JPH04136762A - イムノアッセイ用反応容器 - Google Patents
イムノアッセイ用反応容器Info
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- JPH04136762A JPH04136762A JP25690190A JP25690190A JPH04136762A JP H04136762 A JPH04136762 A JP H04136762A JP 25690190 A JP25690190 A JP 25690190A JP 25690190 A JP25690190 A JP 25690190A JP H04136762 A JPH04136762 A JP H04136762A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【産業上の利用分野１
本発明は，生化学、微生物学、分子生物学、医化学の分
野における、ペプチド，タンパク質，ホルモン、トキシ
ン等の生体関連物質の測定法であるイムノアッセイに関
するものである。 【従来の技術】 種々の臨床目的で、血液等の体液中の様々な成分の濃度
をナノモルあるいはピコモルのレベルで検出することが
行われる。周知のように、この検出には抗原抗体反応を
利用するイムノアッセイと呼ばれる方法が用いられる。 イムノアッセイは放射性同位元素を標識とする方法が採
られてきたが、放射性同位元素には取り扱いや廃棄の問
題があるため、標識をラテックス微粒子、酵素，蛍光物
質等にする方法も普及し始めた。 反応プロセスにも様々な方式のものがある．この方式を
二つに大別できる．一つは、抗原抗体反応物と非反応物
の分離操作を行う必要のない均一系イムノアッセイと言
われるものであり，もう一つは，分離操作を行う非均一
系イムノアッセイと言われるものである。 均一系イムノアッセイの例として、抗原抗体反応によっ
て起こるラテックス微粒子の凝集の状態を光散乱によっ
て計測する方式や、抗原抗体反応によってひき起される
蛍光偏光解消度の変化を計測する方式等がある。これら
はいずれも反応プロセスが簡単なため簡便かつ小型の自
動化装置を作ることができるものの、検出感度の点で非
均−系イムノアッセイより劣る。 一方、非均−系イムノアッセイの一般的な形態は、抗体
を固定化した担体を用意し、この抗体と測定対象物であ
る抗原との反応、及び別途用意した標識抗体と抗原との
反応の二重の抗原抗体反応を行い、最終的に担体上に結
合した標識の量を計測するものである。標識としては、
先に述べた、放射性同位元素、酵素、蛍光物質の他に、
化学発光物質等が用いられる。また、抗体を固定化する
ための担体としては、直径が５ないし６ｍｍのガラスポ
ール、同じくポリスチレンボール、あるいはマイクロタ
イタープレート等がよく用いられる。 この非均−系イムノアッセイは反応プロセスが複雑なた
めに、これを自動的に行う装置はやや複雑で大型になる
ものの、高い検出感度が得られる。 近年は、非均−系イムノアッセイ装置がめざましく普及
しつつある。
野における、ペプチド，タンパク質，ホルモン、トキシ
ン等の生体関連物質の測定法であるイムノアッセイに関
するものである。 【従来の技術】 種々の臨床目的で、血液等の体液中の様々な成分の濃度
をナノモルあるいはピコモルのレベルで検出することが
行われる。周知のように、この検出には抗原抗体反応を
利用するイムノアッセイと呼ばれる方法が用いられる。 イムノアッセイは放射性同位元素を標識とする方法が採
られてきたが、放射性同位元素には取り扱いや廃棄の問
題があるため、標識をラテックス微粒子、酵素，蛍光物
質等にする方法も普及し始めた。 反応プロセスにも様々な方式のものがある．この方式を
二つに大別できる．一つは、抗原抗体反応物と非反応物
の分離操作を行う必要のない均一系イムノアッセイと言
われるものであり，もう一つは，分離操作を行う非均一
系イムノアッセイと言われるものである。 均一系イムノアッセイの例として、抗原抗体反応によっ
て起こるラテックス微粒子の凝集の状態を光散乱によっ
て計測する方式や、抗原抗体反応によってひき起される
蛍光偏光解消度の変化を計測する方式等がある。これら
はいずれも反応プロセスが簡単なため簡便かつ小型の自
動化装置を作ることができるものの、検出感度の点で非
均−系イムノアッセイより劣る。 一方、非均−系イムノアッセイの一般的な形態は、抗体
を固定化した担体を用意し、この抗体と測定対象物であ
る抗原との反応、及び別途用意した標識抗体と抗原との
反応の二重の抗原抗体反応を行い、最終的に担体上に結
合した標識の量を計測するものである。標識としては、
先に述べた、放射性同位元素、酵素、蛍光物質の他に、
化学発光物質等が用いられる。また、抗体を固定化する
ための担体としては、直径が５ないし６ｍｍのガラスポ
ール、同じくポリスチレンボール、あるいはマイクロタ
イタープレート等がよく用いられる。 この非均−系イムノアッセイは反応プロセスが複雑なた
めに、これを自動的に行う装置はやや複雑で大型になる
ものの、高い検出感度が得られる。 近年は、非均−系イムノアッセイ装置がめざましく普及
しつつある。
上記の従来技術では、抗原抗体反応によって反応用担体
に捕捉された反応物、特に標識を含む反応物が洗浄液や
他の試薬の注入時や撹拌時に反応用の担体から脱離する
ことに対する配慮がされていなかった。このような反応
物の脱離は、特に標識物のサイズが大きい場合に顕著で
あった。 本発明の目的は、洗浄液等の試薬の注入時及び試薬の撹
拌時に、反応物が担体から脱離する問題を解決し、サイ
ズの大きな標識、例えば径が１μｍ程度のポリスチレン
ラテックスビーズ等の微粒子を標識とする場合でも脱離
を防ぎ、測定の信頼性を高めることにある。
に捕捉された反応物、特に標識を含む反応物が洗浄液や
他の試薬の注入時や撹拌時に反応用の担体から脱離する
ことに対する配慮がされていなかった。このような反応
物の脱離は、特に標識物のサイズが大きい場合に顕著で
あった。 本発明の目的は、洗浄液等の試薬の注入時及び試薬の撹
拌時に、反応物が担体から脱離する問題を解決し、サイ
ズの大きな標識、例えば径が１μｍ程度のポリスチレン
ラテックスビーズ等の微粒子を標識とする場合でも脱離
を防ぎ、測定の信頼性を高めることにある。
上記目的を達成するために５反応容器に、洗浄液等の試
薬を注入する部位を反応部位とは別に設けた。これによ
り、担体に結合した反応物に直接洗浄液等が滴下される
ことがないようにした。別の手段として、試薬注入部に
液が溜る構造とした。 これにより、試薬を注入して液溜めに溜めたあと、反応
容器を傾けて液溜めから反応部に試薬を送り込んだり、
出し入れすることで、試薬の注入及び撹拌を穏和な条件
で行えるようにした。
薬を注入する部位を反応部位とは別に設けた。これによ
り、担体に結合した反応物に直接洗浄液等が滴下される
ことがないようにした。別の手段として、試薬注入部に
液が溜る構造とした。 これにより、試薬を注入して液溜めに溜めたあと、反応
容器を傾けて液溜めから反応部に試薬を送り込んだり、
出し入れすることで、試薬の注入及び撹拌を穏和な条件
で行えるようにした。
イムノアッセイにおいて、反応用担体からの反応物の脱
離が好ましくないことは、言うまでもないことである。 発明者等は、この脱離がどのようにして起きるかを実験
によって確かめた。その結果、洗浄液や他の試薬をノズ
ルから直接、反応用担体に噴出させた時、及び洗浄液や
他の試薬を反応容器内で強く撹拌した時に、脱離が生じ
ることを見出した。この結果に基づいて、脱離防止の手
段を種々検討した結果、抗原抗体反応等の反応を行わせ
る部位の他に試薬の注入部位を反応容器に設け、ここに
試薬を注入することが、簡単で極めて有効であることを
発見した。また、試薬の撹拌についても、この容器を静
かに傾ける操作を行うことにより１反応物の脱離が起こ
ることなく、効果的な撹拌ができることを見出した。
離が好ましくないことは、言うまでもないことである。 発明者等は、この脱離がどのようにして起きるかを実験
によって確かめた。その結果、洗浄液や他の試薬をノズ
ルから直接、反応用担体に噴出させた時、及び洗浄液や
他の試薬を反応容器内で強く撹拌した時に、脱離が生じ
ることを見出した。この結果に基づいて、脱離防止の手
段を種々検討した結果、抗原抗体反応等の反応を行わせ
る部位の他に試薬の注入部位を反応容器に設け、ここに
試薬を注入することが、簡単で極めて有効であることを
発見した。また、試薬の撹拌についても、この容器を静
かに傾ける操作を行うことにより１反応物の脱離が起こ
ることなく、効果的な撹拌ができることを見出した。
以下本発明を実施例により詳しく説明する。
（実施例１）
第１図に本発明の反応容器の例を示す。反応容器はポリ
スチレン製で、反応部１と試薬注入部２．２′は通液部
３．３′を介して溝状に連結している。通液部３．３′
の幅は６ｍｍで１反応部１と試薬注入部２．２′には液
溜めの凹みを設けである。 反応部１に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトα−フェト
プロティン抗体溶液４０μｍを入れて。 ２時間室温で放置して抗体の固定化を行った。固定化の
後、溶液の吸い出し、０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）４０μｍの注入を繰返
して、未反応の抗ヒトα−フェトプロティン抗体を取り
去った。最後に、反応部１、試薬注入部２．２′及び通
液部３．３′に５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含
む上記リン酸緩衝液を満たして容器の内表面に吸着防止
処理を施して、抗体固定化反応容器を得た。 上に述べた方法で得た抗体固定化反応容器の反塔部１に
、各種濃度のヒトα−フェトプロティン（ＡＦＰと略す
）を含む標準血清あるいは患者血清３０μｍを注ぎ、室
温で２時間反応させたあと、血清を吸い出した。 次に、ウシ血清アルブミンを含む上記リン酸緩衝液で反
応部１をよく洗浄した。ここで洗浄方法としては、反応
容器を、第１図のＡＡ’断面を回転面としてやや回転さ
せて傾け、試薬注入部２．２′の片方を下げた状態にし
て、その下げた方の試薬注入部に洗浄液２００μｍを注
ぎ、逆方向と正方向への約３０度程度の回転を３度繰り
返して洗浄液を揺り動かした後、洗浄液注入時と同様の
状態にして、洗浄液を吸引して反応容器からこれを排出
した。 ３回の洗浄操作の後、別に用意した抗ヒトα−フェトプ
ロティン抗体を結合した直径０．５μｍの蛍光色素入り
のポリスチレンビーズ懸濁液２００μｌを注いで室温で
５時間反応させた。このビーズ懸濁液の注入については
、前の洗浄液の注入と同様に行った。また、反応中に１
０分間に１回の割合で容器を回転して傾けることにより
、懸濁液を撹拌した。なお、蛍光色素入りのポリスチレ
ンビーズにはポリサイエンス社製のフルオレスプライト
・カルボキシレイテッド・マイクロスフェア（イエロー
グリーン）を用い、これを水冷下で２％の１−エチル３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩溶液（リン酸ナトリウムでｐＨ４，５に調整）で活性
化し抗体を結合させた。 次に、ウシ血清アルブミンを含む上記リン酸緩衝液を用
いて、反応容器の反応部１に結合しなかった抗体結合蛍
光ビーズを洗い流した。この洗浄については、前の洗浄
操作と同様に行い、洗浄回数は８回とした。こうして得
た反応後の反応容器を倒立型の蛍光顕微鏡に載せ、反応
部１に結合した蛍光ビーズの数を計測した。 第２図の標準曲線４は、標準血清から得られたＡＦＰ濃
度と蛍光ビーズ数との関係を表すもので、これに患者血
清を試料とした時の蛍光ビーズ数を対比させることによ
り、患者血清のＡＦＰ濃度を求めたところ良好に濃度を
求めることができた。 なお、２０ｎｇ／ｍｌの標準血清を用いて測定値の同時
再現性を求めた結果、変動係数は４．２％であった。 参考のために、ポリスチレン製のマイクロプレートを用
いて同様のプロセスで標準血清のＡＦＰ濃度とプレート
に結合した蛍光ビーズ数との関係を求めた。なお、この
場合の洗浄液やその他の試薬の注入は、ノズルを介して
これらを直接、反応担体であるマイクロプレートの底面
に滴下する方法を採った。また、試薬の撹拌については
、市販の回転式のマイクロプレート・ミキサーを用いた
。 標準血清から得られたＡＦＰ濃度と蛍光ビーズ数との関
係は第２図の標準曲線５に示す通りであり、反応した蛍
光ビーズの多数がマイクロプレートから脱離した。また
、２０ｎｇ／ｍｌの標準血清を用いた時の測定値の同時
再現性は、変動係数で１２．８％であった。 以上のように、本発明を用いれば、洗浄液やその他の試
薬の注入時やその撹拌時に反応物が反応用担体から脱離
することがなく、それだけ測定値の信頼性が高まること
は明らかである。 なお、本実施例では、第１図の構造を持つものを示した
が、本発明はこの形態のものだけに限られるのではない
。例えば、試料注入部が１つのもの、異なる形の凹みを
持つもの等でも同様の効果が得られた。
スチレン製で、反応部１と試薬注入部２．２′は通液部
３．３′を介して溝状に連結している。通液部３．３′
の幅は６ｍｍで１反応部１と試薬注入部２．２′には液
溜めの凹みを設けである。 反応部１に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトα−フェト
プロティン抗体溶液４０μｍを入れて。 ２時間室温で放置して抗体の固定化を行った。固定化の
後、溶液の吸い出し、０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）４０μｍの注入を繰返
して、未反応の抗ヒトα−フェトプロティン抗体を取り
去った。最後に、反応部１、試薬注入部２．２′及び通
液部３．３′に５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含
む上記リン酸緩衝液を満たして容器の内表面に吸着防止
処理を施して、抗体固定化反応容器を得た。 上に述べた方法で得た抗体固定化反応容器の反塔部１に
、各種濃度のヒトα−フェトプロティン（ＡＦＰと略す
）を含む標準血清あるいは患者血清３０μｍを注ぎ、室
温で２時間反応させたあと、血清を吸い出した。 次に、ウシ血清アルブミンを含む上記リン酸緩衝液で反
応部１をよく洗浄した。ここで洗浄方法としては、反応
容器を、第１図のＡＡ’断面を回転面としてやや回転さ
せて傾け、試薬注入部２．２′の片方を下げた状態にし
て、その下げた方の試薬注入部に洗浄液２００μｍを注
ぎ、逆方向と正方向への約３０度程度の回転を３度繰り
返して洗浄液を揺り動かした後、洗浄液注入時と同様の
状態にして、洗浄液を吸引して反応容器からこれを排出
した。 ３回の洗浄操作の後、別に用意した抗ヒトα−フェトプ
ロティン抗体を結合した直径０．５μｍの蛍光色素入り
のポリスチレンビーズ懸濁液２００μｌを注いで室温で
５時間反応させた。このビーズ懸濁液の注入については
、前の洗浄液の注入と同様に行った。また、反応中に１
０分間に１回の割合で容器を回転して傾けることにより
、懸濁液を撹拌した。なお、蛍光色素入りのポリスチレ
ンビーズにはポリサイエンス社製のフルオレスプライト
・カルボキシレイテッド・マイクロスフェア（イエロー
グリーン）を用い、これを水冷下で２％の１−エチル３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩溶液（リン酸ナトリウムでｐＨ４，５に調整）で活性
化し抗体を結合させた。 次に、ウシ血清アルブミンを含む上記リン酸緩衝液を用
いて、反応容器の反応部１に結合しなかった抗体結合蛍
光ビーズを洗い流した。この洗浄については、前の洗浄
操作と同様に行い、洗浄回数は８回とした。こうして得
た反応後の反応容器を倒立型の蛍光顕微鏡に載せ、反応
部１に結合した蛍光ビーズの数を計測した。 第２図の標準曲線４は、標準血清から得られたＡＦＰ濃
度と蛍光ビーズ数との関係を表すもので、これに患者血
清を試料とした時の蛍光ビーズ数を対比させることによ
り、患者血清のＡＦＰ濃度を求めたところ良好に濃度を
求めることができた。 なお、２０ｎｇ／ｍｌの標準血清を用いて測定値の同時
再現性を求めた結果、変動係数は４．２％であった。 参考のために、ポリスチレン製のマイクロプレートを用
いて同様のプロセスで標準血清のＡＦＰ濃度とプレート
に結合した蛍光ビーズ数との関係を求めた。なお、この
場合の洗浄液やその他の試薬の注入は、ノズルを介して
これらを直接、反応担体であるマイクロプレートの底面
に滴下する方法を採った。また、試薬の撹拌については
、市販の回転式のマイクロプレート・ミキサーを用いた
。 標準血清から得られたＡＦＰ濃度と蛍光ビーズ数との関
係は第２図の標準曲線５に示す通りであり、反応した蛍
光ビーズの多数がマイクロプレートから脱離した。また
、２０ｎｇ／ｍｌの標準血清を用いた時の測定値の同時
再現性は、変動係数で１２．８％であった。 以上のように、本発明を用いれば、洗浄液やその他の試
薬の注入時やその撹拌時に反応物が反応用担体から脱離
することがなく、それだけ測定値の信頼性が高まること
は明らかである。 なお、本実施例では、第１図の構造を持つものを示した
が、本発明はこの形態のものだけに限られるのではない
。例えば、試料注入部が１つのもの、異なる形の凹みを
持つもの等でも同様の効果が得られた。
以上で説明したように、本発明の反応容器を用いれば、
洗浄液やその他の試薬の注入時やその撹拌時に反応物が
反応用担体から脱離することがなく、それだけ測定値の
信頼性が高まる。本発明の効果はそれだけでなく、サイ
ズの大きなものでも標識として用いることができるよう
になるために、粒子を直接顕微鏡で観測するなど、これ
までのイムノアッセイで採用されていない計測方法と組
み合わせることができ、従来よりも高い測定感度のイム
ノアッセイを実現できる。
洗浄液やその他の試薬の注入時やその撹拌時に反応物が
反応用担体から脱離することがなく、それだけ測定値の
信頼性が高まる。本発明の効果はそれだけでなく、サイ
ズの大きなものでも標識として用いることができるよう
になるために、粒子を直接顕微鏡で観測するなど、これ
までのイムノアッセイで採用されていない計測方法と組
み合わせることができ、従来よりも高い測定感度のイム
ノアッセイを実現できる。
第１図は本発明の一実施例の平面図、及びＡＡ’縦断面
図であり、第２図は１本発明の実施例と参考例の標準曲
線を示す図である。 符号の説明 １・・・反応部 ２及び２′・・・試薬注入部 ３及び３′・・・通液部 ４・・・標準曲線 ５・・・参考例の標準曲線
図であり、第２図は１本発明の実施例と参考例の標準曲
線を示す図である。 符号の説明 １・・・反応部 ２及び２′・・・試薬注入部 ３及び３′・・・通液部 ４・・・標準曲線 ５・・・参考例の標準曲線
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗体を固定化した反応容器に抗原を捕捉させ、標識
抗体を反応させて該抗原を測定するイムノアッセイに用
いる反応容器において、試薬注入部位を反応部位とは別
に設けたことを特徴とするイムノアッセイ用反応容器。 ２、試薬注入部位が、試薬を溜めることのできる液溜め
構造で、反応容器を傾け、該液溜めから反応部位に試薬
を出し入れできることを特徴とする上記請求の範囲第１
項記載のイムノアッセイ用反応容器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25690190A JPH04136762A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | イムノアッセイ用反応容器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25690190A JPH04136762A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | イムノアッセイ用反応容器 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04136762A true JPH04136762A (ja) | 1992-05-11 |
Family
ID=17298967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25690190A Pending JPH04136762A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | イムノアッセイ用反応容器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04136762A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
| US9249464B2 (en) | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP25690190A patent/JPH04136762A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
| US9249464B2 (en) | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
| US9873919B2 (en) | 2004-11-29 | 2018-01-23 | Sequenom, Inc. | Reagents for detecting methylated DNA |
| US10487351B2 (en) | 2004-11-29 | 2019-11-26 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
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