CN101243191B - 用于检测甲基化dna的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及具有编码双功能多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述双功能多肽包含属于甲基-CpG结合蛋白(MBD)家族的蛋白质的DNA结合结构域和抗体的Fc部分。此外，公开了包含所述核酸分子的载体和宿主细胞和所述核酸分子编码的多肽以及产生所述多肽的方法。此外，本申请提供了特异结合所述多肽的抗体和组合物，尤其诊断组合物，所述组合物包含本申请的核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或抗体。此外，提供了使用本发明的多肽检测甲基化DNA，尤其肿瘤组织或者肿瘤细胞中的甲基化DNA的方法和用途。

Description

用于检测甲基化DNA的手段和方法

本申请涉及具有编码双功能多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述双功能多肽包含属于甲基-CpG结合蛋白(MBD)家族的蛋白质的DNA结合结构域和抗体的Fc部分。此外，公开了包含所述核酸分子的载体和宿主细胞和所述核酸分子编码的多肽以及产生所述多肽的方法。此外，本申请提供了特异结合所述多肽的抗体和组合物，尤其诊断组合物，所述组合物包含本申请的核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或抗体。此外，提供了使用本发明的多肽检测甲基化DNA，尤其肿瘤组织或者肿瘤细胞中的甲基化DNA的方法和用途。

产生所有活的生物的细胞的信息包含在它们的DNA中。DNA由简写为G、A、T和C的四种碱基组成并且像长的梯子一样构造，这些字母对组成梯子的每个“横档”。字母G与C配对，A与T配对。这些对的字符串将信息像编码的信息一样储存，组成分组为区域的特定分子的信息称作基因。二倍体动物的每个细胞含有每个基因的两个拷贝，我们每个基因的一个拷贝来自母亲并且一个拷贝来自父亲。(该规则的唯一例外是染色体上决定生物发育成“雄性”还是“雌性”的基因)。

DNA甲基化和基因调节

除了“拼出”我们的基因组的四种碱基-腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之外，还存在第五种碱基，其通过复制后DNA的修饰产生。DNA甲基转移酶(DNMTs)可以催化甲基从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶环的转移，并从而产生碱基5-甲基胞嘧啶。特定胞嘧啶残基在哺乳动物中被修饰，所述胞嘧啶残基在DNA序列中鸟嘌呤残基之前(CpG二核苷酸)(Singal，Blood 93(1999)，4059-4070)；Robertson，Nat.Rev.Genet.1(2000)，11-19；Ng，Curr.Opin.Genet.Dev.(2000)，158-163；Razin，EMBOJ.17(1998)，4905-4908)。CpG二核苷酸的甲基化通常与稳定的转录抑制相关并且可能导致大部分非编码基因组和潜在可能的序列如转座子、重复或者病毒插入片段不转录这一事实。有趣的是CpG二核苷酸在基因组中分布非常不均(Singal(1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。基因组的大部分含有比统计预期的少得多的CpG。这可能是由于5-甲基胞嘧啶比较容易地脱氨成胸苷，其在进化过程中导致CpG二核苷酸的数目相对减少。然而，再次，有更多数目的CpG分布在基因组中，即所称作的CpG岛。这些区域通常含有转录起始点和基因启动子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不与CpG岛有关。在正常细胞中，CpG岛的甲基化仅在罕见的病例中观察到，如雌性细胞的x染色体的第二个拷贝和亲本印记基因组的失活(Singal(1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。

DNA甲基化的调节

仅仅部分理解DNA甲基化模式怎样在胚胎发生过程中建立起来和CpG甲基化怎样在基因组中保持和受到调节(Singal(1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。在哺乳动物物种中，已知有三种DNA甲基转移酶(DNMT1、3a和3b)，其催化DNA甲基化过程。然而，必须澄清每种DNMT对于CpG甲基化的维持和调节所做贡献的对应份额。然而，所有三种酶显然对于胚胎发生都是必需的，对应的敲除小鼠在子宫内(in utero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor，Hum.Mol.Genet.9(2000)，2395-2402；El Osta，Bioessays 25(2003)，1071-1084)。同时已经几次显示了DNA甲基化、染色质结构的修饰和某些组蛋白修饰之间的联系。DNA的甲基化多数与组蛋白脱乙酰作用和组蛋白H3的赖氨酸9残基的甲基化相关(Sims，Trends Genet.19(2003)，629-639，Fahrner，Cancer Res.62(2002)，7213-7218)。因此，DNMT与组蛋白乙酰基转移酶(HDACs)或者携阻抑物复合体有关。还几乎不知道甲基是怎样从CpG残基除去的。在增殖细胞中，DNA甲基化还可能在复制期间被动地发生。然而，也有在有丝分裂后细胞中DNA甲基化的实例，其可以通过存在活性的迄今还未知的脱甲基酶来解释(Wolffe，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，5894-5896)。

CpG甲基化和基因沉默

启动子(但不是非调节序列)的甲基化与稳定的转录阻抑相关(Singal(1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性质可以通过两种机制介导。首先，DNA甲基化可以直接损害转录因子的结合。第二种可能性(其可能造成最大部分的阻抑)是甲基-CpG-结合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar，Eur.J.Biochem.268(2001)，1-6)。MBP如MECP2或MBD2(MeCP1复合体的组分)伴随着协阻抑物复合体和HDAC，其具有阻抑效果并且负责转录因子不能接近的稠密染色质结构(异染色质)的形成(Ballestar(2001)，在上述引文中)。

肿瘤发生中的外遗传改变

正越来越清楚的是肿瘤的形成不仅受到遗传损伤(例如，突变或者易位)而且受到外遗传改变的支持。异常的染色质结构或者DNA甲基化可以影响癌基因或者肿瘤抑制基因的转录状态并且可以促进肿瘤生长。DNA甲基化的改变包括正常甲基化序列中甲基化的损失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超甲基化)(Roberston(2000)，在上述引文中，Herman，N.Engl.J.Med.349(2003)，2042-2054；Momparler，Oncogene 22(2003)，6479-6483；Esteller，Science 297(2002)，1807-1808；Plass，Hum.Mol.Genet11(2002)，2479-2488)。

低甲基化

已经对几乎所有类型的肿瘤描述了总体DNA低甲基化。在肿瘤组织中，5-甲基胞嘧啶的含量与正常组织相比降低，甲基化事件的主要份额在染色体的重复卫星序列或者着丝粒区域中发现。然而，在单个情况中，还已经描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello，J.Med.Genet.38(2001)，285-303)。

超甲基化或者CpG岛

CpG岛通常发挥基因调节功能。这是为什么甲基化状态的改变最直接地与有关基因座的转录活性的改变相关的原因(Robertson(1999)；Herman(2003)；Esteller(2002)；Momparler(2003)；Plass(2002)，所有都在上述引文中)。多数CpG岛以未甲基化形式存在于正常细胞中。然而，在一些情况下，CpG岛也可以在基因调节事件中被甲基化。雌性细胞的失活的X染色体的CpG岛的多数是例如甲基化的(Goto，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998)，362-378)。CpG岛还可以在正常的衰老过程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol.109(2003)，103-108)。

尤其在肿瘤中，通常不甲基化的CpG岛可以以超甲基化形式存在。在许多情况中，受到超甲基化影响的基因编码抵消肿瘤的生长的蛋白质，如肿瘤抑制基因。下表列出了基因的实例，可以表明这些基因在肿瘤中通过超甲基化的外遗传的机制被失活。

表 肿瘤中超甲基化基因(实例)

肿瘤特异性超甲基化的理由几乎未知。有趣的是，某些种类的肿瘤似乎具有它们自身的超甲基化谱。可以在更大的比较研究中表明超甲基化不是均匀分布的而是它依赖于肿瘤发生。在白血病的情况中，与例如结肠癌或者神经胶质瘤相比，多数其他基因是超甲基化的。从而，超甲基化可以用于对肿瘤分类(Esteller，Cancer Res.61(2001)，3225-3229；Costello，Nat.Genet.24(2000)，132-138)。

在许多情况中，超甲基化还与HDAC的升高的活性组合。用脱甲基化物质(例如，5-氮胞苷)治疗后，仅在也用HDAC抑制剂(如曲古抑菌素A(TSA))后才可以活化许多甲基化的基因(Suzuki，Nat.Genet.31(2002)，141-149；Ghoshal，Mol. Cell.Biol.22(2002)，8302-8319；Kalebic，Ann.N.Y.Acad.Sci 983(2003)，278-285)。

多数分析提示DNA甲基化被优势抑制并且它不能通过用HDAC抑制剂如TSA治疗而逆转TSA(Suzuki(2002)；Ghoshal(2002)，在上述引文中)。然而，最近指出，已经用于临床的一种HDAC抑制剂丙戊酸盐可以导致DNA的脱甲基作用(Detich，J.Biol.Chem.278(2003)，27586-27592)。然而，迄今还没有在这方面进行系统的分析。

逆转外遗传改变的临床方法

尽管癌症的遗传原因(例如，突变)是不可逆的，但是对肿瘤发生产生影响的外遗传改变可能是可逆的。从而，外遗传改变的可能的治疗提供了用于治疗瘤形成的疗法的新的可能性(Herman(2003)；Momparler(2003)；Plass(2002)，an在上述引文中；Leone，Clin.Immunol.109(2003)，89-102；Claus，Oncogene 22(2003)，6489-6496)。

20多年前，5-氮杂胞苷已经被开发为抗肿瘤药物并且在不知该物质的分子作用的情况下使用。现在，它已经以进一步开发的形式(脱氧-5-氮杂胞苷，脱氧氮杂胞苷)用于治疗骨髓增生异常综合征和继发性白血病(Leone(2003)，在上述引文中；Lyons，Curr.Opin.Investig.Drugs 4(2003)，1442-1450；Issa，Curr. Opin.Oncol.15(2003)，446-451)。由于体外观察到HDAC抑制剂可以支持甲基化启动子的再活化并且可以与脱甲基化物质协同作用，当前，在世界范围内进行先导研究，组合使用两类物质(Kalebic(2003)；Claus(2003)，在上述引文中；Gagnon，Anticancer Drugs 14(2003)，193-202；Shaker，Leuk.Res.27(2003)，437-444)。

用于分析CpG甲基化的检测方法

用于分析基因组CpG甲基化的检测方法的开发具有重要性，这是由于已经发现CpG甲基化模式的改变可以与诸如癌症的疾病有关。当前，存在已知的用于检测已知基因座的CpG甲基化的技术(Dahl，Biogerontology 4(2003)，233-250)。允许分析基因组中CpG甲基化的方法还较不成熟。在下文中，概述了用于分析CpG甲基化的最常见方法以及它们的主要应用领域。

甲基化敏感性限制酶用于检测CpG甲基化

使用细菌限制性内切核酸酶的同切点酶确定特定CpG二核苷酸的甲基化状态，所述同切点酶的特征是对5-甲基胞嘧啶的不同的敏感性。它的实例是酶HpaII和MspI-都切割CCGG序列，然而HpaII仅在内部胞嘧啶不被甲基化时切割。一些测定法基于甲基化敏感性限制酶的使用，所述测定法用于分析个体基因和分析整个基因组中的CpG甲基化。甲基化敏感性限制性消化片段多数通过限制性位点侧翼区域的DNA印迹或者基因组PCR来检测(Dahl(2003)，在上述引文中)。迄今已经发表的在基因组中CpG甲基化的所有分析都使用甲基化敏感性限制酶作为该方法的成分。例如，限制性标记的基因组扫描(RLGS)(Costello，Methods 27(2002)，144-149)使用一种二维琼脂糖凝胶电泳，其中每一维用不同的甲基化敏感性限制酶消化以鉴定两个DNA群体中CpG甲基化的身份差异。甲基化CpG岛扩增(MCA)富集具有甲基化SmaI限制性位点的片段并且使用LM-PCR富集所述片段。此类扩增产物已经通过代表性差别分析(RDA)(Smith，Genome Res.13(2003)，558-569)或者CpG岛微阵列(Yan，CancerRes.6(2001)，8375-8380)成功地分析。

对于基因组中CpG甲基化的分析，基于甲基化敏感性限制酶的所有测定法都具有缺点。为了以最佳的方法进行测定，必须保证完成所有限制性消化。最大的缺点是分析仅仅提供已经被所用的甲基化敏感性限制酶识别的胞嘧啶残基的甲基化状态。限制酶的选择自动地限制了可检测的序列的数目-因此对CpG甲基化的中立分析是不可能。

用于分析CpG甲基化的亚硫酸氢盐处理

用亚硫酸氢钠处理双链基因组DNA导致未甲基化的胞嘧啶残基脱氨成尿嘧啶残基和形成不再互补的两条单链。在该处理期间，5-甲基胞嘧啶保持不变。以这种方式产生的序列差异形成甲基化和未甲基化DNA之间区别的基础(Frommer，Proc.Natl.Acad.Sci.889(1992)，1827-1831)。用亚硫酸氢盐处理的DNA可以直接用于PCR中，其中尿嘧啶残基(以前为未甲基化的胞嘧啶)和胸苷残基作为胸苷扩增并且仅仅5-甲基胞嘧啶残基扩增为胞嘧啶残基。取决于应用，用于PCR的引物在甲基化和未甲基化的序列之间分化或者独立于甲基化状态扩增片段。已经使用非区别性引物扩增的PCR片段可以例如直接测序以确定甲基化和未甲基化CpG中的份额。其他方法利用此类PCR片段的物理差异(解链行为、单链构象、限制酶的限制性位点，等等)用于确定甲基化程度(Dahl(2003)，在上述引文中)。其他方法利用序列中的不同，通过有识别力的引物或者探针进行甲基化和未甲基化序列的特异扩增(甲基化特异性PCR，methylight PCR)(Dahl(2003)，在上述引文中)。通过甲基化特异性寡核苷酸(MSO)微阵列也可以发现PCR产物序列中的亚硫酸氢盐诱导的差异(Shi，J.Cell.Biochem.88(2003)，138-143；Adorjan，Nucleic Acid Res.30(2002)，e21；Gitan，Genome Res.12(2002)，158-164)。与甲基化敏感性限制酶相比，用亚硫酸氢盐处理的DNA可以提供关于所扩增的基因组片段中一些CpG残基的甲基化状态的信息。所处理的DNA可能由于其降低的复杂性和高度变性而不适于整个基因组内的分析。

用于检测CpG甲基化的其他方法

识别变性的单链DNA中CpG甲基化的针对5-甲基胞嘧啶的抗体主要用于个体固定化细胞的染色体上CpG甲基化的免疫组织化学染色。然而，这些抗体不适于富集甲基化的序列。

在1994年，A.Bird的实验室已经开发了通过亲和层析富集甲基化DNA片段的方法(Gross，Nat.Genet.6(1994)，236-244)。结合甚质的重组MECP2用于结合甲基化的DNA。自此该技术已经被其他工作小组使用、改进和与其他技术组合使用(Shiraishi，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，2913-2918；Brock，Nucleic Acid.Res.29(2001)，E123)。强烈或较不强烈的甲基化基因组序列与亲和基质的结合依赖于盐浓度，该盐浓度使得可能分离具有密集甲基化的CpG岛与具有较低甲基化密度的其他序列。该亲和层析的缺点是需要大量基因组DNA(50-100μg)和相对耗时的步骤。

考虑到前面的，显然CpG二核苷酸的甲基化是控制细胞的转录活性的重要的外遗传机制。通常，CpG二核苷酸的甲基化与转录失活相关。然而，在正常或退化的分化过程中，基因座的甲基化模式可以改变。因此，在肿瘤发生期间正常甲基化模式的逆转可以导致基因如肿瘤抑制基因或者癌基因的异常阻抑(或者活化)，并从而导致肿瘤发生。所以，CpG甲基化DNA的检测和误调节的肿瘤抑制基因和/或癌基因的鉴定是最具临床重要性的。如上面提到的，现有技术描述了检测甲基化DNA的不同方法，然而，其存在某些缺点。例如，现有技术的方法可能不允许CpG甲基化DNA的中性的基因组范围的分析或者不适于高通量应用或者不能可靠地检测CpG甲基化的DNA，尤其如果分析的目标是少量DNA时。从而，仍然需要其他检测甲基化DNA的手段和方法，它们可以克服现有技术的缺点和不足。因此，本发明下面的技术问题是满足上述需要。

通过提供权利要求中表征的技术方案解决了该技术问题。

因此，本发明的第一方面是具有编码双功能多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述双功能多肽包含属于甲基-CpG结合蛋白(MRD)家族的蛋白质的DNA结合结构域和抗体的Fc部分。所述DNA结合结构域在下文中描述。它可以在本发明的备选实施方案中是其片段，只要所述片段能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化的DNA。在本发明的优选实施方案中，包含本发明的双功能多肽的核苷酸序列的核酸分子还包含编码接头多肽的核苷酸序列。优选地，编码所述接头多肽的核苷酸序列位于编码本发明的双功能多肽的多核苷酸中编码MBD的核苷酸序列和Fc部分之间，从而它导致所述MBD、接头多肽和Fc部分的融合。“融合”指通过两个和多个蛋白质或者其片段通过编码这些蛋白质的核酸分子的遗传表达通过它们各自的肽主链进行共线性连接。从而，优选的融合蛋白包括MBD的DNA结合结构域或者其片段，其中所述片段优选具有结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA的活性，所述DNA结合结构域或者其片段共价连接到接头多肽，该接头多肽自身共价连接如本文描述的抗体的Fc部分。

所述多肽接头优选是柔性接头。优选地，它包含多个亲水的肽键结合的氨基酸并且连接MBD的DNA结合结构域的C-末端和Fc部分的N-末端。任选地，本发明的多肽含有Fc部分之前的蛋白酶切割位点，其允许如需要切割所述Fc部分。蛋白酶切割位点为例如凝血酶切割位点。

优选地，所述多肽接头包含多个甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和/或精氨酸残基。还优选所述多肽接头包含氨基酸序列的多个连续拷贝。通常，多肽接头包含1到20个，优选1到19个，1到18个，1到17个，1到16个或1到15个氨基酸，尽管多于20个氨基酸的多肽接头也可以使用。在本发明的优选实施方案中，所述多肽接头包含1到14个氨基酸残基。在本发明的尤其优选的实施方案中，本发明多肽中的所述多肽接头包含14个氨基酸。如所附实施例中阐明，所述多肽接头有利地包含氨基酸序列“AAADPIEGRGGGGG”，其也在SEQ ID NO：2(图1)的116到129位显示。

本发明的多肽可以任选在其N和/或C-末端包含标记。“标记”是与它所融合的氨基酸序列同源或者异源的氨基酸序列。所述标记可以方便它融合的所述蛋白质的纯化或方便所述蛋白质的检测。优选地，所述标记选自HA-标记、myc6-标记、flag-标记、strep-标记、strepH-标记、TAP-标记、HAT-标记、壳多糖结合结构域(CBD)、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白A(IgA)、His-6-标记、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记、内含肽和链霉抗生物素蛋白结合蛋白(SBP)标记。

CpG岛通常含有基因启动子和转录起始位点并且在正常细胞中通常不甲基化。CpG岛的甲基化与转录抑制有关。在癌中，CpG岛启动子的甲基化导致肿瘤抑制子基因的异常沉默，促进疾病的致病。迄今，在人类癌症中异常的CpG岛甲基化的研究主要采用候选基因方法，然而，该方法具有几个缺点。这些缺点是例如不完全覆盖涉及可能是甲基化(超甲基化或低甲基化)对象的肿瘤发生中的基因座或者当使用例如限制性标记的基因组扫描(RLGS)时由于受限的手段和方法而导致基因座的不完全分析。为了允许在基因组范围内无偏地检测CpG甲基化的DNA，本发明提供了允许分离和检测CpG甲基化的手段和方法，而不应用例如甲基化敏感性限制性内切核酸酶或者亚硫酸氢盐处理。这些手段和方法是基于结合甲基-CpG的抗体样蛋白质，其有效结合CpG甲基化的DNA。如本文所述的，结合甲基-CpG的抗体样蛋白质包含属于甲基-CpG结合蛋白(MBD)的蛋白质的DNA结合结构域和抗体的恒定部分。

令人惊奇地发现，重组的结合甲基-CpG的抗体样蛋白质可以优选以抗体样方式结合CpG甲基化的DNA。这表示本发明的结合甲基-CpG的抗体样蛋白质对它的“抗原”具有高亲和性和高亲合性，所述抗原优选为优选在CpG二核苷酸甲基化的DNA。不被理论束缚，本发明的多肽对它的“抗原”的高亲和性和亲合性由所述结合甲基-CpG的抗体样蛋白质的独特结构引起。认为本发明多肽的独特结构通过存在抗体的恒定区并从而使得所述多肽优选为双功能分子而实现。认为恒定区在本发明的两种多肽分子的每种的恒定区的免疫球蛋白重链之间形成二硫键。因此，优选形成与抗体的结构非常相似的抗体样结构。

再次，不被理论束缚，认为该结构增加本发明多肽的稳定性。这是因为，在本领域中描述，与抗体的恒定区融合的蛋白质可以赋予所述蛋白质更高的稳定性和更长的半寿期。此外，认为恒定区的分子间相互作用导致的抗体样结构将本发明一个多肽的甲基-DNA结合结构域与本发明另一多肽的甲基-DNA结合结构域密切接近。这允许甲基-DNA结合蛋白和甲基化DNA之间的二价相互作用。因此，本发明多肽优选能够通过作为本发明多肽的部分的两个甲基DNA结合结构域结合到它的抗原。本发明多肽的高亲和力结合尤其还通过优选使用蛋白质的甲基DNA结合结构域来实现，而不是使用含有与其他蛋白质相互作用的结构域的全长甲基DNA结合蛋白质实现，所述全长甲基DNA结合蛋白质可能扰乱或者干扰如本文描述的独特适用性，已知甲基DNA结合结构域来特异结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA，而不是结合未甲基化的DNA。此外，甲基DNA结合结构域的优选使用保证实际上结合甲基化的DNA，因为检测是直接而不是间接的。多数现有技术方法仅可以通过PCR间接检测甲基化的DNA。

这些性质使得本发明的多肽成为可靠和容易应用的诊断工具，用于分离、纯化、富集和/或检测甲基化DNA，即使所述DNA仅以非常少量存在，例如，约大于10ng、小于10ng、小于7.5ng、小于5ng、小于2.5ng或者约1ng，如本文所述。因此，由于它的抗体样结构，本发明的多肽是有效的分子，其使得它可以应用于例如多种应用，包括单管测定中的多步步骤。例如，使用反向South-Western印迹分析和甲基-CpG免疫沉淀(MCIp)阐明了CpG甲基化DNA的特定分离和检测。MCIp结合实时PCR，例如，LightCycler PCR，允许从少至例如1ng总基因组DNA灵敏地检测候选CpG岛启动子的CpG岛甲基化。MCIp产生的基因组DNA片段可以容易地扩增、标记和用于CpG岛微阵列杂交。使用本文描述的技术，可能产生人癌症中异常CpG岛甲基化的基因组范围的分布图和例如鉴定肿瘤抑制基因或者其他抑制基因活性。

在详细描述本发明前，将理解本发明不限于本文描述的具体方法、方案、细菌、载体和试剂等等，因为它们可以改变。还将理解本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意在限制本发明的范围，其仅仅受到所附权利要求的限制。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC  Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和

，H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)中描述的定义。在该说明书和下面的权利要求书全文中，除非上下文需要相反的意思，单词“包含”和变型如“包括”将理解为暗含包括所述的整数或步骤或者一组整数或步骤，但是不排除任何其他整数或步骤或者一组整数或步骤。必须指出如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一种”、“这种”包括复数参考，除非上下文清楚地指出相反意思。从而例如，对“一种试剂”的引用包括一种或多种此类不同的试剂，并且对“这种方法”的引用包括引用本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以修饰或者替代本文描述的方法。

术语“核酸分子”当用于本文时包括任一核酸分子，其具有包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基的核苷酸序列，所述碱基被所述核酸分子包含，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构。核酸序列包括有义和反义链的DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、合成形式，例如，PNA和混合的聚合物，或者可以含有非天然或者衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易理解。本发明的多核苷酸优选由任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或者DNA或者经修饰的RNA或者DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA和为单链和双链区混合物的RNA、包含可以为单链或更典型地双链或者单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。此外，多核苷酸可以由包含RNA或者DNA或者RNA和DNA的三链区组成。多核苷酸还可以含有一个或多个经修饰的碱基或者为了稳定性或者其他原因修饰的DNA或者RNA主链。“经修饰的”碱基包括例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基如次黄嘌呤。可以对DNA和RNA做出多种修饰；从而术语“核酸分子”包括化学、酶促或者代谢修饰的形式。

术语“多肽”当在本文中使用时指可互换使用并且包含给定长度的氨基酸链的肽、蛋白质或者多肽，其中氨基酸残基通过共价肽链连接。然而，本发明还包括此类蛋白质/多肽的肽模拟物(peptidomimetics)，其中氨基酸和/或肽键已经被功能类似物以及其他20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸如硒代半胱氨酸替代。肽、寡肽和蛋白质可以称作多肽。如所提到的，术语多肽和蛋白质通常在本文中可互换使用。术语多肽还指并且不排除多肽的修饰。修饰包括糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂类或者脂类衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、formulation、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的加入，如精氨酰化，和遍在蛋白化；见例如，PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)，pgs.1-12；Seifter，Meth.Enzymol.182(1990)；626-646，Rattan，Ann.NY Acad.Sci.663(1992)；48-62。

本发明的多肽优选具有如本文描述的本发明的核酸分子编码的氨基酸序列或者可以通过产生所述多肽的方法或者产生能够表达本文描述的多肽的细胞的方法得到。

优选地，在本发明的上下文中，所述多肽是双功能多肽。“双功能多肽”指本发明的多肽，由于抗体的Fc部分是本发明多肽的部分，该多肽除了结合甲基化DNA，优选结合CpG甲基化DNA外还具有其他能力。例如，所述Fc部分优选赋予将化合物或者部分缀合、连接或者共价偶联所述Fc部分的可能性。本文使用的术语“共价偶联的”指特定化合物或者部分直接共价相互结合；或者通过一个或多个间插部分，如桥、间隔臂或者一个或多个连接部分间接共价结合。

此类化合物可以是可检测的物质。可检测的物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、正电子发射金属，使用多种正电子发射成像术，和非放射性顺磁金属离子。可检测的物质可以直接偶联或者缀合到抗体的Fc部分(或者其部分)或者通过中间体(如本文中已知的接头)，使用本领域中已知的技术间接偶联或者缀合。关于可以缀合到抗体的Fc部分用作根据本发明的诊断剂的金属离子，见例如美国专利号4,741,900。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I或⁹⁹Tc。

此外，所述Fc部分可以缀合到治疗部分如细胞毒素，如细胞抑制剂或者杀细胞剂、治疗剂或者放射性金属，例如，α射线发射体，如²¹³Bi。细胞毒素或者细胞毒性剂包括对细胞有害的任何物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(11)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(以前放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

此外，本发明多肽的Fc部分可以偶联或者缀合到具有目的生物活性的蛋白质或者多肽。此类蛋白质可以包括例如，毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或者白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂。

Fc部分还允许本发明的多肽附着到固相支持体，其尤其可用于免疫测定或者纯化如本文描述的靶抗原。此类固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯等等。

将化合物缀合、偶联或者连接到Fc部分的技术是公知的，见例如，Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biologicai And Clinical Applications，Pinchera 等人(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analyzis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″′，in Monoelonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Acadernic Press 1985)，和Thorpe，Immunol.Rev.，119-158。

术语“属于甲基-CpG结合蛋白(MBD)家族的蛋白质的DNA结合结构域”包括优选具有MBD家族的蛋白质的甲基-DNA-结合结构域的结构和/或功能特征的多肽，所述MBD家族包括蛋白质MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4。可以通过本领域已知的方法检测甲基-DNA结合活性。术语“甲基化DNA”优选包括甲基化DNA，更优选地，CpG甲基化DNA，包括半甲基化DNA或者在两条链上甲基化的DNA或者单链甲基化DNA。迄今最重要的实例是甲基化的胞嘧啶，其主要在二核苷酸CpG背景中和CpNpG-和CpNpN-序列的背景中发生。原则上，其他天然存在的二核苷酸也可以被甲基化。

优选本发明的多肽作为本文描述的单体或者二聚体或者多价分子结合甲基化的DNA。它优选能够结合高度甲基化的DNA或者低甲基化的DNA。优选地，它可以结合单个甲基化的CpG对。MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4组成了共有甲基-CpG-结合结构域的脊椎动物蛋白质家族。MBD蛋白质家族包含基于已知的MBD的序列的两个亚组。MBD4的甲基-DNA-结合结构域与MeCP2在一级序列上最相似，而MBD1、MBD2和MBD3的甲基-DNA-结合结构域相互之间比与MBD4或者MeCP2更相似。然而，基于在MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4的所有5种基因内的保守位置上存在内含子，每种蛋白质内的甲基-DNA-结合结构域似乎在进化上相关。然而，MBD家族的成员之间的序列相似性很大程度上局限于它们的甲基-DNA-结合结构域，尽管MBD2和MBD3是相似的并且在大部分它们的长度上共有约70％的总同一性。最大的分歧发生在C-末端，其中MBD3具有12个连续谷氨酸残基。

根据本发明使用的MBD或者其片段，优选甲基-DNA-结合结构域或者其片段可以例如通过使用本领域已知、优选本文描述的手段和方法进行序列比较和/或比对和将已知的MBD与怀疑为MBD的序列比较和/或比对来鉴定。

例如，当两个比较的序列两者中的一个位置被相同碱基或者氨基酸单体亚基占据(例如，如果两个DNA分子每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，或者两个多肽的每一个中的一个位置被赖氨酸占据)时，那么各自分子在该位置上是同一的。两条序列之间同一性百分数是两条序列共有的匹配或者同一位置的数目除以位置数x100的函数。例如，如果两条序列中10个位置的6个是匹配或者同一的，那么这两条序列是60％同一的。作为实例，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％同源性(6个总位置的3个是匹配的)。通常，当两条序列比对以得到最大同源性和/或同一性时进行比较。使用通过计算机程序如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地实现的例如Needleman，J.Mol Biol.48(1970)：443-453的方法可以提供此类比对。同源序列共有相同或相似的氨基酸残基，其中相似的残基是比对的参考序列中对应氨基酸残基的保守替代或者“允许的点突变”。在这方面，参考序列中残基的“保守替代”是物理上或者功能上类似于对应的参考残基的那些替代，如具有相似的大小、形状、电荷、化学性质的替代，包括能够形成共价键或者氢键等等。尤其优选的保守替代是满足Dayhoff等人，5：Atlas ofProtein Sequence and Structure，5：Suppl.3，chapter 22：354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，D.C.(1978)中对“可接受的点突变”定义的标准的那些保守替代。

优选地，本发明的多肽的甲基-DNA结合结构域或者其片段具有如本文描述的结构和/或功能特征。优选地，本文描述的甲基-DNA结合结构域的片段能够结合甲基化的DNA，优选CpG甲基化的DNA。

本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域或者其片段优选为昆虫来源、线虫来源、鱼来源、两栖动物来源，更优选为脊椎动物来源，甚至更优选为哺乳动物来源，最优选为小鼠来源，尤其优选为人来源的。

优选地，本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域或者其片段具有独特的α-螺旋/β链夹层结构，其具有如Ballester和Wolffe，Eur.J.Biochem.268(2001)，1-6的图1中所示的特征环并且能够结合甲基化DNA。

更优选地，本发明多肽的MBD或者其片段包含Ballester和Wolffe(2001)，在上述引文中所示的MBD的至少50个，更优选至少60个，甚至更优选至少70个或者至少80个氨基酸残基并且能够结合甲基化DNA。

甚至更优选地，本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域或者其片段与Ballester和Wolffe(2001)，在上述引文中的图1中所示的MBD在氨基酸水平上共有优选50％、60％、70％、80％或90％、更优选95％或97％、甚至更优选98％，最优选99％同一性，并且能够结合甲基化DNA。确定序列(如氨基酸序列)的同一性的手段和方法在本文别处描述。

最优选地，本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域或者其片段包含Ballester和Wolffe(2001)，在上述引文中的图1中所示的MBD蛋白质的甲基-DNA-结合结构域或者Hendrich和Tweedy，Trends Genet.19(2003)，269-77中描述的MBD蛋白的甲基-DNA-结合结构域并且能够结合甲基化DNA。

当然，根据本发明，本发明的多肽优选是双功能的并且含有优选如上所述的两个甲基-DNA-结合结构域，其中优选地两个甲基-DNA-结合结构域都能够结合单个甲基化的CpG对。

在本发明的尤其优选的实施方案中，本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域是人MBD2的甲基-DNA-结合结构域。在更尤其优选的实施方案中，甲基-DNA-结合结构域是人MBD2的甲基-DNA-结合结构域，其包含具有Genbank检索号NM 003927的氨基酸序列的氨基酸144到230。在最尤其优选的实施方案中，本发明多肽的甲基-DNA-结合结构域包含来自SEQID NO：2(图1)中所示的氨基酸序列的29到115位的氨基酸序列。

作为本发明多肽组分的抗体的“Fc部分”优选包含免疫球蛋白重链分子的恒定区的至少一部分。Fc区域优选限于恒定结构域铰链区和C_H2和C_H3结构域。本发明多肽中的Fc区域还可以限于铰链区的部分，该部分能够形成分子间二硫键，和C_H2和C_H3结构域，或者其功能等同物。

备选地，还优选Fc部分包含至少所需的那些CH区域，使得本发明的多肽仍然具有本文上述多肽的性质，尤其用于所附实施例中多肽的性质。

在另一备选方案中，还优选所述恒定区当与本领域中已知的恒定区比较时含有一个或多个氨基酸替代。优选地，它含有1到100、1到90、1到80、1到70、1到60、1到50、1到40、1到30或1到20，更优选1到10、甚至更优选1到9、1到8、1到7或1到6最优选1到5、1到4、1到3或2或1个替代。优选如本领域所述的进行或者比较，更优选地，如本文别处描述的进行比较。

备选地，所述恒定区优选包含至少C_H1区，更优选C_H1和C_H2区，最优选C_H1、C_H2和C_H3区。如本领域中已知，抗体的恒定区含有两个免疫球蛋白重链，其含有由约110个氨基酸组成的三个特征性免疫球蛋白结构域，其中两个免疫球蛋白重链通过二硫键共价连接。不被理论束缚，认为包含甲基化DNA结合结构域和抗体的Fc部分的本发明的新生的多肽在宿主细胞内折叠，从而优选地，两个多肽以与抗体的恒定区类似或优选相同的方式连接在它们的Fc部分，得到如本文描述的双功能多肽。

还设想恒定区可以优选为鸡或者鸭来源的。然而，优选地，恒定区是IgM、IgA、IgD或IgE同种型的，并且更优选地，它是IgG同种型的，最优选IgG1同种型的。优选地，前述同种型是脊椎动物来源的，更优选为哺乳动物来源的，甚至更优选为小鼠、大鼠、山羊、马、驴、骆驼或者黑猩猩来源的，最优选为人来源的。优选地，所述IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4类的，所述IgA同种型是IgA1、IgA2类的。

如本文所述，本发明优选提供了双功能多肽。然而，还设想包含一个或多个本发明的双功能多肽的多聚双功能多肽。此类多聚体可以通过使用通常多价的Ig分子如IgM五聚体或者IgA二聚体的那些Fc区域或者其部分产生。可以理解可以需要J链多肽形成和稳定IgM五聚体和IgA二聚体。

在更优选的实施方案中，上述包含本发明的核苷酸序列的核酸分子选自：

(a)具有SEQ ID NO：1(图1)中显示的核苷酸序列的核酸序列；

(b)核酸序列，其具有编码SEQ ID：NO 2(图1)中显示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(c)核酸序列，其具有编码具有SEQ ID：NO 2(图1)中显示的氨基酸序列的多肽的片段的核苷酸序列，其中所述片段包含所述多肽的至少氨基酸130到361，并且能够结合甲基化的DNA；

(d)核酸序列，其具有编码(a)到(c)任一项的多核苷酸编码的多肽的变体的核苷酸序列，其中在所述变体中，一个或多个氨基酸残基与所述多肽相比被替代，并且所述变体能够结合甲基化的DNA；

(e)具有核苷酸序列的核酸序列，所述核苷酸序列与(a)到(d)任一项的核酸序列杂交并且与(a)的核酸分子的核苷酸序列至少65％同一并且编码能够结合甲基化DNA的多肽；

(f)核酸分子，其编码与(b)的核酸分子编码的多肽至少65％同一并且能够结合甲基化DNA的多肽；和

(g)核酸序列，其具有作为(a)到(f)任一项的多核苷酸的核苷酸序列的简并序列的核苷酸序列；

或者这种多核苷酸的互补链。

如上文所述，具有SEQ ID：NO 2(图1)中所示氨基酸序列的本发明多肽的片段包含SEQ ID：NO 2(图1)中所示氨基酸序列的至少氨基酸130到361。这意味着除了代表Fc部分的氨基酸130到361外，所述片段还可以包含一个或多个氨基酸，从而所述片段能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。因此，设想所述片段更优选地包含SEQ ID：NO 2(图1)中所示氨基酸序列的至少氨基酸116到361。甚至更优选地，所述片段可以包含SEQ ID：NO 2(图1)中所示氨基酸序列的至少氨基酸29到115和130到361。在最优选的实施方案中，所述片段可以包含至少氨基酸29到361。通常优选本发明多肽的片段能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。该能力可以通过本领域中已知的方法或者优选通过所附实施例中描述的那些方法测试。

本发明多肽的“变体”包含多肽，其中与所述多肽相比，一个或多个氨基酸残基被替代，优选被保守替代，并且其中所述变体优选能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA。此类变体包括根据本领域中已知的一般规则选择的缺失、插入、倒位、重复和替代，以便对本发明的多肽的活性没有影响。例如，关于怎样产生表型上沉默的氨基酸替代的指导在Bowie，Science 247：(1990)1306-1310中提供，其中作者指出有两个主要策略用以研究氨基酸序列对改变的耐受性。

第一种策略利用在进化过程中自然选择对氨基酸替代的耐受性。通过比较不同物种中氨基酸序列，可以鉴定保守的氨基酸。这些保守的氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相比，替代被自然选择耐受的氨基酸位置表明这些位置对于蛋白质功能不是关键的。从而，可以修饰耐受氨基酸替代的位置而仍然保留蛋白质的生物活性。

第二种策略使用遗传工程在所克隆的基因的特定位置引入氨基酸改变以鉴定对于蛋白质功能关键的区域。例如，可以使用位点定向诱变或者丙氨酸扫描诱变(在分子的每个残基引入单个丙氨酸突变)(Cunningham和Wells，Science 244：(1989)1081-1085.)。然后可以测试所得突变分子的生物活性。

如作者指出的，这两种策略已经揭示蛋白质令人惊奇地耐受氨基酸替代。作者还指出哪些氨基酸改变可能在蛋白质的某些氨基酸位置是允许的。例如，多数埋入(在蛋白质的三级结构内)的氨基酸残基需要非极性侧链，而通常表面侧链几乎没有特征是保守的。

本发明包括多肽，其具有较低的同一性程度但是具有足够的相似性以便进行如本发明多肽执行的一种或多种功能。通过保守氨基酸替代确定相似性。此类替代是通过相似特征(例如，化学性质)的另一氨基酸替代多肽中给定氨基酸的那些替代。根据上文的Cunningham等人，此类保守替代可能是表型沉默的。关于哪些氨基酸改变可能是表型沉默的额外的指导可以见Bowie，Science 247：(1990)1306-1310。

本发明的耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或者疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；酸性残基Asp和Glu的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代；碱性残基Lys、Arg和His的替代；芳族残基Phe、Tyr和Trp的替代，和小尺寸氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。

此外，本发明还包括下表提供的保守替代。

表IV

除了上述用途，此类氨基酸替代还可以增加蛋白质或者肽稳定性。本发明包括氨基酸替代，其含有例如蛋白质或者肽序列中一个或多个非肽键(其替代肽键)。还包括这样的替代，其包括不同于天然发生的L-氨基酸的氨基酸残基，如D-氨基酸或者非天然发生的或者合成的氨基酸，例如，β或者γ氨基酸。

参考下面的出版物可以容易地计算同一性和相似性：ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Infoliuaties and Genome Projects，Smith，DM.，ed.，Academic Press，New York，1993；Informafies Computer Analyzis ofSequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analyzis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academie Press，1987；and Sequence Analyzis Primer，Gribskov，M.和Devereux，eds.，M Stockton Press，New York，1991。

如上述，本发明还涉及核酸序列，其与如本文描述的(图1)SEQ ID NO：1中显示的核酸序列或者其片段或变体杂交并且与SEQ ID NO：1(图1)中显示的核酸序列至少65％同一并且优选编码能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA的多肽。还如所述的，本发明优选涉及编码与SEQ ID NO：2中显示的多肽至少65％，更优选70％、75％、80％、85％、90％，更优选99％同一的多肽的核酸序列。根据本发明使用的术语“杂交”优选涉及在严格条件下杂交。术语“杂交序列”优选指与上文所述的编码能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA的多肽的核酸序列具有至少65％的序列同一性，甚至更优选至少70％，尤其优选至少80％，更尤其优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％、98％或99％的同一性的序列。

可以根据如在Sambrook，Russell″Molecular Cloning，A LaboratoryManual″，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，N.Y.(2001)；Ausubel，″Current Protocols in Molecular Biology″，Green Publishing Associatesand Wiley Interscience，N.Y.(1989)，或Higgins和Hames(Eds.)″Nucleicacid hybridization，a practical approach″IRL Press Oxford，WashingtonDC，(1985)中描述的常规方案建立所述杂交条件。条件的设置在技术人员能力范围内并且可以根据本领域描述的方案确定。从而，仅特异杂交序列的检测将通常要求严格条件和洗涤条件，如65℃下0.1xSSC，0.1％SDS。用于检测同源的或者非准确互补序列的非严格杂交条件可以设置为65℃下的6xSSC，1％SDS。如公知的，探针长度和将确定的核酸的组成构成了杂交条件的其他参数。注意到上述条件的变化可以通过包括和/或替代用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂来完成。典型的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA，和可商购的专利制剂。由于与相容性相关的问题，特定封闭试剂的包括可以需要修饰上述杂交条件。杂交核酸分子还包含上述分子的片段。此类片段可以代表如本文所述的核酸序列。此外，与上述核酸分子的任一种杂交的核酸分子还包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外，杂交复合体指通过在互补的G和C碱基之间和互补的A和T碱基之间形成氢键，在两条核酸序列之间的复合体；这些氢键可以通过碱基堆积作用进一步稳定化。两条互补的核酸序列以反平行构型以氢键结合。杂交复合体可以在溶液(例如，Cot或Rot分析)中形成或者在溶液中存在的一种核酸序列和固相支持体(例如，膜、滤器、芯片、针、或者载玻片，其上已经固定例如细胞)上固定的另一种核酸序列之间形成。术语互补的或者互补性指在碱基配对许可的盐和温度条件下，多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”结合互补序列“T-C-A”。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸结合，或者当两个单链分子之间存在完全互补性时，结合可以是完全的。核酸链之间互补性程度时于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应中尤其重要，其取决于核酸链之间的结合。

根据本发明，在两个或多个核酸或者氨基酸序列上下文中，术语“同一的”或者“百分比同一性”指当为了最大对应在比较窗口或者在指定的区域内进行比较和比对时，如使用本领域已知的序列比较算法，或者通过手工比对和视觉检查测量的，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或者核苷酸(例如，至少65％同一性，优选至少70-95％同一性，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性)的两个或多个序列或者子序列。具有例如65％到95％或者更大序列同一性的序列被认为是实质同一的。这种定义还应用于测试序列的互补序列。优选地，所描述的同一性存在于长为至少约232个氨基酸或者696个核苷酸的区域内。本领域技术人员知道怎样使用例如基于如本领域已知的CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.AcidsRes.2(1994)，4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990)，237-245)的算法确定序列之间和之中的百分比同一性。

尽管FASTDB算法通常不考虑序列中的内部非匹配缺失或者添加，即，缺口，但是在它的计算中，这可以手工校正以避免％同一性的过高估计。然而，CLUSTALW不将序列缺口计入它的同一性计算中。本领域技术人员还可以得到的是BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul Nucl.AcidsRes.25(1977)，3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10作为默认值。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89，(1989)，10915)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4和两条链的比较作为默认值。

例如，代表基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool)(Altschul，Nucl.Acids Res.25(1997)，3389-3402；Altschul，J.Mol.Evol.36(1993)，290-300；Altschul，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)的BLAST2.0可以用于搜索局部序列比对。BLAST产生核苷酸和氨基酸序列的比对以确定序列相似性。因为比对的局部性质，BLAST特别可用于确定精确匹配或者鉴定相似序列。BLAST程序输出的基本单位是高得分区段对(High-scoring Segment Pair)(HSP)。HPS由任意但是相等长度的两个序列片段组成，所述片段的比对为局部最大并且它们的比对得分满足或者超过用户设置的阈值或者截断得分。BLAST方法是寻找查询序列和数据库序列之间的HPS，以评估所发现的任何匹配的统计学显著性，和仅报告满足用户选择的显著性阈值的那些匹配。参数E建立统计学显著性阈值用于报告数据库序列匹配。E解释为在整个数据库检索的背景中HSP(或者HPS集合)的机会发生的预期频率的上限。匹配满足E的任何数据库序列以程序输出报告。

使用BLAST(Altschul(1997)，在上述引文中；Altschul(1993)，在上述引文中；Altschul(1990)，在上述引文中)的类似的计算机技术搜索核苷酸数据库如GenBank或EMBL中的相同或者相关的分子。该分析比基于多个膜的杂交快得多。此外，可以修饰计算机搜索的灵敏性以确定任一具体匹配分类为精确的还是相似的。搜索的基础是乘积得分，其定义为：

并且它考虑两条序列之间的相似性程度和序列匹配的长度。例如，对于40的乘积得分，匹配将在1-2％误差内是精确的；在70时，匹配将是精确的。通过选择显示出15到40的乘积得分的那些分子，通常鉴定相似的分子，尽管较低的得分可以鉴定相关的分子。

此外，本发明还涉及核酸分子，所述核酸分子的序列与上述核酸分子的序列相比是简并的。当根据本发明使用时，术语“遗传密码简并产物”指由于遗传密码冗余性，不同的核苷酸序列编码相同的氨基酸。

当然，本发明还设想上文和下面提到的核酸分子的互补链(如果它们可以为单链形式)。

优选地，本发明的核酸分子可以是任何类型的核酸，例如，DNA、基因组DNA、eDNA、RNA或者PNA(肽核酸)。

对于本发明，肽核酸(PNA)是聚酰胺类型的DNA类似物并且腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的单体单位可以通过商业途径获得(PerceptiveBiosystems)。DNA的某些成分，如磷、磷氧化物或者脱氧核糖衍生物不存在于PNA中。如Nielsen等人，Science 254：1497(1991)；和Egholm等人，Nature 365：666(1993)公开的，PNA特异并且紧密结合互补的DNA链并且不被核酸酶降解。实际上，PNA比DNA自身更强烈地结合DNA。这可能是因为两条链之间没有静电排斥，并且聚酰胺主链更有柔性。为此，PNA/DNA双链体比DNA/DNA双链体在更宽的严格条件下结合，使得它更容易进行多路杂交。由于强烈结合，可以使用比DNA更小的探针。此外，用PNA/DNA杂交更可能确定单个碱基错配，因为PNA/DNA 15聚体中的单个错配降低解链温度(T_m)8°-20℃，相比DNA/DNA 15聚体双链体降低解链温度4°-16℃。而且，PNA中不存在带电基团意味着杂交可以在低离子强度下进行并且在分析期间减小盐的可能的干扰。

DNA可以例如是基因组DNA或者cDNA。RNA可以是例如mRNA。核酸分子可以是天然的、合成的或者半合成的，或者它可以是衍生物，如肽核酸(Nielsen，Science 254(1991)，1497-1500)或者硫代磷酸酯。此外，核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，其包含单独或者组合的前述核酸分子的任一种。

优选地，本发明的核酸分子是载体的部分。因此，本发明在另一实施方案中涉及包含本发明的核酸分子的载体。此类载体可以是例如，质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者例如常规用于遗传工程中的另一种载体，并且可以包含其他基因如标记基因，其允许在合适的宿主细胞和合适的条件下选择和/或复制所述载体。在优选实施方案中，所述载体是表达载体，其中本发明的核酸分子有效连接到如本文描述的允许在原核或真核宿主细胞中表达的表达控制序列。该上下文中使用的术语“有效连接”指一个或多个表达控制序列和将表达的多核苷酸中编码区之间以这样的方式连接使得在与表达控制序列相容的条件下实现表达。

从而本发明的核酸分子可以插入到一些通过商业途径可获得的载体。非限制性实例包括与哺乳动物细胞相容的质粒载体，如pUC、pBluescript(Stratagene)、pET(Novagen)、pREP(Invitrogen)、pCRTopo(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1 neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pUCTag、pIZD35、pLXIN and pSIR(Clontech)和plRES-EGFP(Clontech)。优选地，将本发明的核酸分子插入到载体Signal pIG plus(Ingenius，R&D Systems)中。杆状病毒载体如pBlueBac、BacPacz Baculovirus Expression System(CLONTECH)和MaxBacTM Baculovirus Expression System、昆虫细胞和方案(Invitrogen)可以通过商业途径得到并且也可以用于产生高产量的生物活性蛋白质。(也见Miller(1993)，Curr.Op.Genet.Dev.，3，9；O′Reilly，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，p.127)。此外，原核载体如pcDNA2和酵母载体如pYes2是适于用于本发明的其他载体的非限制性实例。本发明的其他优选的表达载体是本领域中公知的用于在果蝇细胞中表达蛋白质的那些表达载体，如Invitrogen的DES

系列。优选地，所述果蝇细胞表达载体是pMTBiP/V5-His B(Invitrogen)。pMT/BiP/V5-His载体提供了下面的额外特征。它具有小尺寸(3.6kb)以提高DNA产率和增加亚克隆效率，它具有用于用抗V5抗体快速检测的C-末端V5表位标记并且它具有C-末端6xHis标记，其用于用镍螯合树脂简单地纯化重组融合蛋白。

关于载体修饰技术，见Sambrook和Russel(2001)，上文。载体可以含有用于克隆或表达的一个或多个复制和遗传系统，用于在宿主中选择的一种或多种标记，例如，抗生素抗性，和一个或多个表达盒。

插入载体中的编码序列可以通过标准方法合成、从天然来源分离或者制备为杂交体。可以使用建立的方法进行编码序列与转录调节元件(例如，启动子、增强子和/或绝缘子)和/或其他氨基酸编码序列的连接。

此外，除了本发明的核酸序列外，载体还可以包含表达控制元件，允许在合适的宿主中正确表达编码区。此类控制元件是技术人员已知的并且可以包括启动子、翻译起始密码子、翻译和插入位点或者内部核糖体进入位点(IRES)(Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)，1471-1476)以将插入片段导入载体。优选地，本发明的核酸分子有效连接允许在真核或原核细胞中表达的所述表达控制序列。

确保在真核和原核细胞中表达的控制元件是本领域技术人员公知的。如上面提到的，它们通常含有确保转录起始的调节序列和任选地确保转录终止和转录物稳定化的多聚A信号。额外的调节元件可以包括转录以及翻译增强子，和/或天然结合的或者异源启动子区。允许在例如哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调节元件包含CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV启动子(劳斯肉瘤病毒)、人延伸因子1α-启动子、CMV增强子、CaM-激酶启动子或者SV40-增强子。

对于在原核细胞中表达，已经描述了多种启动子，包括例如，tac-lac-启动子、lacUV5或者trp启动子。除了负责转录起始的元件外，此类调节元件还可以包含多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-多聚-A位点或者tk-多聚-A位点。在该上下文中，合适的表达载体是本领域中已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-Vitrogene，如在所附的实施例中使用)、pSPORT1(GIBCOBRL)或pGEMHE(Promega)、或者原核表达载体，如λgt11。

根据本发明的表达载体至少能够指导本发明的核酸和蛋白质的复制，优选地表达。合适的复制起点包括例如，Col E1、SV40病毒和M13复制起点。合适的启动子包括例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、lacZ启动子、gal10启动子和苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体启动子。合适的终止序列包括例如，牛生长激素、SV40、lacZ和AcMNPV多角体多聚腺苷酸化信号。选择标记的实例包括新霉素、氨苄青霉素和潮霉素抗性等等。特别设计的载体允许DNA在不同的宿主细胞如细菌-酵母、或者酵母-动物细胞或者细菌-真菌细胞或者细菌-无脊椎动物细胞之间穿梭。

除了本发明的核酸分子外，载体还可以包含编码分泌信号的核酸序列。当本发明的多肽在果蝇细胞、优选果蝇S2细胞中表达时，优选根据本发明使用的本发明的分泌信号是本领域中公知的果蝇Bip分泌信号。在本发明的上下文中使用的优选的Bip分泌信号在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的1到28位显示。其他分泌信号序列是本领域技术人员公知的。此外，取决于使用的表达系统，能够将表达的多肽导向细胞区室的前导序列可以加入到本发明的核酸分子的编码序列中并且是本领域技术人员公知的。前导序列与翻译、起始和终止序列在合适的相位装配并且优选地，能够指导翻译的蛋白质或者其部分分泌到细胞外膜的前导序列。任选地，异源序列可以编码融合蛋白，该融合蛋白包括赋予所希望的特征如表达的重组产物的稳定化或者简化纯化的C-或者N-末端标识肽。一旦已经将载体掺入合适的宿主，那么宿主就在适合高水平表达核苷酸序列的条件下保持，并且如希望，可以接着收集和纯化本发明的蛋白质、抗原片段或者融合蛋白。当然，载体还可以包含来自病原体生物的调节区。

此外，所述载体除了可以是表达载体外，还可以是基因转移和/或基因寻靶载体。基因治疗是基因转移的最重要的应用之一，它基于通过离体(ex-vivo)或者体内技术向细胞中导入治疗基因(例如用于接种)。用于体外或者体内基因治疗的合适的载体、载体系统和方法在文献中描述并且是本领域技术人员已知的；见例如，Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813，Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Wang，Nature  Medicine  2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；Schaper，Current Opinion in Biotechnology7(1996)，635-640或Verma，Nature 389(1997)，239-242和其中引用的参考文献。

可以设计如本文所述的本发明的核酸分子和载体用于直接导入或者通过脂质体或者病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒载体)导入细胞中。此外，杆状病毒系统或者基于痘苗病毒或者Semliki病毒的系统可以用作本发明核酸分子的真核表达系统。除了重组产生外，还可以使用固相技术通过直接肽合成产生本发明的蛋白质片段、融合蛋白或者抗原性片段(参见Stewart等人(1969)Solid Phase Peptide Synthesis；Freeman Co，SanFrancisco；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85(1963)，2149-2154)。可以使用手工技术或者通过自动化进行体外蛋白质合成。例如，使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Peptide Synthesizer)(Perkin Elmer，FosterCity CA)根据生产商提供的使用说明实现自动化合成。可以单独化学合成多种片段并使用产生全长分子的化学方法组合。

本发明还涉及用本发明的核酸分子或者本发明的载体基因工程化的宿主细胞。所述宿主可以如下产生：将所述载体或者核苷酸序列导入宿主细胞，其当存在于细胞中时介导本发明的核苷酸序列编码的蛋白质的表达或者包含根据本发明的核苷酸序列或者载体，其中所述核苷酸序列和/或编码的多肽是宿主细胞外源的。

“外源的”指核苷酸序列和/或编码的多肽是宿主异源的，这意味着来自具有不同基因组背景的细胞或者生物，或者是宿主同源的但是位于与所述核苷酸序列的天然存在的副本不同的基因组环境中。这意味着，如果核苷酸序列与宿主同源，那么它不位于所述宿主的基因组中它的天然位置中，尤其它受到不同基因的包围。在该情况中，该核酸序列可以处于它的自身启动子控制下或者处于异源启动子控制下。使用本领域技术人员公知的方法，例如DNA印迹，可以确定导入的核酸分子或者载体的位置。存在于宿主中的本发明的载体或者核苷酸序列可以整合到宿主的基因组中或者它可以以某种形式保持在染色体外。在这方面，还理解本发明的核苷酸序列可以用于通过同源重组恢复或者产生突变基因。

所述宿主可以是任何原核或者真核细胞。合适的原核/细菌细胞是通常用于克隆的细胞，像大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所述真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞或者细菌细胞(例如，大肠杆菌菌株HB101、DH5a、XL1Blue、Y1090和JM101)。优选真核重组宿主细胞。真核宿主细胞的实例包括但不限于，酵母，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或者巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、人、牛、猪、猴和啮齿类来源的细胞系，以及昆虫细胞，包括但不限于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞和斑马鱼细胞。

然而，优选果蝇细胞。更优选地，所述果蝇细胞是果蝇S2(ATCCCRL-1963)，其优选用于在果蝇表达系统，例如果蝇表达系统(DES

)中表达异源蛋白质。S2细胞系来自晚期(20-24小时大)黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)胚胎的原代培养物。该通用的细胞系在室温没有CO₂的条件下快速生长并且容易适应悬浮培养。通常，当表达本发明的多肽时，优选昆虫细胞，因为它们具有含有较少或者优选无甲基化DNA的优点。因此，当表达和分离并且优选纯化本发明的多肽时，所述多肽优选不受它可以优选结合的甲基DNA的污染。使用昆虫细胞的另一优点是它们优选在无蛋白质的培养基中生长，从而当优选从培养基(如果所述多肽优选分泌到所述培养基中)分离、回收和/或纯化本发明的多肽时，减小了本发明多肽的进一步污染。

适于使用并且可通过商业途径获得的哺乳动物物种来源的细胞系包括，但不限于L细胞、CV-1细胞、COS-1细胞(ATCC CRL 1650)、COS-7细胞(ATCC CRL 1651)、HeLa细胞(ATCC CCL 2)、C1271(ATCC CRL1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。

在另一实施方案中，本发明涉及产生能够结合甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA的多肽的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并回收产生的多肽。所述多肽优选由本发明的核酸分子编码。用于产生本发明多肽的优选方法在实施例2中描述。

本发明还提供了产生能够表达本发明的多肽的细胞的方法，所述多肽能够结合甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA，该方法包括通过本领域中已知的或者本文描述的体外方法基因工程化细胞。所述多肽优选由本发明的核酸分子编码。

在本领域中存在用于在合适的宿主中产生多肽的多种合适的方法。如果宿主是单细胞生物或者哺乳动物或者昆虫细胞，本领域技术人员可以采用多种培养条件，其可以进一步优化而不用过度的工作负担。方便地，通过成熟的技术从培养基或者从分离的(生物)膜收获产生的蛋白质。此外，可以直接从宿主细胞分离产生的多肽。

通过微生物学方法或者转基因哺乳动物可以产生本发明的多肽。还设想从转基因植物回收本发明的多肽。备选地，可以合成或者半合成地产生本发明的多肽。

例如，可以使用化学合成，如Houghton Proc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985)，5131-5135所述的固相方法。另一种方法是mRNA的体外翻译。优选的方法涉及在上述宿主细胞中重组产生蛋白质。例如，包含根据本发明的核酸序列的任一种的全部或者部分的核酸序列可以通过PCR合成，插入到表达载体中，并用该表达载体转化宿主细胞。之后，培养宿主细胞以产生目的多肽，将其分离或者纯化。可以通过几种已知的技术的任一种实现蛋白质分离和纯化；所述技术为例如但不限于，离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、制备圆盘凝胶电泳。此外，无细胞的翻译系统可以用于产生本发明的多肽。根据本发明使用的合适的无细胞表达系统包括兔网织红细胞裂解物、麦胚抽提物、犬胰脏微粒体膜、大肠杆菌S30提取物，和偶联的转录/翻译系统，如TNT-系统(Promega)。这些系统允许在加入含有编码序列和合适的启动子元件的克隆载体、DNA片段或者RNA序列时表达重组多肽或者肽。如上文提到的，蛋白质分离/纯化技术可以需要用常规方法修饰本发明的蛋白质。例如，可以将组蛋白标签加到蛋白质以允许在镍柱上纯化。其他修饰可以导致更高或者更低的活性，允许更高水平的蛋白质产生，或者简化蛋白质的纯化。产生本发明的多肽后，它可以通过PEG化、衍生等等修饰。

在另一实施方案中，本发明涉及特异结合本发明的多肽的抗体。优选地，多肽具有结合甲基化DNA的能力并且是如本文描述的双功能蛋白质。

术语“特异”在该上下文中指抗体与本发明的多肽反应，但是不与所述多肽的仅部分反应，即，不与甲基-DNA结合结构域、Fc部分或者前导或者分泌序列反应。然而，所述抗体可以特异结合本发明的多肽的多肽接头(如果存在这种多肽接头)。

因此，所述抗体特异结合例如本发明多肽的甲基-DNA结合结构域和Fc部分的部分或者特异结合甲基-DNA结合结构域和接头多肽的部分或者特异结合接头多肽的部分和Fc部分，或仅结合接头多肽。不管抗体是否如上文定义的特异反应，其都可以通过将所述抗体与如上述部分和仅与本发明多肽的各自部分的结合反应进行比较来测试。

本发明的抗体可以是例如多克隆或者单克隆的。术语“抗体”还包括其仍然保留结合特异性的衍生物或者片段。用于产生抗体的技术是本领域公知的并且在例如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中描述。这些抗体可以用于例如本发明多肽的免疫沉淀和免疫定位以及监视此类多肽例如在重组生物或者诊断中的存在。它们还可以用于鉴定与根据本发明的蛋白质相互作用的化合物(如下文提到的)。例如，如用于BIAcore系统中的表面等离子体共振可以用于增加结合本发明多肽的表位的噬菌体抗体的效率(Schier，HumanAntibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995)，7-13)。

本发明还包括嵌合、单链和人源化抗体，以及抗体片段，像Fab片段等等。抗体片段或者衍生物还包含F(ab′)2、Fv或scFv片段；见例如Harlowand Lane，上文。多种步骤是本领域中已知的并且可以用于产生此类抗体和/或片段。从而，(抗体)衍生物可以通过肽模拟物产生。此外，对产生单链抗体描述的技术(见美国专利4,946,778)可以适于产生针对本发明多肽的单链抗体。而且，转基因动物也可以用于表达针对本发明多肽的人源化抗体。最优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体的任一种技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(

和Milstein Nature 256(1975)，495-497)、三瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。描述产生单链抗体的技术(例如，美国专利4,946,778)可以适于产生针对如上述的免疫原性多肽的单链抗体。此外，转基因小鼠可以用于表达针对所述免疫原性多肽的人源化抗体。尤其优选根据本发明使用或者能够在细胞中表达的抗体/抗体构建体以及抗体片段或者衍生物。这可以通过直接注射对应的蛋白质分子或者通过注射编码所述蛋白质分子的核酸分子来实现。此外，设想基因治疗方法。因此，在本发明的上下文中，术语“抗体分子”涉及完整免疫球蛋白分子以及此类免疫球蛋白分子的部分。此外，如上文讨论的，该术语涉及修饰的和/或改变的抗体分子，像嵌合和人源化抗体。该术语还涉及单克隆或者多克隆抗体以及重组或者合成产生的/合成的抗体。该术语还涉及完整抗体以及其抗体片段，像分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)2。术语“抗体分子”还包括双功能抗体和抗体构建体，像单链Fvs(scFv)或抗体-融合蛋白。在本发明上下文中还设想术语“抗体”包括可以在细胞中表达的抗体构建体，例如，可以通过病毒或者载体转染和/或转导的抗体构建体。当然，本发明的抗体可以偶联、连接或者缀合到如上文关于本发明多肽的Fc部分描述的可检测的物质。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或者抗体的组合物。

根据本发明使用的术语“组合物”涉及包含至少一种前述化合物的组合物。设想下文描述的本发明的组合物包含任一组合的前述化合物。它可以任选地包含能够结合甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA的其他分子。组合物可以是固体、液体或者气体形式并且可以为粉剂、片剂、溶液剂、气溶胶、粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体、酏剂、浸膏、酊剂或者流浸膏的形式或者尤其适于口服或肠胃外或者局部施用的形式。

此外，本发明涉及包含本发明的核酸分子、载体、宿主、多肽或者抗体的试剂盒。

有利地，本发明试剂盒还任选包含反应缓冲液、贮存溶液和/或进行科学或者诊断测试等等所需的剩余的试剂或者材料。此外，本发明的试剂盒的部分可以单独包装在小瓶或者瓶子中或者组合在容器或者多容器单位中。

本发明的试剂盒可以有利地用于实施如本文所述的分离、富集、纯化和/或检测甲基化DNA的方法和/或它可以用于本文提到的多种应用中，例如，作为诊断试剂盒、作为研究工具或者治疗工具。此外，本发明的试剂盒可以含有适合科学、医学和/或诊断目的的检测手段。试剂盒的生产优选按照本领域技术人员已知的标准方法。

如上所述，本发明基于如下令人惊奇的发现：包含甲基-DNA结合结构域和抗体的Fc部分的双功能的抗体样分子能够以高亲和性和高亲合性特异结合甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA，其使得它是用于从多于10ng、小于10ng、小于7.5ng、小于5ng、小于2.5ng或者约1ng样品中分离、富集和/或检测甲基化DNA的合适的诊断工具。

因此，在优选实施方案中，根据本发明的组合物是诊断组合物，其任选还包含合适的检测手段。

本发明的另一实施方案是本发明的多肽用于检测甲基化DNA的用途。

此外，本发明的核酸分子、多肽、载体、宿主细胞或者抗体用于制备用于检测甲基化DNA的诊断组合物。

此外，本发明的核酸分子、多肽、载体、宿主细胞或者抗体用于制备用于检测肿瘤组织或者肿瘤细胞的诊断组合物。

如本文提到的，本发明的多肽具有出乎意料的优良性质，尤其用于分离、富集、纯化和/或检测甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA。从而，本发明提供了本发明多肽的多种诊断用途和其使用方法。甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA的优选的小规模富集方法在实施例3中描述。简言之，本发明的多肽结合到例如蛋白A sepharose并洗涤以除去未结合的蛋白质。接着，将目的DNA优选消化并加入到本发明的结合的多肽。此外，将所述消化的DNA与本发明的结合的多肽温育，洗涤并被本发明的多肽结合后，进行洗脱。

因此，本发明还涉及检测甲基化DNA的体外方法，其包括：

(a)将包含甲基化和/或未甲基化DNA的样品与本发明的多肽接触；和

(b)检测所述多肽与甲基化DNA的结合。

优选地，所述体外方法是如实施例3中示例的反向South-Western印迹、甲基化DNA的免疫沉淀、亲和纯化或者如实施例4和5中示例的甲基-CpG-免疫沉淀(MCIp)。然而，所述体外方法不限于此，而是可以基本上为任何步骤，其中本发明的多肽连接到固体基质，例如，诸如sepharose、琼脂糖、毛细管、容器壁的基质，如本文中也关于本发明的诊断组合物所述。

更优选地，前述体外方法还包括作为步骤(c)的分析甲基化DNA，例如，通过测序、DNA印迹、限制酶消化、亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序(pyrosequencing)或者PCR来分析。然而，通过使用本发明的多肽分析已经分离、富集、纯化和/或检测的甲基化DNA不限于前述方法，而是包括本领域中已知的用于分析甲基化DNA的所有方法，例如，RDA、微阵列等等。

本发明多肽的优选的诊断应用是图7中显示的所称作的MB-PCR。简言之，在第一步中，将本发明的多肽加入可包被的PCR容器，例如，来自Nunc的TopYield Strips。这样，通过本领域中已知的技术将多肽优选包被到所述容器的内表面。下一步，向被包被的PCR容器加入封闭试剂，例如，4.5％奶粉。在另一步中，向经包被和封闭的PCR容器优选加入目的DNA片段(例如，甲基化和/或未甲基化的DNA片段)。认为本发明的多肽特异结合甲基化DNA(如果存在)。在下一步中，将优选含有DNA片段的经包被和封闭的PCR容器温育然后洗涤以除去未结合的DNA片段。之后，加入PCR混合物以优选进行实时PCR或者常规PCR，接着电泳以分离扩增产物，所述PCR混合物优选包括基因特异性引物，或者还优选地，用于例如怀疑被甲基化或者未甲基化的目的基因或者基因座的多路PCR的至少2、3、4、5、6、7等等个引物对。

优选如下进行MB-PCR：

优选地，使用热稳定的TopYield^TM Strips(Nunc Cat.No.248909)制备PCR管。优选地，将优选为重组形式的50μl本发明多肽(在10mMTris/HCl pH 7.5中稀释为15μg/ml)加入每孔中并在4℃过夜温育。优选地，用200μl TBS(20mM Tris，pH 7.4，含有150mM NaCl)洗涤孔三次，并在4℃用100μl封闭溶液(10mM Tris，pH 7.5含有150mM NaCl，4.5％脱脂奶粉，5mM EDTA和0.8μg/ml每种多聚d(I/C)，多聚d(A/T)和多聚d(CG))过夜封闭。优选地，然后用200μl TBST(含有0.1％Tween-20的TBS)洗涤管三次。

优选地，向每孔加入50μl结合缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，含有400mM NaCl，2mM MgCl2，0.5mM EDTA，和0.1％Tween-20)，并优选向每第二个孔加入1μl消化的DNA，优选用MseI消化的基因组DNA，其量优选为10ng/μl(M-反应)。

优选通过本领域已知的试剂盒，例如，使用Blood and Cell CultureMidi Kit(Qiagen)制备基因组DNA。优选通过琼脂糖凝胶电泳控制基因组DNA制备物的质量，并优选通过UV分光光度法测定DNA浓度。优选使用PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes)进行DNA的定量。

将含有本发明的多肽和DNA，优选DNA片段(通过酶促消化或者机械断裂产生)的孔在振荡器上优选在4℃下温育3小时。优选地，将管用200μl结合缓冲液(Binding Buffer)洗涤三次并用10mM Tris/HCl pH 7.5洗涤一次。接着，优选直接在TopYield^TM Strips中进行PCR。优选地，PCR-Mix(50μl/孔)含有标准PCR缓冲液(Roche)，优选2.5U FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)，优选10pmol每种基因特异性引物(由Qiagen合成)、dNTPs(优选每种200mM，Amersham/Pharmacia)，优选1M甜菜碱(Sigma)。特定目的基因的引物序列和循环参数在实施例6的表2和3中显示。当然，本领域技术人员可以设计任何其他合适的基因特异性或者基因座特异性或者多个基因座特异性引物。此外，技术人员可以容易确定和/或测试最适合引物和基因、一个或多个目的基因座的PCR参数。加入PCR混合物后，优选将1μl Mse I-消化的DNA(优选10ng/μl的量)加入每隔二个孔，其以前不与DNA片段温育(P-反应)。优选地，使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并使用例如Typhoon 9200 Imager(Amersham/Pharmacia)扫描溴化乙锭染色的凝胶。

因此，设想本发明的多肽可用于检测下文中描述的样品中甲基化DNA，优选地CpG甲基化DNA，所述样品可以包括一个或多个单个细胞。还设想可用于完整细胞。“完整细胞”指完整单个细胞的基因组背景。从而它可以用于甲基化DNA的基因组范围的分析。

此类方法优选包括使用本发明多肽对甲基化DNA的富集/纯化步骤和检测步骤，例如，基因组DNA微阵列的杂交、嵌合阵列(tiling arrays)、低密度阵列或者芯片实验室(lab-on-a-chip)方法。本领域技术人员可容易进行本领域中公知的检测方法。这些方法的一些在所附的实施例中显示，其中本发明的多肽用于富集、纯化和/或分离甲基化DNA。一个实施例显示了所称作的MB-PCR，其可以适于高通量、稳健的单管测定法。此外，本发明的多肽尤其可用于在单个基因水平上检测CpG甲基化。此类方法优选包括富集和/或纯化单个基因的甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA的步骤和通过使用PCR、实时PCR等检测所述甲基化DNA的步骤。

本发明多肽的另一种可能的诊断应用是免疫组织化学。因此，本发明的多肽可以用于“染色”甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA。本发明的多肽通过它的Fc部分偶联、连接或者缀合到如本文描述的合适的检测物质，或者例如，将第二种抗-Fc部分抗体用于检测结合到甲基化DNA的本发明的多肽。

认为通过本发明的方法通过一些恶性肿瘤的甲基化模式/分布图可以检测这些恶性肿瘤，所述甲基化模式/分布图从而可以具有预后和/或可预测的价值。这意味着甲基化模式可以用于为患者设立药理学谱。例如，如果检测到某些癌基因和/或肿瘤抑制基因被超甲基化或低甲基化，那么可以确定对例如抗癌药物的易感性和/或敏感性。因此，技术人员选择最合适的药物避免阴性和/或不利效果，如果例如所述药物可以抑制癌基因的话，尽管所述癌基因已经被超甲基化并且从而认为它它们是元活性的。

本文描述的方法可以用于首先鉴定在恶性如癌症或肿瘤疾病中超甲基化或者的低甲基化的基因座和/或基因并且其次，提供在单个基因水平上测定所述基因座和/或基因的甲基化状态的基础。所述恶性优选是肿瘤。肿瘤可以是任何可能类型的肿瘤。实例是皮肤、乳腺、脑、宫颈癌、睾丸癌、头和颈癌、肺、纵隔、胃肠道、生殖泌尿系统、妇科系统、乳腺、内分泌系统、皮肤、儿童期、未知的原发部位或者转移性癌、软组织和骨的肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、中枢神经系统的肿瘤、淋巴瘤、白血病、瘤外综合征、腹膜carcinomastosis、免疫抑制相关的恶性和/或转移性癌等等。肿瘤细胞可以例如来自：头和颈，包括鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽部、唾液腺的肿瘤和神经节细胞瘤、肺的癌症，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、纵隔癌、胃肠道癌，包括食管、胃、胰腺、肝脏、胆系、小肠、结肠、直肠和肛门区的癌、生殖泌尿系统的癌，包括肾、尿道、膀胱、前列腺、尿道、阴茎和睾丸的癌、妇科癌，包括宫颈、阴道、阴门、子宫体、妊娠滋养层细胞病、卵巢、输卵管、腹膜的癌症，乳腺癌、内分泌系统癌，包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质的肿瘤、胰腺内分泌肿瘤、类癌瘤和类癌综合征、多发性内分泌腺肿瘤形成、软组织和骨的肉瘤、间皮瘤、皮肤癌、黑素瘤，包括皮肤黑素瘤和眼内黑素瘤，中枢神经系统的肿瘤、儿童期癌症，包括视网膜成神经细胞瘤、Wilm肿瘤、多发性神经纤维瘤、成神经细胞瘤、Ewing肉瘤家族的肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤，和霍奇金病、白血病，包括急性白血病、慢性髓性和淋巴细胞白血病、浆细胞肿瘤和骨髓异常增生综合征、瘤外综合征、未知的原发部位的癌症、腹膜carcinomastosis、免疫抑制相关的恶性肿瘤，包括艾滋病相关的恶性肿瘤，包括卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、艾滋病相关的原发性中枢神经系统淋巴瘤、艾滋病相关的霍奇金病和艾滋病相关的肛门生殖器癌，和移植相关的恶性肿瘤、向肝脏的转移性癌症、向骨的转移性癌症、恶性胸膜和心包渗出液和恶性腹水。最优选所述癌症或者肿瘤疾病是头和颈、肺、纵隔、胃肠道、生殖泌尿系统、妇科系统、乳腺、内分泌系统、皮肤、儿童期、未知的原发部位或者转移性癌症、软组织和骨的肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、中枢神经系统癌、淋巴瘤、白血病、瘤外综合征、腹膜carcinomastosis、免疫抑制相关的恶性肿瘤和/或转移性癌。优选的肿瘤是AML、浆细胞瘤或者CLL。

本发明的诊断组合物包含至少一种本文描述的本发明的化合物。诊断组合物可以用于分离、富集和/或确定例如来自如上述的个体的样品中甲基化DNA、优选CpG甲基化DNA的存在。

根据本发明，术语“样品”意指来自个体、细胞系、组织培养物或者含有多核苷酸或者多肽或者其部分的其他来源的任何生物样品。如所指出的，生物样品包括发现表达本发明的多核苷酸的体液(如血液、血清、血浆、尿液、滑膜液和脊髓液)和组织来源。从哺乳动物得到组织活检样品和体液的方法是本领域中公知的。包括基因组DNA、mRNA或蛋白质的生物样品优选为来源。

诊断组合物的其他应用在本文描述并且在所附的实施例中显示。

诊断组合物任选包含用于检测的合适的手段。上述核酸分子、载体、宿主、抗体和多肽例如适于用于免疫测定中，其中它们可以以液相使用或者结合到固相载体。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯离子、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。对于本发明，载体的性质可以是可溶的或不溶的。

固相载体是本领域中已知的并且可以包含聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝酸纤维素strips、膜、片、duracytes和反应盘的孔壁、塑料管或者其他试管。用于在固相上固定核酸分子、载体、宿主、抗体、适体、多肽等等的合适的方法包括但不限于，离子、疏水、共价相互作用或者(化学)交联等等。可以利用本发明的所述化合物的免疫测定法的实例为直接或者间接形式的竞争和非竞争免疫测定法。常用的检测测定法可以包括放射性同位素或非放射性同位素方法。此类免疫测定法的实例是放射免疫测定法(RIA)、夹层(免疫测定)和RNA印迹或DNA印迹测定法。此外，这些检测方法包括IRMA(免疫放射免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、和CLIA(化学发光免疫测定)。此外，本发明的诊断化合物可以用于像FRET(荧光共振能量转移)测定的技术中。

合适的标记和用于标记的方法是本领域中技术人员已知的。可以用于本发明的标记类型的实例包括荧光染料(像萤光素、罗丹明、Texas Red等等)、酶(像辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(像³²p、³³p、³⁵S或¹²⁵I)、生物素、洋地黄毒苷、胶体金属、化学或者生物发光化合物(像二氧杂环丁烷、鲁米诺或者acridiniums)。

多种技术可以用于标记生物分子，它们是本领域技术人员公知的并且被认为在本发明的范围内，并且包括共价偶联酶或生物素基团、磷酸化、生物素化、随机引发、缺口翻译、加尾(使用末端转移酶)。此类技术例如在Tijssen，″Practice and theory of enzyme immunoassays″，Burden andvon Knippenburg(Eds)，Volume 15(1985)；″Basic methods in molecularbiology″，Davis LG，Dibmer MD，Battey Elsevier(1990)；Mayer，(Eds)″Immunochemical methods in cell and molecular biology″Academic Press，London(1987)；或在系列″Methods in Enzymology″，Academic Press，Inc中描述。检测方法包括但不限于，放射自显影、荧光显微术、直接和间接酶促反应等等。

本发明的另一优选的组合物是药物组合物，其任选还包含可药用载体。所述药物组合物包含本发明的多肽，其可以偶联到另一种肽，例如，组蛋白脱乙酰酶、组蛋白乙酰基转移酶、DNA-甲基化酶和/或DNA脱甲基酶。它还可以偶联限制酶或者核酶。认为如果偶联如上述的一种或多种其他蛋白质的本发明的多肽结合到甲基化DNA，那么它可以将所述蛋白质进一步靶定DNA。因此，DNA甲基化酶可以超甲基化或者低甲基化DNA，例如，低甲基化的癌基因基因座或者癌基因或者DNA。这样，可以实现基因失活。

备选地，DNA脱甲基酶可以脱甲基超甲基化的基因或者基因座，例如，肿瘤抑制基因或者基因座。这样，可以实现基因活化。

组蛋白脱乙酰酶通过脱乙酰组蛋白的乙酰化的赖氨酸残基，从而导致DNA与组蛋白的更紧密包装并抑制基因，造成活性基因的转录抑制。如本领域中已知，组蛋白乙酰基转移酶可以进行相反作用。

限制酶或者核酶当靶定将被切割的DNA时可以发挥它的作用。合适的限制酶是本领域中已知的。可以如本领域中已知的制备靶DNA序列特异性核酶。

因此，药物组合物可以用于治疗癌症和/或瘤性疾病。它们都已知由不受控制的基因表达、活化和/或抑制引起，其受到组蛋白乙酰化/脱乙酰化和/或DNA-甲基化/脱甲基化的调节。

如本文所述，可以用生理上可接受的载体将药物组合物施用于患者。在特定实施方案中，术语“可药用的”指得到管理机构或者其他公认的药典认可用于动物或者更具体地用于人中。术语“载体”指用于施用治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或者载体。此类药物载体可以是无菌的液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液态载体，尤其用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、硬脂酸甘油酯、滑石、钠离子、干燥的脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果希望，组合物还可以含有少量增湿剂或者乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等等的形式。用常规黏合剂和载体如甘油三酯可以将组合物配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中描述。此类组合物将含有治疗有效量的前述化合物，优选纯化形式的前述化合物，以及合适量的载体以提供正确施用于患者的形式。制剂将适于施用方式。

在另一优选实施方案中，根据常规方法将组合物配制成适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，成分单独或者混合在一起以单位剂型提供，例如，作为密封容器如安瓿或者小囊中的冻干的粉剂或者无水浓缩物，所述容器指示活性成分的量。当通过输注施用组合物时，它可以用含有无菌药物级水或者盐水的输注瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供用于注射用无菌水或者盐水的安瓿从而可以在施用前混合成分。

本发明的药物组合物可以配制为中性或者盐形式。可药用盐包括用阴离子如来自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐和用阳离子如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的阳离子形成的盐。

体外测定可以任选用于帮助鉴定最佳的剂量范围。用于制剂的精确剂量将还依赖于施用途径、疾病或病症的严重性，并且将根据开业医生的判断和每名患者的情况决定。可以从来自体外或者动物模型试验系统的剂量反应曲线外推有效剂量。优选地，药物组合物直接或者与辅药组合施用。

优选将药物组合物设计成在基因治疗中应用。基因治疗的技术已经关于本发明的核酸分子在上文中描述并且其中所有所述的也适用于药物组合物。例如，药物组合物中核酸分子优选为允许它导入、表达和/或稳定整合到将治疗的个体的细胞中的形式。

对于基因治疗，可以利用多种病毒载体，例如，腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒，或者优选地，RNA病毒，如逆转录病毒。其中可以插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多额外的逆转录病毒载体也可以掺入到多个基因中。所有这些载体可以转移或者掺入选择标记的基因使得可以鉴定和产生转导的细胞。通过插入例如，编码糖、糖脂或者蛋白质的多核苷酸，可以使得逆转录病毒是靶标特异的。本领域技术人员将知道或者不用过度的实验容易地确定特定多核苷酸序列，所述序列可以插入到逆转录病毒基因组以允许含有插入的多核苷酸序列的逆转录病毒载体的靶标特异递送。

因为重组逆转录病毒优选是缺陷的，所以它们需要帮助以产生感染性载体颗粒。例如通过使用辅助细胞系可以提供该帮助，所述辅助细胞系含有编码逆转录病毒的所有结构基因的质粒，所述结构基因处于LTR内调节序列的控制下。这些质粒缺少使得包装机制是识别用于壳体化的RNA转录物的核苷酸序列。具有包装信号缺失的辅助细胞系包括，但不限于例如w2、PA317和PA12。这些细胞系产生空病毒体，因为没有基因组被包装。如果将逆转录病毒载体导入此类包装信号是完整的但是结构基因被其他目的基因替换的细胞中，那么载体可以包装并且产生载体病毒体。备选地，可以通过常规磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染NIH 3T3或者其他组织培养物细胞。然后用含有目的基因的载体质粒转染这些细胞。所得的细胞释放逆转录病毒载体到培养基中。本发明的核酸分子的另一种定向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合体、毫微型胶囊、微球体、珠和基于脂类的系统，包括水包油乳剂、微粒、混合微粒、和脂质体。本发明的优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜囊，其可以用作体外和体内递送载体。已经表明大小为0.2-4.0pm的大单层脂质体(LUV)可以包裹很大百分比的含有大分子的水性缓冲液。RNA、DNA和完整病毒体可以包裹在水性内层并以生物活性形式递送到细胞(Fraley，等人，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。除了哺乳动物细胞，脂质体还可以用于递送多核苷酸到植物、酵母和细菌细胞中。为了使脂质体成为有效的基因转移载体，应该存在下面的特征：(1)以高效率包裹目的基因而不损害它们的生物活性；(2)与非靶细胞相比，优先和实质结合靶细胞；(3)以高效率递送囊泡的水性内含物到靶细胞细胞质；和(4)准确和有效表达遗传信息(Mannino，等人，Biotechniques，6：682，1988)。脂质体的组成通常是磷脂类，尤其高相变温度磷脂的组合，通常与类固醇、特别是胆固醇组合。还可以使用其他磷脂或者其他脂类。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。用于脂质体产生的脂类的实例包括磷脂酰基化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。尤其有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂类部分含有14-18个碳原子，尤其16-18个碳原子，并且是饱和的。阐明性磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶定可以基于解剖学和机械因素分类。解剖学分类可以基于选择性水平，例如，器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。机械靶定可以基于它是被动还是主动的来区分。被动靶定利用脂质体分布到含有窦状毛细血管的器官中网状内皮系统(RES)的细胞中的天然倾向。

在优选实施方案中，本发明的组合物可以用于体内成像甲基化DNA，优选CpG甲基化DNA。因此，将所述组合物施用于需要其的受试者。在本发明的上下文中，术语“受试者”指需要情感障碍治疗的个体。优选地，受试者是脊椎动物，甚至更优选哺乳动物，尤其优选人。术语“施用的”指对个体施用治疗或者诊断有效剂量的编码本发明多肽的前述核酸分子。“治疗或诊断有效量”指所施用的产生效果的剂量。精确剂量将取决于治疗或者诊断目的，并且将通过本领域技术人员使用已知的技术确定。如本领域中已知和上述的，对全身对比局部递送、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和状况的严重性的调节是必要的，并且将通过本领域技术人员通过常规实验确定。方法可以应用于人治疗和兽医应用。本文所述的具有所希望的治疗活性的化合物可以以生理上可接受的载体施用于患者，如本文所述。取决于导入的方式，可以以如下文讨论的多种方法配制化合物。制剂中治疗活性化合物的浓度可以从约0.1-100wt％变化。活性剂可以单独或者与其他治疗组合施用。

可以以如上讨论的多种方式进行药物组合物的施用，所述方式包括，但不限于，口服、皮下、静脉内、动脉内、结节内、髓内、鞘内、心室内、鼻内、支气管内、经皮、结节内、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠、或者眼内方式。在一些情况中，例如，在伤口和炎症的治疗中，候选活性剂可以作为溶液干燥喷雾直接应用。

主治医生和临床因素将决定剂量方案。如医学领域中公知，任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、将施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康、和同时施用的其他药物。典型的剂量可以是例如0.001到1000μg范围；然而，设想低于或高于该示例范围的剂量，特别考虑前面的因素。

剂量优选每周一次给予，然而，在治疗的进展期间，剂量可以以更长的时间间隔给予，并且需要时可以以更短的时间间隔例如每天给予。在优选情况中，使用本文所述的方法和本领域技术人员已知的其他方法监视免疫应答并且，例如，在时间、量和/或组成方面优化剂量。剂量将改变，但是DNA的静脉内施用的优选剂量为约10⁶到10¹²个拷贝/DNA分子。如果方案是连续输注，那么它将还在1μg到10mg单位/kg体重/分钟的范围内。可以通过定期评估监视进展。可以局部或全身施用本发明的药物组合物。施用将优选是肠胃外，例如静脉内的。肠胃外施用的制剂包括无菌水性或者非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油、和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂和混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖注射液、葡萄糖和钠离子、乳酸林格注射液或者不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格葡萄糖注射液的那些)，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。

还设想药物组合物与其他药物用于共同治疗方法中，所述其他药物为例如用于检测甲基化DNA并且从而例如用于诊断可以显示出典型的甲基化模式的恶性肿瘤的药物。

附图描述：

图1：图1显示了质粒pMTBip/MBD2-Fc的核苷酸序列和质粒pMTBip/MBD2-Fc编码的MBD2-Fc双功能蛋白质的蛋白质序列(粗体)。MBD2-Fc双功能蛋白质的氨基酸序列具有下面的特征。

AA 1-28(nt 851-934)：果蝇BiP分泌信号(来自pMT/Bip/V5-His载体的前导肽)

AA 29-115(nt 935-1196)：人MBD2的AA 144-230

AA 116-129(nt 1196-1237)：柔性接头(AAADPIEGRGGGGG)

AA 130-361(1238-1933)：人IGHG1的AA99-330

图2：MBD2-F_c在果蝇Schneider细胞中的表达。将稳定转染的S2细胞接种在培养基w/o FCS中，其具有w/o 500μM CuSO₄。4天后收集上清液并在4℃使用sepharose珠进行预清除。将1ml预清除的上清液用蛋白Asepharose沉淀、洗涤、重悬浮在SDS-上样染料中并进行SDS-PAGE。凝胶用考马斯染色以检测沉淀的蛋白质。

图3：反向South-Western印迹.将人ICSBP启动子的50bp PCR片段(A)或者不同CpG密度的甲基化启动子片段(50ng)(CpG-二核苷酸数目/100bp：ICSBP：10，6；CHI3L1：2，9；TLR2：6，2；TLR3：2，1)用SssI甲基化，进行琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色显示为对照)并直接印迹到尼龙膜上。如实施例3所述将膜用MBD2-Fc、HRP缀合的抗人Fc和ECL染色。

图4：甲基化CpG与MBD-Fc珠的依赖于盐浓度的结合(A)人启动子片段的图示。圆形标记CpG二核苷酸的位置(ο：未甲基化的-CPM；·SssI甲基化的-CCL13，TLR2，CHI3L1)。(B，C)甲基化的和未甲基化的片段的混合物结合到MBD2-Fc-sepharose(给出了MBD2-Fc的量/50μl蛋白Asepharose)，用增加的盐浓度洗脱，纯化并使用琼脂糖凝胶电泳分离(与1/5输入混合物一起)。用溴化乙锭显示带并用Typhoon Imager(Pharmacia-Amersham)扫描。

图5：通过MCIp对CpG岛的富集。将所示细胞类型的基因组DNA(300ng)进行MCIp。使用LightCycler实时PCR定量三种CpG岛启动子(TLR2、p15和ESR1)的富集。相对于未处理的基因组DNA对照显示了从MCIp洗脱液扩增的具体启动子片段的量。在THP-1细胞中检测不到p15启动子，表明该基因突变或者缺失。

图6：通过MCIp检测甲基化CpG岛的灵敏性。将减少量的受限的基因组U937DNA进行MCIp。使用LightCycler实时PCR定量两种CpG岛启动子(TLR2，p15)的富集。相对于未处理的基因组对照显示了从MCIp洗脱液扩增的具体启动子片段的量。

图7：MB-PCR的原理。该图显示了MB-PCR的图示。

图8：在正常和四种白血病DNA样品中TLR2、ESR1和p15启动子的MB-PCR。将所示细胞类型的基因组DNA(10ng)进行MB-PCR。通过标准基因组PCR检测三种CpG岛启动子(TLR2、p15和ESR1)的富集。在THP-1细胞中检测不到p15启动子，表明该基因突变或缺失。

图9：使用实时PCR对特定CpG岛启动子中CpG甲基化的MCIp检测。(A-C)将分级的甲基-CpG免疫沉淀(MCIp)与实时LightCycler PCR组合以检测来自未处理的(灰色条形)和SssI甲基化和MseI限制的基因组DNA片段(黑色条形)的所示基因的甲基化状态。从MCIp洗脱液回收的基因片段(NaCl浓度(mM)在上面的方框中给出)和等量的输入DNA通过LightCycler-PCR扩增。个体级分的值(平均值±SD，n＝4)代表回收的百分比并且相对于从各自输入DNA(100％)产生的PCR产物的量计算。每个图上图示了对应于CpG岛的3kB区域。每个CpG二核苷酸通过垂直线表示。外显子的位置以灰色框指出，转录起始位点用箭头指出。白色框代表100bp片段。黑色框指出所检测的MseI片段的位置。(D-G)通过如上的实时PCR分析三种人骨髓白血病细胞系(KG-1、U937和THP-1)以及正常人血液单核细胞(N)的高盐(1000mM)MCIp级分中的SNRPN、TLR2、ESR1和CDKN2B基因片段。

图10：MCIp方法的灵敏性和线性。(A)将减少量的MseI处理的U937DNA进行MCIp。如上定量CDKN2B和TLR2基因片段。(B)将正常人血单核细胞(N)和KG-1细胞的MseI处理的DNA以所示的比例混合并将混合物进行MCIp并用如上的LightCycler-PCR定量TLR2基因片段。

从下面的实施例可以更好地理解本发明并看出它的许多优点，这些实施例仅用于阐明的目的，并且不意在以任何方式限定本发明的范围。

实施例1：pMTBip/MBD2-Fc的克隆

使用引物MBD2-Nhe_S(5’-AGA TGC TAG CAC GGA GAG CGGGAA GAG G-3’)(SEQ ID NO：4)和MBD2-Not_AS(5’-ATC ACG CGGCCG CCA GAG GAT CGT TTC GCA GTC TC-3’)(SEQ ID NO：5)和Herculase DNA聚合酶(Stratagene)从反转录的人原代巨噬细胞总RNA通过PCR扩增对应于人MBD2的甲基-CpG结合结构域(MBD)(Genbank acc.no.NM_003927；AA 144-230)的cDNA。循环参数为95℃3分钟变性；95℃，20s，65℃，20s，72℃，80s扩增34个循环；72℃，5min最后延伸。将PCR产物沉淀，用Not I/Nhe I消化，克隆到Signal pIg plus载体(Ingenius，R&DSystems)的NotI/NheI位点中并验证序列得到pIg/MBD2-Fc(真核生物表达载体)。为了克隆用于在果蝇S2细胞中重组表达的pMTBip/MBD2-Fc，将含有融合到人IgG1的Fc尾的人MBD2的MDB的pIg/MBD2-Fc的ApaI/Nhe I片段亚克隆到pMTBiP/V5-His B(Invitrogen)的Apa I/Spe I位点。

实施例2：抗体样甲基-CpG-DNA结合蛋白的重组表达

使用5-mC抗体可以有效检测单链但是非双链的DNA分子中的甲基化胞嘧啶。为了能够像抗体那样检测双链CpG甲基化DNA，构建将如上面实施例1中描述的载体，其编码融合蛋白，该融合蛋白包含人甲基-CpG-结合结构域2(MDB2)的甲基-CpG结合结构域(MBD)、柔性接头多肽和人IgG1的Fc部分。蛋白质在果蝇S2 Schneider细胞中处于金属可诱导的启动子的控制下表达，并通过蛋白A亲和层析从上清液收集。纯化的蛋白质以大量(4-5mg/L细胞培养物上清液)表达并且具有约40kDa的预期分子量(图2)。

因此，详细地，由于几种原因选择昆虫细胞系统用于重组表达MBD2-Fc蛋白。主要原因是不存在或者存在低丰度的CpG甲基化。在哺乳动物(特别是人)细胞中产生该蛋白质可以导致DNA污染(结合到细胞培养上清液中的MBD2-Fc蛋白质)，其可以使得CpG甲基化DNA的随后分析复杂化。其他原因包括简单的培养条件和蛋白质的可能的高产量。

果蝇S2细胞从ATCC得到并且在培养箱中25℃下含有10％FCS(PAA)的Insect-Xpress培养基(Bio Whittaker)中培养。

使用Effectene转染试剂(Qiagen)根据生产商的方案用1.5μgpMTBip/MBD2-Fc和0.3μg pCoHygro(Invitrogen)的混合物转染4x 10⁶果蝇S2细胞/60mm细胞培养皿。在第三天，收获转染的细胞，洗涤并在含有10％FCS和300μg/ml潮霉素(BD Biosciences)的选择培养基(Insect-Xpress)中再次平板接种。在5周内每4-5天更换选择培养基。将稳定转染的果蝇S2细胞库扩大并将几个等分试样在液氮中保存。

对于大规模生产，在2000ml旋转瓶中没有FCS(任选地：300μg/ml潮霉素)的100-200ml Insect-Xpress中培养1-5x10⁸个细胞后加入0.5mMCuSO₄。每4-7天收获培养基并将细胞再次平板接种在补充CuSO₄的培养基中进一步产生蛋白质。合并细胞培养上清液，对TBS(pH 7.4)透析并使用蛋白A柱纯化。合并含有MBD-Fc的级分并对TBS(pH7.4)透析。稳定转染的果蝇S2细胞产生3-5mg重组MBD2-Fc蛋白/升细胞培养上清液。

实施例3：在膜上检测CpG甲基化的DNA(反向South-Western印迹)

为了测试在Western印迹样的步骤中，MBD2-Fc是否能够检测膜上CpG甲基化的DNA，我们使用等同于常规DNA印迹然而在印迹前不变性DNA的毛细管转移系统，将具有不同CpG密度的甲基化或者未甲基化的PCR片段体外印迹到尼龙膜上。如图3中所示，使用标准印迹条件和MBD-Fc作为一级抗体的等同物，可以以线性方式(图3A)并且取决于CpG含量(图3B)在尼龙膜上检测甲基化的DNA。这些结果表明MBD-Fc融合蛋白能够检测结合固相支持体的CpG甲基化的DNA。

实施例4：使用甲基-CpG免疫沉淀(MCIp)小规模富集CpG-甲基化DNA

下面的方案允许使用旋转柱快速富集CpG甲基化的DNA。DNA结合到通过通过蛋白A偶联到Sepharose珠的MBD2-Fc蛋白质。甲基化DNA的亲和性随着甲基化CpG二核苷酸的密度增加并且随着洗涤缓冲液的离子强度减小。

4.1MBD2-Fc蛋白对蛋白A Sepharose的结合

向1ml TBS中的50μl蛋白A Sepharose 4Fast Flow珠(Amersham)加入8-10μg纯化的MBD2-Fc蛋白并在旋转器上4℃下过夜旋转。第二天，将MBD2-Fc珠用缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 8.0，2mM MgCl₂，0.5mMEDTA，150mM NaCl，0.1％NP-40)洗涤两次。

4.2DNA的限制性消化和定量

将至少1μg基因组DNA(使用Qiagen柱制备)用Mse I消化。使用琼脂糖凝胶电泳控制完全消化并用PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes)精确定量消化的DNA。

4.3高度甲基化的CpG-DNA的定量

将消化的DNA(300ng)加入到1ml缓冲液A中洗涤的MBD2-Fc-珠中并在旋转器上4℃下旋转3小时。将珠子转移到SpinX-柱并用约1ml缓冲液A旋转洗涤。用400μl缓冲液B(20mM Tris-HClpH 8.0，2mM MgCl₂，0.5mM EDTA，450mM NaCl，0.1％NP-40)洗涤珠子两次并用缓冲液C(20mM Tris-HCl pH 8.0，2mM MgCl₂，0.5mM EDTA，650mM NaCl，0.1％NP-40)洗涤一次。将每次洗涤步骤的穿过液丢弃或者收集用于进一步分析。将CpG甲基化的DNA用250μl缓冲液D(20mM Tris-HCl pH8.0，2mM MgCl₂，0.5mM EDTA，1000mM NaCl，0.1％NP-40)洗脱到新管中。用Qiaquick Spin柱(ELUTED)对洗脱的DNA脱盐。平行地，将300ng消化的DNA(INPUT)重悬浮在250μl缓冲液D中并用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)脱盐。用PicoGreen dsDNA QuantitationReagent(Molecular Probes)精确定量洗脱的和输入DNA。

4.4.备选方法

用不同的限制性内切酶或者超声处理可以限制DNA。

实施例5：通过MCIp检测和定量甲基化的CpG-DNA片段

为了以免疫沉淀样方法测试MBD-Fc融合蛋白是否能够结合CpG-甲基化的DNA片段，我们首先测试了体外产生的和不同甲基化的DNA片段的结合性质。使用PCR产生具有不同CpG密度的人启动子的PCR片段并用SssI甲基化CpG(CCL13，TLR2，CHI3L1)或者未甲基化(CPM)。DNA结合到150mM NaCl(实施例4)中的MBD-Fc-蛋白A sepharose珠并用增加浓度的NaCl洗脱。收集级分，旋转纯化并进行琼脂糖凝胶电泳。如图4B中所示，甲基化片段的亲和性随着甲基化CpG二核苷酸的密度增加，未甲基化的DNA(CPM启动子片段)在相对低的盐浓度下洗脱，高甲基化DNA(TLR2启动子片段)在高盐浓度下洗脱。输入DNA的量的改变不显著改变洗脱图。然而，DNA的依赖盐的亲和性取决于蛋白A sepharose珠上MBD-Fc融合蛋白的密度。这些结果表明MBD-Fc融合蛋白能够以依赖盐浓度和CpG甲基化密度的方式结合溶液中的CpG甲基化DNA。

5.1使用基因特异性实时PCR在单个基因水平上定量

5.1.1为了测试重组MBD-Fc蛋白是否能够检测复杂基因组DNA混合物中CpG岛启动子的甲基化密度，将来自三种白血病细胞系、正常供体单核细胞以及来自AML患者的胚细胞的基因组DNA用Mse I消化并进行MCIp。使用LightCycler-PCR检测1000mM NaCl MCIp级分中三种CpG岛启动子(TLR2，p15和ESR1)的富集。选择这三个基因座是因为p15和ESR1是白血病中甲基化的已知靶标并且TLR2在以前表明在U937细胞中但是不在THP-1细胞中被甲基化。如图5所示，在来自正常供者DNA(MO)的DNA制备物中不能显著检测三种基因座的任一种，这与正常细胞中CpG岛的通常未甲基化状态一致。TLR2在U937但不在THP-1中富集与以前在两种细胞中观察到的甲基化模式一致。如

，J.Immunol.168(2002)，5629-37)中所述对TLR3启动子的亚硫酸氢盐测序表明KG1-细胞中TLR2启动子的几乎完全甲基化(数据未显示)，其与图5中所示的强MCIp富集一致。p15在KG1和U937中的结果与公布的数据一致。这些数据表明MCIp可以用于检测基因组DNA中单个基因片段的甲基化DNA片段。

因此，通过实时Lightcycler-PCR检测MCIp洗脱液中特定Mse I片段的富集并相对于基因组输入(INPUT)定量(见图5)。还可以在洗脱的和输入DNA的非特异DNA扩增后定量所述富集(见下面实施例5.2.1中的扩增子产生，数据未显示)。

表1-1：CpG岛启动子的基因特异性寡核苷酸引物

为了测试MCIp是否可以用于从基因组DNA区分甲基化和未甲基化的DNA片段，用MCIp富集来自健康供者的单核细胞的体外SssI甲基化的和未处理的正常DNA的MseI-限制性消化的基因组DNA。选择MseI用于DNA片段化是因为已知它优先在低CpG含量的区域切割而留下许多CpG岛不切割(Cross，Nat.Genet.6(1994)，236-244)。

使用LightCycler实时PCR，确定相对于输入DNA，在SssI甲基化的和未处理的DNA中四种不同的CpG岛启动子和具有低CpG密度的启动子的依赖盐浓度的富集。作为DNA甲基化的阳性对照，使用SNRPN基因启动子，其也在正常细胞中甲基化的两个拷贝之一受到母本印记(zeschnigk，Hum.Mol. Genet.6(1997)，387-395)。在正常DNA中，在两个单独级分中富集SNRPN的两种差别甲基化的等位基因片段(见图9A)。用SssI甲基化的DNA观察到仅一个富集的级分。对于已知在白血病细胞中频繁甲基化的CDKN2B基因(也称作p15^INK4b)(Chim，Ann.Hematol.82(2003)，738-742；Dodge，Int.J.Cancer 78(1998)，561-567；Dodge，Leuk.Res.25(2001)，917-925)(图9B)，主要在来自正常DNA的低盐级分和来自SssI甲基化的DNA的高盐级分中检测到该片段。对于人雌激素受体1(ESR1)基因(Issa，Cancer Res.56(1996)，973-977)和人Toll-样受体2基因(TLR2)得到相似的结果(数据未显示)。如图9C中所示，在CHI3L1基因座上甲基化和未甲基化DNA的分布图与上面测试的CpG岛启动子的分布图显著不同。在较低NaCl浓度下回收了多数未处理的CHI3L1-片段，当DNA被SssI甲基化时，对较高的NaCl浓度观察到轻微偏移。上面的洗脱图谱的分析表明：

a)在低或者高盐级分中可以得到比甲基化程度较低的基因组片段强200到300倍的富集；

b)具有低CpG密度的片段大部分从高盐级分排除；

c)分级分离的MCIp方法允许分辨CpG甲基化密度中的小差异(SssI处理的和未处理的单核细胞DNA之间的平均差异约为12个甲基化CpG残基中6个，数据未显示)。

为了测试MCIp是否可以检测肿瘤样品中的异常超甲基化，对来自三种白血病细胞系(KG1，U937，THP-1)以及来自健康供者的单核细胞的DNA分析在高盐级分中SNRNP、CDKN2B、ESR1和TLR2启动子富集(见图9D-G)。TLR2基因启动子在KG-1和U937细胞中富集，但是不在THP-1或正常细胞中富集。通过亚硫酸氢盐测序证实TLR2的甲基化模式(Haehnel，J.Immunol.168(2002)，5629-5637)(数据未显示)。CDKN2B(KG-1和U937)和ESR1(KG-1)的结果也与以前公布的研究一致(Chim(2003)；Dodge(2001)；Issa(1996)，都如上文)。上面三种MseI片段没有一种在来自正常细胞的DNA中显著富集。与它的印记相关的甲基化状态符合，SNRPN基因启动子在所有白血病细胞系以及正常细胞中显著富集。这些实验确定高盐MCIp级分特别富集具有高度CpG甲基化的基因组DNA片段。

为了测试该方法的灵敏性，使用MCIp方法分析增加量的U937DNA。通过LightCycler实时PCR测定TLR2(强甲基化)和CDKN2B基因片段(无甲基化)的富集。如图10A中所示，对于MCIp方法，使用少至1ng的基因组DNA片段(等同于约150个肿瘤细胞)实现了TLR2片段的显著富集。来自肿瘤的样品可以含有显著数目的正常细胞，其可以预期在多数CpG岛未甲基化。为了测试CpG甲基化关于细胞纯度是多么线性的，用来自正常血细胞和白血病细胞系KG-1的DNA的混合物进行MCIp，表明在几个启动子处高水平的CpG岛甲基化。如图10B中所示，仅在含有KG-1 DNA的样品中检测到TLR2启动子片段并且信号随着样品中甲基化DNA的比例逐渐增强。对于ESR1基因座得到类似的结果(数据未显示)。通常，当靶基因片段仅含有CpG岛内的邻近启动子时，得到信息最多(关于对转录的影响)和最清楚的结果(按照噪音和背景)。而且，除了酶限制，通过机械方法如超声处理也实现了DNA片段化(数据未显示)。

表1-2：用于CpG岛启动子的实时扩增的基因特异性寡核苷酸引物

5.1.2为了确定检测基因组DNA的复杂混合物中单个基因片段所需的DNA的量，将不断减少量的DNA片段进行MCIp和随后的LightCycler实时PCR。如图6中所示，可以富集甲基化的TLR2启动子并且可以从少至1ng来自U937细胞的基因组DNA检测到。U937细胞中未甲基化的p15启动子不能显著富集(20ng MCIp-洗脱物)或者不能检测到(4ng或1ngMCIp洗脱物)(图6)。这些结果表明MCIp是一种检测复杂基因组混合物中甲基化DNA片段的灵敏方法。

5.2使用微阵列技术在基因组水平上定量

5.2.1使用连接介导的(LM)-PCR从基因组MES-1片段产生DNA

扩增子

为了产生Mse I-相容的LMPCR-接头，如下退火寡核苷酸LMPCR_S-L(5’-GCG GTG ACC CGG GAG ATC TCT TAA G-3’)(SEQID NO：22)和LMPCR_AS-L(5’-TAC TTA AGA GAT C-3’)(SEQ ID NO：23)。将两种寡核苷酸在无核酸酶的H₂O(USB)中以20μM的浓度合并，在80℃温育10分钟，缓慢冷却到RT。退火的接头以50μl等分试样保存在-20℃。

在60μl反应物中使用1μl T4-连接酶(1200u/μl，NEB)在16℃o/n下将LMPCR-接头(0.5μl/ng洗脱的-和输入-DNA)连接到洗脱的DNA并且在单独反应中连接到等量的输入DNA。使用QIAq uick PCR PurificationKit(Qiagen)对接头连接的DNA脱盐并在55μl Tris-HCl pH 8.0(5mM)中洗脱。

使用LMPCR-引物(5’-GTG ACC CGG GAG ATC TCT TAA G-3’)(SEQ ID NO：24)和Taq DNA聚合酶(Roche)通过PCR扩增接头连接的DNA(分别为洗脱的-和输入的)。PCR混合物含有25μl 10xPCR-缓冲液(Roche)，15μlMgCl₂(25mM，Roche)，10μl dNTPs(每种10mM)65μl甜菜碱(5M，Sigma)，2.5μl LMPCR-引物，45μl接头连接的DNA，2.5μl TaqDNA聚合酶(5U/μl)，总体积250μl，将其分布到5个PCR管中。循环参数为58℃，2min(解链LMPCR_AS-L)，72℃5min(填充突出端)；95℃，30s，58℃，30s，72℃，3min扩增15个循环；72℃，10min最后延伸。

将PCR反应物组合并使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化。使用PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes)精确定量洗脱的和输入扩增子。

5.2.2使用CPG岛微阵列分析MCIp扩增子

使用PCR(LightCycler，Standard PCR)分析MCIp扩增子以检测单个基因片段的富集。为了检测多种基因片段，可以使用阵列技术。使用例如CpG岛微阵列对MCIp扩增子的分析将涉及MCIp-DNA片段的荧光标记和随后使用标准方案与微阵列杂交。

实施例6：使用甲基结合聚合酶链式反应(MB-PCR)检测CpG甲基化DNA片段的单管测定

该方法使用类似于ELISA的方法。将对CpG甲基化DNA具有高亲和性的蛋白质包被到PCR循环仪相配的反应容器的壁上并用于从基因组DNA混合物选择性捕获强烈甲基化的DNA片段。可以使用PCR(标准PCR或者实时PCR，单一或者多路)在同一管中检测特定DNA片段(例如，特定基因的CpG岛启动子)的保留。可以相对于基因组输入DNA的PCR反应估计甲基化的程度。图7显示了MB-PCR的图示。

6.1DNA制备和片段化

使用血液和细胞培养物Midi试剂盒(Blood and Cell Culture Midi Kit(Qiagen))从三种细胞系(KG1、U937和THP-1)、正常人单核细胞(健康供者)和来自AML患者的冷冻胚细胞制备基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳控制基因组DNA制备物的质量并通过紫外分光光度法测定DNA浓度。将基因组DNA用Mse I(NEB)消化并最终使用PicoGreen dsDNAQuantitation Reagent(Molecular Probes)定量。

6.2PCR管的制备

使用热稳定的TopYield^TM Strips(Nunc Cat.No.248909)制备MBD-Fc-包被的PCR管。向每管中加入50μl重组MBD-Fc-蛋白质(用10mM Tris/HCl pH 7.5稀释为15μg/ml)并在4℃过夜温育。将孔用200μlTBS(20mM Tris，pH 7.4，含有150mM NaCl)洗涤三次并在4℃用100μl封闭溶液(10mM Tris，pH 7.5，含有150mM NaCl，4.5％脱脂奶粉，5mMEDTA和0.8μg/ml每种聚d(I/C)，聚d(A/T和聚d(CG))过夜封闭。将管用200μl TBST(TBS，含有0.1％Tween-20)洗涤三次。

6.3甲基化DNA的结合

向每孔加入50μl结合缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，含有400mM NaCl，2mM MgCl₂，0.5mM EDTA，和0.05％Tween-20)，并向每第二个孔加入1μlMse I-消化的DNA(10ng/μl)(M反应)。在摇床上4℃下温育孔3小时。用200μl结合缓冲液洗涤管三次，并用10mM Tris/HCl pH7.5洗涤一次。

6.4甲基化DNA片段的检测

直接在TopYield^TM Strips中进行PCR。PCR混合物(50μl/孔)含有标准PCR缓冲液(Roche)、2.5U FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、10pmol每种基因特异性引物(由Qiagen合成)、dNTPs(每种200mM，Amersham/Pharmacia)、1M甜菜碱(Sigma)，引物序列和循环参数分别在表2和3中显示。加入PCR混合物后，向每隔两个孔加入1μl Mse I-消化的DNA(10ng/μl)，其以前没有与DNA片段温育(P-反应)。使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并使用Typhoon 9200Imager(Amersham/Pharmacia)扫描溴化乙锭染色的凝胶。

表2循环参数(MB-PCR)：

表3CpG岛启动子的基因特异性寡核苷酸

图8显示了分析5种细胞类型中三种不同的CpG岛启动子的甲基化分布图的MB-PCR实验的结果。标记P的泳道代表基因组输入DNA的扩增。除了THP-1细胞中p15基因例外(可能缺失或突变)外，扩增了所有启动子。值得注意的是，在MB-PCR反应中从正常DNA对照没有检测到启动子，这与这些启动子在正常个体中不甲基化的事实一致。在细胞系以及患者样品中，启动子甲基化程度最大。结果对应于在独立的实验中用MCIp得到的数据。

Claims (16)

1.核酸分子，其核苷酸序列编码双功能多肽，所述双功能多肽由属于甲基-CpG结合蛋白家族的蛋白质的DNA结合结构域和抗体的Fc部分组成，其中所述核酸分子由选自如下的核苷酸序列组成：

(a)核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中显示；

(b)核酸分子，其核苷酸序列编码如SEQ ID：NO2中显示的氨基酸序列；

(c)核酸分子，其核苷酸序列为(a)到(b)任一项的核酸分子的核苷酸序列的简并序列；

或者这种核酸分子的互补链。

2.权利要求1的核酸分子，其还包含编码接头多肽的核苷酸序列。

3.权利要求1的核酸分子，其中所述属于甲基-CpG结合蛋白家族的蛋白质的DNA结合结构域是MBD2蛋白质的DNA结合结构域。

4.权利要求1到3任一项的核酸分子，其是DNA、RNA或者PNA。

5.权利要求4的核酸分子，其中所述DNA是cDNA或基因组DNA。

6.载体，其包含权利要求1到5任一项的核酸分子。

7.权利要求6的载体，其中所述核酸分子有效连接允许在原核或真核宿主细胞中表达的表达控制序列。

8.宿主细胞，其用权利要求1到5任一项的核酸分子或者权利要求6或7的载体基因工程化。

9.产生能够结合甲基化DNA的多肽的方法，其包括：培养权利要求8的宿主细胞并回收所述多肽。

10.产生能够表达多肽的细胞的方法，所述多肽能够结合甲基化DNA，所述方法包括用权利要求6或7的载体在体外基因工程化细胞。

11.多肽，其由权利要求1到5任一项的核酸分子编码或者可以通过权利要求10的方法得到。

12.组合物，其包含权利要求1到5任一项的核酸分子、权利要求6或7的载体、权利要求8的宿主细胞或权利要求11的多肽。

13.权利要求12的组合物，其是诊断组合物，任选还包含合适的诊断试剂。

14.权利要求12的组合物，其是药物组合物，任选还包含可药用载体。

15.权利要求1到5任一项的核酸分子、权利要求6或7的载体、权利要求8的宿主细胞或权利要求11的多肽用于制备检测甲基化DNA的诊断组合物的用途。

16.权利要求1到5任一项的核酸分子、权利要求6或7的载体、权利要求8的宿主细胞或权利要求11的多肽用于制备检测肿瘤组织或者肿瘤细胞的诊断组合物的用途。

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