KR100839984B1 - 시토신 메틸화 패턴의 탐지를 위한 고민감 방법 - Google Patents
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Abstract
Description
특히 바람직하게는 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도의 적어도 5배로 존재한다.
특히 바람직한 변형으로서, 수개의 메틸화가능한 위치가 한정자 위치로 정의되고, 바람직하게 배경 DNA 뿐 아니라 프로브에 결합하는 한정자 포지션으로 정의되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드가 이러한 위치들을 위해 사용되는 것이다. 이 경우에서의 배경 DNA의 확대가 몇가지 올리고뉴클레오티드에 의해서 억압될 것이기 때문에, 조사될 DNA보다 배경 DNA가 상대적으로 특히 많은 경우에 바람직하다. 많은 경우, 현재 가능한 방법으로는 임의의 다수 염료들을 동시에 검출할 수 없기 때문에, 이러한 변형에서 하나의 조각내 몇가지 한정자 위치가 존재하는 경우 분류자 위치의 더 이상의 조사는 불필요할 수 있다.(대부분의 경우 이러한 상이한 염료의 수는 4-5이다). 이후, 바람직하게 앞에서 언급된 다른 감지 기술중 하나로 부가적인 분류자 위치의 조사가 행해질 수 있다.
만일, 분류자 위치의 메틸화 및 그 정도를 보다 정확하게 정량화하는 것이 요구된다면, 바람직하게 서로 경쟁하는 두개의 프로브가 상이한 염료와 함께 사용될 수 있는 데, 여기에서 이들 중 하나가 조사될 DNA에서의 비 메틸화 위치의 경우에 결합하고, 반면 다른 하나는 바람직하게 반대경우, 메틸화 위치에 결합한다.
형광 변화가 또한 PCR 동안에 일어날 수 있는 기본적으로 다른 방법은 LightCyclerTM 기술로 현재 알려져 있다. 만일 그들이 서로, 예를 들어 1-5 뉴클레오티드 떨어진 정도의 직접 인접부위에서 발견될 수 있다면, 형광 공진 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer (FRET))가 두개의 염료 사이에서 오직 일어날 수 있다는 사실이 이용될 수 있다. 제 1 염료의 방출로 인해서 제 2 염료가 오직 여기될 수 있으며, 차례로 다른 파장의 빛을 방출하며, 이것이 감지된다.
또한 본 발명은 증폭된 생성물의 제조를 위한 중아황산염, 프라이머 및 3'-OH 작용이 없는 부가적인 올리고뉴클레오티드를 함유하는 시약, 및 경우에 따라 본 발명의 다양한 방법의 변형 중 적어도 하나를 수행하는데 필요한 지침서를 포함한다.
Claims (41)
- DNA 샘플에서 다음의 단계들에 의해 행해지는 시토신 메틸화 검출방법.(1) 조사 대상의 DNA와 배경 DNA를 포함하는 게놈 DNA 샘플을 모든 비메틸화된 시토신 염기가 우라실로 변환되면서 5-메틸시토신염기는 그대로 변하지 않은 상태로 남아 있도록 화학처리하는 단계;(2) 화학적으로 처리된 DNA 샘플을 2개 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드, 폴리머라아제, 및 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머를 사용하여 증폭하는 단계로서, 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 배경 DNA에 우선적으로 결합하며 그 증폭에 반대로 영향을 주고, 이로써 조사 대상의 DNA가 주형(template)으로서 배경 DNA에 우선하여 증폭되는 단계; 및(3) 증폭된 생성물을 분석하고, 조사 대상의 DNA 중의 메틸화 상태를 증폭된 생성물의 존재, 또는 부가적인 위치들의 분석, 또는 증폭된 생성물의 존재 및 부가적인 위치들의 분석으로부터 결정하는 단계.
- 제1항에 있어서, DNA 샘플이 개체의 혈청 또는 다른 체액으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, DNA 샘플이 세포선, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 뇌척수액, 파라핀 중에 매입된 조직으로서, 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 가슴 또는 간 조직, 조직학적 슬라이드 및 그의 모든 가능한 결합물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 화학적 처리는 중아황산염(=이아황산염, 수소아황산염)으로 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제4항에 있어서, 화학적 처리가 아가로스(agarose)에 DNA를 매입한 후에 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제4항에 있어서, DNA 이중나선 변성 시약, 또는 유리기 트랩, 또는 DNA 이중나선 변성 시약 및 유리기 트랩이 화학적 처리중에 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머의 결합 사이트가 배경 DNA에 대한 프라이머들의 결합사이트들과 겹치고, 부가적인 올리고뉴클레오티드가 배경 DNA에 대한 상기 하나 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 2개 이상의 다른 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 사용되며, 이때 그들의 결합사이트는 다시 배경 DNA에 대한 프라이머의 결합사이트와 매번 겹쳐지고, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머는 배경 DNA에 대한 양자의 프라이머 올리고머의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제8항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머 중 하나는 정 프라이머의 결합을 저지하고 다른 하나는 역 프라이머의 결합을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 프라이머 올리고뉴클레오티드에 비해 5배 이상의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 배경 DNA에 결합하여 결국 폴리머라아제 반응속에서 프라이머 올리고뉴클레오티드의 완전한 신장을 저지하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제11항에 있어서, 사용된 폴리머라아제는 5'-3' 익소뉴클레아제 활성을 가지고 있지 않은 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제11항에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드가 5' 말단에서 변형된 상태로 존재하여 5'-3' 익소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제에 의해 분해되지 않는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 프라이머들에 부가하여 사용된 올리고뉴클레오티드들이 3'-OH 작용기가 이용가능하지 않는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 화학적으로 처리된 DNA 샘플은 제2단계에서 2개 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드, 하나의 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머(이것은 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화함), 및 하나 이상의 리포터 올리고뉴클레오티드(이것은 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-TG-3' 디뉴클레오티드 또는 5'-CA-3' 디뉴클레오티드에 혼성화함) 및 폴리머라아제를 사용하여 증폭되고, 부가적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA 올리고머가 배경 DNA에 우선적으로 결합하여서 그의 증폭에는 반대로 영향을 주고 그리고 리포터 올리고뉴클레오티드는 조사 대상인 DNA에 결합하여 그의 증폭을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제15항에 있어서, 리포터 뉴클레오티드에 더하여, 형광염료로 라벨된 다른 올리고머가 사용되어 리포터 올리고뉴클레오티드에 직접 인접하여 혼성되며 이 혼성화는 형광공명 에너지전달에 의해 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제15항에 있어서, 타크만 분석(Tagman assay)이 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제15항에 있어서, 라이트사이클러 분석(Light Cycler assay)이 행해지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제15항에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 형광라벨을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제15항에 있어서, 리포터 분자가 형광의 증감에 의해 증폭을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제20항에 있어서, 형광의 증감이 분석에 직접 이용되고 분석대상의 DNA의 메틸화 상태는 형광신호로부터 추론되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 배경 DNA가 조사 대상의 DNA 농도의 100배로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항에 있어서, 배경 DNA가 조사 대상의 DNA의 농도의 1000배로 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석을 올리고머 배열에 대한 혼성화에 의해 수행하고, 올리고머는 핵산 또는 그들의 혼성 특성에 유사한 PNA와 같은 분자인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제24항에 있어서, 올리고머가 분석대상 DNA에 12-22 베이스 롱 세그먼트(base long segment) 이상으로 혼성하고 이들 올리고머는 CG, TG 또는 CA 디뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제24항에 있어서, 분석 대상 DNA의 20개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험으로 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제24항에 있어서, 분석 대상 DNA의 60개 이상의 메틸화 위치의 메틸화 상태가 하나의 실험으로 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석들이 조사대상 증폭 DNA의 길이측정에 의해 행해지고, 길이측정 방법은 겔 전기영동, 모관 겔 전기영동, 크로마토그래피(이를테면, HPLC) 또는 질량 스펙트로메트리인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 또는 부가적인 분석들이 시퀀싱에 의해 행해지고, 시퀀싱 방법은 생거(Sanger) 방법, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법 또는 SBH(sequencing by hybridization)인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제29항에 있어서, 시퀀싱이 각각의 CpG 위치 또는 이들 위치의 소그룹을 위해 매번 개별적인 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되고, 프라이머의 신장은 단지 1 또는 적은 수의 염기에 이르며, 조사대상 DNA의 각 위치의 메틸화 상태가 프라이머 연장 타입으로부터 추론되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 생성물 자체가 검출용 라벨과 함께 제공되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제31항에 있어서, 라벨들이 형광라벨인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제31항에 있어서, 라벨들이 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제31항에 있어서, 라벨들이 제거가능한 질량라벨들로서, 질량 분석계에서 검출되는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머들 중 한 프라이머는 증폭에서 고체상에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 생성물은 질량 분석계에서 전체적으로 검출되고 그들의 질량에 의해 명료하게 특징지어지는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플에서의 시토신 메틸화 검출방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법을 세포 형태나 조직을 식별하는데 또는 세포 파생을 조사하는데 사용하는 방법.
- 증폭된 생성물의 제조를 위한 중아황산염, 프라이머 및 3'-OH 작용이 없는 다른 올리고뉴클레오티드를 함유하는 시약, 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 분석을 시행하기 위한 지시사항이 기록된 서류로 이루어진 키트.
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