CN101906414B

CN101906414B - 甲基化dna的浓缩方法和检测方法以及试剂盒

Info

Publication number: CN101906414B
Application number: CN 200910085872
Authority: CN
Inventors: 夏东元
Original assignee: Biochain Beijing Science and Technology Inc
Current assignee: Biochain Beijing Science and Technology Inc
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2029-06-03
Also published as: CN101906414A

Abstract

本发明提供一种甲基化DNA的浓缩方法和检测方法以及试剂盒，浓缩方法包括将生物样品直接与固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白接触。检测方法包括以下步骤：浓缩：将生物样品直接与固相化甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白接触；转化：使用重硫酸盐处理浓缩到的甲基化DNA；脱硫：使用碱性脱硫剂处理经转化的甲基化DNA；以及测定得到的DNA序列。上述方法中编码所述甲基化DNA结合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。上述方法采用固相化甲基化DNA结合蛋白或其结构域直接高效结合甲基化DNA，对于体积大或DNA浓度低的生物样品尤为有利。

Description

甲基化DNA的浓缩方法和检测方法以及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA的浓缩方法和检测方法，以及相应的试剂盒，具体涉及一种采用甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的甲基化DNA的浓缩方法和检测方法，以及相应的试剂盒。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要研究内容，其在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一^[1]。甲基化状态的改变是引起肿瘤发生的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，导致基因组不稳定从而诱发细胞癌变^[2]。因此，甲基化的研究为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的参考。

随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。首先是直接测序法。直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化的方法。经重亚硫酸盐处理，使DNA中的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。再经PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断CpG位点是否发生甲基化^[3]。此方法比较准确，而且一次可以测定多个位点，但是相对复杂。第二种方法是由Herman等在1996年提出的，它是在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建立的一种方法^[4]。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后用引物特异性PCR进行测定。另一种方法是抗体结合纯化甲基化DNA法。甲基化的CpG基团可以产生抗体。使用抗甲基化DNA抗体可以纯化甲基化DNA片段^[5]。纯化的甲基化DNA可以通过DNA寡核酸微阵杂交测定。此方法准确性较前者低。近来，根据甲基化DNA CpG结合结构域(MBD)蛋白家族和甲基化DNA CpG结合蛋白2(MeCP2)可以特异性地结合甲基化DNA的特性，Shiraishi、Masahiko等人在2004年提出了一种新方法一MBD柱层析法，用于纯化基因组中甲基化DNA并结合其他方法加以测定^[6]。这一类蛋白非常特异性地结合DNA中甲基化的CpG结构。通过这种对甲基化DNA的特异结合在细胞中达到基因表达调控的功能。在体外，甲基化DNA CpG结合蛋白家族仍可以特异性地与甲基化DNA CpG结合，并可以用来纯化甲基化DNA。但是，目前所使用的这些方法，一般都要经纯化、处理、测定等步骤，比较复杂，尤其是对体积较大和/或DNA含量较低的生物样品，上述方法的效果更差。

发明内容

本发明通过研究发现，采用本发明的固相化甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白可以直接高效地结合生物样品中的甲基化DNA，实现对生物样品中甲基化DNA的浓缩，这对于体积大或DNA浓度低的生物样品尤为有利。将该技术应用于甲基化DNA的检测，使得固相载体和甲基化DNA的复合物不经分离，无需纯化、处理就可以直接完成转化和脱硫等反应，处理后的甲基化DNA可以直接用于PCR分析或序列测定。

因此，本发明的目的在于提供一种甲基化DNA的浓缩方法及相应的试剂盒。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种甲基化DNA的浓缩方法，该方法包括将生物样品直接与固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白接触，编码所述甲基化DNA结合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

在上述浓缩方法中，固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白的固相化载体选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。

上述浓缩方法还可以包括生物样品预处理的步骤，例如将生物样品进行蛋白变性预处理。

一种用于浓缩甲基化DNA的试剂盒，该试剂盒包括固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白，编码所述甲基化DNA结合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一个目的在于提供一种甲基化DNA的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)浓缩：将生物样品直接与固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白接触，编码所述甲基化DNA结合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

(2)转化：使用重硫酸盐处理步骤(1)浓缩到的甲基化DNA；

(3)脱硫：使用碱性脱硫剂处理步骤(2)得到的经转化的甲基化DNA；以及

(4)测定步骤(3)得到的DNA序列。

根据上述检测方法得到DNA甲基化的信息可以直接用于试验室和临床研究。

在上述检测方法中，固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白的固相化载体可以选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。步骤(4)中的测定方法可以选自PCR分析、定量PCR分析、基因序列分析和分子杂交分析中的一种或多种。生物样品可以选自血清、血浆、尿、痰、细胞提取物、组织提取物和粪便提取物中的一种或多种。

上述检测方法还可以包括生物样品预处理的步骤，例如将生物样品进行蛋白变性预处理。

本发明还提供了一种用于检测甲基化DNA的试剂盒，该试剂盒包括固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白，编码所述甲基化DNA结合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

在上述试剂盒中，固相化的甲基化DNA结合蛋白和/或其结构域蛋白的固相化载体可以选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中一种或多种。上述试剂盒还包括用于转化甲基化DNA的重硫酸盐、用于脱硫的碱性脱硫剂和转化后的DNA回收溶液。

由于天然存在的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白经基因工程技术克隆并在大肠杆菌中表达^[7]。重组的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白通过化学法，共价或非共价可以与凝胶颗粒或磁珠载体相连^[8]。因此，本发明经过大量的筛选实验获得了编码基因序列如SEQ ID NO：1所示的甲基化DNA结合蛋白以及编码基因序列如SEQ ID NO：2所示甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白，并将它们固相化，利用这两种固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白与甲基化DNA的特异性结合，从而高效地结合甲基化DNA，将甲基化DNA特异性地从生物样品中浓缩，并可以直接用于测定。本发明的固相化甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白可以直接用于甲基化DNA的浓缩。生物样品，比如细胞或组织提取物、血清、血浆、尿、痰以及粪便提取物中的甲基化DNA可以在室温条件下，与本发明的固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白相结合。该复合物可以直接进行DNA甲基化分析，直接经过重亚硫酸盐转化处理及脱硫，浓缩的DNA样品可以用于PCR测定或DNA序列分析。本发明所提供的方法的整个技术过程连续进行，操作简便，尤其适用于浓缩和/或测定体积较大且DNA含量较低的生物样品中的甲基化DNA。基于本发明所提供的上述方法而制备的试剂盒使得上述方法的实施更加简便快捷。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明，其中：

图1为PCR扩增甲基化DNA结合蛋白基因(MeCP2基因)和甲基化DNA结合蛋白的结构域基因(MBD基因)的电泳结果图。

图2为表达得到的甲基化DNA结合蛋白的结构域基因的蛋白产物的SDS电泳鉴定图。经诱导后甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的表达明显增加(为28K道耳顿)。其中1、2、3为三个不同大肠杆菌菌株。

图3为固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂的SDS电泳凝胶鉴定结果图。所有蛋白都已与树脂(beads)相联，上清液对照呈阴性(control)。用解析液可将树脂上的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白分离纯化加以证明(1至6为含蛋白的洗脱组份)。

图4为固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂的功能鉴定结果图。其中，样品1为树脂浓缩物，样品2为上清液，样品3为阳性对照。

图5为测定肠癌细胞中VIMENTIN基因的甲基化的电泳鉴定结果图。其中VIMENTIN基因的某些位点在人正常组织中是不被甲基化的(样品1)，但在肠癌的组织中明显的被甲基化(样品2、3、4、5、6分别来自五名病人)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明所提供的甲基化DNA的浓缩和检测方法进行详细说明。

实施例1：制备甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白

甲基化DNA结合蛋白基因(MeCP2)或甲基化DNA结合蛋白的结构域基因(MBD)(Genebank No.NM_004992)首先由PRC扩增，具体方法参见文献^[9]。

甲基化DNA结合蛋白基因(MeCP2)所用引物：

MECP2F：5-CACCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCT；

MECP2R：5-GCTAACTCTCTCGGTCACGGGCGT。

所扩增出的DNA产物为1458个碱基(见SEQ ID NO：1)。

甲基化DNA结合蛋白的结构域基因(MBD)所用引物：

MBDF：5-CACCATGCGCTCCATCATCCGTGA；

MBDR：5-TGGTTTCTGCTCTCGCCGGGA。

所扩增出的DNA产物为264个碱基(见SEQ ID NO：2)。

1％的琼脂糖电泳鉴定以上扩增出的DNA产物，结果如图1所示。

再将互补的cDNA片段插入到DNA表达载体质粒pBAD中(参见Invitrogen Corporation.5791 Van Allen Way，Carlsbad，CA，92008，United States产品说明)。在大肠杆菌中表达(37℃培养3小时后经阿拉伯糖诱导，再经16小时培养并收获细菌)。所得到的蛋白产物可由SDS电泳鉴定，结果如图2所示，甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白为28KD(甲基化DNA结合蛋白为69KD，图中未示出)。

实施例2：制备固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白

从裂解后的基因工程大肠杆菌提取液中提取表达的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白。在培养的250毫升大肠杆菌提取液加入0.5毫升的树脂(Qiagen，Ni-NTA，MBD蛋白由镍树脂纯化。参见Qiagene 27220 Turnberry Lane，Suite 200，Valencia，CA 91355 USA.^[10])。混合物在4℃下混合1小时后，离心(600转/分钟，3分钟)，除去上清液。再经磷酸缓冲液漂洗两次。

将5微升所得树脂经SDS样品液直接处理，通过SDS电泳鉴定，结果如图3所示，表明甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白已吸附在树脂上。

实施例3：固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的功能鉴定

在本实施例中，对实施例2所制备出的固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白进行功能鉴定，具体步骤如下：

(1)样品的预处理：血浆中DNA的含量在每毫升5到50纳克左右。将500微升血浆首先与500微升的6M胍溶液混合，然后将样品用结合缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，3mM MgCl₂，50mM NaCl，0.1mM EDTA)稀释至2毫升。

(2)甲基化DNA的浓缩：加入5微升固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂，室温并在摇动下保持1小时。离心除去液体(6000转/分钟，3分钟)，树脂再经500微升的结合缓冲液漂洗两次。

(3)重硫酸盐转化：加入90微升重硫酸盐溶液在65℃条件下保温3小时。然后，在混合物中加入600毫升的平衡缓冲液并将混合物转移至DNA提取的离心柱内。经离心后，DNA结合在离心柱上。

(4)脱硫处理：加入200微升的碱性脱硫剂(NaOH)，室温保温15分钟。再经淋洗和10微升水洗脱，所得到的DNA中的未甲基化的胞嘧啶核苷酸全部转变为尿嘧啶核苷酸。甲基化的胞嘧啶核苷酸仍为甲基化的胞嘧啶核苷酸。

(5)PCR测定：设计特异性的PCR引物，将甲基化的胞嘧啶核苷酸鉴定出来。

ADAR2基因中的CpG在正常细胞中是甲基化的^[11]。在上述处理过的DNA样品中，测定出该甲基化基因，如图4所示。该结果表明，固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂具有结合甲基化DNA的功能。并且此实验也证明：利用甲基化结合蛋白或其结构域蛋白对循环系统中游离的甲基化DNA进行结合以实现甲基化DNA的浓缩，进而用于检测。

实施例4：肠癌细胞中VIMENTIN基因甲基化的鉴定

肠癌组织中DNA发现有异常的甲基化变化。VIMENTIN基因特定位点的甲基化被看作肠癌的征兆^{[12，13，14]}。甲基化的VIMENTIN基因片段可以在患者的循环系统中游离的DNA中检测到。也可以从患者的大便样品DNA中测得。

本实施例采用大便样品(1g)，首先溶于5毫升的6M胍溶液中并在70℃下保温10分钟。再震荡1分钟。然后，加入15毫升的结合缓冲液，超声波处理1分钟。样品经离心(6000转/分钟，10分钟)后，除去沉淀。加入10微升的固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂，混合条件下室温保持2小时。固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的树脂再经离心回收(5000转/分钟，3分钟)。经500毫升结合缓冲洗两次。得到的树脂DNA混合物直接用于甲基化测定，其中设计的特异性PCR引物为：

mVF：5-TCGTTTCGAGGTTTTCGCGTTAGAGAC，以及

mVR：5-CGACTAAAACTCGACCGACTCGCGATA，

通过电泳测定出肠癌细胞中VIMENTIN基因的甲基化(见图5)。

实施例5：血清或血浆中VIMENTIN基因甲基化的鉴定

本实施例采用方法的具体步骤同实施例3，不同之处在于，将血清或血浆的量增加至2毫升。胍溶液和结合缓冲液也分别增至2毫升和4毫升。最终得到的转化的DNA直接用VIMENTIN甲基化测定引物经PCR测定。

实施例6：尿液、痰液等生物样品中VIMENTIN基因甲基化的鉴定

本实施例采用的方法的具体步骤同实施例3和实施例5。尿液，痰液等生物样品首先加入等体积的胍溶液。保温10分钟后，加入两倍体积的结合缓冲液和相应体积的固相化的甲基化DNA结合蛋白或甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白树脂，混合条件下室温保持2小时。离心回收树脂并直接进行甲基化分析。

实施例7：试剂盒的制备

试剂盒包括凝胶颗粒300微升，转化试剂1000微升，平衡液20毫升，碱性脱硫剂4毫升，柱子50个。该试剂盒可供50个样品分析。

参考文献

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序列表

<110>博尔诚(北京)科技有限公司

<120>甲基化DNA的浓缩方法和检测方法以及试剂盒

<130>DIC09110037

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1458

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggtagctg ggatgttagg gctcagggaa gaaaagtcag aagaccagga cctccagggc 60

ctcaaggaca aacccctcaa gtttaaaaag gtgaagaaag ataagaaaga agagaaagag 120

ggcaagcatg agcccgtgca gccatcagcc caccactctg ctgagcccgc agaggcaggc 180

aaagcagaga catcagaagg gtcaggctcc gccccggctg tgccggaagc ttctgcctcc 240

cccaaacagc ggcgctccat catccgtgac cggggaccca tgtatgatga ccccaccctg 300

cctgaaggct ggacacggaa gcttaagcaa aggaaatctg gccgctctgc tgggaagtat 360

gatgtgtatt tgatcaatcc ccagggaaaa gcctttcgct ctaaagtgga gttgattgcg 420

tacttcgaaa aggtaggcga cacatccctg gaccctaatg attttgactt cacggtaact 480

gggagaggga gcccctcccg gcgagagcag aaaccaccta agaagcccaa atctcccaaa 540

gctccaggaa ctggcagagg ccggggacgc cccaaaggga gcggcaccac gagacccaag 600

gcggccacgt cagagggtgt gcaggtgaaa agggtcctgg agaaaagtcc tgggaagctc 660

cttgtcaaga tgccttttca aacttcgcca gggggcaagg ctgagggggg tggggccacc 720

acatccaccc aggtcatggt gatcaaacgc cccggcagga agcgaaaagc tgaggccgac 780

cctcaggcca ttcccaagaa acggggccga aagccgggga gtgtggtggc agccgctgcc 840

gccgaggcca aaaagaaagc cgtgaaggag tcttctatcc gatctgtgca ggagaccgta 900

ctccccatca agaagcgcaa gacccgggag acggtcagca tcgaggtcaa ggaagtggtg 960

aagcccctgc tggtgtccac cctcggtgag aagagcggga aaggactgaa gacctgtaag 1020

agccctgggc ggaaaagcaa ggagagcagc cccaaggggc gcagcagcag cgcctcctca 1080

ccccccaaga aggagcacca ccaccatcac caccactcag agtccccaaa ggcccccgtg 1140

ccactgctcc cacccctgcc cccacctcca cctgagcccg agagctccga ggaccccacc 1200

agcccccctg agccccagga cttgagcagc agcgtctgca aagaggagaa gatgcccaga 1260

ggaggctcac tggagagcga cggctgcccc aaggagccag ctaagactca gcccgcggtt 1320

gccaccgccg ccacggccgc agaaaagtac aaacaccgag gggagggaga gcgcaaagac 1380

attgtttcat cctccatgcc aaggccaaac agagaggagc ctgtggacag ccggacgccc 1440

gtgaccgaga gagttagc 1458

<210>2

<211>264

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cgctccatca tccgtgaccg gggacccatg tatgatgacc ccaccctgcc tgaaggctgg 60

acacggaagc ttaagcaaag gaaatctggc cgctctgctg ggaagtatga tgtgtatttg 120

atcaatcccc agggaaaagc ctttcgctct aaagtggagt tgattgcgta cttcgaaaag 180

gtaggcgaca catccctgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 240

ccctcccggc gagagcagaa acca 264

Claims

1.一种甲基化DNA的浓缩方法，该方法包括将生物样品直接与固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白接触，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的固相化载体选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的浓缩方法，其特征在于，所述浓缩方法还包括生物样品预处理的步骤，所述生物样品预处理为将生物样品进行蛋白变性预处理。

3.一种用于浓缩甲基化DNA的试剂盒，该试剂盒包括固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的固相化载体选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。

4.一种甲基化DNA的检测方法，所述方法用于非诊断目的，该方法包括以下步骤：

（1）浓缩：将生物样品直接与固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白接触，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQID NO：2所示；

（2）转化：使用重硫酸盐处理步骤（1）浓缩到的甲基化DNA；

（3）脱硫：使用碱性脱硫剂处理步骤（2）得到的经转化的甲基化DNA；以及

（4）测定步骤（3）得到的DNA序列；

所述固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的固相化载体选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中的测定方法选自PCR分析、基因序列分析和分子杂交分析中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述生物样品选自血清、血浆、尿、痰、细胞提取物、组织提取物和粪便提取物中的一种或多种。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括生物样品预处理的步骤。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述生物样品预处理的步骤为将生物样品进行蛋白变性预处理。

9.一种用于检测甲基化DNA的试剂盒，该试剂盒包括固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白，编码所述甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述固相化的甲基化DNA结合蛋白的结构域蛋白的固相化载体选自凝胶颗粒、磁珠、树脂和膜系统中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于转化甲基化DNA的重硫酸盐、用于脱硫的碱性脱硫剂和转化后的DNA回收溶液。