JPS61292556A - 酵素免疫測定方法およびキツト - Google Patents
酵素免疫測定方法およびキツトInfo
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- JPS61292556A JPS61292556A JP13310785A JP13310785A JPS61292556A JP S61292556 A JPS61292556 A JP S61292556A JP 13310785 A JP13310785 A JP 13310785A JP 13310785 A JP13310785 A JP 13310785A JP S61292556 A JPS61292556 A JP S61292556A
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- antigens
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明は、相互に独立した免疫反応系および酵素反応系
を組み合わせて用いることにより、２種以上の被検物質
を一度の測定で検出しうる酵素免疫測定（以下Ｅ工Ａと
いう）方法および当該試薬キットに関する。
を組み合わせて用いることにより、２種以上の被検物質
を一度の測定で検出しうる酵素免疫測定（以下Ｅ工Ａと
いう）方法および当該試薬キットに関する。
（ロ）従来の技術
ＥＩＡ法は酵素反応系をマーカーとして用いて、抗原抗
体反応を定量的に追跡して、抗原もしくは、抗体を測定
する方法である。このＥＩＡ法は高感度、操作が簡単で
しかも安価に利用できる利点がある。
体反応を定量的に追跡して、抗原もしくは、抗体を測定
する方法である。このＥＩＡ法は高感度、操作が簡単で
しかも安価に利用できる利点がある。
しかし、ＥＩＡ法においては従来、試薬の性質上、単品
の抗原または抗体物質について高感度で測定することに
重点が置かれていた。
の抗原または抗体物質について高感度で測定することに
重点が置かれていた。
しかし、一度の測定結果で疾病を判定したり、あるいは
症状の進行を判断できるように、複数の抗原または抗体
を測定できる試薬が求められている。
症状の進行を判断できるように、複数の抗原または抗体
を測定できる試薬が求められている。
例えば前者の例としては、腫瘍抗原である、癌胎児性抗
原（ＣＥＡ）、アルファ・フェトプロティン（ＡＦ’Ｐ
）、７エリチンの同時測定により、腫瘍部位を判定する
場合などが該当する。
原（ＣＥＡ）、アルファ・フェトプロティン（ＡＦ’Ｐ
）、７エリチンの同時測定により、腫瘍部位を判定する
場合などが該当する。
また、後者の例としては、ＨＢｓＡｇ 、 ＥｉＢｅＡ
ｇ 。
ｇ 。
ＨＢｃ抗体の同時測定によりＢ型肝炎の進行状況を判断
する場合などが該当する。
する場合などが該当する。
また、自然には混合する機会の非常に少ない抗原物質ま
たは抗体物質を併せて検出できるような試薬を用いて、
統一的な判断を正しく得たい場合もある。
たは抗体物質を併せて検出できるような試薬を用いて、
統一的な判断を正しく得たい場合もある。
その例としては、先述の肝炎の判定の際に、免疫学的に
差を生じないサブタイプを判定できる試薬が該当する。
差を生じないサブタイプを判定できる試薬が該当する。
即ち、例えば、日本・韓国等の東南アジアでは、ａｄタ
イプのＢ型肝炎の表面抗原が多いが、欧米ではａｙタイ
プが多いと言われている。そこでａｄ、ａｙの両タイプ
の抗原物質または抗体物質を併せて検出できるような試
薬があれば便宜である。
イプのＢ型肝炎の表面抗原が多いが、欧米ではａｙタイ
プが多いと言われている。そこでａｄ、ａｙの両タイプ
の抗原物質または抗体物質を併せて検出できるような試
薬があれば便宜である。
（ハ）発明が解決しようとする問題点
本発明の目的はＥＩＡ法を用いて生理活性において何ら
かの関連を有する抗原もしくは抗体を同時に高感度に検
出できる方法およびその試薬キットを提供することにあ
る。
かの関連を有する抗原もしくは抗体を同時に高感度に検
出できる方法およびその試薬キットを提供することにあ
る。
に）問題点を解決するための手段
本発明に係るＥ工Ａ試薬は各試薬をキットとしておくこ
とが便宜であるので、以下キット化されたものを例とし
て本発明を説明する。
とが便宜であるので、以下キット化されたものを例とし
て本発明を説明する。
本発明をキット化した場合、次のような試薬にて構成さ
れる。
れる。
■ ２種以上の抗原もしくは抗体を固定化した固定化容
器。
器。
■ ２種以上の抗原もしくは抗体を、同一条件下で各々
相異なる独立した酵素反応系を有する酵素で標識した標
識抗原もしくは抗体。
相異なる独立した酵素反応系を有する酵素で標識した標
識抗原もしくは抗体。
■ ■の各々の酵素に対する活性測定用基質。
■ ■の各々の酵素に対する反応停止剤。
■ 検量線作成用標準品。
■ 緩衝液
■ 固定化容器
本発明の固定化容器は２種以上の抗原あるいは抗体を不
溶性担体に固定化したものである。
溶性担体に固定化したものである。
まず不溶性担体としては、ビーズ、マイクロプレートあ
るいは繊維などが挙げられるが、好適にはマイクロプレ
ートが用いられる。
るいは繊維などが挙げられるが、好適にはマイクロプレ
ートが用いられる。
特に、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンな
どの透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定法用マイ
クロタイトレージョンプレー、トナどが適用である。
どの透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定法用マイ
クロタイトレージョンプレー、トナどが適用である。
測定すべき抗原もしくは抗体としては、測定の目的上、
生理活性において何らかの関連を有するものであれば特
に限定されない。また組み合わせの数は測定系の問題か
らみて、２〜５種程度が好ましい。組み合わせの具体例
としては、ａ、 ＨＢｓＡｇ、 ＨＢｅＡｇ、
ＨＢｃ抗体す、ＨＢｅ抗体、ＨＢｅ抗体、ＨＢｃ抗原Ｃ
６各種腫瘍抗原 ａｘ、癌胎児性抗原（ＣＥｉＡ） アルファ・フェトプロティン（ＡＦＰ）フェリチン Ｂ２−ミクログロブリン ヒト結腸癌株化細胞ＣｏＡｏ２０１由来抗原（以下、Ｋ
ＭＯｌという。
生理活性において何らかの関連を有するものであれば特
に限定されない。また組み合わせの数は測定系の問題か
らみて、２〜５種程度が好ましい。組み合わせの具体例
としては、ａ、 ＨＢｓＡｇ、 ＨＢｅＡｇ、
ＨＢｃ抗体す、ＨＢｅ抗体、ＨＢｅ抗体、ＨＢｃ抗原Ｃ
６各種腫瘍抗原 ａｘ、癌胎児性抗原（ＣＥｉＡ） アルファ・フェトプロティン（ＡＦＰ）フェリチン Ｂ２−ミクログロブリン ヒト結腸癌株化細胞ＣｏＡｏ２０１由来抗原（以下、Ｋ
ＭＯｌという。
特願昭５９−１６６９８０参照）
ｄ、 ＨＢａＡｇＯａｄタイプおよびａｙタイプｅ、
ＨＢａＡｇのａｄタイプおよびａｙタイプの各々に
対する抗体 ｆ、ウロキナーゼ、ＴＰＡ ｇ、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビンｈ、α１−
アンチプラスミン、プラスミノゲン、フイプリノゲン で、アンジオテンシン、キニン、アルドステロン、プロ
スタグランジン、 ｊ、カリクレイン、レニン に、エリスロポエチン、コロニー形成刺激因子で、各種
血液凝固（Ｆ’ａｃｔｏｒ■、ｌＸ、Ｘなど）ｍ、
）リプシン、エステラーゼ−Ｉｎ、風疹ウィルス抗体、
サイトメガロウィルス抗体、トキソプラズマウィルス抗
体 。、ゴナドトロピン、プロジェステロン、ニストロジエ
ン ｐ、インシュリン、グルカゴン ｑ、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺ホルモンなどが挙げら
れる。
ＨＢａＡｇのａｄタイプおよびａｙタイプの各々に
対する抗体 ｆ、ウロキナーゼ、ＴＰＡ ｇ、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビンｈ、α１−
アンチプラスミン、プラスミノゲン、フイプリノゲン で、アンジオテンシン、キニン、アルドステロン、プロ
スタグランジン、 ｊ、カリクレイン、レニン に、エリスロポエチン、コロニー形成刺激因子で、各種
血液凝固（Ｆ’ａｃｔｏｒ■、ｌＸ、Ｘなど）ｍ、
）リプシン、エステラーゼ−Ｉｎ、風疹ウィルス抗体、
サイトメガロウィルス抗体、トキソプラズマウィルス抗
体 。、ゴナドトロピン、プロジェステロン、ニストロジエ
ン ｐ、インシュリン、グルカゴン ｑ、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺ホルモンなどが挙げら
れる。
従って固定化に必要な抗原あるいは抗体としては、上記
測定物質の免疫反応性物質を調製すればよい。その方法
は、自体公知の方法に準じて行なえばよい。
測定物質の免疫反応性物質を調製すればよい。その方法
は、自体公知の方法に準じて行なえばよい。
固定化方法としては、２種以上の抗原あるいは抗体が各
々、波長２８０ ｎｍでの吸光度が０．００１〜０．０
５の蛋白濃度になるように混和調製した後、当該溶液の
液の適量、たとえば５０〜１００ｐ／を容器に入れ、た
とえば０〜３７℃にて１〜２４時間靜置後、希釈液を除
去する。
々、波長２８０ ｎｍでの吸光度が０．００１〜０．０
５の蛋白濃度になるように混和調製した後、当該溶液の
液の適量、たとえば５０〜１００ｐ／を容器に入れ、た
とえば０〜３７℃にて１〜２４時間靜置後、希釈液を除
去する。
洗浄液の適量、たとえば２００〜３００μｌを用いて、
好ましくは１〜３回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水
、生理食塩液、及びこれらに０．０１〜１．０％アルブ
ミンやＴｗｅｅｎ −２０を添加溶解した溶液が使用で
きる。洗浄後容器を乾燥するととにより、固定化容器が
得られる。
好ましくは１〜３回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水
、生理食塩液、及びこれらに０．０１〜１．０％アルブ
ミンやＴｗｅｅｎ −２０を添加溶解した溶液が使用で
きる。洗浄後容器を乾燥するととにより、固定化容器が
得られる。
■ 標識抗原もしくは抗体
標識抗原もしくは抗体とは、２種以上の抗原もしくは抗
体を相異なる酵素で標識化したものである。標識はＥＩ
Ａ法のタイプに応じて、各々の被検物質自体もしくは相
応する免疫反応物物質に対してなされる。例えば被検物
質を競合法により測定する場合（第２図の（１）および
（１）を参照）は被検物質を酵素標識することになる。
体を相異なる酵素で標識化したものである。標識はＥＩ
Ａ法のタイプに応じて、各々の被検物質自体もしくは相
応する免疫反応物物質に対してなされる。例えば被検物
質を競合法により測定する場合（第２図の（１）および
（１）を参照）は被検物質を酵素標識することになる。
従って、被検物質が抗原であれば標識抗原が調製される
し、被検物質が抗体であれば、標識抗体を調製すること
が必要となる。
し、被検物質が抗体であれば、標識抗体を調製すること
が必要となる。
また、被検物質を非競合的に測定する場合（第２図の（
ｌｌｉ）および（１ｖ）を参照）は、被検物質に相応す
る免疫反応性物質を酵素標識する。従って被検物質が抗
原であれば標識抗体が調製され、被検物質が抗体であれ
ば標識抗原を調製することが必要となる。
ｌｌｉ）および（１ｖ）を参照）は、被検物質に相応す
る免疫反応性物質を酵素標識する。従って被検物質が抗
原であれば標識抗体が調製され、被検物質が抗体であれ
ば標識抗原を調製することが必要となる。
ＥＩＡ法のタイプの違いによる被検物質と固定化される
物質および標識化される物質の関係をまとめると第１表
のようになる（第２図参照）。
物質および標識化される物質の関係をまとめると第１表
のようになる（第２図参照）。
第１表
本発明において用いられる標識用酵素としては以下の条
件を満たす必要がある。
件を満たす必要がある。
ａ、酵素は相異なっており、各々の酵素反応はある一定
の同一条件で共に進行し、かつ各々が独立反応であるこ
と。
の同一条件で共に進行し、かつ各々が独立反応であるこ
と。
（共通の基質でないこと、生成物による阻害が作用しな
いこと） ｂ、各々の生成物は分別定量できること。
いこと） ｂ、各々の生成物は分別定量できること。
このａ、の条件としては、たとえば同様のｐＨ１温度お
よび触媒の存在下に酵素反応が進行する反応系を選ぶ必
要がある。
よび触媒の存在下に酵素反応が進行する反応系を選ぶ必
要がある。
また、ｂ、の条件としては、例えば、
１）異る波長により比色法で定量する。
２）λｅＸやλｅｍを変えて螢光法で定量する。
３）一方を比色法で、他方を螢光法で測定。
４）化学ルミネセンス（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅ
ｎｃｅ ）や酸化還元電位などで測定。
ｎｃｅ ）や酸化還元電位などで測定。
等による測定が考えられる。
具体的には第２表のような酵素反応系の組み合わせが挙
げられる。
げられる。
これらの酵素の組み合わせに対して抗原あるいは抗体が
標識される。
標識される。
標識方法としては、自体既知の方法、たとえばＮ−サク
シ／イミジル３〜（２″−ピリジルジチオ）プロピオネ
ートを用いる方法、グルタルアルデヒドヲ用いル方法、
Ｎ、Ｎ’ −０−フェニレンジマレイミビを用いる方法
にて標識することによって作成することができる。
シ／イミジル３〜（２″−ピリジルジチオ）プロピオネ
ートを用いる方法、グルタルアルデヒドヲ用いル方法、
Ｎ、Ｎ’ −０−フェニレンジマレイミビを用いる方法
にて標識することによって作成することができる。
■ 基質
酵素活性測定用基質は、当然のことながら、用いる標識
用酵素の種類によって異るが、当該酵素に適した基質の
粉末、錠剤又は溶液である。具体的には第２表に示した
。
用酵素の種類によって異るが、当該酵素に適した基質の
粉末、錠剤又は溶液である。具体的には第２表に示した
。
■ 反応停止剤
反応停止剤も用いる標識用酵素の種類により異なる。当
該酵素に適した反応停止剤として、公知のものが用いら
れる。
該酵素に適した反応停止剤として、公知のものが用いら
れる。
■ 検量線作成用標準品
本発明で用いられる標準品は後述する検量線を作成する
ために用いられるものであり、溶液あるいは、凍結乾燥
品よりなるものである。
ために用いられるものであり、溶液あるいは、凍結乾燥
品よりなるものである。
標準品は緩衝液に溶解して使用され、この際、測定する
物質のレベルに合わせて４〜６濃度段階まで小分けして
検量線の作成に使用される。
物質のレベルに合わせて４〜６濃度段階まで小分けして
検量線の作成に使用される。
■ 緩衝液
本発明キット用として使用される緩衝液は、抗原−抗体
反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもので
ある。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、
塩濃度が０．０１〜０．２Ｍ程度のものが好ましく、具
体的には、たとえば０．１Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液
ｐＨ７，０のものがあげられる。酵素活性測定用緩衝液
は、標識用酵素の種類により異るが、通常は上記の抗原
−抗体反応用緩衝液が共用できる。標識用酵素の活性測
定条件が上記の抗原−抗体反応用緩衝液の塩濃度やｐＨ
と異る場合に限り、酵素活性測定用緩衝液を作成する。
反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもので
ある。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、
塩濃度が０．０１〜０．２Ｍ程度のものが好ましく、具
体的には、たとえば０．１Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液
ｐＨ７，０のものがあげられる。酵素活性測定用緩衝液
は、標識用酵素の種類により異るが、通常は上記の抗原
−抗体反応用緩衝液が共用できる。標識用酵素の活性測
定条件が上記の抗原−抗体反応用緩衝液の塩濃度やｐＨ
と異る場合に限り、酵素活性測定用緩衝液を作成する。
具体的に、至適ｐａについては第２表で示す。
■ 測定方法
本発明キットを使用した、２種以上の被検物質の同時測
定方法は例えば非競合法による場合以下の通りである（
第１図参照）。
定方法は例えば非競合法による場合以下の通りである（
第１図参照）。
（１）固定化容器をセット
（０）被検液および抗原抗体反応用緩衝液を添加（ｉ［
ｌ） インキュベーション （１■）洗浄 （■）各々の標識抗体もしくは抗原を含有する緩衝液溶
液を添加 （ｖｌ）インキュベーション （ｖｌ 洗浄 −各々の基質緩衝液溶液を添加 （ｌｘ） インキュベーション （ｘ） 酵素反応停止剤を添加 （ｘＤ 定量測定：酵素反応により形成された生成物
を分別定量 非競合法では、被検液中の測定すべき物質が多ければ多
い程、酵素で標識された抗体もしくは抗原の結合量が増
えるので、酵素活性は増加する。
ｌ） インキュベーション （１■）洗浄 （■）各々の標識抗体もしくは抗原を含有する緩衝液溶
液を添加 （ｖｌ）インキュベーション （ｖｌ 洗浄 −各々の基質緩衝液溶液を添加 （ｌｘ） インキュベーション （ｘ） 酵素反応停止剤を添加 （ｘＤ 定量測定：酵素反応により形成された生成物
を分別定量 非競合法では、被検液中の測定すべき物質が多ければ多
い程、酵素で標識された抗体もしくは抗原の結合量が増
えるので、酵素活性は増加する。
■ 定量方法
各々の測定系を用いて酵素活性値を測定し、検量線によ
って被検物質を定量する。
って被検物質を定量する。
また、市販の多成分分離定量法に関するプログラムを内
臓したコンピューターに連動されることにより、被検物
質量を自動的に算出することもできる。
臓したコンピューターに連動されることにより、被検物
質量を自動的に算出することもできる。
（ホ）効 果
本発明のキットによれば、複数の被検物質を同時に測定
できることにより、サンプリングが１度ですみ、測定の
手間が省け、時間が短縮できる。
できることにより、サンプリングが１度ですみ、測定の
手間が省け、時間が短縮できる。
またサンプル量も少なくてすむ。
本発明のキットを用いることにより、生体中の複数の関
連物質を同時に測定でき、疾病の判定、あるいは症状進
行状況を診断することができる。
連物質を同時に測定でき、疾病の判定、あるいは症状進
行状況を診断することができる。
例えば、第３表に挙げるような例に用いることができる
。
。
第３表
〔実施例１〕
腫瘍マーカ、ＫＭＯＩとＣＥＡの測定
（抗体固定容器の作製→
既知の方法によりＫＭＯｌ及びＣＥＡに対する特異抗体
を作製した。次に１同じく既知の方法により、個々の抗
体（抗ＫＭＯ１抗体、抗ＣＩＡ抗体）を用いて対応する
抗原（ＫＭＯＩ 、 Ｃ］１ＥＡ）を測定するＥ工Ａを
ポリスチレンを材質とするマイクロプレートを用いて確
立した。このとき抗ＫＭＯ１抗体は西洋ワサビ由来パー
オキシダーゼと既知の方法により結合させ、抗原−抗体
反応後酵素反応は次の通り行なった。４−アミノアンチ
ピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシ
ジン、Ｈ２０□を含有する０、０２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、（ｐＨ７，０）を基質溶液として、３７℃で反
応後Ｎ ａ ２ ＣＯ３で反応を停止させ、生成した色
素を５４０ ｎｍの波長で比色定量した。一方、抗ＣＥ
Ａ抗体はＥ、 Ｃｏ１を由来β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を結合させ、抗原−抗体反応後の酵素反応は。−二トロ
フェニルーβ−Ｄ−ガラクトシドを含有する０．０２Ｍ
！ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を基質溶液として、３７
℃で反応後Ｎ ａ ２ （１０３を添加して波長４１４
ｎｍで比色定量した。これらの検討によりマイクロプレ
ートに固定する抗体濃度は、抗ＫＭＯ１抗体で０Ｄ２８
ｏ＝０．０１９ 、抗ＣＥＡ抗体で０Ｄ２８ｏ＝０．０
２２であった。
を作製した。次に１同じく既知の方法により、個々の抗
体（抗ＫＭＯ１抗体、抗ＣＩＡ抗体）を用いて対応する
抗原（ＫＭＯＩ 、 Ｃ］１ＥＡ）を測定するＥ工Ａを
ポリスチレンを材質とするマイクロプレートを用いて確
立した。このとき抗ＫＭＯ１抗体は西洋ワサビ由来パー
オキシダーゼと既知の方法により結合させ、抗原−抗体
反応後酵素反応は次の通り行なった。４−アミノアンチ
ピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシ
ジン、Ｈ２０□を含有する０、０２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、（ｐＨ７，０）を基質溶液として、３７℃で反
応後Ｎ ａ ２ ＣＯ３で反応を停止させ、生成した色
素を５４０ ｎｍの波長で比色定量した。一方、抗ＣＥ
Ａ抗体はＥ、 Ｃｏ１を由来β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を結合させ、抗原−抗体反応後の酵素反応は。−二トロ
フェニルーβ−Ｄ−ガラクトシドを含有する０．０２Ｍ
！ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を基質溶液として、３７
℃で反応後Ｎ ａ ２ （１０３を添加して波長４１４
ｎｍで比色定量した。これらの検討によりマイクロプレ
ートに固定する抗体濃度は、抗ＫＭＯ１抗体で０Ｄ２８
ｏ＝０．０１９ 、抗ＣＥＡ抗体で０Ｄ２８ｏ＝０．０
２２であった。
そこで、０．０５Ｍ重炭酸す） ＩＪウム塩緩衝液（ｐ
Ｈ９，６）に抗ＫＭＯ１抗体が０Ｄ２８ｏ＝０．０１９
゜抗ＣＥＡ抗体が０Ｄ２８ｏ＝０．０２２になるように
混和攪拌して、そのＱ、 ｌ ｔｔｉｌずつマイクロプ
レートのウェル（穴）に加え、２５℃で１５時間靜装し
た。
Ｈ９，６）に抗ＫＭＯ１抗体が０Ｄ２８ｏ＝０．０１９
゜抗ＣＥＡ抗体が０Ｄ２８ｏ＝０．０２２になるように
混和攪拌して、そのＱ、 ｌ ｔｔｉｌずつマイクロプ
レートのウェル（穴）に加え、２５℃で１５時間靜装し
た。
ウェルの内容液を吸引除去後０．０２％Ｔｗθｅｎ−２
０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）０、
３１ｎｌを加え再び吸引除去した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
−２０の添加及び吸引除去を計３回（り返したのち、０
．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ Ｑ、３
ゴを添加、室温で１時間放置後吸引除去した。低温（５
℃）で減圧乾燥した。
０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）０、
３１ｎｌを加え再び吸引除去した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
−２０の添加及び吸引除去を計３回（り返したのち、０
．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ Ｑ、３
ゴを添加、室温で１時間放置後吸引除去した。低温（５
℃）で減圧乾燥した。
（本キットによる測定例）
ＫＭＯＩ並びにＣＩＡ濃度既知の標準溶液、及び膵ガン
患者血清、及び健常人血清を検液として用いた。膵ガン
患者血清は０．０５％ ＢＳＡ含有ＰＢＳにより２５〜
ｉ、ｏｏｏ倍希釈、また健常人血清は５倍希釈した。
患者血清、及び健常人血清を検液として用いた。膵ガン
患者血清は０．０５％ ＢＳＡ含有ＰＢＳにより２５〜
ｉ、ｏｏｏ倍希釈、また健常人血清は５倍希釈した。
抗ＫＭＯ１抗体と抗ＣＥＡ抗体を固定化したマイクロプ
レートに検液を０，１ｄ加え、３７℃で２時間静置し、
次いで内容液を吸引除去した。
レートに検液を０，１ｄ加え、３７℃で２時間静置し、
次いで内容液を吸引除去した。
抗ＫＭＯ１抗体−パーオキシダーゼ縮合体と抗ＣＩ Ａ
抗体−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する。、ｏｓｓ
ウシ血清アルブミンとＰＢＳを０．１ｄ加え３７℃で２
時間静置し、次で内容液を吸引除去した。酵素反応は次
の通り行なった。
抗体−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する。、ｏｓｓ
ウシ血清アルブミンとＰＢＳを０．１ｄ加え３７℃で２
時間静置し、次で内容液を吸引除去した。酵素反応は次
の通り行なった。
０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）にＨ
２０２（ｏ、 ＯＯ５％ ｗ／ｖ ） ４−アミノアン
チピリン（Ｑ、５ｍＭ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニンジン（０，５ｍＭ）、及び０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシ）’ （０，０６％ ｗ
／ｖ）を溶かした基質溶液〔（）内はいずれも終濃度〕
０．１−をウェルに加え、３７℃で３０分間反応させ、
その後１ ％ １’Ｊａ２Ｃｏ３ｏ、１ｒＩＬｌを添加
して反応な停止した。この液につきマイクロプレート用
分光光度計により５４０ ｎｍと４１４ ｎｍの吸光度
を測定し、市販の多成分分離定量法に関するプログラム
を内蔵したコンピューターに連動して、次の結果を得た
。
２０２（ｏ、 ＯＯ５％ ｗ／ｖ ） ４−アミノアン
チピリン（Ｑ、５ｍＭ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニンジン（０，５ｍＭ）、及び０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシ）’ （０，０６％ ｗ
／ｖ）を溶かした基質溶液〔（）内はいずれも終濃度〕
０．１−をウェルに加え、３７℃で３０分間反応させ、
その後１ ％ １’Ｊａ２Ｃｏ３ｏ、１ｒＩＬｌを添加
して反応な停止した。この液につきマイクロプレート用
分光光度計により５４０ ｎｍと４１４ ｎｍの吸光度
を測定し、市販の多成分分離定量法に関するプログラム
を内蔵したコンピューターに連動して、次の結果を得た
。
（測定結果）
本キットによる測定結果と従来の個々の成分を測定スる
Ｅ工Ａキットによる結果を表に示す。
Ｅ工Ａキットによる結果を表に示す。
（（注））単位： ＫＭＯ１（ｕｎｉｔ ７ｍ）ＣＩＡ
（ｎｇ／ｍ） 〔実施例２〕 肝炎関連物質ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｃ抗体の
測定 （抗体・抗原容器の作製） 既知の方法によりＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原及びＨＢｃ抗
体を個々に測定する３種類のＥ工Ａをポリスチレンのマ
イクロプレートを用いて作製した。このとき、抗ＨＢｓ
抗体はノーオキシダーゼと結合させ、酵素反応はＮ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、４−アミ
ノアンチピリン、Ｈ２０□を含有する０、１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，０）を基質溶液として、３７
℃で反応後グリシンーＮａＯＨ緩衝液（ｐ）ＩＩ Ｏ，
０）で反応を停止させ５４０ ｎｍの吸光度を比色した
。抗ＨＢｅ抗体はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと結合させ
、酵素反応は０−ニトロフレニルリン酸を基質としてｐ
ｕｓ、ｏの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で行ないグ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，０）添加後生酸物
は４１４ｎｍで比色定量した。ＨＢｃ抗原はＥ、Ｃｏ１
：由来のアルカリホスファターゼと結合させ、酵素反応
はｐ−二トロフェニルリン酸を含有する０、 １ Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中で行ない、グ
リクン−ＮａＯＨ緩衝液を添加後、生成物を４０５ｎｍ
の吸光度で定量した。これらの検討によりマイクロプレ
ートに固定する至適濃度は０Ｄ２８ｏ表示で抗ＨＢｓ抗
体が０．０１２、抗ＨＢｅ抗体が０．０２５、ＨＢｃ抗
原が０．００５であった。従って、０．０５Ｍ重炭酸ナ
トリウム塩緩衝液（ｐＨ９，６） Ｋ−抗ＨＢＥＩ抗体
、抗ＨＢｅ抗体、及びＨＢｃ抗原をそれぞれこの至適濃
度になるように混和攪拌して、その０．１ ｍｊずつマ
イクロプレートのウェル（穴）に加え、２５℃で１５時
間靜装した。ウェルの内容液を吸引除去後０．０２ ％
Ｔｗｅｅｎ −２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食
塩液（ＰＢＳ ） ０．３１Ｌｌ！を加え再び吸引除去
した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０の添加及び吸引除去を
計３回くり返したのち、０．５％ウシ血清アルブミンを
含有するＰＢＳ Ｑ、３ｍを添加、室温で１時間放置
後吸引除去した。低温（５℃）で減圧乾燥した。
（ｎｇ／ｍ） 〔実施例２〕 肝炎関連物質ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｃ抗体の
測定 （抗体・抗原容器の作製） 既知の方法によりＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原及びＨＢｃ抗
体を個々に測定する３種類のＥ工Ａをポリスチレンのマ
イクロプレートを用いて作製した。このとき、抗ＨＢｓ
抗体はノーオキシダーゼと結合させ、酵素反応はＮ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、４−アミ
ノアンチピリン、Ｈ２０□を含有する０、１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，０）を基質溶液として、３７
℃で反応後グリシンーＮａＯＨ緩衝液（ｐ）ＩＩ Ｏ，
０）で反応を停止させ５４０ ｎｍの吸光度を比色した
。抗ＨＢｅ抗体はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと結合させ
、酵素反応は０−ニトロフレニルリン酸を基質としてｐ
ｕｓ、ｏの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で行ないグ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，０）添加後生酸物
は４１４ｎｍで比色定量した。ＨＢｃ抗原はＥ、Ｃｏ１
：由来のアルカリホスファターゼと結合させ、酵素反応
はｐ−二トロフェニルリン酸を含有する０、 １ Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中で行ない、グ
リクン−ＮａＯＨ緩衝液を添加後、生成物を４０５ｎｍ
の吸光度で定量した。これらの検討によりマイクロプレ
ートに固定する至適濃度は０Ｄ２８ｏ表示で抗ＨＢｓ抗
体が０．０１２、抗ＨＢｅ抗体が０．０２５、ＨＢｃ抗
原が０．００５であった。従って、０．０５Ｍ重炭酸ナ
トリウム塩緩衝液（ｐＨ９，６） Ｋ−抗ＨＢＥＩ抗体
、抗ＨＢｅ抗体、及びＨＢｃ抗原をそれぞれこの至適濃
度になるように混和攪拌して、その０．１ ｍｊずつマ
イクロプレートのウェル（穴）に加え、２５℃で１５時
間靜装した。ウェルの内容液を吸引除去後０．０２ ％
Ｔｗｅｅｎ −２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食
塩液（ＰＢＳ ） ０．３１Ｌｌ！を加え再び吸引除去
した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０の添加及び吸引除去を
計３回くり返したのち、０．５％ウシ血清アルブミンを
含有するＰＢＳ Ｑ、３ｍを添加、室温で１時間放置
後吸引除去した。低温（５℃）で減圧乾燥した。
（本キットによる測定例）
ＨＢｓ抗原、ＨＢθ抗原、及び抗ＨＢｃ抗体のそれぞれ
濃度既知の標準溶液及び濃度既知の模擬検液を用いた。
濃度既知の標準溶液及び濃度既知の模擬検液を用いた。
上述の抗原・抗体固定マイクロプレートに検液を０．１
ｄ加え、３７℃で２時間静置し、次いで内容液を吸引除
去した。
ｄ加え、３７℃で２時間静置し、次いで内容液を吸引除
去した。
抗ＨＢｓ抗体−パーオキシダーゼ縮合物及び抗ＨＢｅ抗
体−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合物、ＨＢｃ抗原−ア
ルカリホスファターゼ縮金物を含有する０、０５％ウシ
血清アルブミン添加ＰＢＳを０．１１加え３７℃で２時
間静置し、次で内容液を吸引除去した。酵素反応は次の
通り行なった。
体−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合物、ＨＢｃ抗原−ア
ルカリホスファターゼ縮金物を含有する０、０５％ウシ
血清アルブミン添加ＰＢＳを０．１１加え３７℃で２時
間静置し、次で内容液を吸引除去した。酵素反応は次の
通り行なった。
０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）にＨ
２０□（０，００５％Ｗ／Ｖ） ４−アミノアンチピリ
ン（０，５ｍＭ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
ｍ−アニシジン（０，５ｍＭ）、０−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（０，０６％ ｗ／ｖ）、及びｐ
−ニトロフェニルリン酸（ｌ ｍＭ）を溶かした基質溶
液〔（）内はいずれも終濃度）０．１ｍをウェルに加え
、３７℃で３０分間反応させ、その後０．１Ｍグリ’／
７−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０） Ｑ、１ＷＬｌを添
加して反応を停止した。この液につきマイクロプレート
用分光光度計により５４０ｎｍ、４１４及び４０５ ｎ
ｍの吸光度を測定し、市販の多成分分離定量法に関する
プログラムを内蔵したコンピューターに連動して、次の
結果を得た。
２０□（０，００５％Ｗ／Ｖ） ４−アミノアンチピリ
ン（０，５ｍＭ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
ｍ−アニシジン（０，５ｍＭ）、０−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（０，０６％ ｗ／ｖ）、及びｐ
−ニトロフェニルリン酸（ｌ ｍＭ）を溶かした基質溶
液〔（）内はいずれも終濃度）０．１ｍをウェルに加え
、３７℃で３０分間反応させ、その後０．１Ｍグリ’／
７−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０） Ｑ、１ＷＬｌを添
加して反応を停止した。この液につきマイクロプレート
用分光光度計により５４０ｎｍ、４１４及び４０５ ｎ
ｍの吸光度を測定し、市販の多成分分離定量法に関する
プログラムを内蔵したコンピューターに連動して、次の
結果を得た。
（測定結果）
標準溶液におけるＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、並びに抗Ｈ
Ｂｃ抗体の理論値と本キットによる測定値は次の通り。
Ｂｃ抗体の理論値と本キットによる測定値は次の通り。
注））単位：相対含量
のである。２種類の抗原（Ａ、Ｂ）の測定系な例したも
のである。
のである。
代理人 弁理士（８１０７）佐々木 清 隆（ほか２名
） 第２図 ◇ 」 Ｙ 丁九体 口 嚇 囚 ４貰 口 反さミヘ灼 手続補正書 昭和６ｏ年１１月ｌｑ日
） 第２図 ◇ 」 Ｙ 丁九体 口 嚇 囚 ４貰 口 反さミヘ灼 手続補正書 昭和６ｏ年１１月ｌｑ日
Claims (2)
- （１）相互に独立した複数の酵素反応系を形成すること
のできる２種以上の標識用酵素および２種以上の酵素活
性測定用基質を使用し、複数の抗原および／または抗体
を同時に測定することを特徴とする酵素免疫測定方法。 - （２）［１］２種以上の抗原もしくは抗体を固定化した
固定化容器、 ［２］２種以上の抗原もしくは抗体を、同一条件下で各
々相異なる独立した酵素反応系を有する酵素で、標識し
た標識抗原もしくは抗体、［３］［２］の各々の酵素に
対する活性測定用基質、［４］［２］の各々の酵素に対
する反応停止剤、［５］検量線作成用標準品、 ［６］緩衝液、 からなる酵素免疫測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13310785A JPS61292556A (ja) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | 酵素免疫測定方法およびキツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13310785A JPS61292556A (ja) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | 酵素免疫測定方法およびキツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61292556A true JPS61292556A (ja) | 1986-12-23 |
Family
ID=15096977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13310785A Pending JPS61292556A (ja) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | 酵素免疫測定方法およびキツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61292556A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
| US9249464B2 (en) | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160655A (en) * | 1980-01-11 | 1981-12-10 | Akzo Nv | Method of measuring immunochemical reactant and kit and reagent therefor |
| JPS58189558A (ja) * | 1982-04-28 | 1983-11-05 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 免疫学的測定用容器 |
| JPS5924256A (ja) * | 1982-07-31 | 1984-02-07 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 免疫学的測定方法及び試薬 |
-
1985
- 1985-06-20 JP JP13310785A patent/JPS61292556A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160655A (en) * | 1980-01-11 | 1981-12-10 | Akzo Nv | Method of measuring immunochemical reactant and kit and reagent therefor |
| JPS58189558A (ja) * | 1982-04-28 | 1983-11-05 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 免疫学的測定用容器 |
| JPS5924256A (ja) * | 1982-07-31 | 1984-02-07 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 免疫学的測定方法及び試薬 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
| US9249464B2 (en) | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
| US9873919B2 (en) | 2004-11-29 | 2018-01-23 | Sequenom, Inc. | Reagents for detecting methylated DNA |
| US10487351B2 (en) | 2004-11-29 | 2019-11-26 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
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