JPH06504130A - 毛細管血液抗原試験装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 毛細管血液抗原試験装置 発明の背景 本発明は、医療及び実験室用の流体試料の収集及び試験装置に関するものであり 、更に詳しくは、体液中の特異的抗原の存在を検出する装置に関するものである 。

多くの疾患を診断及び試験する際には、分析のために患者から体液、例えば喀痰 、血液、胸膜腔及び腹腔流体を収集することが、一般に必要とされる。体液試料 を収集し、取り扱う際に重要なことは、試料の汚染及びこの試料からのあらゆる 感染の拡大の可能性を、最小限にすることである。さらにまた、この収集過程の 間に試料か損傷を受ける可能性があるだけでなく、試料中の特定の成分か破壊さ れる可能性があり、これは試験装置か流体をスクリーンしなかったり、または異 なる流体成分の混合を起こすからであるか、この試料を試験するときに、試験結 果が無効になったり、結果的に誤ったデータをもたらすであろう。

ヘルスケア産業においては、血液の診断試験か日常的になっており、医師達は、 自分達の診断を支持するために、患者の試料についての多様な専門的試験を予期 し、要求している。このように血液試料からの分析データに対する要求か増大し ているのに答えるため、特別に準備された患者の試料について多数の物理的及び 化学的試験を実施するために、過去２０年にわたって高度な化学分析機か開発さ れてきた。標的である分析物を問わず、必要な試料の容量は顕著に減少してきて おり、幾つかの試験では１００μｍ以下である。この目的が単純なブドウ糖測定 てあれ、白血球の計数であれ、又は特定の分析物のスクリーニングであれ、試料 の汚染及び試料収集の後に試料から感染が拡大する潜在的危険は、ヘルスケア産 業の従事者には知られていないままである。最近では、この原因のみて、ＡＩＤ ｓや肝炎のような高度に感染性のウィルス性疾患の拡大に、幾つかのケースで貢 献したが、これはもしも試料か同定され、適当に処理されていたとすれば、防止 できたものである。

最近、癌のような疾患の存在や麻薬のような異物の存在について、可視的な定量 的試験によって迅速かつ容易に実施できるように、体液を収集及び試験すること か要請されている。診断上の分析のために血液を収集及び処理する際の各工程を 充分に統合した新しい技術と、その実施のための方法論とが、必要とされている ：これは患者の健康に関して臨床的に適切な回答を得るために必要な時間を、最 小にするためであり：患者の試料を取り扱うのに関する健康上の危険を最小にす るためであり：陽性の患者について試料を確実に同定するためてあり、ユーザー フレンドリ−とするためであり、ユーザーに分かりやすくするためである。

免疫測定の原理および設計 一連の免疫測定は、抗体によって抗原を特異的に認識するという一つの原理の上 で行われている。特異的抗原の検出及び定量には、抗原の特異性を認識する抗体 が必要である。一つの特異的結合部位が、このタンパク質を同定するための標識 として働く。ここで、この抗原特異的抗体が精製され、標識され、抗原に直接結 合するのに用いられるときには、検出が直接的となり、この抗原特異的抗体か標 識されず、精製する必要かないときには、検出か間接的となる。間接的検出の際 には、抗原への結合を、標識された抗免疫グロブリン抗体や標識タンパク質への ような、二次試薬によって検出する。直接法及び間接法の両面を利用した変形法 においては、ビオチン及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）のような小さな化学基 を一次抗体に結合させることによって一次抗体を修飾し、次いてこの修飾された 一次抗体を、ビオチン結合タンパク質のような標識試薬や抗ＤＮＰ抗体のような ハブテン特異的抗体によって検出できるようにする。

固相免疫測定 交差反応分子の混合物中の生体分子を検出及び定量するための免疫測定の設計は 、ホルモン及び薬品のような、より小さな分子とは異なる。膜上に固定化された （非可逆的に結合された）抗体は本技術分野で良く知られており、こうした抗体 は、唾液中で運ばれる抗原のエピトープに対して高い親和性を有する結合部位を 備えるように設計されており、その逆もまた真である。

この膜の表面へのタンパク質の共有結合か、非可逆的な永続する結合を与えるの で、抗体のようなタンパク質が一旦結合すれば、これはアッセイの間中分離しな いであろう。アフィニティークロマトグラフィーの原理により要求されるのは、 生物特異的配位子の分離に成功しうることてあり、これをクロマトグラフィーヘ ット材料、基質の上に化学的に固定化しうることである。本技術分野で良く知ら れた多くの方法では、配位子を多様な活性化樹脂へと結合または固定化させてき ている。

可変性の結合を示す固定化技術を例示すると、支持体上の反応性基と、タンパク 質配位子上のアミノ基、千オール基、水酸基及びカルボキシル基との反応によて 形成された結合かある。

この配位子の選択は、二つの因子によって影響される。第一に、この配位子は、 精製すべき物質に対して特異的及び可逆的結合親和性を示していなければならず 、第二に、基質の結合活性を破壊することなく、基質への付着を可能とするよう な化学修飾可能な基を有していなければならない。（これを例示すると、ファル マシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）製のｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｊ　、バイオプ ローブ　インターナショナル（ＢｉｏＰｒｏｂｅ　［ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ）社製のｒＨｙｄｒａｚｉｄｅ　ＡｖｉｄＧｅｌ　ＡＸＪ　、及びステロゲン　 バイオセパレーション　インコーホレーテッド（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ　Ｂｉｏｓ ｅｐａｒａｔｉｏｎＩｎｃ、　）社製のｒＡｃｔｉｇｅｌ−ＡＬＤ　Ｊがある。

所与の抗原に対して限定的な抗体が得られる場合は、これを試料混合物中の抗原 を同定するのに使用する。一旦この抗体が抗原と結合すると、この複合体を認識 するための手段が必要である。これは過去においては、酵素のような標識抗体を 与えることによって、酵素結合抗体免疫吸着（ＥＬＴＳＡ）型アッセイによって 達成されてきており、これによりこの部位を色素発現基質によって培養し、色を 発現させ、この色の強度か、存在する酵素標識に比例する。

粒子に基づいた診断試験 多くの寸法のミクロスフイア又は均一粒子か、床几な現代の診断試験及びアッセ イにおいて使用されている。粒子に基づいた診断試験及び定性／定量アッセイは 、通常、抗原と抗体との特異的相互作用に基づいている。抗原又は抗体は、しば しば「均一ラテックス粒子」と呼ばれる、サブミクロンサイズのポリスチレン（ ＰＳ）粒子上へと吸着しつる。次いで、これらの感作性の粒子は請求める標的粒 子を含む試料をこれらの適当な被覆粒子と混合するときに生ずる抗原−抗体反応 を、拡大又は増幅するように作用する。古典的な例では、ガラススライド上で水 滴中に均一に分散された乳状に見えるＡｂ被覆粒子が、試料（全血、血清、尿等 ）の滴中のＡｇと反応して粒子の凝集（凝固又は凝集）を生じさせたとき、試験 結果が陽性である。ラテックス凝集試験（ＬＡＴｓ）における改善は、異なった コントラストを与える染色粒子を使用したことである（染色粒子は、白い背景に 対して観察される。）。またこれにより、暗青色又は黒色の粒子を使用すれば、 全血試料を使用した幾つかの試験が可能になる。染色粒子の汎用性を示す例とし ては、ウェルカム診療所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　（英 国、ケント州、ダートフォード：　Ｄａｒｔｆｏｒｄ）が行うサルモネラ試験で は、三つの異なった着色粒子（赤、青及び緑）に結合された三つの異なった抗原 基に対して、抗体を使用する。結合された凝集粒子の色の背景色に対する濃淡を 比較することによって、試料中に存在するサルモネラ集団の上程の組み合わせを 決定することができる。

酵素免疫濾過アッセイ（ＦＩＦＡ） ＥＩＦＡは、同相を支持する受容体として細孔性膜を使用し、可溶性の試料配位 子と信号発生試薬との接触を促進する手段として、濾過を採用する。これらの試 験を準備する際には、ＡｂをＰＳ粒子上へと吸着させ：これらの粒子をフィルタ ー上に捕捉し、乾燥する。使用時には：第一に、フィルターに試料を透過させ、 あらゆるＡｇを粒子上のＡｂによって捕捉する。次いて、第二のＡｂ酵素をこれ と反応させ、Ａｇの捕捉量に比例する不溶性の着色生成物を生成させる。従来の 固相免疫測定に見られる反応速度の拡散限界は、ＦＩＦＡにおいては最小限であ る。これは、固相を支持する膜からなる受容体を透過して反応体か流れることと 、液体の容量に対して細孔性膜の表面積の割合が高いことによる。こうして、Ｆ ＩＦＡにより、数分て終了に達する迅速な発現試験が可能となる。ＥＩＦＡにお ける抗原−抗体反応は、免疫染色によって直接に可視となり、ここで信号を発現 する接合体が、膜上の反応部位に着色スポットをもたらす。これらのスポットの 色強度は、反射測光によって定量できる。

試料を膜へと直接に結合させることによって、又はサンドイッチ状の二つの抗体 を採用することによって、抗原を検出するための種々のＥＩＦＡ法が記載されて いる。この方法を変更することによって抗体を検出することも記載されている。

ヴアルカース（Ｖａｌｋｉｒｓ　）及びバートン（Ｂａｒｔｏｎ）によって記載 されているサンドイッチアッセイにおいては、急速に流し、次いで短時間培養す ることによって、５分間の全アッセイ時間が得られた。ＥＩＦＡに基づく定量的 アッセイは、他の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術の再現性及 び感度に匹敵する、再現性及び感度を有する。このＦＩＦＡ装置はユニット中に 収容することかでき、このユニットは、抗体を支持する固相の他に、膜を通して 液体を引く吸収材料及び廃棄物情めを備えている。これらの便利さ、単純さ及び 速さのゆえに、ＥＩＦＡ装置は、技術的に未熟な患者環境、即ち、患者の身辺で の試験に使用できる。この原理を採用した種々の試験（ＨＣＧ、’５ｔｒｅｐ’ Ａ他のような）が、ハイプリチック社（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ：　ＩＣ０Ｎ）、ア ボット社（Ａｂｂｏｔｔ：　Ｔｅ５ｔＰａｃｋ）　、ノボ　ノルディスク社（Ｎ ｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ：　ＮｏｖｏＣｌｏｎｅ　Ｔａｒｇｅｔ）　、 及び多くの他社によって製造されてきた。ｒＭｕｒｅｘ　５ＵＤＳＪは、これら の試験に液体試薬を使用している：Ａｂ被覆粒子＋Ａｇ（試料からの）十第二の Ａｂ酵素接合体を混合し；次いで、この混合物をこの濾過装置を通して注入して 粒子を捕捉し、粒子を酵素基質で洗浄して色を生成させる。

濾過分離凝集試験（アッセイ） コダック社の最初のシュア−セル（Ｓｕｒｅｃｅｌｌ）試験キットは、フィルタ ー上に捕捉された染色凝集粒子を使用していた。Ａｂで被覆された赤く染色され た粒子を試料と共に培養し、フィルター上に注入した。個々の粒子はフィルター を透過し、表面に色が発現しない。もし試料か適当なＡｇを含んでいると、粒子 が凝集し、凝集した固まりがフィルター上に捕捉され、Ａｇに対して赤（又はピ ンク）の陽性色の試験結果をもたらす。この原理は、反射色強度が試料のＡｇ含 有量と相関するようなアッセイ手順へと、容易に適用され得た。コスタ−社（Ｃ ｏｓ　ｔａｒ　Ｃｏｒｐ、）は、粒子凝集捕捉ＥＬＩＳＡスキームを提案した。

色素発現基質との反応の後、可溶性基質を分光光度計（マイクロプレートリーダ ー）中で測定する。

染料及びラテックスの改善 明るい、光学的に安定な蛍光性又は着色染料を有する小さなミクロスフイアか、 感受性診断試験に新しい機会を開いた。蛍光ラテックスは安価であり、定性及び 定量免疫診断に対して法尻に適用できる。蛍光ラテックス粒子の使用は、ラテッ クス凝集試験（ＬＡＴ）　、濾過分離試験（凝集した粒子をフィルター上に捕捉 するもの）、粒子捕捉ＥＬＩＳＡ法及び二粒子サンドイッチ技術を含んだ、現在 採用されているラテックスに基づいた主要な診断試験装置の、すべてではないに しても、はとんとすべてに対して適用されるべきものである。蛍光から得られる 信号の増大は、定量的及び定性的な結果の機会を、比色法とくらべて１０００倍 を越える感度の上昇の可能性をもって、提供する。

超高感度診断試験におけるラテックス粒子の幾つかの領域を、次に要約する。

一ラテックス凝集試験（ＬＡＴ）／ラテックス免疫アッセイ（ＬＩＡ） 一凝集／捕捉試験及びアッセイ（染色粒子）−粒子捕捉ＥＬＩＳＡ試験及びアッ セイ−染色粒子サンドイッチ試験及びアッセイ−ＳＰＲＩＡ／ＳＰＥ　ＩＡ、Ｄ ＮＡプローブ（遠心分離又は磁石による固体　／液体分離） 従来技術の説明 典型的な試料収集装置は、米国特許第４，７４１．３４６号に示されている。こ の装置は、試料びんを真っ直ぐな位置に支持するベーススタンドを備えている。

ロートかこの試料びんの開放端中に挿入され、このびんの上部をロートが包囲し 、封をしている。このベーススタンドが２、上方へと伸びる管状壁を有し、管状 壁かキャップと組み合わされてびんを少なくとも部分的に包囲し、ユーザーかび んの表面に触れることなく、又は試料との接触に至ることなく、びんを取り外せ るようになっている。尿を収集及び輸送するための種々の型の液体容器の例が、 米国特許第３．７７．７３９号、３，８８１．４６５号、４゜０４２，３３７号 、４，０８４，９３７号、４．　２４４．　９２０号、４，４９２．２５８号及 び４，７００，７１４号に示されている。

米国特許第４，０４０，７９１号に示されている他の試料収集装置か開示する収 集容器は、ニップルを備えており、ニップルの上に試料容器が載せられており、 試料容器が封止条件下で所定量の試料を受ける。この試料容器に、一体成形され たキャップか設けられ、このキャップか開口の上方に配置され、容器のニップル が開口内へと挿入される。米国特許第４，５５７゜２７４号か開示する中流尿収 集器はロートを備え、ロートが尿をカップ部材中へと輸送し、カップ部材が膜力 バーによって覆われている。

結合されたストリップ試験装置及び収集装置が、米国特許第４．４７３，５３０ 号に示されており、これに係る装置は、比重読み取り手段と共にチューブ内に存 在する化学試薬試験ストリップを備えることによって、試験及び収集を一体化し 、尿の迅速な試験を可能とする。８米国特許４，５７３，９８３号が対象とする 液体収集装置は、排出部上に抗敗血症部材を有し、空気のフィルター及び尿を濾 過するための細菌不透過性材料を使用する。

本発明者は、現在、体液の試験装置を対象とする、発行された米国特許を多数有 している。米国特許番号第５．　０２２．　４１１号か開示する尿中の生体分子 標識の試験装置は、プランジャアセンブリ及び連動する試験アセンブリを持っ筒 状容器を備えている。この筒状容器中に収集された尿は、標識抗体と混合され、 プランジャアセンブリによって、固定化抗体の設けられた試験面に対して流され 、この固定化抗体が、標識抗体と複合化された抗原を捕捉する。標識抗体の酵素 は反応体溶液によって着色され、試験された尿中の特異的抗原の存在又は不在を 示す。

米国特許第５．０１６，６４４号は、尿中の生体分子標識を試験するための方法 を開示する。尿か加圧下に試料容器を通して輸送され、この試料容器を流れ過ぎ 、これにより尿中の抗原が収集され、ビーズ上に固定化された抗体に結合し、抗 原−抗体複合体を形成する。このビーズを洗浄して細胞残滓を除去し、特異的な 予備標識抗体溶液にこの試料容器を流過させ、捕捉された抗原の受容体部位にこ の子ｍ＊識された抗体を付着させ、抗体−抗原一子備標識抗体からなるサンドイ ッチ複合体を生成させる。このサンドイッチ複合体を洗浄して細胞残滓と供給分 子とを除去し、予備標識抗体と反応する着色試薬溶液と混合し、特異的癌抗原の 存在を示す色を生じさせる。

米国特許第５，００３，９８８号か開示する多重生体標識の収集及び試験装置は 、共有結合した抗原ビーズを保持する筒状の区分された容器を備え、このビーズ が、分離された区画内に含まれている。体液か筒状容器内に収集され、区分され た容器内の分離された区画を流されて通過し、これにより所定の配位子かビーズ の配位子に付着し始め、多数の生体標識が得られる。

米国特許第４．９６１，４３２号が開示する、体液を収集し、体液を試験用試料 中へと取り扱うための装置は、開放端部を有する筒状容器を備え、開放端部のう ちの一つか収集貯蔵ユニットへと取り外し可能なように結合されている。チャン バの輪郭をなす円筒状の中空ピストンからなるシャトルアセンブリ、前記ピスト ンの一方の端部を覆う頂部カバー、開口を有する第二のカバー及びピストンの第 二の端部を覆うコネクタが、筒状容器内にスライド可能なように装着されている 。　°オー′　リングがピストンの外側表面上に装着され、この°オー°　リン グと筒状容器の内側表面との間に液密シールを形成しており、このコネクタが取 り外し可能なように樹脂／試料容器に結合されており、これにより筒状容器内の ピストンの動作によって樹脂／試料容器か収集貯蔵ユニット内へと運ばれ、筒状 容器内に収集された流体を、樹脂／試料容器に流して通過させる。

米国特許第４，９６０，１３０号か開示する、体液を収集し、体液を試験用試料 中へと取り扱うための装置は、開放端部を有する筒状容器を備え、開放端部のう ちの一つが収集貯蔵ユニットへと取り外し可能なように結合されている。チャン バの輪郭をなす円筒状の中空ピストンからなるシャトルアセンブリ、前記ピスト ンの一方の端部を覆う頂部カバー及び開口を有する第二のカバー及びピストンの 第二の端部を覆うコネクタが、筒状容器内にスライド可能なように装着されてい る。　゛オー゛　リングかピストンの外側表面上に装着され、この°オー°　リ ングと筒状容器の内側表面との間に液密シールを形成しており、このコネクタか 取り外し可能なように樹脂／試料容器に結合されており、これにより筒状容器内 のピストンの動作によって樹脂／試料容器か収集貯蔵ユニット内へと運ばれ、筒 状容器内に収集された流体を、樹脂／試料容器に流して通過させる。

米国特許第４，９５３，５６１号か開示する尿中の生体分子標識を試験するため の装置は、筒状容器、及び固定化配位子を有するビーズを保持する試料容器を備 えている。尿は、加圧下に筒状容器を通して輸送され、試料容器を流れて通過し 、試料容器か抗体をスクリーンし、これにより尿流体によって運ばれた抗原が収 集され、ビーズ上で濃縮される。

また、本発明は、体液中で運ばれるマーカーを容易に可視的に同定できるような 装置である。

本発明の簡単な要約 本発明は、体液の収集及び試験装置に係るものであり、好ましくは血液の試験装 置に係るものである。この装置は、血液試験容器のような内部容器を有するびん の形態であり、内部容器かこのびんの中に回転可能に設置されており、この容器 の側部に、配位子を、又は、特異的抗体又は、好ましくは、特異的抗原の可視的 同定を特徴とする特異的抗原のような、生体特異的複合体対の要素を捕捉するた めの毛細管マーカーアセンブリが設けられている。この流体、好ましくは血液が 、封止されたキャップを通してびんへと加えられる。この内部容器において、こ の流体が、５ミクロン未満の孔径を有する容器の底部内のフィルター膜を通過す る流れに加わり、この膜か、びん内の反応ウェルの上方に設置されている。この フィルター膜か与える表面の上に、赤血球が接触するが、透過することはできず 、７゜２のｐＨを有する血清をびんのウェル内へと膜を透過させ、このウェルに 充填させる。例えば分析物として存在するときは、第一の配位子又は生体特異的 複合体対の要素、典型的には血清抗原が、処理容器に隣接する捕捉ウェル内に収 容された凍結乾燥標識抗体と反応し、抗原−抗体複合体のような生体特異的対を 生成する。このびんを第一の位置へと、例えば９０°の角度で回転させ、反応ウ ェル内の血清を内部血液容器内の残りの血液から分離し、標識抗体の血液容器内 へのいかなる逆拡散も防止する。短い培養時間の後、次いでこのびんを、毛細管 マーカ−アセンブリか、充填されたウェルの上方に位置するまで、第二の位置へ と、例えばびん及び内部容器の最初の位置からの全角度が１８０°となるように 、回転させる。このウェルと毛細管マーカーアセンブリとの関係により、毛細管 マーカーアセンブリ内の膜ストリップ（ｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｔｒｉｐ）に沿っ て血清が移動する。この分析物が、抗原のように、生体特異的対の第一の要素で ある典型的な状況ては、もし標本（血清）試料中に抗原か不在であれば、標識抗 体のような、生体特異的対の標識された第二の要素が占有されないままで残り、 毛管アセンブリの制御領域内に配置された膜上に存在する抗原被覆重合体粒子の 結合部位を探索する。ウェルから血清の毛細管作用によって毛細管マーカーアセ ンブリ内へと運ばれた複合化された抗原／標識抗体は、この制御領域内で固定化 抗原を有する重合体粒子と反応しない。むしろ、この複合化された抗原／標識抗 体は、膜上の第二の試験領域へと輸送される。この第二の領域には、第二の捕捉 抗体を有する重合体粒子か設けられ１、第二の捕捉抗体か、この複合化された抗 原／標識抗体を捕捉し、これかびんの透明な壁をとおして見え、可視的な色を生 成する。この試験領域内の第二の捕捉抗体（結合部位）の量は、複合体抗原／標 識抗体による充填部位の数を毛細管メーターアセンブリ上のマークによって定量 できるように、決定する。癌又は薬品等のような分析物の存在又は不在を示す試 験結果は、こうして着色又は着色がないことによって、可視となる。コロイドの 全基質か他の染色粒子又はミクロソームよりも好ましいけれども、色素発現基質 もまた、酵素接合体の敏感な検出方法を提供する。また、本発明の目的は、特に 、抗原又は抗体のような、生体特異的対の要素、又は配位子か、試験用の体液か ら除去されつつある場合に、体液試料中の抗原のような、生体特異的対の特定の 要素を検出及び可視的に定量することである。以前には、本発明の背景技術の項 目で議論してきたように、こうした試験は、試料の収集、分割及び試料の試験装 置への輸送を含む幾つかの別個の工程を採用して、遂行されてきた。

添付図面において、本発明の例を図示するか、ここからこれらの及び他の目的、 新規な特徴及び利点か容易に判るであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の流体試験装置の分解断面図である：図２は、図１に示す組み立 てられた流体試験装置の断面図である； 図３は、図４に示すように部品位置を変更させるために回転された図２の装置を 示す概略図である：図４は、図２に示す装置を図３の概略図に示すように回転さ せた後の装置を示す、断面図である。

図５は、本発明の収集容器内へと針内腔を通して血液か回収されているのを示す 、本発明の試験装置の断面図である：図６は、収集針から取り外されたあとの図 ５に示す装置の断面図であり、濾過されたウェル内への容量血清分離を示す：図 ６Ａは、各部材の回転及び抗原がフィルターを通ってウェル内へと移動するのに 先立つ、図６の装置の先端部材を示す部分断面図である： 図７は、図６の装置の概略図であり、図８の配置をとるための装置の部材の相対 的回転を示す； 図７Ａは、図７に示すように部分的に回転（９０°回転）された後の、図６の装 置の先端部材を示す部分断面図である：図８は、１８０°回転後の図６の装置の 断面図であり、血清分離ウェルの上方での毛細管チューブアセンブリの設置を示 す：図８Ａは、図８の装置の先端部材を示し、これを充分に回転させてウェルを 毛細管チューブのフットと整列させた後を示す部分断面図である。

図９は、濾過されたウェルの上方に設置された毛細管チューブの拡大断面図であ り、制御及び試験領域内の毛細管膜内にそれぞれ埋め込まれた抗原及び抗体被覆 粒子を概略的に示す。

図１０は、図９に示す例の断面図であり、ここで濾過ウェル内の標識抗体か毛細 管作用によって毛細管チューブを上方へ移動し、制御領域内の膜の配位子被覆粒 子へと付着している：図１１は、制御領域内の膜上の特異的標識抗体の存在を示 す毛細管チューブの正面図である： 図１２は、図９の毛細管チューブの概略的断面図てあり、ここて濾過ウェル内の 複合化された抗原及び標識抗体が毛細管作用によって毛細管チューブを上方へ移 動し、試験領域内の膜上の配位子被覆粒子へと付着している： 図１３は、特異的な複合化抗原／標識抗体の存在を示す毛細管チューブの正面図 である： 図１４は、多重配位子試験用の装置の断面図を示す、本発明の他の例である。及 び 図１５は、図１４に示す本発明てあり、ここて多重配位子の存在又は不在か、こ の装置の試験膜の表示領域上に可視的に示されている。

本発明の詳細な説明 本発明の最良の態様及び好適例を図１−１３に示す。本発明ては、流体収集及び 試験装置２０は、管壁３２及び球状の末端先端部３３によって形成された末端封 鎖ハウジング３０を備えている。本発明は出発点ては血液の試験に係るものであ るが、本発明で尿のような他の体液を使用できることがわかる。頂部平面３５を 有する先端部材３４を、封鎖された球状末端先端部３３内に設置し、収集ウェル 及び反応チャンバ３６の輪郭を形成する。このウェル３６は、着色ラテックス８ ９によって標識されたマウス抗−抗原抗体８８を含み、又は備えており、後述さ れるであろうように、これかウェルに入る濾過後の血清と混合されるであろう。

もし望むならば、図１に示すように細孔性膜３７によってこのウェルを被覆し、 この収集ウェルからの着色ラテックスの漏れを防止することができる。またこの 先端部材３４に雌受け３８を設け、雌受け３８が、流体容器５０から伸びるシャ フト５７及び矢印の頭の形状の先端部５９を有する雄部材５８を受けるように調 整され、これが先端部材３４内に容器５０を保持する受け３８内に音を立てて嵌 められ、一方この容器が二つの相に回転するのを可能とし、一つめでは９０゜回 転して、反応チャンバに血清を満たした後に血液容器から反応チャンバを分離さ せると共にこのチャンバ内で反応体を短時間培養することを可能とし、二つめで は１８０°回転してこの反応チャンバを毛細管メーターアセンブリと整列させる 。この流体容器５０は、平坦な末端壁５２を有する末端開放管状壁５１を備えて いる。この末端壁５２か流れ開口５３の輪郭を形成し、流れ開口５３の中に、流 体を濾過するためのフィルター５４が設置されている。このフィルター５４は、 血清の流れを容易にするため、５ミクロン未満の孔寸法を有していることか好ま しい。またこの末端壁５２はピボットアセンブリ５８の輪郭を形成し、ピボット アセンブリ５８が備えるシャフト５７が末端壁５２から外側へと伸び、ピボット アセンブリ５８が備えるロッキング先端部５９は好ましくは、ハウジング３ｏ内 に容器５０を保持する受け３８内に適合する矢印の頭部の形状である。

毛細管メーターアセンブリ６ｏが、流体容器壁５１の側面にフィルター５４の反 対側に結合されている。

この毛細管メーターアセンブリ６０は、毛細管チューブ又は導管６２を備えてお り、ウェル３６の上方に適合するウェル反応被覆フランジ又はフット６４を一端 に備えている。このチューブは、フット６４の反対側の末端部内に吸収材料６８ を保持している。この吸収材料が隣接する膜ストリップ部材６６が、フット領域 の方へと伸びる。この膜ストリップが意図している毛細管作用により、流体血清 かウェル３６がらフットを通して膜ストリップ６６に沿って吸収材料６８内へと 上方に移動するてあろう。この膜ストリップ６６には、図９に示すように制御領 域７０か設けられている。この制御領域７ｏは、膜６６内に捕捉された抗原被覆 ポリスチレン粒子８０を含有する。また、この膜６６には、再び図９に示すよう に試験領域７２か設けられており、試験領域７２が、膜６６内に捕捉された抗− 抗原抗体被覆ポリスチレン粒子８２を含有する。

本発明で使用する好ましい膜は、ゲルマン　スポール（ＧｅＩｍａｎ　５ｕｐｏ ｒ）　膜である。スポール膜は、親水性表面、優れた流速及び粒子保持を備えた 低タンパク質結合ポリサルフすン膜である。ゲルマン　スポール膜は、滑らかな 表面、明るい白及び透明性を与えるので、診断試験において信号のコントラスト か高まる。抽出物か低いことにより試料の汚染か減り、均一な孔により最終製品 の一定性か確保され、望ましくない抽出物の混入を防止する外部の潤滑剤かない 。スポールの有するこれらの特異な特性は、本発明の装置に理想的である。固相 膜１４は、好ましくは、抗原又は抗体被覆粒子かその表面に捕捉された低タンパ ク質結合の合成膜であるが、高タンパク質結合の他の膜を、これらの表面に直接 に抗原又は抗体を固定化するのに使用てきる。この固相として膜を使用すると、 取扱いを省くことかでき、この製品の形状をベース上に配置するための所望の形 状又はフォーマットに切断することが可能であり、より早い反応速度論を提供し 、タンパク質の結合が上昇する。固体プラスチック基質へのタンパク質の結合は 、非定量的プロセスであることか発見されており、使用したプラスチックの型に よって大きく変わる。結合は非特異的であり、一般に、プラスチックとタンパク 質との間の静電的及び疎水性相互作用によって生ずる。膜基質が固相免疫測定に 内在する問題の多くを克服するのは、これらか拡大された能力の範囲によって複 数の品質の固相と結合すること及び、これらの多孔性とその結果の大きな表面積 によって、高いタンパク質結合容量を有しているからである。タンパク質結合容 量は、より小さな孔径の膜を使用することによって増大し、より小さな孔径の膜 の全結合面は、等価前面表面のために増大する。前記のラテックス捕捉膜に加え て、本発明で使用しつる膜は、ニトロセルロース、ナイロン、セルロース又はミ リボール社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｎｃ、）製のＩＡＭからなっていてよい。

吸収マトリックスの選択は、感度、結合容量、安定性又は結合分子のような物理 的特性及びアッセイ装置との互換性に依存する。ナイロン及びセルロースのよう な膜を修飾して、共有結合又はタンパク質用の表面部位を作りだすことができる 。ニトロセルロースは、タンパク質及び細胞性高分子に対する親和性か高いこと から、最も一般的に使用される膜の−っである。ＩＡＭにおいては、ＩＡＭのベ ースポリマーであるポリヒニリデンジフルオライト（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅ ｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）　（ＰＶＤＦ）は、疎水性であり、タンパク質に結 合する。ＩＡ〜ｆはタンパク質の結合の程度に対して高度の制御を可能とし、ユ ーザーは、再現性良くこの表面にナノグラム−マイクログラムの量のタンパク質 を固定化することができ、種々のアッセイの要求に適合させることかできる。こ のＩＡＭの表面に対するタンパク質の結合は、元来リジンのイプシロンアミノ基 を通して生じ、これは、結合かイオン性又は疎水性であるニトロセルロース、ナ イロン又はプラスチックへの結合タンパク質とは対照的である。

既に記載した本発明で使用できる他の型の膜は、ニトロセルロースであり、これ はプロッティングタンパク質及び核酸に対して優れたマトリックスを提供する。

このニトロセルロースは、必要とされるいかなる形状にも切断てきる。純粋なニ トロセルロースは、タンパク質、核酸及び他の細胞性抗原を吸収する。

これらの吸収された物質は、しばしば抗原−抗体結合活性を保持し、超高感度の 酵素増幅免疫染色法を用いて可視化することかでき、これにより色素発現染色か 、吸収された材料の位置をマークする。このアブａ−チはドツト　イライサ（Ｄ ｏｔ　ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる技術を用いており、（これはまたナイロン、ＩＡ Ｍ、プラスチック膜て採用できる）これによりナノグラム量のタンパク質をニト ロセルロースに直接に付着させることかできる。ドラトイライザの重要な利点の 一つは、単一の試験手順て、１マイクロリツトルもの少なさの抗原又は捕捉抗体 溶液を用いて、多重酵素免疫測定を実施てきることである。単一の膜上へとドツ トされたナノグラム量の捕捉抗体が、多様な抗原を同時にスクリーンするのに使 用できる。ドラトイライザの手順においては、反応体をコーティング溶液内で希 釈し、湿った膜上へとドツトする。この最適濃度は反応体から反応体へと変化す るであろうか、複合化抗原に対しては、０．　１〜１゜０ｍｇ／ｍｌが適当であ る。膜プロッティングに続いて、希釈剤／ブロッキング溶液内にこの膜の両側を 完全に浸漬することによって、過剰の結合部位をブロックする。あらゆる種類の 貯蔵容器を使用できる。この希釈剤／ブロッキング溶液は、リン酸緩衝液中に１ ％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでおり、吸収されたタンパク質を表面 変性から保護する。このブロッキング工程に続いて、膜を乾燥状態で冷蔵温度で 数カ月の開店性を失うことなしに貯蔵することかできる。抗原又は捕捉抗体のニ トロセルロース膜上への吸着は、抗原検出イライザ（Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｄｅｔｅ ｃｔｉｏｎ　ＥＬ［ＳＡ　）　、抗体又は抗原のいずれかを、いずれが未知とし て設定されているかに従って検出することができる間接抗体イライザ（Ｉｎｄｉ ｒｅｃｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＥＬ［ＳＡ）又は抗体サンドイツチイライザ（Ａ ｎｔｉｂｏｄｙ　５ａｎｄｉｖｉｃｈ　ＥＬ［ＳＡ　）によって達成することが でき、抗体サンドイツチイライザを遂行するには、抗原又は捕捉抗体を吸着し、 あらゆる遊離の又は未付着の反応体の各試薬を洗浄し、及び他の試薬を加えて、 一段毎に、膜表面上に分子サンドイッチを形成し、酵素−抗体接合体を添加して これを完了させる。こうした膜表面の構成は、カークガード及びべり一研究所社 速報（ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｉｎｃ、　）　１９８５年の題「膜上の抗原又 は抗体を検出するためのイライザメイト（ＴＭ）酵素免疫測定試験装置Ｊ　（Ｅ ＬＩＳＡｍａｔｅ　（ＴＭ）　Ｅｎｚｙｍｍｅ　［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅ ５ｔ　Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏ ｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）　ｌこよって、明らか に示されており、これは本出願に参照文献として包含する。

エラストマー性のキャップ部材４０を本発明のために設ける。

このキャップ部材４０は肩４４とリップ４２とを備え、この肩の外側表面は、チ ューブ３２の内側面３２ａ内にきちんと嵌められるように設計されており、この リップ４２は、チューブ３２の頂上面３１に対して設置される。この肩４４に環 状溝４６が設けられ、管状溝４６か、流体容器壁５１の開放末端をストッパー壁 ４７に対して上方に保持する。この溝４６には拡大領域４８か設けられ、拡大領 域４８が毛細管メーターアセンブリ６０の上部６１を受けてこの流体容器５０を キャップ部材内にきちんと結合された位置に保持し、この流体容器５０が図３に 示すようにチューブハウジング５０内を回転するのを可能とする。図５に示すよ うに、内腔９２を備える針９０が、エラストマー性キャップ部材４０を通して流 体容器５０のチャンバ５５内へと挿入される。図５に示すように、血液又は他の 流体か、源から針９０を通してチャンバ５５内へと供給される。この血液１００ は血清１０１、細胞１０２、細胞残滓１０４及び抗原１０６を含有している。こ の試験装置２０を針９０及び結合された血液又は流体源から取り外し、エラスト マー性キャップ部材がこの針孔からシールする。このときに注目すべきことに、 流体容器のフィルター５４は、先端部材３４のウェル反応チャンバ３６の上方に 直接に配置されており、これにより血液の容量血清分離かあり、ここでこの血液 からの血清かフィルター５４を通してウェル３６内へと透過する。この血清は、 予めウェル３６の反応チャンバへと加えられていた着色ラテックス８９によって 標識された凍結乾燥マウス抗−抗原抗体８８と混合される。次いでハウジング３ ０を容器５０の回りにピボットアセンブリ３８上で二段階で回転させ、第一に９ ０°回転させてこの反応チャンバを流体容器から分離し、この反応チャンバ内の 反応体の短時間培養を可能とし、第二に、血清複合体を有するウェル３６が毛細 管メーターアセンブリ６０に隣接して配置され、このアセンブリのカバー又はフ ット６４がウェル３６の反応チャンバを覆うまで、１８０°回転させる。次いで 、マウス抗−抗原抗体標識着色ラテックスを含むウェル内の流体の毛細管作用か 生ずる。この標識抗体か複合化しない場合には、この配位子が図１Ｏに示すよう に毛細管チューブを通って移動する。

図１１に示すように、この試験結果は、流体容器チューブ５１の外側面上に形成 されたマーキング印に対して存在する呈色反応によって示され、この試験領域内 の所定の結合部位の充填部位対非充填部位の量を示す。

一般に、もし試料中の未知の物が装置の許容成分であれば、生成した色は、試料 中に存在する未知の物又は分析物の量に比例する。ＢＣＩ　Ｐ、ＮＢＴリン酸基 質系（Ｐｈｏｐｈａｔｅｓ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　）は、ホスフ ァターゼを保持する膜部位上に暗い紫色の染色を生成する。アルカリホスファタ ーゼは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル　ホスフェートの脱リン酸化を 触媒し、これが反応カスケードを開始させ、強い色生成をもたらす。抗体の結合 は、膜の抗体に結合した抗原の場合におけるように、多様な試薬系によって検出 てきる。例えば、■−標識抗マウス免疫グロブリン又はＩ−標識タンパク質Ａを 使用できる。

アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼに直接に接合した抗マウス免疫グ ロブリンを、適当な色素発現基質と共に使用できる。ビオチン−アビジン　ペル オキシダーゼ系を、適当な色素発現基質と共に使用できる。このビオチン−アビ ジン　ペルオキシダーゼ系（例えば、ヘクター研究所：　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓが供給するベクタスティンＡＢＣ系：　Ｖｅｃｔａｓｔａｉ ｎ　ＡＢＣｓｙｓｔｅｍ）は、特に敏感である。

図１２には毛細管作用か示されており、ここで標識着色ラテックスを備えた複合 化された抗原／抗体９８が、試験領域７２内の粒子８２によって捕捉され、陽性 の試験結果を示している。

こうした試験の可視的表示を図１３に示す。

本発明の他の例を図１４及び図１５に示す。この例では、領域７０及び粒子８０ に対応して制御領域２００があり、領域７２に対応して多重試験領域２１０〜２ ４０があり：これらの各々に、特異的抗−抗原被覆ポリスチレン粒子領域８２． ８２ａ：８２ｂ及び８２ｃのような特異的試験スポット又は領域が設けられてお り、これらは血液又は他の液体によって運ばれる癌又は他の疾患を発現する抗原 のような異なった分析物のためであり、流体容器のガラスを通して容易に認識さ せるためである。

本発明の装置においては、抗原／抗体、被覆／非被覆粒子及び予め標識された抗 体を多様に変更して使用することができ、従来技術において以前には逸されてい た、類似の結果を得られることか理解される。

前記した本発明の装置及び方法は、次の特徴及び利点を与える・第一に、血液試 料か、検出装置に必要な全ての処理及び分離工程の間中、血液収集容器内に留ま る。こうした封じ込めにより、陽性の患者の同定か自動的に確保され、手動吸引 及び試料の分離に関連するすへての周辺機器を省略できる。また、試料か環境へ と外部露出するのを防止することで、健康上の災害を最小限にできる。更に、試 料を手で取り扱わないので、処理時間か最小となり、取扱者の誤りを可能にする 無数の他の原因か、実質的に無くなる。

第二に、細胞分離及び分離チャンバへの血漿輸送の処理か、取扱者か介入するこ となく、この血液収集及び処理容器の内部で起こる。収集された血清の量は、こ の分離チャンバによって正確に決定され、これが今度は血清中の分析物の定量的 測定を可能にする。

上記の記載においては、本発明を特定の好適例に関して説明したけれども、例示 した特定の詳細は単に例示的なものであり二本発明を、次の請求の範囲の真の精 神及び範囲から離れることなく、他の方法で実施できることを理解するへきであ る。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、５

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ハウジング、このハウジング内に配置されたウエル、このウエルに隣接して 前記ハウジングに回転可能に設けられた容器を備え、流体を前記ウエルに連通さ せるための流体流通手段が前記容器に設けられており、流体を濾過して前記ウエ ル内へと透過させるために前記流体流通手段内に設けられたフィルターを備え、 及び前記容器に結合された毛細管配位子試験アセンブリを備えている、流体収集 及び試験装置。
2. ２．前記毛細管試験アセンブリが、毛細管チューブ、この毛細管チューブ内に設 けられた膜及び前記毛細管チューブ内に設けられた吸収材料を備えており、特異 的な所定の配位子を捕捉するための結合部位を所定数育する指定配位子捕捉手段 が前記膜に設けられている、請求項１に記載の流体収集及び試験装置。
3. ３．流体試験装置が、ハウジング、このハウジング内に配置されたウエル、前記 ハウジングに回転可能に設けられかつ前記ウエルに隣接して配置された容器、前 記ハウジング及び前記容器に設けられたキャップを備え、前記容器が、流体を前 記ウエルに連通させる流体流通手段を有する容器ハウジング、流体を濾過して前 記ウエル内へと透過させるために前記流体流通手段内に設けられたフィルター及 び前記容器ハウジングに結合された毛細管配位子試験アセンブリを備え；この毛 細管試験アセンブリが、毛細管チューブ、この毛細管チューブ内に設けられた膜 及び前記毛細管チューブ内に設けられた吸収材料を備えており、特異的な所定の 配位子を捕捉するための指定配位子捕捉手段が設けられた試験領域及び調整領域 内へと分割された膜ストリップを前記膜が備えている、流体試験装置。
4. ４．体液を収集及び試験するための方法であって、ａ）．着色標識手段を有する 配位子を第一の容器に充填する工程； ｂ）．前記第一の容器に隣接して配置された第二の容器に、試験すべき体液を充 填する工程； ｃ）．前記体液を前記第一の容器内へとフィルターを透過させることによって、 前記体液を前記第二の容器から前記第一の容器内へと分割する工程； ｄ）．前記第一及び第二の容器の間に相対回転を与えて前記第一の容器内への体 液流を遮断し、培養させて配位子複合体を生成させる工程； ｅ）．前記第一及び第二の容器の間に相対回転を与えて前記第一の容器を毛細管 アセンブリの反対側に位置させる工程；及び ｆ）．前記配位子複合体を、前記毛細管アセンブリに固定された抗原と反応させ る工程を有する、体液を収集及び試験するための方法。
5. ５．流体収集及び試験装置が、 反応チャンバ： 前記反応チャンバに連絡してかつ連通可能に設けられた収集チャンバ；及び 流体中の少なくとも一種の所定の分析物の存在を示すための毛細管試験アセンブ リを備え、この毛細管試験アセンブリが前記反応チャンバと連通可能である、流 体収集及び試験装置。
6. ６．前記反応チャンバが前記収集チャンバに対して第一及び第二の位置の間で移 動可能であり、これにより前記収集チャンバ内に存在する流体が、前記第一の位 置で前記反応チャンバ内に流れる、請求項５記載の流体収集及び試験装置。
7. ７．前記反応チャンバが前記収集チャンバに対して第一及び第二の位置の間で移 動可能であり、これにより前記反応チャンバ内に存在する流体が、前記第二の位 置で前記毛細管試験アセンブリ内へと毛細管作用によって流れる、請求項５記載 の流体収集及び試験装置。
8. ８．前記毛細管試験アセンブリが、前記した少なくとも一種の所定の分析物の存 在を示す少なくとも一種の固定化試薬を含む、請求項５記載の流体収集及び試験 装置。
9. ９．前記した少なくとも一種の分析物が少なくとも一種の特異的配位子であり、 前記した少なくとも一種の固定化試薬が、前記した少なくとも一種の特異的配位 子と少なくとも一種の生体特異的複合体対を形成する能力がある、請求項８記載 の流体収集及び試験装置。
10. １０．流体収集及び分析物の試験用のキットであって：（ａ）流体試料を収集し 、分析物の存在を試験するための装置であって： 反応チャンバ； 前記反応チャンバに連絡してかつ連通可能に設けられた収集チャンバ； 流体中の少なくとも一種の所定の分析物の存在を示すための、前記反応チャンバ と連通可能である毛細管試験アセンブリを備えた装置；及び （ｂ）少なくとも一種の試験試薬 を備えた、流体収集及び試験用キット。
11. １１．前記毛細管試験アセンブリが、前記した少なくとも一種の所定の分析物の 存在を示す少なくとも一種の固定化試薬を含む、請求項１０記載の流体収集及び 試験用キット。
12. １２．前記した少なくとも一種の試験試薬が、前記した少なくとも一種の所定の 分析物と相互作用して、前記した少なくとも一種の固定化試薬と相互作用しうる 生成物を生成する能力がある、請求項１０記載の流体収集及び試験用キット。