 메틸화 상태의 분류자 위치에 대응하여 결합되는 프로브를 포함하는 역 샘플(counter sample)은 또한 적절하고 그리고 바람직하다.

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프로브들을 서로 구별하여 멀티플렉싱을 제공하기 위해, 바람직하게 상이한 방출 파장을 갖는 상이한 형광 염료들이 냉각자와 함께 수개의 프로브에 사용된다.

그러한 분석의 경우에서도, 한정자 위치에 결합하는 올리고뉴클레오티드가 사용되고, 이것은 배경 DNA의 실질적인 증폭을 방지한다. 조사될 DNA의 증폭은 또한 전술한 바와 같이 프로브와 함께 동일한 위치가 조사되는 식으로 분석되며, 따라서 증폭은 한정자 위치에 결합하는 프로브에 의해 검출된다. 이 경우, 특히 바람직하게는 형광 라벨된 프로브는 조사될 DNA에 결합하는 반면, 분해될 수 없는 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 배경 DNA에 결합된다. 본 방법의 특히 바람직한 변형에서, 프로브와 분해되지 않는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 하나의 뉴클레오베이스를 제외하고는(다만, 어떤 경우에서건 두개 이상의 뉴클레오베이스를 넘지 않는다) 동일한 서열을 가진다.
특히 바람직한 변형으로서, 수개의 메틸화가능한 위치가 한정자 위치로 정의되고, 바람직하게 배경 DNA 뿐 아니라 프로브에 결합하는 한정자 포지션으로 정의되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드가 이러한 위치들을 위해 사용되는 것이다. 이 경우에서의 배경 DNA의 확대가 몇가지 올리고뉴클레오티드에 의해서 억압될 것이기 때문에, 조사될 DNA보다 배경 DNA가 상대적으로 특히 많은 경우에 바람직하다. 많은 경우, 현재 가능한 방법으로는 임의의 다수 염료들을 동시에 검출할 수 없기 때문에, 이러한 변형에서 하나의 조각내 몇가지 한정자 위치가 존재하는 경우 분류자 위치의 더 이상의 조사는 불필요할 수 있다.(대부분의 경우 이러한 상이한 염료의 수는 4-5이다). 이후, 바람직하게 앞에서 언급된 다른 감지 기술중 하나로 부가적인 분류자 위치의 조사가 행해질 수 있다.

삭제

몇가지 위치의 메틸화정도가 하나의 프로브로 동시에 조사될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
만일, 분류자 위치의 메틸화 및 그 정도를 보다 정확하게 정량화하는 것이 요구된다면, 바람직하게 서로 경쟁하는 두개의 프로브가 상이한 염료와 함께 사용될 수 있는 데, 여기에서 이들 중 하나가 조사될 DNA에서의 비 메틸화 위치의 경우에 결합하고, 반면 다른 하나는 바람직하게 반대경우, 메틸화 위치에 결합한다.
형광 변화가 또한 PCR 동안에 일어날 수 있는 기본적으로 다른 방법은 LightCycler^TM기술로 현재 알려져 있다. 만일 그들이 서로, 예를 들어 1-5 뉴클레오티드 떨어진 정도의 직접 인접부위에서 발견될 수 있다면, 형광 공진 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer (FRET))가 두개의 염료 사이에서 오직 일어날 수 있다는 사실이 이용될 수 있다. 제 1 염료의 방출로 인해서 제 2 염료가 오직 여기될 수 있으며, 차례로 다른 파장의 빛을 방출하며, 이것이 감지된다.

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현 메틸화 분석의 경우, 형광-라벨된 프로브의 혼성화는 분류자 위치에서 각각 화학적으로 처리된 DNA를 생성하며, 차례로 이러한 프로브의 결합은 조사될 DNA가 이 위치에서 메틸화된 형태로 존재하였는지 또는 비메틸화된 형태로 존재하였는지에 의존한다. 다른 형광 물질을 가진 다른 프로브는 직접 이 프로브에 인접하여 결합한다. 이러한 결합은 다시 바람직하게 만일 다른 메틸가능한 위치가 각각 시퀀스 조각에서 나타나는 경우 메틸화에 의존하여 일어난다. 증폭 중에, DNA가 복수화되고, 이 이유로 훨씬 많은 형광 라벨된 프로브가 각 위치에 인접하여 결합되며, 각 위치가 이에 요구되는 메틸화 상태를 갖고 있는 만큼 증가된 FRET가 측정된다.

수개의 상이한 형광 라벨된 프로브를 사용한 복합(multiplexing)은 또한 바람직하게 이 방법에서 일어난다.

또한 가능하며 바람직한 것은 한정자 위치가 측정되는 것이다. 배경 DNA는 각각의 위치에서 비메틸화된 형태로 존재하고, 화학적 처리와 증폭 후, TG 디 뉴클레오티드가 이 위치에 생성되며, 그리고 이와 대조적으로, 조사될 메틸화된 DNA는 CG 디뉴클레오티드를 생성하며, 형광 라벨된 프로브가 CG를 함유하는 시퀀스에 결합하고, 반면 라벨되지 않은 경쟁적인 올리고머가 배경 DNA의 상응하는 TG 시퀀스에 결합되는 것으로 추정된다.

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따라서 비메틸화된 올리오뉴클레오티드가 더 짧은 프로브 올리고뉴클레오티드에 대조적으로 그것의 명백하게 높은 녹는 점 때문에 증폭을 방지한다는 것이 중요하다. 이에 대해, 화학적으로 처리된 배경 DNA에 결합하는 프로브와 올리고머는 이 경우 몇가지 베이스를 제외하고는 동일하지 않고, 이들은 근본적으로 길다(5-15 베이스 정도). 또한, 변형된 올리고뉴클레오티드 그리고/또는 PNAs를 활용하는 것은 바람직하고 또 가능하다. 이 경우에 또한, PCR에서 신장되는 것을 피하기 위하여, 모든 프로브와 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 제외하고, 그들의 3' 말단(terminal)이 차단되어 있다. 이것은 예를 들어 인산기(phosphate)로 행해질 수 있다.

상기 두 방법은 그 결과가 한 경우는 형광의 감소가 측정되고, 다른 경우는 형광의 증가가 측정된다는 점에서 원칙적으로 상이하다. 상기 두 방법 모두에서, 한정자 위치 및 분류자 위치 양자 모두 측정될 수 있다.

요약하면, DNA 샘플에서의 시토신 메틸화의 감지를 위한 방법으로 특히 다음 단계가 행해지는 것이 바람직하다. 우선 배경 DNA 뿐 만 아니라 조사될 DNA를 가지고 있는 게놈(genomic) DNA 샘플이 화학적으로 처리되어 5-메틸시토신 염기가 바뀌지 않고 유지되는 반면, 모든 비메틸 시토신 베이스가 우라실로 변환된다. 그런후 화학적으로 처리된 DNA 샘플은 폴리머라제 뿐 아니라 적어도 2개의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 사용과 함께 증폭되고, 여기서 조사될 DNA는 주형으로서 배경 DNA에 우선하여 증폭된다. 그리고 다음 단계로, 증폭 생성물이 분석되고 그리고 조사될 DNA에서의 메틸 상태가 증폭 생성물의 존재 및/또는 부가적인 위치의 분석으로부터 결정된다.

특히 바람직한 방법의 변형에서, 샘플 DNA는 혈청이나 또는 기타 개체의 체액(body fluid)으로부터 얻어진다. 샘플 DNA는 세포 라인, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 뇌-척수 액, 파라핀상에 내재된 조직, 예를 들어 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 가슴, 간장, 조직학적(histological) 슬라이드, 그리고 그것으로부터 가능한 모든 조합으로부터의 얻어지는 것이 또한 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 변형은, 화학적 처리는 중아황산염(=이아황산염(disulfite), 수소아황산염(hydrogen sulfite))과 함께 행해진다. 아가로스에 DNA를 포함시킨 후에 화학적 처리를 행하는 것이 바람직하다. 또한 DNA 이중 나선 변성 시약 및/또는 유리기 트랩이 화학적 처리의 경우에 존재하는 것이 바람직하다.

본 방법의 특히 바람직한 변형은, 증폭이 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3'디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3'디뉴클레오티드에 결합되는 적어도 하나의 부가적인 올리고뉴클레오티드의 존재하에 행해지는 것이 바람직한데, 여기에서 이 다른 뉴클레오티드는 바람직하게는 배경 DNA에 결합되고 그 증폭에 반대로 영향을 미친다.

또한 특히 바람직하게 화학적으로 처리된 DNA 샘플은 두번째 단계에서 적어도 2개의 프라이머 올리고뉴클레오티드, 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화하는 다른 올리고뉴클레오티드, 그리고 폴리머라제 및 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3'-디뉴틀레오티드 또는 5'-CA-3'-디뉴클레오티드에 혼성화하는 적어도 하나의 리포터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭되며, 여기에서 부가적인 올리고뉴클레오티드는 배경 DNA에 우선적으로 결합하고 그리고 그 증폭에 반대로 영향을 주며 그리고 여기에서 리포터 올리고뉴클레오티드는 조사될 DNA에 우선적으로 결합하며 그리고 그 증폭을 나타낸다.

또한 바람직하게 상기 리포터(reporter) 올리고뉴클레오티드에 부가하여, 형광 염료로 라벨된 다른 올리고머가 사용되고, 이것은 리포터 올리고뉴클레오티드에 직접 인접하여 혼성화되며, 이 혼성화는 형광 공진 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의하여 검출된다.

바람직하게 분석에 타크만(TaqMan) 시험이 수행된다. 또한 바람직하게 전술한 바와 같이 라이트 사이클러 시험이 수행된다.

가장 바람직하게 프라이머에 부가하여 사용되는 올리고뉴클레오티드들은 3'-OH 작용기가 이용가능하지 않다. 또한, 리포터 올리고뉴클레오티드는 가장 바람직하게 적어도 하나의 형광 레벨을 갖는다.

특히 바람직하게 리포터 분자들은 형광의 증가나 감소에 의해 증폭을 나타내고, 또한 형광의 증가나 감소가 분석에 직접 사용되며, 분석되는 DNA의 메틸화 상태가 형광 신호로부터 추론된다.

특히 바람직한 본 방법의 변형으로서, 분석 및 부가적인 분석이 올리고머들이 배열에 대한 혼성화에 의해 수행되는 것이며, 상기 올리고머는 핵산 또는 PNA와 같은 혼성화 성질이 유사한 분자이다. 바람직하게, 상기 올리고머들은 분석되는 DNA에 이르는 12-22 염기의 긴 세그먼트에 의하여 혼성화되고 CG, TG, CA와 같은 디뉴클레오티드를 포함한다. 조사되는 DNA의 20개 이상의 메틸화 위치들의 메틸화 상태가 하나의 실험에서의 본 방법으로 바람직하게 검출되며, 가장 바람직하게는, 60개 이상의 메틸화 위치들이 검출된다.

바람직하게 부가적인 분석은 조사되는 증폭된 DNA의 길이를 측정함으로써 수행되고, 또한 이러한 길이 측정 방법은 겔 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 크로마토그래피(가령, HPLC), 질량분석법 그리고 다른 적당한 방법들을 포함한다.

특히 바람직하게 본 방법에서, 부가적인 분석이 시퀀싱에 의해 수행되고, 또한 시퀀싱에 대한 방법은 생거 방법(Sanger method), 맥삼-길버트 방법(Maxam-Gilbert method) 그리고 혼성화에 의한 시퀀싱(SBH)과 같은 다른 방법들을 포함한다. 또한, 바람직하게 시퀀싱(생거에 의한)이 개별적 프라이머 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 매번 각 CpG 위치들에 대하여 또는 이러한 위치들의 작은 그룹에 대하여 수행되며, 프라이머의 연장은 하나 또는 단지 몇개의 염기를 포함하고, 조사되는 DNA의 각각의 위치의 메틸화 상태는 프라이머 연장의 형태로부터 결정된다.

특히 바람직한 본 방법의 변형에서, 병의 존재나 환자의 또다른 의학적 상태가 조사되는 다양한 CpG 위치들에서 메틸화의 정도로부터 결정된다.

특별히 바람직한 방법으로, 증폭된 생성물은 그들의 검출을 위해 검출용 라벨이 부여된다. 이러한 라벨들은 질량분석계에서 검출할 수 있는 형광성 라벨들, 방사성 핵종 또는 제거가능한 질량 라벨들을 포함한다.

부가적으로, 프라이머들중 하나가 증폭에서 고체상에 결합되어 있는 것이 바람직하다.

또한 바람직한 일 변형으로, 증폭된 생성물들이 질량분석계에서 전체로서 검출되며 따라서 그들의 질량에 의해서 명확하게 특성화된다.

본 발명의 또 다른 주제는 상기 전술한 방법을 환자 또는 개체에 유해한 상태의 진단 및/또는 예측하는데 사용하는 것으로서, 상기 유해한 상태는 적어도 하기 범주 중 하나에 속한다: 이는 원치않는 약물 상호작용; 암 질병; CNS 비정상 기능, 손상, 또는 질병; 공격 증상 또는 행동장애; 뇌손상의 임상적, 심리적 및 사회적 장애; 심리적 장애 및 인격 장애; 치매 및/또는 관련 신드롬; 심혈관계의 질병, 비정상 기능 및 손상; 위장관계의 비정상기능, 손상 또는 질병; 호흡계의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 장해, 염증, 감염, 면역 및/또는 회복; 성장 과정 중 기형(불구)으로서의 신체의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 피부, 근육, 결체 조직 또는 뼈의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 내분비선 및 신진대사의 비정상 기능, 손상 또는 질병; 두통 또는 성적 비정상 기능.

부가하여, 상기 방법들은 바람직하게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법을 세포 형태나 조직을 식별하는데 또는 세포 파생을 조사하는데 사용된다.
또한 본 발명은 증폭된 생성물의 제조를 위한 중아황산염, 프라이머 및 3'-OH 작용이 없는 부가적인 올리고뉴클레오티드를 함유하는 시약, 및 경우에 따라 본 발명의 다양한 방법의 변형 중 적어도 하나를 수행하는데 필요한 지침서를 포함한다.

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다음의 실시예로서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

예 1 : MDR-1 유전자에서 PNA 블로킹 프로브(PCR 클램핑)를 사용한 MDR1 유전자의 메틸화-민감성 증폭.

a) 결합 사이트가 프라이머의 결합 사이트와 겹치지 않는 PNA 프로브(PNA 블로킹 프로브)를 사용한 메틸화-특이적 PCR

먼저, 중아황산염-처리 DNA에 대한 PCR조건이 특정되었으며, 이로써 PCR에 대한 PNA 블로킹 프로브의 대립유전자-특이적 영향이 인식될 수 있다. 이 첫번째 실험에서는, PNA와 프라이머간의 결합 사이트가 서로 겹치지 않는다.

우선적으로, AAAATGTGTT 배열의 11-mer PNA의 영향은 프라이머 TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG 와 TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC 로 시행한 PCR에서 테스트 되었다. PCR 반응에 대한 PNA의 영향은 어닐링 온도가 섭씨 55도인 표준 PCR 상태에서는 측정될 수 없었다. MDR-1 조각의 증폭에 사용된 표준 사이클러 프로그램은 다음의 프로그램 단계를 사용하였다.

1단계 : 온도=섭씨 96도 20분

2단계 : 온도=섭씨 96도 30초

3단계 : 온도=섭씨 56도 1분 15초

4단계 : 온도=섭씨 72도 2분

2단계에서 4단계까지 40회 수행.

5단계 : 온도=섭씨 72도 15분

6단계 : 섭씨 4도로 식혀서 온도 유지.

결과적으로, 프라이머 길이, 어닐링 온도, PNA 샘플 길이는 증폭의 대립유전자-특이적 억제를 이루기 위하여 최적화되어야 한다.

프라이머와 PNA들에 대한 최적의 어닐링을 가능하게 하기 위하여, 짧은 21-mer 프라이머 TAAGTATGTTGAAGAAAGATT 와 AATCCCCATAAACTTACCAAA는 긴 13-mer PNA AAAGACGTGTTAT로 테스트되었다. 부가적인 테스트는 단지 3'-말단에서 염기가 생략되었다는 점에서 상기 배열과 다른 18, 19, 20-mer 프라이머로 수행되었다. 21-mer 프라이머는 어닐링 온도를 다르게 하여 테스트되었다. 평행 배치(parallel batch)에, 비메틸화 대립유전자로부터 생산된 서열에 맞춰진 13-mer PNA AAAGACGTGTTAT 와 PNA AAAGATGTGTTAT를 20-100 pmol/㎕의 여러 농도로 부가하였다.

PCR에 대한 명백한 영향은 70 및 100 pmol/㎕의 농도로 PNA를 부가하고, 어닐링 온도 섭씨 49.4도와 섭씨 46.7도에서 관찰되었다. 효과는 18-mer 프라이머를 사용하였을 때 가장 명백하다.

낮은 신장 온도 섭씨 54도가 PNA들의 억제에 얼마나 많은 영향을 미치는 지를 조사하였다.

이러한 목적을 위해 PCR 배치에 50 및 70 pmol/ul의 농도의 상기-명명된 13-mer PNA들이나 양 13-mer PNA들의 각각이 함께 추가되었다. PCR의 명백한 억제가 PNA가 없는 양성 대조군과 비교되어 관찰되었다(도 2, 아가로스-겔 전기이동, 13-mer PNA 프로브에 대한 PNA들의 농도가 사용되었음; 주석: MDR 1-5 FM: 13-mer PNA AAAGACGTGTTAT; MDR 1-5 FU: 13-mer PNA AAAGATGTGTTAT). 상기 테스트로부터 테스트에 사용된 DNA들이 관심 위치에서 주로 비메틸화된 상태로 존재함을 명백히 확인할 수 있었으며, 이는 중아황산염 시퀀싱에 의해 확인되었다. 따라서, PNA 블로킹 프로브의 명백한 대립유전자 특이성이 본 실험에서 나타났으며, 이는 비메틸화 조각의 바람직한(우선적인)증폭을 도출한다.

b) 결합 사이트가 프라이머의 결합 사이트와 겹치는 PNA 프로브(PNA 블로킹 프로브)를 사용한 메틸화-특이적 PCR("프라이머 배제").

상기 실험에서, 증폭되는 지역의 대략적인 중심에 PNA 표적 서열이 위치되는 방식으로 프라이머가 선택되었다. 이 배열은 프라이머와 PNA 서열이 서로 인접해 있거나 겹쳐져 있을 때 더욱 민감하였다. 서열-특이적 PNA 결합의 경우에, 이러한 배열과 더불어, PNA의 영향은 보다 적은 PNA 농도에서도 관찰될 수 있다.

서열 TTATGTGAATTTTGAAAG 의 프라이머는 본 실험에서 선택되어 PNA 서열과 겹쳐진다(프라이머 배제). 양 13-mer PNA들인 AAAGACGTGTTAT 과 AAAGATGTGTTAT 은 3가지 다른 농도에서 반응 배치에 부가되었다.

PCR 반응의 완전한 억제는 25pmol/ul 의 농도에서도 얻어졌다. 앞선 실험에서는, PCR의 완전한 억제는 농도가 70pmol/ul에 도달했을 때만 양 PNA들의 부가로 인식될 수 있었다.

c) 비메틸화 DNA 에 대응하는 조각들에 의한 프라이머 배제

서열-특이적 결합의 검출을 위하여, 메틸화 상태가 비교적 잘 특징지워진 주형에 대한 PNA들의 영향이 부가적인 실험에서 조사되었다. 본 실험에서 사용된 주형 DNA는 중아황산염-처리된 완전히 비메틸화된 DNA에 대응되었다.

이것은 PCR에서 주형으로 사용되었다. 다음의 프로그램 단계가 이용되었다.

1단계 : 온도=섭씨 96도 20분

2단계 : 온도=섭씨 96도 30초

3단계 : 온도=섭씨 49도 1분 15초

4단계 : 온도=섭씨 54도 2분

2단계에서 4단계까지 36회 수행.

5단계 : 온도=섭씨 72도 15분

6단계 : 섭씨 4도로 식혀서 온도 유지.

상기와 같이 기술된 13-mer [PNA들]은 반응 배치에 대하여 3가지 다른 농도에서 부가되었다. 이러한 비메틸화된 주형의 경우에서, 이러한 주형에 적응된 PNA MDR 1-5-FU(3)가 MDR 1-5-FM(3)보다 명백하게 강력한 영향력을 가질 것이라고 생각될 수 있다. 도 3(주석에 대하여는 도 2 참조)에는 비교적 낮은 PNA 농도의 경우에서도 이것이 사실이라는 것을 보여준다.

이러한 결과들은 PCR 반응의 억제가 PNA들의 특이적 결합에 인하여 메틸화-특이적 증폭을 가능하게 한다는 것을 보여준다. MDR-1에 상보적이지 않은 PNA들을 사용한 대조 실험에서, 이것들은 문제의 농도에서 PCR에 대한 어떠한 주목할만한 영향력도 행사하지 못함을 볼 수 있다(도시되지 않음).

예 2 : GSTpi 유전자 조각의 메틸화-민감 확대

GSTPi 유전자의 특정 CpG 위치들은 전립선 암에 대한 종양 마커로서 확인되었다. 본 실험들에서 선택된 한 쌍의 프라이머들, GGAAAGAGGGAAAGGTTTT 과 TACTAAAAACTCTAAACCCCAT 에서, 하나의 프라이머는 PNA 배열 CCCCGAAAACGCG (또는 CCCTGAAAATGTG) 을 정확하게 묶도록 한 곳에 위치한다. PNA 배열은 MDR1 조각에 사용되는 그러한 PNA들에 구별되는 세 개의 관련된 CpG 위치들을 포함한다. GSTPi 조각들의 관련된 CpG들은 "보통의" 비메틸화된 DNA, 말하자면, 종양 환자들로부터 유래되지 않는 DNA 에 존재한다. 반응 배치에 주어지는 서열 CCCTGAAAATGTG 의 PNA "GSTP-down"은 따라서 PCR 반응에 대하여 인식할 수 있는 영향력을 가지게 되나, 대응하는 PNA "GSTP-up" CCCCGAAAACGCG 는 그렇지 아니하다.

PNA "GSTP-down" 은 시험 배치에 대하여 세가지 다른 농도로 부가되었다. 어닐링 온도의 차이도 테스트되었다.

본 실험들의 결과들은 도 4에서 나타내었다. PCR에 대한 가장 강력한 억제는어닐링 온도 섭씨 55도에서 PNA (GSTP-down) 의 부가에 의한 것으로 결정되었다. (PNA 의 부가가 없는) 양성 대조와 비교하여, PCR 반응이 20[p]mol/㎕ 의 농도에서 PNA의 부가에 의하여 현저하게 억제될 수 있었다는 것이 인식되었다.

이후 PNA들 "GSTP-up"과 "GSTP-down"의 원래 샘플에서의 비메틸화된 DNA와 전립선 종양 조직으로부터 유래된 메틸화된 DNA를 주형으로 한 증폭에 대한 영향이서열-특이적성(따라서 최종 분석에서는, 메틸화-민감) 결합을 검출하도록 비교되었다.

비메틸화된 DNA와 전립선 DNA가 PCR에서 주형으로서 이용되었다. PNA들 "GSTP-up"과 "GSTP-down"는 반응 배치에 대하여 세가지 다른 농도로 부가되었다.

"GSTP-down" PNA의 부가는 다운-비메틸화 주형에 대하여 가시적인 영향을 나타내었다: PCR은 PNA가 70 pmol/㎕ 의 농도에서 부가되었을 때 완전하게 억제되었다. PNA "GSTP-up" 의 부가의 경우, 반면에, PCR에 대한 PNA의 억제적 영향이 매우 약한 것으로 나타났다.

전립선 조직의 시험 DNA에 대한 "GSTP-up" PNA 의 부가는, 그러나, PCR를 상당한 정도로 억제하는 영향을 나타내었다(도 5 참조). 20pmol/㎕ 의 농도에서의 PNA의 부가는 PCR을 명백하게 억제시켰다. PCR에 대한 완벽한 억제는 50pmol/㎕ 의 농도에서 PNA의 부가로 결정될 수 있다. 반면, 전립선 DNA에 대한 "GSTP-down" PNA의 부가는 명백하게 적은 영향력을 나타내었다. 70pmol/㎕의 농도에서의 PNA의 부가도 PCR을 완벽하게 억제하지 못했다.

본 실험들은, 블로킹 올리고머 프로브에 의하여, 지정된 위치들에서 메틸화된 또는 비메틸화된 대립유전자들의 증폭을 선택적으로 억제하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 본 발명에 있어서, 각각의 위치들은 한정자 위치들로 기능 하는데, 다시말해, 배경 DNA의 원치않는 메틸화된 주형의 증폭을 선택적으로 억제할 수 있다.

예 3: GSTPi 유전자의 예에 대한 메틸화-특이적 방식으로 PCR을 억제하는 프로브의 사용에 대한 다른 가능성.

도 6은 주어진 주형 서열에 대하여 메틸화-민감하게 적용하기 위해 프라이머들을 어떻게 배열하는지에 대한 다양한 가능성들을 보여준다. 설명을 위하여, 도 6a는 중아황산염 처리 후에 존재하는 주형들을 보여준다: 본래적으로 메틸화된 DNA 샘플에 대응하는 DNA 1 과 본래적으로 비메틸화된 DNA 샘플에 대응하는 DNA 2.

도 6b는 대립유전자-특이적 PCR 또는 메틸화-특이적 PCR (MSP)의 의미에서 프라이머들중 하나의 배열을 보여준다. 이 경우에서, 단지 메틸화된 DNA 1의 증폭만이 도시된 프라이머의 사용으로 발생될 수 있다.

도 6c와 6d는, 상응하게 축퇴 위치들 (6c) 이나 도 6d의 보편적 염기(여기서는, 이노신)의 사용에 의하여, 어떻게 비메틸화-특이적 프라이머들이 사용될 수 있는지 보여준다.

도 7은 주어진 주형 서열의 경우에서 프라이머들과 프로브들("블로커들")이 어떻게 메틸화-민감성 증폭의 의미로 배열될 수 있는지에 대한 다양한 가능성들을 나타낸 것이다. 이러한 예들에서, 사용되는 프라이머들은 그 자체은 메틸화-특이적이 아니며, 단지 프로브들("블로커들")에 의하여 메틸화 특이성이 이루어지는 것이다. 특정 프로브들은 매번 DNA 1과 DNA 2에 대한 블로커로서 이용된다.

도 7a에서 프라이머들과 프로브들은 겹치지는 않으나, 프로브는 프라이머의 3' 말단에 직접적으로 연결되어 있다. 도시된 프로브는 증폭에서 그 자체로 연장될 수 없는, 3' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 유사하게, PNA들이 또한 사용될 수 있으나, 이 예에서는 더 짧아야 하고, 그들의 융해점에 대응한다. 도 7b에서는 동일한 프라이머가 사용되나, 여기서 DNA 프로브는 프라이머와 겹친다(프라이머 배제).

도 7c 와 7d에서, 축퇴 위치들로 제공되는 프라이머와 메틸화-특이적 프로브가 겹친다. 보편적인 염기들은 프라이머들에서 또한 유사하게 사용될 수 있다.

프로브가 사용되는 도 8에서도 유사하게 정방향과 역방향 프라이머들이 도시되는 예가 제시되는데 어느 프라이머도 겹치지는 않는다.

이러한 예들은 분석되는 DNA와 비교하여 배경 DNA를 억제하기 위하여 올리고머 프로브들이 어떻게 메틸화-특이적 증폭에 사용될 수 있는지에 대한 다양한 가능성을 예시한다. 그러나, 본 발명의 범위는 본 예에서 기술되는 실시예에 한정되지 않을 것이다.

예 4 : 비메틸화된 그리고 메틸화된 DNA의 제조 및 중아황산염 처리

메틸화된 DNA를 제조하기 위하여, 제조자의 지시에 따라 인간 게놈 DNA를 S-아데노실메티오닌과 CpG 메틸라제(SssI, 뉴 잉글랜드 생물연구소)로 처리하였다. 비메틸화된 DNA를 제조하기 위하여, 인간 게놈 DNA로부터 유전자 조각 ELK-1을 프라이머 GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA(배열 ID: 1)와 AGGTGGTGGTGGCGGTGG(배열 ID: 2)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 이렇게 얻어진 비메틸화된 그리고 메틸화된 DNA 및 인간 게놈 DNA을, 5-위치에서 메틸화된 시토신들은 그대로 있는 반면에, 베이스의 5-위치에서 메틸화되지 않은 모든 시토신들은 그것의 베이스-페어링 행동에서 다른 베이스가 형성되도록 변형되도록, 중아황산염(아황산수소, 이아황산염)으로 처리하였다. 만일 중아황산염이 0.1몰에서 6몰의 농도 범위에서 반응에 사용된다면, 비메틸화된 시토신 베이스들에서는 부가가 일어난다. 또한, 라디컬 트랩과 더불어 변성 시약이나 용매가 있어야 한다. 뒤이은 알카리성 가수분해는 비메틸화된 시토신 뉴클레오베이스들을 우라실로 변환시킨다. 이렇게 변환된 DNA는 메틸화된 시토신들을 검출하는 목적으로 이용된다.

예 5: Cy5-레벨 유전자 프로브의 준비

중아황산염 처리된 DNA 샘플을 시작으로, ELK-1 유전자의 프로모터 영역으로부터 595bp의 길이의 한정된 조각이 증폭되었다. 상기 증폭은 프라이머 올리고뉴클레오티드 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT(배열 ID: 3)와 TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT (배열 ID: 4)로 수행되었다. 형광 염색체 Cy5로 라벨된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 상기 조각은 PCR에서 직접적으로 라벨되었다. 중아황산염 처리된 (1)비메틸화된 DNA, (2)메틸화된 DNA 또는 (3)인간 게놈 DNA를 매트릭스 DNA로 사용하였다. 이후 이러한 세가지 다른 DNA 조각들을 특정 CpG 위치에서 메틸화의 정도에 대하여 별도의 혼성화 반응에서 조사하였다.

예 6: 혼성화의 수행과 혼성화 DNA "칩"의 평가

예 5에서 준비된 유전자 프로브들은 DNA 칩에서 혼성화되었다. 올리고뉴클레오티드들은 칩에 미리 고정되었다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 예 2에서 명명된 유전자 ELK-1의 증폭된 조각으로부터 얻어지며, 그들의 직접 인접을 포함하여, CG 디뉴클레오티드들을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드들의 길이는 14-22개의 뉴클레오티드에 달하며, 올리고뉴클레오티드내의 CG 디뉴클레오티드의 위치는 가변적이다. 혼성화 후에, DNA 칩은 스캔되며(도 1 참조), 혼성화 신호들은 수적으로 평가된다(데이터는 도시되지 않음). 올리고뉴클레오티드 CTACTCAACGAAAACAAA(배열 ID: 5)와 CTACTCAACAAAAACAAA(배열 ID: 6)에 대한 혼성화 결과들이 도 1에 도시되었다. 여기서 CTACTCAACGAAAACAAA(배열 ID: 5)는 증폭된 생성물의 103 위치에서 발견된 ELK-1 조각의 시토신이 메틸화되었다면 양호하게 혼성화되고, 이러한 시토신이 비메틸화된다면 CTACTCAACAAAAACAAA(배열 ID: 6)가 혼성화된다.

도 1에는 프로모터 조각과 교잡된 후의 DNA 칩이 도시된다. 유사색깔 이미지가 스캐닝 이후 생성된다. 본 도면에서는 흑백을 도시되었으나, 스캐너에 의해 칼라 그림이 만들어진다. 상이한 칼라들의 강도가 혼성화의 정도를 나타내며, 혼성화의 정도는 빨간색(도 1에서 밝은 지점으로 인식될 수 있는)에서 파란색(도 1에서 어두운 지점으로 인식될 수 있는)으로 변함에 따라 줄어든다.

예 7: 주형 DNA의 제조와 GSTp1 PCR의 생성

말초 혈액으로부터 체외에서 효소에 의해 메틸화된 미처리 인간 DNA(프로메가, 메디슨 [위스콘신] 미국)를 중아황산염 처리하고, 주형 DNA로 사용하였다. 모든 CG 디뉴클에오티드를 메틸화하기 위하여, 반응 부피 150㎕내의 6㎍의 DNA를 제조자의 지시에 따라 SssI(뉴잉글랜드 생물연구소, 프랑크푸르트/본부)와 반응시켰다. 중아황산염 처리는 공지된 방법에 따라 수행하였다(올렉 A, 오스왈드 J, 왈터 J. 중황산염에 기초한 시토신 메틸화 분석에 대한 변형되고 진보된 방법. 핵산. 1996. 12. 15; 24 (24: 5064-6)).

기탁 번호 M24485.1 내의 153-bp GSTp1 조각(위치 1242-1393)은 다음의 PCR 조건(섭씨 95도 - 15분; 46회: 섭씨 96도 - 45초, 섭씨 52도 - 45초, 섭씨 72도 - 20분; 섭씨 72도 - 10분)(도 9 및 10 참조)하에서 25㎕의 반응 부피(1x 반응 버퍼, Qiagen; HotstarTag의 1 U, Qiagen; 각 dNTP의 200uM, 각 프라이머의 500nM, 중아황산염 처리된 주형 DNA의 0.05-10ng)내에서 중아황산염-DNA 특이적 프라이머 2cf GTTTT (CT) GTTATTAGTGAGT와 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC로 증폭되었다. GSTp1 조각들의 시퀀싱에 의하여, 말초 혈액으로부터의 인간 DNA가 이러한 조각에 대하여 어떠한 메틸화된 CG 디뉴클레오티드도 갖지 않음을 확인할 수 있었다. 반면에, SssI-처리된 DNA에서 모든 CG 디뉴클레오티드들은 메틸화된 형태로 존재한다(도 9 참조). GSTp1 조각의 시퀀싱 결과, 공개된 배열에 대비하여(Genbank 번호 M24485.1), GSTp1 유전자내에 부가적인 G 뉴클레오티드가 존재한다(Genbank 번호 M24485.1 내의 위치 1273과 1274 사이; GSTp1 PCR 조각내의 위치 33, 도 9 참조)는 다른 결과들을 확인할 수 있었다(예, WO 99/55905 참조). PCR 효율에 관하여, CpG-메틸화와 CpG-비메틸화 주형 DNA 사이에는 차이가 없다(도 10 참조).

예 8: 메틸화된 GSTp1 조각들의 선택적인 증폭

메틸화된 GSTp1 조각들의 선택적인 증폭에 대한 실험적 디자인은 도 11에 도식적으로 나타내었다. 비메틸화된 주형 DNA에 대한 프라이머 2cf GTTTT (CT) GTTATTAGTGAGT와 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC로의 GSTp1 조각의 증폭은, 그 서열이 비메틸화된, 중아황산염-처리된 DNA 에 대응하는 2개의 블로커 올리고뉴클레오디드들(B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P; B15+17RT11, TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P, 도 11 참조)로 저지되었다. 이러한 올리고뉴클레오디드들은 PCR 동안 그들의 신장을 방지하기 위하여 인산기에 의하여 3' 말단에서 변형되었다. PCR은 25㎕의 반응 부피에서 다음의 사이클러 프로그램(섭씨 95도 - 15분; 46회: 섭씨 96도 - 45초, 섭씨 52도 - 45초, 섭씨 72도 - 20분; 섭씨 72도 - 10분)에 의하여 수행되었다. PCR 배치는 다음으로 구성되었다: 1x 반응 버퍼(Qiagen, Hilden) HotstarTag의 2 U(Qiagen, Hilden); 각 dNTP의 200uM, 각 프라이머의 500nM, 각 블로커(B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P; B15+17RT11, TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P)의 10um, 중아황산염 처리된 주형 DNA의 20ng-20pg. 이러한 PCR 조건에서, 25㎍의 비메틸화된 주형 DNA와 관련된 GSTp1 조각의 확대를 완전히 억제하는 것이 가능했다(도 12A, 8줄 참조). 상기 PCR이 블로커 올리고뉴클레오티드들 없이 수행된 경우, GSTp1 조각은 증폭되었다(도 12D, 8줄 참조). 반대로, 100pg의 메틸화된 주형 DNA에 대하여, 블로커 올리고뉴클레오티드들이 있을 때와 없을 때, 동일한 PCR 조건에서 GSTp1 PCR 생성물이 탐지될 수 있다(도 12C, 7줄; 12F 7줄 참조). 따라서, PCR의 절대 민감도는 적어도 100pg의 메틸화된 주형 DNA에 놓여있다.

PCR의 상대 민감도를 조사하기 위하여, 메틸화된 주형 DNA에 대한 비메틸화된 주형 DNA의 비율이 1:1-1000인 비메틸화된 주형 DNA와 메틸화된 주형 DNA의 혼합물을 준비하였다. 이러한 DNA 혼합물을 준비하기 위하여, 말초 혈액으로부터의 인간 DNA(프로메가, 메디슨 [위스콘신] 미국)를 수득될 비율에 상응하게 SssI-처리 DNA와 혼합되고(도 7 참조), 중아황산염 처리하였다. 이러한 주형 DNA 혼합물(전체 DNA의 25㎍)에 대해 블로커 올리고뉴클레오티드들의 존재 및 비존재하에 PCR을 수행하고 그 결과를 도 12A, B 또는 도12D, E에 도시하였다. 여기에서 메틸화된 GSTp1 유전자의 하나의 복제물이 비메틸화된 GSTp1 유전자의 200개의 복제물의 배경에서 재현성 있게 검출될 수 있음을 알 수 있었다(도 12A, 6줄, B, 6줄 참조). 1:1000 의 상대민감도가 PCR 조건의 추가적 최적화에 의해 달성될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 12B, 7줄 참조).

블로커와 함께(도 12A, 6줄 참조) 또는 블로커 없이(도 12D 6줄 참조) DNA 혼합물(1:200, 메틸화된 DNA에 대한 비메틸화된 DNA의 비율)로부터 증폭된 PCR 생성물의 배열 분석들은 예상된 결과들을 보여준다. 블로커가 없을 때 PCR에서 생성된 PCR 생성물은 비메틸화된 GSTp1 유전자에 대응하며, 반면에, 블로커 올리고뉴클레오티드가 있을 때 PCR에서 생성된 GSTp1 유전자 조각은 메틸화된 후생적 상태를 가졌다.

ddNTP나 부가적인 뉴클레오티드들 같이, 대응하는 GSTp1 뉴클레오티드 배열에 대응할 수 없는, 다른 3' 변형은 또한 성공적으로 테스트되었다.

예 9: 라이트사이클러(LightCycler)에 대한 메틸화된 GSTp1 조각들의 선택적 증폭

라이트사이클러(로쉬)는 PCR 수행 및 PCR 생성물의 검출 및 분석을 동시에 수행하는 기기이다. 상기 기기는 사용자의 지시에 따라 조작되었다. PCR의 양적 그리고 질적인 분석은 라이트사이클러 소프트웨어 버전 3.5로 수행되었다.

메틸화된 GSTp1 유전자 조각들의 선택적 증폭은 다음의 사이클러 프로그램: 섭씨 95도 - 15분; 46회: 변성 섭씨 96도 - 4초, 어닐링 섭씨 52도 - 30초; 신장 섭씨 52도 - 30초에서, 10㎕의 반응 부피(1x 반응 버퍼(Qiagen, Hilden) HotstarTag의 5 U(Qiagen, Hilden); 각 dNTP의 200μM, 각 프라이머(2cf GTTTT (CT) GTTATTAGTGAGT; 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC)의 625nM, 4μM 블로커(B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P; B15+17RT11, TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P), 0.25㎍/㎕ BSA(시그마, 뮌헨), 250nM 앵커 뉴클레오티드(GSTp1-Fluo, TTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT-플루오레세인; TibMolBiol, 베를린), 250nM 교잡성 프로브(GSTp1-red 705, red 705-GTATTAGGTTTGGGTTTTTGGT-P; TibMolBiol, 베를린, 그리고/또는 GSTp1-red 650, red 650-TAGTGTTAGGTTCGGGTTTTCGG-P; TibMolBiol, 베를린), 주형 DNA의 20ng-200pg)에서 수행되었다. 검출은 각 증폭사이클에서 어닐링 단계 이후 10초에서 유전자-특이적과 메틸화-특이적 라이트사이클러 검출 프로브를 사용하여 수행되었다. 메틸화-특이적 프로브들 GSTp1-red 705나 GSTp1-red 650 중의 하나와 더불어 메틸화-비특이적 앵커 프로브, GSTp1 Fluo가 PCR 조각과 혼성화될 때, GSTp1-PCR 조각이 검출되었다.

검출 프로브들의 메틸화 특이성을 체크 하기 위하여, 중아황산염-처리된 메틸화된 그리고 비메틸화된 주형 DNA의 각 15ng이 라이트사이클러에서 증폭되었다. 검출을 위하여, PCR은 앵커 프로브 GSTp1-Fluo와 혼성화 프로브들 GSTp1-red 705와 GSTp1-650의 동등한 몰의 혼합물을 포함했다. 프로브의 형광성은 메틸화된 GSTp1 유전자, GSTp1-650에 대하여 라이트사이클러의 F2/F1 검출 채널에서 측정되었고, 반면에, 비메틸화된 GSTp1 유전자, GSTp1-705는 F3/F1 채널에서 검출되었다(도 13참조). 상기 실험은 GSTp1-red 650이 메틸화된 GSTp1 유전자를 특별히 검출하고, 비메틸화된 버전은 형광성 신호를 발생시키지 못한 것을 보여주었다(도 13A 참조). 프로브 GSTp1-red 705는, 반면에, 비메틸화된 그리고 메틸화된 GSTp1 유전자를 검출하나, 상당히 줄어든 효율로 후자를 검출하였다(도 13B 참조).

메틸화된 GSTp1 조각의 증폭의 절대 그리고 상대 민감도들은 예 8과 유사하게 조사되었다. 절대 민감도의 결정을 위하여, GSTp1-PCR은 블로커 뉴클레오티드가 있을때와 없을때 라이트사이클러에서 메틸화되고 중아황산염-처리된 다양한 주형 DNA의 양에서 수행되었다. "앵커" 프로브에 부가하여, 혼성화 프로브, GSTp1-red 650이 검출을 위하여 사용되었다. 상기 결과는 도 14에 나타난다. "크로싱 포인트(crossing points)"의 계산은 라이트사이클러 버전 3.5에 의하여 생성되고 PCR 싸이클의 횟수를 가리키며, GSTp1-PCR 생성물은 음성 대조보다 높은 신호로 처음으로 검출될 수 있었다. "크로싱 포인트" 값이 낮을 수록, GSTp1 조각의 증폭이 더 효율적이라는 것을 의미한다. 만일 "크로싱 포인트"가 지시되지 않으면, 이것은 어떠한 PCR 생성물도 검출될 수 없음을 의미한다. 보여진 실험에서, 블로커의 존재시에도, GSTp1이 메틸화된 중아황산염-처리된 주형 DNA의 75pg으로 증폭될 수 있었다(도 14 참조).

상대 민감도의 결정을 위해, GSTp1의 PCR은 블로커 올리고뉴클레오티드들과 함께 또는 없는 경우의 주형 DNA 혼합물들의 20ng(예 8 참조)에 대해 수행되었다(도 15). 검출을 위하여, PCR은 "앵커" 프로브 GSTp1-Fluo와 혼성화 프로브들 GSTp1-red 705와 GSTp1-650의 동등한 몰의 혼합물을 포함한다. 메틸화된 GSTp1 유전자, GSTp1-650에 대한 프로브의 형광성은 라이트사이클러의 F2/F1 검출 채널에서 측정되었고, 반면에, 비메틸화된 GSTp1 유전자, GSTp1-705에 대한 프로브는 F3/F1 채널에서 검출되었다.

결정된 "크로싱 포인트"는 블로커 올리고뉴클레오티드가 있는 PCR에서, 메틸화된 GSTp1 유전자의 하나의 복제물이 비메틸화된 GSTp1 유전자의 500개의 복제물의 배경에서 재현성 있게 검출될 수 있다는 것을 보여준다(도 15 참조, "로터 위치" 17, F2/F1 열). 이것은 40pg의 메틸화된 주형 DNA의 절대 민감도에 대응한다. 블로커 올리고뉴클레오티드들이 없을때, 단지 1:10의 상대 민감도가 얻어질 수 있었다(도 15 참조, "로터 위치" 3, F2/F1 열). 동일한 조건에서, 15ng의 비메틸화된 중아황산염-처리된 주형 DNA로부터의 GSTp1 유전자의 증폭은 완전히 억제되었다(도 15 참조, "로터 위치" 19, F3/F1 열).

예 10: TaqMan 상에서의 메틸화된 GSTp1 조각들의 선택적 증폭

TaqMan(Applied Biosystems, Weiterstadt)은 PCR의 수행 및 PCR 생성물의 검출 및 분석을 동시에 수행하는 또 다른 기기이다. 상기 기기는 사용자의 지시에 따라 조작되었다. PCR의 양적 그리고 질적인 분석은 TaqMan 소프트웨어로 수행되었다.

메틸화된 GSTp1 유전자 조각들의 선택적 증폭은 다음의 사이클러 프로그램: (섭씨 95도 - 10분; 3회: 변성 섭씨 96도 - 15초, 어닐링 섭씨 60도 - 60초;3회: 변성 섭씨 96도 - 15초, 어닐링 섭씨 58도 - 30초; 신장 섭씨 60도 - 30초;3회: 변성 섭씨 96도 - 15초, 어닐링 섭씨 55도 - 30초; 신장 섭씨 60도 - 30초;40회: 변성 섭씨 96도 - 15초, 어닐링 섭씨 52도 - 30초; 신장 섭씨 60도 - 40초)에서, 20㎕의 반응 부피(1x 반응 버퍼(Applied Biosystems); AmplitaqGold의 2 U(Applied Biosystems); 3.5 mM MgCl₂, 각 dNTP의 400μM, 각 프라이머(2cf GTTTT (CT) GTTATTAGTGAGT; 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC)의 500nM, 7.5μM 블로커 1(B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P), 7.5μM 블로커 2(B15+17RT19, TAAACCCCCCATCCCAAATCTC-P), 450nM TaqMan 프로브(Taq1, Blackhole-TAATTCGTAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGGTAGGG-FAM; Biosearch Technologies), 10ng의 주형 DNA)에서 수행되었다. 검출은 각 확대 싸이클에 대하여 신장 단계 후에 유전자-특이적 TaqMan 프로브들에 의해 수행되었다.

상대 민감도를 결정하기 위하여, GSTp1의 PCR은 블로커 올리고뉴클레오티드들이 있는 또는 없는 주형 DNA 혼합물들의 10ng(예 8 참조)에 의하여 수행되었다(도 16). "문턱 싸이클(threshold cycle)"의 계산은 TaqMan 소프트웨어에 의하여 수행되고, GSTp1-PCR 생성물이, 라이트사이클러의 "크로싱 포인트"의 값과 비교할 수 있는, 음성 대조보다 높은 신호로 처음으로 검출되는 PCR 싸이클의 횟수를 부여한다. "문턱 싸이클" 값이 낮을 수록 GSTp1 조각의 증폭이 더 효율적이라는 것을 의미한다.

결정된 "문턱 싸이클"값은 블로커 올리고뉴클레오티드가 있는 PCR에서, 메틸화된 GSTp1 유전자의 하나의 복제물이 비메틸화된 GSTp1 유전자의 200개의 복제물의 환경에서 검출될 수 있다는 것을 보여주었다(도 16 참조). 이것은 50pg의 메틸화된 주형 DNA의 절대 민감도에 대응한다. 동일한 조건에서, 10ng의 비메틸화된 중아황산염-처리된 주형 DNA로부터의 GSTp1 유전자의 증폭은 완전히 억제되었다(도 16 참조).

도면의 설명:

도 10: GSTp1 PCR 조각들의 아가로스 겔. PCR은 10ng, 5ng, 1ng, 0.5ng, 0.1ng의 메틸화된(A) 그리고 비메틸화된(B) 중아황산염-처리된 주형 DNA로 수행되었다.

도 11: 프라이머들과 블로커 올리고뉴클레오티드들의 위치와 더불어 GSTp1 조각의 배열

도 12: GSTp1 PCR 조각들의 아가로스 겔. 메틸화된 GSTp1 유전자(A, B, C, D)의 확대의 상대 민감도와 메틸화된 GSTp1 유전자의 확대의 절대 민감도(C, F)가 분석되었다. GSTp1 PCR들은 블로커 올리고뉴클레오티드가 있을때(A, B, C)와 블로커 올리고뉴클레오티드가 없을때(D, E, F) 수행되었다. 다음은 주형 DNA로 사용되었다: 20ng의 메틸화된 중아황산염-처리된 DNA(A1, B1, D1, E1, C1, F1, C2, F2)와 20ng의 비메틸화된 중아황산염-처리된 DNA(A8, B8, D8, E8); 메틸화된 그리고 비메틸화된 중아황산염-처리된 DNA로서 혼합 비율 1:2(A2, B2, D2, E2), 혼합 비율 1:10(A3, B3, D3, E3), 혼합 비율 1:20(A4, B4, D4, E4), 혼합 비율 1:100(A5, B5, D5, E5), 혼합 비율 1:200(A6, B6, D6, E6), 혼합 비율 1:1000(A7, B7, D7, E7); 10ng(C3, F3), 2ng(C4, F4), 1ng(C5, F5), 0.2ng(C6, F6), 0.1ng(C7, F7), 0.02ng(C8, F8)의 메틸화된 중아황산염-처리된 DNA와 DNA 아닌것(A9, D9).

도 13: 검출 프로브들의 메틸화 특이성의 분석. 본 도면은 혼성화 프로브 GSTp1-red 650 (A) 또는 GSTp1-red 705 (B)로 검출된 메틸화된 중아황산염-처리된 DNA(직선)와 비메틸화된 중아황산염-처리된 DNA(점선)의 GSTp1 PCR 동안 형광성에 대한 과정을 보여준다.

도 14: 라이트사이클러에서 GSTp1 PCR의 절대 민감도의 결정. GSTp1 PCR 블로커 올리고뉴클레오티드가 있을때("로터 위치" 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18)와 블로커 올리고뉴클레오티드가 없을때("로터 위치" 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 17) 수행되었다. 다음은 주형 DNA로 사용된 것들이다: 메틸화된 중아황산염-처리된 DNA: 7.5ng ("로터 위치" 1, 9), 3.7ng ("로터 위치" 2, 10), 0.75ng ("로터 위치" 3, 11), 0.37ng ("로터 위치" 4, 12), 0.75ng ("로터 위치" 5, 13), 0.37ng ("로터 위치" 6, 14), 0.015ng ("로터 위치" 7, 15), 0.0075ng ("로터 위치" 8, 16), DNA 아닌것 ("로터 위치" 17, 18).

도 15: 메틸화된 GSTp1 유전자의 확대의 상대 민감도 결정. 메틸화된 GSTp1 유전자의 증폭은 라이트사이클러로 수행되었다. 검출은 혼성화 프로브 GSTp1-red 650 (F2/F1, 크로싱 포인트)와 GSTp1-red 705 (F3/F1, 크로싱 포인트)로 지시되었다. GSTp1 PCR은 블로커 올리고뉴클레오티드("로터 위치" 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20)가 있을때와 블로커 올리고뉴클레오티드("로터 위치" 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10)가 없을때 수행되었다. 다음은 주형 DNA로 사용된 것들이다: 15ng의 메틸화된 중아황산염-처리된 DNA("로터 위치" 1, 11)와 15ng의 비메틸화된 중아황산염-처리된 DNA("로터 위치" 10, 20), 메틸화된 그리고 비메틸화된 중아황산염-처리된 DNA로서 혼합 비율 1:2("로터 위치" 2, 12), 혼합 비율 1:10("로터 위치" 3, 13), 혼합 비율 1:20("로터 위치" 4, 14), 혼합 비율 1:100("로터 위치" 5, 15), 혼합 비율 1:500("로터 위치" 7, 17), 혼합 비율 1:1000("로터 위치" 18), DNA 아닌것("로터 위치" 10, 20).

도 16: 메틸화된 GSTp1 유전자의 확대의 상대 민감도 결정. 메틸화된 GSTp1 유전자의 확대는 TaqMan에 의하여 수행되었다.

<시퀀스 리스팅>

<110> Epigenomics AG

<120> Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns

시토신 메틸화 감지를 위한 매우 정확한 방법.

<130> E01/1289/WO

<160> 17

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1<211> 24<212> DNA<213> Artificial

<400> 1

gctctatggt cttgtctaac cgta 24

<210> 2<211> 18<212> DNA<213> Artificial

<400> 2

aggtggtggt ggcggtgg 18

<210> 3<211> 28<212> DNA<213> Artificial

<400> 3

atggttttgt ttaatygtag agttgttt 28

<210> 4<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<400> 4

taaacccraa aaaaaaaaac ccaatat 27

<210> 5<211> 18<212> DNA<213> Artificial

<400> 5

ctactcaacg aaaacaaa 18

<210> 6<211> 18<212> DNA<213> Artificial

<400> 6

ctactcaaca aaaacaaa 18

<210> 7<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<400> 7

gttttctgtt attagtgagt a 21

<210> 8<211> 35<212> DNA<213> Artificial

<400> 8

taattcgtag tattaggttc gggttttcgg taggg 35

<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial

<400> 9

gttttctgtt attagtgagt 20

<210> 10<211> 18<212> DNA<213> Artificial

<400> 10

tcctaaatcc cctaaacc 18

<210> 11<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<400> 11

gtgagtatgt gtggtttgtg t 21

<210> 12<211> 22<212> DNA<213> Artificial

<400> 12

taaaccccca tcccaaatct ca 22

<210> 13<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<400> 13

taaaccccca tcccaaatct c 21

<210> 14<211> 22<212> DNA<213> Artificial

<400> 14

gtgagtatgt gtggtttgtg tt 22

<210> 15<211> 22<212> DNA<213> Artificial

<400> 15

gtattaggtt tgggtttttg gt 22

<210> 16<211> 23<212> DNA<213> Artificial

<400> 16

tagtattagg ttcgggtttt cgg 23

<210> 17<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<400> 17

tttagagttt ttagtatggg gttaatt 27

서열목록 전자파일 첨부

Claims

DNA 샘플에서 다음의 단계들에 의해 행해지는 시토신 메틸화 검출방법.

(1) 조사 대상의 DNA와 배경 DNA를 포함하는 게놈 DNA 샘플을 모든 비메틸화된 시토신 염기가 우라실로 변환되면서 5-메틸시토신염기는 그대로 변하지 않은 상태로 남아 있도록 화학처리하는 단계;

(2) 화학적으로 처리된 DNA 샘플을 2개 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드, 폴리머라아제, 및 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머를 사용하여 증폭하는 단계로서, 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 배경 DNA에 우선적으로 결합하며 그 증폭에 반대로 영향을 주고, 이로써 조사 대상의 DNA가 주형(template)으로서 배경 DNA에 우선하여 증폭되는 단계; 및

(3) 증폭된 생성물을 분석하고, 조사 대상의 DNA 중의 메틸화 상태를 증폭된 생성물의 존재, 또는 부가적인 위치들의 분석, 또는 증폭된 생성물의 존재 및 부가적인 위치들의 분석으로부터 결정하는 단계.
제1항에 있어서, DNA 샘플이 개체의 혈청 또는 다른 체액으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, DNA 샘플이 세포선, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 뇌척수액, 파라핀 중에 매입된 조직으로서, 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 가슴 또는 간 조직, 조직학적 슬라이드 및 그의 모든 가능한 결합물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 화학적 처리는 중아황산염(=이아황산염, 수소아황산염)으로 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제4항에 있어서, 화학적 처리가 아가로스(agarose)에 DNA를 매입한 후에 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제4항에 있어서, DNA 이중나선 변성 시약, 또는 유리기 트랩, 또는 DNA 이중나선 변성 시약 및 유리기 트랩이 화학적 처리중에 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머의 결합 사이트가 배경 DNA에 대한 프라이머들의 결합사이트들과 겹치고, 부가적인 올리고뉴클레오티드가 배경 DNA에 대한 상기 하나 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 2개 이상의 다른 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 사용되며, 이때 그들의 결합사이트는 다시 배경 DNA에 대한 프라이머의 결합사이트와 매번 겹쳐지고, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 배경 DNA에 대한 양자의 프라이머 올리고머의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제8항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머 중 하나는 정 프라이머의 결합을 저지하고 다른 하나는 역 프라이머의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 프라이머 올리고뉴클레오티드에 비해 5배 이상의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 배경 DNA에 결합하여 결국 폴리머라아제 반응속에서 프라이머 올리고뉴클레오티드의 완전한 신장을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제11항에 있어서, 사용된 폴리머라아제는 5'-3' 익소뉴클레아제 활성을 가지고 있지 않은 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제11항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드가 5' 말단에서 변형된 상태로 존재하여 5'-3' 익소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제에 의해 분해되지 않는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 프라이머들에 부가하여 사용된 올리고뉴클레오티드들이 3'-OH 작용기가 이용가능하지 않는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 화학적으로 처리된 DNA 샘플은 제2단계에서 2개 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드, 하나의 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머(이것은 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화함), 및 하나 이상의 리포터 올리고뉴클레오티드(이것은 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화함) 및 폴리머라아제를 사용하여 증폭되고, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 배경 DNA에 우선적으로 결합하여서 그의 증폭에는 반대로 영향을 주고 그리고 리포터 올리고뉴클레오티드는 조사 대상인 DNA에 결합하여 그의 증폭을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제15항에 있어서, 리포터 뉴클레오티드에 더하여, 형광염료로 라벨된 다른 올리고머가 사용되어 리포터 올리고뉴클레오티드에 직접 인접하여 혼성되며 이 혼성화는 형광공명 에너지전달에 의해 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제15항에 있어서, 타크만 분석(Tagman assay)이 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제15항에 있어서, 라이트사이클러 분석(Light Cycler assay)이 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제15항에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 형광라벨을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제15항에 있어서, 리포터 분자가 형광의 증감에 의해 증폭을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제20항에 있어서, 형광의 증감이 분석에 직접 이용되고 분석대상의 DNA의 메틸화 상태는 형광신호로부터 추론되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 배경 DNA가 조사 대상의 DNA 농도의 100배로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 배경 DNA가 조사 대상의 DNA의 농도의 1000배로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석을 올리고머 배열에 대한 혼성화에 의해 수행하고, 올리고머는 핵산 또는 그들의 혼성 특성에 유사한 PNA와 같은 분자인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제24항에 있어서, 올리고머가 분석대상 DNA에 12-22 베이스 롱 세그먼트(base long segment) 이상으로 혼성하고 이들 올리고머는 CG, TG 또는 CA 디뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제24항에 있어서, 분석 대상 DNA의 20개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험으로 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제24항에 있어서, 분석 대상 DNA의 60개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험으로 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석들이 조사대상 증폭 DNA의 길이측정에 의해 행해지고, 길이측정 방법은 겔 전기영동, 모관 겔 전기영동, 크로마토그래피(이를테면, HPLC) 또는 질량 스펙트로메트리인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석들이 시퀀싱에 의해 행해지고, 시퀀싱 방법은 생거(Sanger) 방법, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법 또는 SBH(sequencing by hybridization)인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제29항에 있어서, 시퀀싱이 각각의 CpG 위치 또는 이들 위치의 소그룹을 위해 매번 개별적인 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되고, 프라이머의 신장은 단지 1 또는 적은 수의 염기에 이르며, 조사대상 DNA의 각 위치의 메틸화 상태가 프라이머 연장 타입으로부터 추론되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 생성물 자체가 검출용 라벨과 함께 제공되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제31항에 있어서, 라벨들이 형광라벨인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제31항에 있어서, 라벨들이 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제31항에 있어서, 라벨들이 제거가능한 질량라벨들로서, 질량 분석계에서 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머들 중 한 프라이머는 증폭에서 고체상에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 생성물은 질량 분석계에서 전체적으로 검출되고 그들의 질량에 의해 명료하게 특징지어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법을 세포 형태나 조직을 식별하는데 또는 세포 파생을 조사하는데 사용하는 방법.
증폭된 생성물의 제조를 위한 중아황산염, 프라이머 및 3'-OH 작용이 없는 다른 올리고뉴클레오티드를 함유하는 시약, 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 분석을 시행하기 위한 지시사항이 기록된 서류로 이루어진 키트.
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