ES2287269T3 - Procedimiento para la deteccion de modelos de metilacion de citosina, con alta sensibilidad. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección de una metilación de citosina en muestras de ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas a) se trata una muestra de ADN genómico, que comprende un ADN que se ha de investigar y un ADN de fondo, por medios químicos, de tal manera que todas las bases de citosina no metiladas se transforman en uracilo, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen inalteradas, b) la muestra de ADN tratada químicamente se amplifica mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores, de una polimerasa así como de por lo menos un oligonucleótido adicional o de un oligómero de ANP, que se fija a un dinucleótido 5''-CG-3'' o a un dinucleótido 5''-TG-3'' o a un dinucleótido 5''-CA-3'', fijándose el otro oligonucleótido o el oligómero de ANP de manera preferida al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste, siendo preferido como molde en la amplificación el ADN que se ha de investigar con respecto al ADN de fondo, y c) se analizan los materiales amplificados y a partir de la existencia de un material amplificado y/o a partir del análisis de otras posiciones se sacan conclusiones acerca del estado de metilación en el ADN que se ha de investigar, siendo llevado a cabo el procedimiento fuera del cuerpo humano.

Description

Procedimiento para la detección de modelos de metilación de citosina, con alta sensibilidad.

El presente invento se refiere a un procedimiento para la detección de la metilación de citosina en muestras de ADN.

Los planos de observación, bien estudiados después de los desarrollos metodológicos de los últimos años en la biología molecular, son los genes propiamente dichos, la traducción de estos genes en ARN (ácidos ribonucleicos) y las proteínas que resultan a partir de éstos. Cuándo se conecta un cierto gen en el transcurso del desarrollo de un individuo, y cómo se regulan la activación y la inhibición de determinados genes en células y tejidos determinadas/os, se pueden correlacionar con la magnitud y el carácter de la metilación de los genes y respectivamente del genoma. Por consiguiente, es evidente la suposición de que ciertos estados patógenos se exteriorizan en un modelo modificado de metilación de genes individuales o del genoma.

La 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente en los ADN de células eucarióticas. Ella desempeña por ejemplo un cierto cometido en la regulación de la transcripción, en la impresión genética y en la génesis de tumores. La identificación de una 5-metilcitosina como parte componente de una información genética presenta por lo tanto un considerable interés. Las posiciones con 5-metilcitosina no se pueden identificar sin embargo mediante secuenciación, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además de esto, en el caso de una amplificación por PCR (reacción en cadena de una polimerasa) se pierde totalmente la información epigenética, que llevan las 5-metilcitosinas.

Un método relativamente nuevo, y que entretanto se está aplicando con la mayor frecuencia, para la investigación de los ADN en cuanto a la existencia de 5-metilcitosina, se basa en la reacción específica de un bisulfito con citosina, que después de una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas es transformada en uracilo, que en su comportamiento de apareamiento de bases se corresponde con la timidina. Por el contrario, la 5-metilcitosina no es modificada en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original es transformado de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no puede ser diferenciada de la citosina por medio de su comportamiento de hibridación, ahora puede ser detectada, mediante técnicas "normales" de biología molecular, como la citosina que ha quedado únicamente, por ejemplo mediante amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en un apareamiento de bases, que ahora se aprovecha totalmente. El estado de la técnica, en lo que concierne a la sensibilidad, es definido mediante un procedimiento, que encierra el ADN que se ha de investigar en una matriz de agarosa, de esta manera impide la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona solamente con un ADN monocatenario) y reemplaza a todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A., Oswald J., Walter J. A modified and improved method for bisulphate based methylation analysis [Un método modificado y mejorado para el análisis de una metilación de citosina basada en un bisulfato], Nucleic Acids Res. 15 de Diciembre de 1996;24(24), 5064-6). Con este método se pueden investigar células individuales, lo cual demuestra el potencial del método. No obstante, hasta ahora se investigan solamente regiones individuales con una longitud hasta de aproximadamente 3.000 pares de bases, y no es posible una investigación global de células en cuanto a millares de posibles análisis de la metilación. No obstante, tampoco este procedimiento puede analizar de una manera confiable fragmentos muy pequeños a partir de pequeñas cantidades de muestras. Éstos se pierden, a pesar de la protección contra la difusión por medio de la
matriz.

Una recopilación acerca de las posibilidades adicionales conocidas de detectar 5-metilcitosinas, se puede tomar a partir del siguiente artículo de compendio: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Identifying 5-methylcitosine and related modifications in DNA genomes [Identificación de 5-metilcitosina y de modificaciones afines en genomas da ADN] Nucleic Acids Res. 15 de Mayo de 1998;26(10), 2255-64.

La técnica del bisulfito se aplica hasta ahora solamente en la investigación, salvo unas pocas excepciones (p. ej. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus [Un ensayo PCR en un solo tubo para el diagnóstico del síndrome de Angelman and Prader-Willi basándose en las diferencias de metilación alélicas en el locus de SNRPN]. Eur J Hum Genet. Marzo-Abril de 1997;5(2):94-8). No obstante, siempre se amplifican cortos trozos específicos de un gen conocido después de un tratamiento con un bisulfito, y o bien se secuencian completamente (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint [La ontogenia antes de la implantación de la impronta de metilación H19] Nat. Genet. Noviembre de 1997; 17(3):275-6) o se detectan posiciones individuales de citosina mediante una "reacción de prolongación con cebadores" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) [Cuantificación rápida de las diferencias de metilación en sitios específicos usando una prolongación con cebadores de un único nucleótido sensible a la metilación (Me-SNuPE)]. Nucleic Acids Res. 15 de Junio de 1997; 25(12):2529-31, documento de solicitud de patente internacional WO 9500669) o un corte con enzimas (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay [Un ensayo de metilación de ADN sensible y cuantitativo]. Nucleic Acids Res. 15 de Junio de 1997; 25(12):2532-4). Además, también se ha descrito la detección mediante hibridación (Olek y colaboradores, documento WO 99 28498).

La urea mejora la eficiencia del tratamiento con un bisulfito antes de la secuenciación de 5-metilcitosina en un ADN genómico (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA [La urea mejora la eficiencia de la secuenciación, mediada por un bisulfato, de 5'-metilcitosina en un ADN genómico. Nucleic Acids Res. 1 de Noviembre de 1998; 26(21):5009-10).

Otras publicaciones, que se ocupan de la aplicación de la técnica del bisulfito para la detección de una metilación en el caso de genes individuales son:

Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA [Secuenciación de residuos de 5-metilcitosina en un ADN genómico]. Bioassays. Junio de 1994; 16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method [Segmentos impresos en el genoma humano: diferentes modelos de metilación en la region del syndrome de Prader-Willi/Angelman, como se determina por el método de secuenciación genómica]. Hum Mol Genet. 6 de Marzo de 1997 (3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing [Análisis de la metilación en cromosomas individuales: protocolo mejorado para la secuenciación genómica con un bisulfato]. Nucleic Acids Res. 25 de Febrero de 1994;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines [Una secuenciación genómica indica una correlación entre una hipometilación de ADN en la región de 5' del gen de pS2 y su expresión en linajes celulares de cánceres de mama humanos]. Gene. 19 de Mayo de 1995;157(1-2):261-4; documentos WO 97 46705, WO 95 15373 y WO 45560.

Otro procedimiento conocido lo constituye la denominada PCR sensible a la metilación (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands [PCR específica para una metilación: un nuevo ensayo de PCR en cuanto al estado de metilación de islas de CpG]. Proc Natl Acad Sci U S A. 3 de Septiembre; 93 (18):9821-6). Para este procedimiento se utilizan unos cebadores, que o bien se hibridan solamente con una secuencia, que resulta mediante el tratamiento con un bisulfito de un ADN no metilado en la correspondiente posición, o, por el contrario, a la inversa se usa un cebador que solamente se fija a un ácido nucleico, que resulta mediante el tratamiento con un bisulfito de un ADN no metilado en la correspondiente posición. Con estos cebadores se pueden generar, por consiguiente, unos materiales amplificados, cuya detección, a su vez, proporciona indicaciones acerca de la existencia de una posición metilada o no metilada en la muestra, a la que se fijan los cebadores.

Un procedimiento más reciente es también la detección de la metilación de citosina mediante una PCR de Taqman, que ha sido conocida como "luz de metilación" [del inglés "Methyl-Light" (documento WO 00/70090). Con este procedimiento es posible detectar el estado de metilación de posiciones individuales o de unas pocas posiciones directamente en la evolución de la PCR, de manera tal que se hace innecesario un análisis subsiguiente de los productos.

Orum H. PCR clamping [Afianzamiento de una PCR]. Curr Issues Mol Biol, Enero de 2000; 2 (1): 27-30, y Yu y colaboradores. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5' to 3' exonuclease deficient DNA Polymerase [Una inhibición específica de una PCR por oligonucleótidos no prolongables usando una polimerasa de ADN deficiente en exonucleasa de 5' a 3']. Biotechniques, Eaton Publishing, US, Octubre de 1997; 23(4):716-20, describen en cada caso la utilización de moléculas bloqueadoras con el fin de conseguir una amplificación por PCR específica para una secuencia diana.

Un compendio acerca del estado de la técnica en la producción de agrupaciones de oligómeros se puede tomar de una edición especial, aparecida en Enero de 1999, de Nature Genetics (suplemento de Nature Genetics, volumen 21, Enero 1999), de la bibliografía que allí se cita y de la patente de los EE.UU. 5.994.065 acerca de métodos para la producción de soportes sólidos para moléculas dianas tales como oligonucleótidos en el caso de una señal de fondo inespecífica disminuida.

Para la exploración de una agrupación inmovilizada de ADN se han utilizado en muchos casos sondas marcadas con fluorescencia. Es especialmente apropiada para marcaciones con fluorescencia la sencilla colocación de colorantes Cy3 y Cy5 junto al 5'-OH de la respectiva sonda. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se efectúa, por ejemplo, a través de un microscopio homofocal. Los colorantes Cy3 y Cy5 son obtenibles comercialmente, junto con muchos otros.

La espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser, asistida por una matriz (MALDI, de Matrix Assistierte Laser Desorption/Ionisation), es un nuevo desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas, M., Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons [Ionización y desorción por láser de proteínas con unas masas moleculares que superan los 10.000 dalton]. Anal Chem. 15 Octubre 1988; 60 (20): 2299-301). Un analito es embebido en una matriz absorbente de la luz. Mediante un corto impulso de láser, la matriz es evaporada y la molécula del analito es transportada de esta manera sin fragmentar a la fase gaseosa. Mediante choques con moléculas de la matriz se alcanza la ionización del analito. Una tensión eléctrica aplicada acelera a los iones en un tubo de vuelo exento de campo. A causa de sus diferentes masas, los iones se aceleran con diversa intensidad. Los iones más pequeños llegan al detector antes que los mayores.

La espectroscopia por MALDI-TOF es apropiada excelentemente para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends [la espectrometría de masas por desorción e ionización de láser asistida por matriz y ADN: innovaciones actuales y futuras tendencias] 1: 147-157). Para los ácidos nucleicos, la sensibilidad es aproximadamente 100 veces peor que para los péptidos y disminuye de manera más que proporcional con un tamaño creciente de los fragmentos. Para ácidos nucleicos, que tienen un entramado cargado negativamente múltiples veces, el proceso de ionización a través de la matriz es esencialmente más ineficiente. En la espectroscopia por MALDI-TOF desempeña un cometido importante eminente la elección de la matriz. Para la desorción de péptidos se han encontrado algunas matrices muy productivas, que proporcionan una cristalización muy fina. Para un ADN se han presentado ciertamente entretanto algunas matrices adecuadas, pero de esta manera no se disminuyó la diferencia entre sensibilidades. La diferencia entre sensibilidades se puede disminuir, modificando químicamente el ADN de tal manera que éste sea similar a un péptido. Los fósforotioato - ácidos nucleicos, en los cuales los fosfatos habituales del entramado están sustituidos por tiofosfatos, se pueden transformar mediante una sencilla tecnología química de alquilación en un ADN neutralizado en cuanto a cargas (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry [Un proceso para la alquilación selectiva de ADN y para su detección por espectrometría de masas]. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de una "etiqueta con cargas" a este ADN modificado da como resultado el aumento de la sensibilidad por la misma magnitud que se encuentra para péptidos. Una ventaja adicional del "etiquetado con cargas" es la sensibilidad aumentada del análisis frente a impurezas, que dificultan en gran manera la detección de substratos no modificados.

Un ADN genómico se obtiene mediante métodos clásicos a partir de un ADN de muestras de células, de tejidos o de otros ensayos.

Esta metodología clásica se encuentra en referencias tales como la de Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: un manual de laboratorio], 1989.

Por consiguiente, se han convertido en estado de la técnica hasta ahora numerosos procedimientos para el análisis de metilación. El presente invento debe sin embargo resolver el problema, de que los procedimientos corrientes no están en situación de amplificar de una manera deliberada un ADN que se ha de investigar que se encuentra en un líquido corporal o en un suero, cuando al mismo tiempo están presentes segmentos de ADN con secuencias homólogas, de otro origen distinto.

El ADN que se ha de investigar, así como los ácidos nucleicos presentes por lo demás, en lo sucesivo denominados ADN de fondo, son amplificados por regla enteramente general de igual manera, puesto que los cebadores utilizados tampoco están en la situación de diferenciar entre un ADN que se ha de investigar y un ADN de fondo. Una posibilidad para la diferenciación de estos ADN's se establece sin embargo mediante el diferente modelo de metilación. Un procedimiento corriente es la PCR sensible a la metilación, denominada brevemente MSP (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands [PCR sensible a la metilación: un nuevo ensayo de PCR en cuanto al estado de metilación de islas de CpG]. Proc Natl Acad Sci U S A. 3 de Septiembre; 93(18):9821-6). Este procedimiento se compone de varias etapas parciales. En primer lugar, se lleva a cabo un tratamiento con un bisulfito, que corresponde al estado de la técnica, el cual de nuevo conduce a que sean transformadas en uracilo todas las bases de citosina, mientras que las bases de citosina metiladas (5-metilcitosina) permanecen inalteradas. En la siguiente etapa se utilizan entonces unos cebadores que son totalmente complementarios con un ADN metilado, transformado con un bisulfito, pero no lo son con un correspondiente ADN que originalmente se presentaba sin metilar. Esto conduce, en el caso de la realización de una PCR con uno de tales cebadores, a que sea amplificado exclusivamente el ADN originalmente metilado. De modo correspondiente, es posible utilizar un cebador, que en el sentido contrario amplifica solamente al ADN no metilado. De esta manera, cuando están presentes un ADN a analizar así como un ADN de fondo, se pueden producir exclusivamente de manera selectiva los fragmentos de ADN que se ha de investigar, siempre y cuando que éstos se diferencien en lo que se refiere a su estado de metilación en una posición CpG con respecto del ADN de fondo. Constituye ahora estado de la técnica, a partir de la detección de una de tales moléculas de ADN que se ha de investigar, sacar conclusiones acerca de un estado de metilación o de la existencia de un ADN que se ha de investigar, lo cual de nuevo permite en principio un diagnóstico, por ejemplo, de una enfermedad de tumores en pacientes, puesto que es conocido que por ejemplo la concentración del ADN en suero se aumenta en parte drásticamente en pacientes con tumores. Solamente el ADN que procede de los tumores debe ser detectado entonces junto al ADN de fondo. Es principio es comparable el análisis de ADN en otros líquidos corporales.

El procedimiento aquí expuesto, que se ha de considerar como el estado más próximo de la técnica, tiene sin embargo algunas desventajas. Por ejemplo, no es posible, a partir de la detectabilidad de un fragmento amplificado de un ADN que se ha de investigar, sacar conclusiones acerca de la cantidad presente en el suero. Ya unas pequeñísimas cantidades de tal ADN son suficientes como para conseguir un resultado positivo, lo cual, por una parte, constituye una ventaja, pero, por otra parte, puede repercutir también de una manera muy desventajosa, cuando por ejemplo se quiere evaluar el efecto de una resección de un tumor sobre el ADN en suero. La máxima desventaja es, sin embargo, que existen muchas posiciones de metilación, en las cuales el ADN que se ha de investigar y el ADN de fondo se diferencian sólo gradualmente. Es manifiesto, que el procedimiento de MSP existente se puede llevar a cabo solamente cuando se sabe, que el ADN de fondo se diferencia de un modo definitivo y hasta en un 100% del ADN que se ha de investigar en la correspondiente posición CpG, si no se quiere correr el riesgo de obtener falsos resultados positivos. Por el contrario, es típico en un tejido tumoral el hecho de que en p. ej. un 95% de las células tumorales se presenta metilada una determinada posición, pero en la que el ADN de fondo, por lo demás presente, se presenta en estado metilado solo como máximo un 5%, entonces con el método de MSP no es posible producir resultados con poder informativos, puesto que una cuantificación del ADN de molde mediante una PCR en principio no es posible, o solamente es posible con un gasto aumentado. Además de ello este invento se basa en el reconocimiento de que con frecuencia hay en un fragmento de ADN ciertos modelos de estados de metilación, que son típicos para un determinado tipo de células, por ejemplo de una célula tumoral.

Es estado de la técnica, de nuevo, un procedimiento desarrollado por la entidad Epigenomics, que amplifica de igual manera a un ADN que se ha de investigar y a un ADN de fondo, después de un tratamiento con un bisulfito, y entonces investiga las antiguas posiciones CpG contenidas en el fragmento mediante unas técnicas de hibridación, de manera alternativa mediante una minisecuenciación u otros procedimientos habituales. Esto tiene la ventaja de que se obtiene una imagen cuantitativa en lo que se refiere a las posiciones investigadas de metilación, es decir que se efectúa la determinación del grado de metilación de un gran número de posiciones, lo cual hace posible una clasificación muy exacta p. ej. en los casos de tumores sólidos. La desventaja de este método es, sin embargo, el hecho de que él no puede proporcionar ninguna información exacta, en los casos, en los cuales predomina en gran manera el ADN de fondo, puesto que éste ciertamente es amplificado exactamente igual que el ADN que se ha de investigar, y ambos son analizados en mezcla. Este problema no existe en el caso del análisis de tumores sólidos, donde se puede escoger deliberadamente el material que se ha de investigar, pero se puede dificultar el análisis de por ejemplo un ADN en un suero.

Es la meta del presente invento, por consiguiente, superar las desventajas del estado de la técnica y combinar las ventajas de ambos procedimientos para la detección de líquidos corporales y de un suero.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el recurso de que se proporciona un procedimiento para la detección de la metilación de citosina en muestras de ADN, en el cual se realizan las siguientes etapas:

se trata por medios químicos una muestra de ADN genómico, que comprende el ADN que se ha de investigar y el ADN de fondo, de manera tal que todas las bases de citosina no metiladas son transformadas en uracilo, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen inalteradas,

se amplifica la muestra de ADN tratada químicamente mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores así como de una polimerasa, siendo preferido como molde el ADN que se ha de investigar con respecto al ADN de fondo, y se analizan los materiales amplificados, y a partir de la existencia de un material amplificado y/o a partir del análisis de otras posiciones adicionales se sacan conclusiones acerca de un estado de metilación en el ADN que se ha de investigar.

Se prefiere conforme al invento que los ADN de muestras se obtengan a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo.

Se prefiere conforme al invento, además, que los ADN de muestras se obtengan a partir de linajes celulares, una sangre, un esputo, una defecación, una orina, un suero, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojos, intestinos, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mamas o hígados, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de éstos.

Es preferido conforme al invento de manera muy especial que el tratamiento químico se lleve a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito). Se prefiere también que el tratamiento químico se efectúe después de una imbibición del ADN en agarosa. Se prefiere también y además que en el caso del tratamiento químico estén presentes un reactivo que desnaturaliza al dúplex de ADN y/o un agente captador de radicales.

Se prefiere que la amplificación en la segunda etapa se lleve a cabo en presencia de por lo menos otro oligonucleótido adicional, que se fija a un 5'-CG-3'-dinucleótido o a un 5'-TG-3'-dinucleótido o a un 5'-CA-3'-dinucleótido, fijándose el otro oligonucleótido adicional de manera preferida al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste.

Se prefiere especialmente que este sitio de fijación del otro oligonucleótido u oligómero de ANP adicional se solape con los sitios de fijación de los cebadores sobre el ADN de fondo y que el otro oligonucleótido adicional impida la fijación de por lo menos un oligonucleótido cebador al ADN de fondo.

Se prefiere de nuevo especialmente que se empleen por lo menos otros dos oligonucleótidos u oligómeros de ANP adicionales, solapándose el sitio de fijación de éstos de nuevo en cada caso con el sitio de fijación de un cebador al ADN de fondo e impidiendo los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales la fijación de ambos oligonucleótidos cebadores al ADN de fondo.

Por lo demás, se prefiere especialmente que en cada caso uno de los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales impida la fijación del cebador en avance, mientras que respectivamente otro impida la fijación del cebador en sentido inverso.

Se prefiere especialmente que los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales se presenten en por lo menos una concentración cinco veces mayor en comparación con la de los oligonucleótidos cebadores.

En otra variante de procedimiento, especialmente preferida, los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales se fijan al ADN de fondo e impiden por consiguiente la completa prolongación de los oligonucleótidos cebadores en la reacción de la polimerasa. En este contexto, es de nuevo especialmente preferido que la polimerasa utilizada no tenga ninguna actividad de 5'-3'-exonucleasa. Una variante preferida adicional consiste en que los otros oligonucleótidos adicionales se presentan en estado modificado junto al extremo 5' y por consiguiente no pueden ser descompuestos de una manera significativa por una polimerasa con actividad de 5'-3'-exonucleasa.

Por otro lado, es preferido conforme al invento el hecho de que la muestra de ADN tratada químicamente sea amplificada en la segunda etapa mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores y de otro oligonucleótido adicional, que se hibrida con un 5'-CG-3'-dinucleótido o con un 5'-TG-3'-dinucleótido o con un 5'-CA-3'-dinucleótido, y de por lo menos un oligonucleótido reportero, que se hibrida con un 5'-CG-3'-dinucleótido o con un 5'-TG-3'-nucleótido o con un 5'-CA-3'-dinucleótido, así como de una polimerasa; fijándose el otro oligonucleótido adicional de manera preferida al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste, y fijándose el oligonucleótido reportero de manera preferida al ADN que se ha de investigar e indicando su amplificación. En este contexto es ventajoso que adicionalmente al oligonucleótido reportero se utilice otro oligómero adicional marcado con un colorante fluorescente, que se hibrida de modo inmediatamente contiguo al oligonucleótido reportero, y que esta hibridación se pueda detectar mediante una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Además, es ventajoso que se lleve a cabo un ensayo de Taqman. Se prefiere también que se lleve a cabo un ensayo de Lightcycler.

Se prefiere además conforme al invento que los oligonucleótidos utilizados de manera adicional a los cebadores, no dispongan de ninguna función 3'-OH. Por otro lado, se prefiere que los oligonucleótidos reporteros lleven por lo menos una marcación fluorescente. Además, se prefiere también que las moléculas reporteras indiquen la amplificación ya sea mediante un aumento o mediante una disminución de la fluorescencia. En este contexto es especialmente ventajoso que se utilice también directamente para el análisis el aumento o la disminución de la fluorescencia, y que a partir de la señal de fluorescencia se saquen conclusiones acerca de un estado de metilación del ADN que se ha de analizar.

Se prefiere conforme al invento, además, que el ADN de fondo se presente en una concentración 100 veces mayor en comparación con la del ADN que se ha de investigar. Se prefiere, por otra parte, que el ADN de fondo se presente en una concentración 1.000 veces mayor en comparación con la del ADN que se ha de investigar.

Se prefiere además que el análisis, o eventualmente el análisis adicional, se efectúe por medio de una hibridación con agrupaciones de oligómeros, pudiendo los oligómeros ser ácidos nucleicos o moléculas similares en sus propiedades de hibridación, tales como ANP's.

Es ventajoso, conforme al invento, también que los oligómeros se hibriden, a través de un segmento que tiene una longitud de 12-22 bases, con el ADN que se ha de analizar, y que ellos comprendan un dinucleótido CG, TG o CA.

Se prefiere que se detecte en un solo experimento el estado de metilación de más de 20 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

Se prefiere, por otra parte, que se detecte en un solo experimento el estado de metilación de más de 60 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

También es preferido conforme al invento que el análisis, o eventualmente el análisis adicional se efectúe mediante una medición de longitudes de los ADN amplificados que se han de investigar, comprendiendo los métodos para la medición de las longitudes una electroforesis en gel, una electroforesis en gel capilar, una cromatografía (p. ej. una HPLC = cromatografía de fase líquida de alto rendimiento), una espectrometría de masas y otros métodos apropiados. Es ventajoso también en este contexto que los métodos para la secuenciación abarquen el método de Sanger, el método de Maxam-Gilbert y otros métodos tales como el de secuenciación por hibridación (SBH, de Sequencing by Hybridisation).

Es preferido conforme al invento también un procedimiento, en el que la secuenciación para cada una de las posiciones CpG o para un pequeño grupo de estas posiciones se realice cada vez con un oligonucleótido cebador separado, y que la prolongación del cebador constituya solamente una base o unas pocas bases, y que a partir del tipo de la prolongación del cebador se saquen conclusiones acerca del estado de metilación de las correspondientes posiciones en el ADN que se ha de investigar.

Por otra parte se prefiere que a partir del grado de metilación en las diferentes posiciones CpG investigadas se saquen conclusiones acerca de la existencia de una enfermedad o de otro estado médico del paciente.

Es ventajoso que los materiales amplificados propiamente dichos estén provistos, para la detección, de una marcación detectable. Es ventajoso, por otra parte, que las marcaciones sean marcaciones fluorescentes, o/y que las marcaciones sean radionúclidos, o/y que las marcaciones sean marcaciones de masas desprendibles, que se detecten en un espectrómetro de masas.

Se prefiere además que al realizar la amplificación, uno de los cebadores esté fijado a una fase sólida.

Es conforme al invento también el hecho de que los materiales amplificados sean detectados en su totalidad en un espectrómetro de masas y por consiguiente sean caracterizados inequívocamente por su masa.

Un objeto adicional del presente invento es también la utilización de un procedimiento conforme al invento para el diagnóstico y/o el pronóstico de sucesos desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer; funciones defectuosas, daños o una enfermedad del SNC (sistema nervioso central); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos sicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/u otros síndromes asociados; una enfermedad, una función defectuosa y un daño cardiovascular; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección, una inmunidad y/o una convalecencia; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; una función defectuosa, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema endocrino y metabólico; un dolor de cabeza o una función defectuosa sexual.

Es ventajosa en este contexto la utilización de un procedimiento conforme al invento para la diferenciación de tipos de células o de tejidos o para la investigación de la diferenciación de células.

Es objeto del presente invento también un estuche, que se compone de un reactivo que contiene un bisulfito, de cebadores y de otros oligonucleótidos sin ninguna función 3'-OH, para la producción de los materiales amplificados, así como opcionalmente unas instrucciones para la realización de un ensayo conforme al invento.

El presente invento describe por consiguiente un procedimiento para la detección del estado de metilación de muestras de ADN genómico. Al contrario que en los procedimientos conocidos hasta ahora, se determina p. ej. en un suero el grado de metilación de un conjunto de posiciones CpG en un subgrupo seleccionado de fragmentos de ADN, de manera tal que es posible un análisis también en presencia de un exceso de un ADN de fondo no relevante para el diagnóstico.

En este contexto, el procedimiento preferido se compone a su vez de varias etapas, que se pueden resumir de la siguiente manera:

En primer lugar se extraen del paciente un suero y/u otros líquidos corporales, y se aísla, cuando sea necesario el ADN que allí se encuentra. A continuación, en la segunda etapa se lleva a cabo un tratamiento químico, preferiblemente con un bisulfito (= hidrógeno-sulfito, disulfito), siendo transformadas por ejemplo en uracilo todas las base de citosina no metiladas, pero permaneciendo inalteradas las bases de citosina metiladas (5-metilcitosina). En la tercera etapa del procedimiento, se lleva a cabo entonces una amplificación, en la cual se amplifica de manera preferente el ADN que se ha de investigar, pero no se amplifica o se amplifica solamente en pequeña medida, el ADN de fondo. En la cuarta etapa siguiente se analizan entonces los fragmentos amplificados en cuanto a su signatura (modelo) de metilación, y se determina el grado de metilación de varias posiciones CpG antiguas en los materiales amplificados. En la quinta etapa del procedimiento, a partir del grado de metilación en las diferentes posiciones CpG investigadas se sacan conclusiones acerca de la existencia de una enfermedad o de otro estado médico del paciente.

La esencia del presente invento es por consiguiente el hecho de que dos tipos de posiciones CpG desempeñan un cierto cometido y contribuyen de igual manera al análisis, y deben ser denominadas seguidamente como posiciones calificadoras ("qualifier") y posiciones clasificadoras ("classifier"). Las posiciones calificadoras sirven para diferenciar en la amplificación el ADN que se ha de analizar con respecto del ADN de fondo. Esto puede efectuarse a escala técnica, tal como se expone detalladamente a continuación, de diferentes maneras. Una propiedad de estas posiciones es, sin embargo, que su grado de metilación es lo más diferente que sea posible en un ADN que se ha de investigar con respecto del que tiene el ADN de fondo, y que conduce a una preferencia del ADN que se ha investigar en la amplificación. Las posiciones clasificadoras sirven, por el contrario, para extraer una información importante para el diagnóstico, acerca del respectivo grado de metilación a partir del material amplificado, producido predominantemente a partir del ADN que se ha de investigar. Se pueden utilizar para un análisis hasta algunos cientos (100) de tales posiciones clasificadoras. El análisis se efectúa, por ejemplo, en agrupaciones de oligómeros, incluso aunque esto con frecuencia no será necesario. Sin embargo, en este caso no es la formación de un determinado material amplificado la que tiene importancia para el resultado de la investigación, sino más bien el análisis de las posiciones CpG en el mismo material amplificado. En algunos casos, sin embargo, es posible y conveniente con seguridad incluir en el análisis la información que se ha de deducir a partir de la formación de un material amplificado, en este caso algunas de las posiciones son entonces al mismo tiempo clasificadoras y calificadoras.

La primera etapa del procedimiento, a saber la obtención de muestras, se efectúa de manera preferida por extracción de líquidos corporales tales como p. ej. un esputo o por el contrario un suero, pero es notorio que el procedimiento se puede realizar con muchos tipos de muestras de diferentes fuentes, que aquí se han expuesto sin pretender que se abarque la totalidad de ellas.

De manera preferida el ADN genómico empleado en el procedimiento, se obtiene a partir de una muestra de ADN, abarcando las fuentes para ADN p. ej. linajes celulares, una sangre, un esputo, una defecación, una orina, un suero, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojos, intestinos, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mamas o hígados, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de éstos.

En algunos casos, antes del tratamiento con un bisulfito, se efectúa una purificación o un aumento de la concentración del ADN, con el fin de evitar una perturbación de la reacción con un bisulfito y/o de la subsiguiente PCR mediante un grado demasiado alto de impurezas. Sin embargo, es conocido que por ejemplo se puede efectuar una PCR a partir de un tejido después de un tratamiento, por ejemplo, con una proteinasa K sin ninguna purificación adicional, y esto es válido oportunamente también para el tratamiento con un bisulfito y la subsiguiente PCR.

El tratamiento químico se lleva a cabo preferiblemente por medio de un tratamiento con un bisulfito (= hidrógeno-sulfito, disulfito), a su vez de manera preferida bisulfito de sodio (es menos apropiado el bisulfito de amonio). O bien la reacción se lleva a cabo de acuerdo con una variante publicada, se prefiere aquí una imbibición del ADN en una agarosa, con el fin de mantener al ADN durante el tratamiento en el estado monocatenario, o por el contrario, de acuerdo con una nueva variante, por tratamiento en presencia de un agente captador de radicales y de un reactivo desnaturalizador, de manera preferida un oligo(etilenglicol)-dialquil-éter o por ejemplo dioxano. Antes de la reacción de PCR, los reactivos se eliminan, ya sea por lavado en el caso del método de la agarosa o de un procedimiento de purificación de ADN (estado de la técnica, precipitación o fijación a una fase sólida, o membrana), o por el contrario simplemente por dilución a un intervalo de concentraciones, que ya no influye de manera significativa sobre la PCR.

Es esencial para la tercera etapa, entonces, que se seleccionen las posiciones calificadoras y que se escoja un método apropiado que permita la amplificación selectiva del ADN que se ha de investigar. La elección de las posiciones se efectúa según la premisa de que ellas deben diferenciarse lo más que sea posible en lo que se refiere a su metilación, entre el ADN de fondo y el ADN que se ha de investigar. Para esto, se determinan primeramente los perfiles de metilación de los segmentos de un gen que entran en cada caso en cuestión, tanto para los tumores que se han de investigar como también para el ADN de fondo procedente de individuos sanos. Aquellas posiciones, que tienen las mayores diferencias entre un ADN de un tumor y un ADN de fondo (por ejemplo en un suero) se seleccionan como posiciones calificadoras. Tales posiciones son ya conocidas para un gran número de genes, por ejemplo para GSTpi, para HIC-1 y para MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts [Metilación de citosina y supresión de la expresión de O6-metilguanina-ADN metiltransferasa en linajes celulares de rabdomiosarcoma humano y xenoinjertos]. Oncol Res.; 4(4-5):167-74; Esteller M, Toyota M, Sánchez-Céspedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000), Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis [La desactivación del gen para reparación de ADN de O6-metilguanina-ADN metiltransferasa mediante una hipermetilación con promotores está asociada con mutaciones de G a A en K-ras en una tumorigénesis colorrectal]. Cancer Res. 1 de Mayo; 60(9):2368-71). Existen por consiguiente varios métodos, todos los cuales son preferidos, con los cuales se puede amplificar de una manera preferente el ADN que se ha de investigar mediando utilización de estas posiciones calificadoras.

Por una parte, es posible llevar a cabo de nuevo una reacción correspondiente a la MSP, utilizando unos cebadores, que se hibridan totalmente con la secuencia, que corresponde al ADN que se ha de investigar después de un tratamiento con un bisulfito, pero no con el ADN de fondo que ha sido tratado análogamente. Con otras palabras, los cebadores se hibridan con un segmento de ADN, en el que se encuentran una o varias posiciones calificadoras, y solamente cuando su estado de metilación en el ADN original se corresponde con el que es característico para el ADN que se ha de investigar, puede tener lugar una amplificación en un grado significativo. Ésta es una variante sencilla en principio, que sin embargo tiene la desventaja que las posiciones calificadoras deben estar presentes en cada caso junto a un extremo o junto a ambos extremos del fragmento de ADN, es decir que las posiciones clasificadoras deben estar situadas entre las posiciones calificadoras (o por el contrario, en el caso de que haya solamente una posición calificadora, ésta no debe estar situada entre medias de las posiciones clasificadoras). Aún cuando es preferido conforme al invento llevar a cabo una de tales variantes de la MSP, hay que partir del hecho, por lo tanto, de que ella puede pasar a utilizarse solamente en comparativamente pocos casos, puesto que de esta manera la distribución de posiciones calificadoras y clasificadoras será ideal solamente en unos pocos casos. Puesto que en principio, sin embargo, se puede llevar a cabo de una manera sencilla, ella es a pesar de todo expuesta como preferida.

Se prefiere especialmente, sin embargo, una variante en la que los cebadores no se solapan con una posición calificadora o no se hibridan con ésta, sino que la amplificación por PCR, más bien, es influida mediante por lo menos otro oligonucleótido adicional, que no puede actuar como cebador y que se fija a una posición calificadora.

Esto quiere decir que el ADN tratado químicamente es amplificado en principio, como constituye estado de la técnica, mediante dos cebadores. Dentro del segmento de ADN que es delimitado por los dos cebadores, se encuentran una o varias posiciones calificadoras. Entonces, al contrario que en una PCR normal, se añaden otros oligonucleótidos, que se fijan a estas posiciones calificadoras, y ciertamente de un modo selectivo cuando éstas se presentaban o bien metiladas o no metiladas antes del tratamiento con un bisulfito. El ADN que se ha de investigar es amplificado por consiguiente de manera preferente cuando los oligonucleótidos añadidos se fijan con menos efectividad a sus posiciones calificadoras que en el caso del ADN de fondo. Con otras palabras, los oligonucleótidos añadidos bloquean selectivamente a la amplificación del ADN de fondo.

De manera preferida, estos oligonucleótidos añadidos contienen o bien por lo menos un dinucleótido CG, TG o CA. Por lo demás, ellos deben tener la propiedad de que no pueden ser prolongados por sí mismos por la polimerasa empleada en la reacción de PCR. Esto se realiza de manera preferida mediante el empleo de 3'-desoxi-oligonucleótidos o por el contrario de oligonucleótidos funcionalizados de otra manera distinta en la posición 3', por ejemplo 3'-O-acetil-oligonucleótidos. Además, la descomposición de estos oligonucleótidos debe ser impedida mediante la polimerasa. Esto se efectúa de manera preferida ya sea mediante la utilización de una polimerasa sin ninguna actividad de nucleasa, o de manera también preferida mediante la utilización de oligonucleótidos modificados, que por ejemplo tienen puentes de tioato junto a un extremo 5' y por lo tanto son resistentes contra una descomposición.

Una variante adicional, especialmente preferida, es la utilización de oligómeros de ANP (ácidos nucleicos peptídicos), que convenientemente se emplean en este experimento igual que los oligonucleótidos. Los oligómeros de ANP no son ni descompuestos con la polimerasa ni tampoco pueden ser prolongados por ésta, de manera tal que éstos son apropiados idealmente para esta variante del procedimiento. Constituyen un estado de la técnica procedimientos para el diseño y la síntesis de oligómeros de ADN.

Tal como arriba se ha señalado, se pueden utilizar en uno de tales procedimientos varias posiciones calificadoras y también, por consiguiente, varios oligonucleótidos específicos en cada caso para un estado de metilación existente en el ADN de fondo.

Después de la amplificación selectiva del ADN que se ha de investigar se pueden determinar seguidamente, de manera preferida, de acuerdo con procedimientos conocidos de por sí, los estados de metilación de varias posiciones clasificadoras.

Es sin embargo notorio que también en este caso la formación de un fragmento de PCR puede tener por sí sola un suficiente poder informativo en un caso individual, siempre y cuando que, como también en el caso de la MSP, se haya presentado la situación de que la posición calificadora se presenta sin metilar prácticamente en un 100% por ejemplo en el ADN de fondo, pero se presenta metilada en el ADN que se ha de investigar. Si entonces se utiliza en la PCR un oligonucleótido, que se fija de manera preferente a la secuencia, que se ha formado en el tratamiento con un bisulfito a partir de un ADN de fondo no metilado, entonces en la PCR resulta un producto solamente cuando esté presente en suma por lo menos una pequeña cantidad de un ADN que se ha de investigar. Esto puede ser en un caso individual ya suficiente para un diagnóstico, y se trataría en este contexto de un procedimiento que tiene propiedades similares a las de una MSP. Aún cuando tal realización no es preferida directamente, un procedimiento de esta índole no ha sido conocido hasta ahora, y por consiguiente también es considerado como perteneciente al objeto de este invento.

Se prefiere que en una reacción de PCR se produzcan al mismo tiempo varios fragmentos, es decir que se lleve a cabo una PCR múltiple. En el caso del diseño de ésta se debe prestar atención a que no solamente los cebadores, sino también los otros oligonucleótidos empleados, no deben ser complementarios unos con otros, de manera tal que una multiplicación en alto grado sea en este contexto más difícil que en un caso usual. Sin embargo, en el caso de un ADN tratado con un bisulfito se tiene la ventaja de que a causa del diferente contenido de G y C de ambas cadenas de ADN, un cebador en avance jamás puede actuar como cebador en el sentido inverso, lo cual de nuevo facilita la multiplicación y compensa en lo esencial esta desventaja.

En el caso más sencillo, entonces se comprueban y detectan de nuevo los fragmentos resultantes. Para esto entran en cuestión todos los posibles procedimientos de biología molecular conocidos, tales como electroforesis en gel, secuenciación, cromatografía de fase líquida o hibridaciones, sin que en este contexto se analicen los oligonucleótidos clasificadores. Esto sería concebible también para el control de la calidad de las precedentes etapas de procedimiento. Tal como arriba se ha señalado, sin embargo es especialmente preferido el siguiente análisis del grado de metilación de las posiciones clasificadoras.

Existen numerosas posibilidades de combinar la amplificación preferida del ADN que se ha de investigar mediante los procedimientos arriba descritos, ventajosamente con técnicas de detección para los oligonucleótidos clasificadores.

Las técnicas de detección que resultan especialmente apropiadas, son la hibridación con agrupaciones de oligómeros y, por ejemplo, reacciones de prolongación con cebadores (minisecuenciación). La hibridación con agrupaciones de oligómeros se puede utilizar sin ninguna modificación adicional de los protocolos con respecto al estado de la técnica más cercano (Olek A, Olek S, Walter J; documento de patente WO 9928498). Sin embargo, se prefiere hibridar los materiales amplificados con una agrupación de oligómeros, que se compone de pares de oligonucleótidos inmovilizados junto a una fase sólida, de los cuales en cada caso uno se hibrida de modo grandemente preferido con un segmento de ADN que contiene una CpG (posición clasificadora) originalmente no metilada y el otro, a su vez, se hibrida de modo grandemente preferido al correspondiente segmento en el que originalmente estaba contenida una CpG metilada, en cada caso antes del tratamiento con un bisulfito y de la amplificación. De manera especialmente preferida, en este caso el material amplificado, o los materiales amplificados, está(n) marcado(s) de modo fluorescente o radiactivo o con etiquetas de masas desprendibles, de manera tal que, después de la hibridación, los fragmentos fijados a los dos oligonucleótidos de un par se pueden detectar y cuantificar con ayuda de esta marcación. Se obtiene una relación de intensidades, a partir de la cual por ejemplo después de una calibración del experimento con un ADN totalmente metilado y con otro ADN totalmente sin metilar, se puede determinar el grado de metilación en la respectiva posición clasificadora. En una de tales agrupaciones de oligómeros (Figura 1) se pueden detectar al mismo tiempo un gran número de fragmentos y de posiciones clasificadoras. Es conveniente y preferido que la agrupación contenga también oligómeros que detecten posiciones calificadoras para el control testigo del experimento, puesto que de esta manera se puede determinar la relación del ADN que se ha de investigar al ADN de fondo, que entran en el
análisis.

Las reacciones de prolongación con cebadores se pueden realizar asimismo en oligonucleótidos inmovilizados sobre una fase sólida. Aún cuando esto no es indispensablemente necesario, se prefiere la inmovilización de estos cebadores, puesto que por regla general se deben de investigar un gran número de posiciones clasificadoras a partir de varios materiales amplificados y esto se puede realizar de manera significativamente más fácil y en un solo experimento sobre una fase sólida, es decir con una agrupación de oligómeros. Es especialmente preferido que los cebadores se encuentren inmediatamente junto a una posición clasificadora y que la prolongación se efectúe solamente por un nucleótido. Es especialmente preferido que se añadan solamente didesoxitimidina y didesoxicitidina como nucleótidos y que éstos estén marcados en cada caso con un colorante fluorescente diferente, siendo concebibles y preferidas sin embargo también otras marcaciones diferentes tales como etiquetas de masas. Después de un tratamiento con un bisulfito y de una amplificación, los antiguos CG metilados se presentan como CG y los antiguos CG no metilados se presentan ahora como TG. La reacción de prolongación con cebadores conduce por lo tanto ya sea a la incorporación de una didesoxicitidina o didesoxitimidina. A partir de la relación de las marcaciones fluorescentes en cada caso detectadas para estos dos terminadores, se pueden sacar conclusiones acerca del grado de metilación de la respectiva posición. También es posible y preferido llevar a cabo la prolongación con cebadores en este caso con desoxicitidina y desoxitimidina, cuando no se añade ningún derivado de guanina y, por consiguiente, en el caso de una secuencia TG o CG la prolongación con cebadores termina por lo demás ya detrás de una base. Además es asimismo preferido llevar a cabo el análisis en la cadena opuesta de una manera análoga por diferenciación de CA y CG, entonces de modo correspondiente con didesoxi-ATP y didesoxi-GTP o sus derivados.

Una variante especialmente preferida del procedimiento es, sin embargo, la detección simultánea de posiciones calificadoras y de posiciones clasificadoras en un solo experimento, lo cual se puede conseguir mediante utilización de las variantes de tecnología de Taqman o Lightcycler. En este contexto, de un modo adicional a los oligonucleótidos que procuran una amplificación preferente del ADN que se ha de investigar, se añaden otros oligonucleótidos adicionales marcados con fluorescencia, y se mide la modificación de la fluorescencia durante la reacción de PCR. En este contexto de manera predominante, puesto que ciertamente se amplifica principalmente el ADN que se ha de investigar, también a partir de esta modificación de la fluorescencia se obtiene inmediatamente información acerca del estado de metilación de diferentes posiciones CpG clasificadoras. Puesto que diferentes oligonucleótidos son provistos preferiblemente en cada caso de diferentes colorantes fluorescentes, también es posible una diferenciación de la modificación de la fluorescencia durante la PCR, por separado para diferentes posiciones.

Esta modificación de la fluorescencia dependiente del estado de metilación, se puede conseguir mediante numerosos métodos, de las cuales aquí se deben de exponer a modo de ejemplo dos.

Por una parte, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos, que se fijan específicamente ya sea a una secuencia que ha procedido, por medio de un tratamiento químico, a partir de un ADN no metilado en la correspondiente posición o también de manera correspondiente a una secuencia, que ha procedido, por medio de un tratamiento químico, a partir de un ADN metilado la correspondiente posición. Estas sondas son provistas, de manera especialmente preferida, de dos colorantes fluorescentes, un colorante sofocador y un colorante fluorescente que sirve como marcador. Ambos están unidos con la misma sonda de oligonucleótido. Si tiene lugar entonces una reacción de PCR con el ADN que se ha de investigar como molde, entonces la reacción de PCR es bloqueada esta vez mediante la sonda de oligómero que está marcada fluorescentemente. Puesto que ésta, sin embargo, no es resistente frente a la actividad como nucleasa de la polimerasa, tiene lugar una descomposición de la sonda fijada al ADN de molde durante la reacción de PCR, que se correlaciona con la eficiencia de fijación de la sonda al molde, puesto que la sonda no fijada no es descompuesta por la polimerasa. La descomposición de la sonda es entonces visible inmediatamente por medio de un aumento de la fluorescencia del colorante marcador, por el hecho de que en este contexto el colorante sofocador y el colorante fluorescente que sirve como marcador están separados uno de otro. En principio, se trata en este caso de una variante del denominado ensayo de Taqman.

Lo que se mide por consiguiente es la formación de un producto de PCR a partir del ADN que se ha de investigar, pero solamente cuando la posición clasificadora investigada se presenta también en el estado de metilación, que puede detectar la sonda mediante hibridación con el ADN tratado químicamente. Una muestra antagonista con una sonda, que se fijaría correspondientemente a la posición clasificadora en el otro estado de metilación, es por lo tanto conveniente y preferida.

De manera preferida se emplean diferentes colorantes fluorescentes con diferentes longitudes de onda de emisión en varias sondas, en común con el sofocador, con el fin de conseguir una diferenciabilidad de las sondas y por consiguiente una multiplicación.

También en el caso de una de tales agrupaciones, se emplean unos oligonucleótidos que se fijan a la posición calificadora, que impiden una amplificación significativa del ADN de fondo. La amplificación del ADN que se ha de investigar se puede analizar también de tal manera que la misma posición se investigue también con una sonda como la que arriba se ha descrito, y la amplificación se detecte por consiguiente mediante una sonda que se fija a una posición calificadora. En este caso es especialmente preferido que el oligonucleótido no descomponible se fije selectivamente al ADN de fondo, mientras que la sonda marcada con fluorescencia se fije al ADN que se ha de investigar. En una variante especialmente preferida del procedimiento, en este contexto la sonda y el oligonucleótido no descomponible tienen la misma secuencia, excepto preferiblemente una nucleobase, pero no más de dos nucleobases.

Se prefiere especialmente además una variante en la que varias posiciones metilables se definen como posiciones calificadoras y para estas posiciones se utilizan en cada caso por lo menos un oligonucleótido que se fija preferentemente al ADN de fondo, así como una sonda. Puesto que la amplificación del ADN de fondo en este caso es reprimida por varios oligonucleótidos, este procedimiento es apropiado en especial en los casos en los que el exceso de ADN de fondo es especialmente grande con respecto al ADN que se ha de investigar. En muchos casos, en el caso de esta variante y en el de la existencia de varias posiciones calificadoras en un fragmento se hará innecesaria la investigación adicional de posiciones clasificadoras, puesto que con los aparatos hoy en día disponibles tampoco se puede detectar al mismo tiempo un número arbitrario de colorantes diferentes (en la mayor parte de los casos éstos son 4-5). La investigación de más posiciones clasificadoras adicionales se lleva a cabo entonces de manera preferida con una de las otras técnicas de detección arriba mencionadas.

Se prefiere también que con una sonda se puedan investigar al mismo tiempo varias posiciones en cuanto a su grado de metilación.

Si es deseable una cuantificación más exacta del grado de metilación de las posiciones clasificadoras, entonces se pueden emplear preferentemente también dos sondas que compiten entre ellas, con diferentes colorantes, realizándose que una de éstas se fija preferentemente en el caso de una posición no metilada en el ADN que se ha de investigar, y la otra, a la inversa, se fija preferentemente en el caso de una posición metilada. A partir de la relación de los aumentos de fluorescencia para los dos colorantes se pueden entonces sacar conclusiones de nuevo acerca del grado de metilación de la posición investigada.

Un procedimiento fundamentalmente distinto, en el cual, sin embargo, también durante la PCR se efectúa una modificación de la fluorescencia, es conocido actualmente como tecnología de LightCycler®. En este contexto se aprovecha el hecho de que una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, de Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) entre dos colorantes puede efectuarse solamente cuando éstos se encuentran en una proximidad inmediata, es decir se encuentran alejados entre sí por 1-5 nucleótidos. Solamente entonces el segundo colorante puede ser excitado por la emisión del primer colorante y entonces puede emitir por su parte luz con otra longitud de onda distinta, que entonces se detecta.

En el caso presente del análisis de una metilación se efectúa una hibridación de una sonda, marcada por fluorescencia, con el correspondiente ADN, tratado químicamente, junto a una posición clasificadora, y la fijación de esta sonda depende a su vez de que el ADN que se ha de investigar se presentase en esta posición en estado metilado o no metilado. De manera inmediatamente contigua a esta sonda, otra sonda adicional se fija con otro colorante fluorescente distinto. Esta fijación se efectúa de manera preferida de nuevo de una manera dependiente de la metilación, cuando en el correspondiente segmento de la secuencia se presenta una posición metilable adicional. Durante la amplificación, entonces se multiplica el ADN, por lo cual cada vez más sondas marcadas con fluorescencia se fijan contiguamente a la posición correspondiente, siempre que ésta tuviera el estado de metilación necesario para ello, y por lo tanto se mide una FRET creciente.

También en el caso de este procedimiento se efectúa de manera preferida una multiplicación con varias diferentes sondas marcadas con fluorescencia.

También aquí es de nuevo posible y preferido que se mida una posición calificadora. Suponiendo que el ADN de fondo se presenta sin metilar en la correspondiente posición y después de un tratamiento químico y de una amplificación se establece un dinucleótido TG en esta posición, y que, por el contrario, el ADN metilado que se ha de investigar proporciona un dinucleótido CG, entonces una sonda marcada con fluorescencia se fijaría a la secuencia que contiene un CG, mientras que un oligómero competitivo, que no está marcado, se fijaría a la correspondiente secuencia TG del ADN de fondo.

En este contexto es importante que el oligonucleótido no metilado inhiba la amplificación a causa de su temperatura de fusión manifiestamente más alta, al contrario que los oligonucleótidos de sonda, que son más cortos. Por lo tanto, en este caso, las sondas y los oligómeros que se fijan al ADN de fondo tratado químicamente, no son idénticas/os exceptuando unas pocas bases, sino que son esencialmente más largos (por 5-15 bases). También es de nuevo posible y preferido, emplear oligonucleótidos y/o ANP's modificados. También en este caso todas las sondas y todos los oligonucleótidos, excepto los cebadores, están bloqueados en su extremo 3', con el fin de evitar una prolongación en la PCR. Esto se puede efectuar por ejemplo con un grupo fosfato.

Ambos procedimientos se diferencian principalmente en el resultado de que en un caso se mide una disminución, y en el otro caso se mide un aumento, de la fluorescencia. En ambos casos, se pueden medir tanto posiciones calificadoras como también posiciones clasificadoras.

Resumiendo, es especialmente preferido un procedimiento para la detección de una metilación de citosina en muestras de ADN, en el que se realizan las siguientes etapas: En primer lugar se trata químicamente una muestra de ADN genómico, que comprende un ADN que se ha de investigar y un ADN de fondo, de tal manera que todas las bases de citosina no metiladas se transforman en uracilo, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen inalteradas, luego la muestra de ADN tratada químicamente se amplifica mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores, así como de una polimerasa, siendo preferido como molde el ADN que se ha de investigar con respecto al ADN de fondo y en la siguiente etapa se analizan los materiales amplificados y a partir de la existencia de un material amplificado y/o a partir del análisis de otras posiciones adicionales se sacan conclusiones acerca del estado de metilación en el ADN que se ha de investigar.

En una variante de procedimiento, especialmente preferida, el ADN de muestra se obtiene a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo. Asimismo es preferido que los ADN de muestra se obtengan a partir de linajes celulares, una sangre, un esputo, una defecación, una orina, un suero, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojos, intestinos, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mamas o hígados, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de éstos.

En una variante especialmente preferida del procedimiento, el tratamiento químico se lleva a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito). Se prefiere llevar a cabo el tratamiento químico después de una imbibición del ADN en agarosa. También es preferido que en el caso del tratamiento químico estén presentes un reactivo que desnaturaliza al dúplex de ADN y/o un agente captador de radicales.

En una variante de procedimiento especialmente preferida, la amplificación en la segunda etapa se lleva a cabo en presencia de por lo menos otro oligonucleótido adicional, que se fija a un dinucleótido 5'-CG-3' o a un oligonucleótido 5'-TG-3' o a un dinucleótido 5'-CA-3', fijándose el otro oligonucleótido adicional de manera preferida al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste.

Es especialmente preferido además que la muestra de ADN tratada químicamente sea amplificada en la segunda etapa mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores y de otro oligonucleótido adicional, que se hibrida con un dinucleótido 5'-CG-3' o con un dinucleótido 5'-TG-3' o con un dinucleótido 5'-CA-3', y de por lo menos un oligonucleótido reportero, que se hibrida con un dinucleótido 5'-CG-3' o con un dinucleótido 5'-TG-3' o con un dinucleótido 5'-CA-3', así como de una polimerasa, realizándose que el otro oligonucleótido adicional se fija de manera preferente al ADN de fondo y perjudica a la amplificación de éste, y realizándose que el oligonucleótido reportero se fija de manera preferente al ADN que se ha de investigar e indica la amplificación de éste.

Se prefiere también que de manera adicional al oligonucleótido reportero se utilice otro oligómero marcado con un colorante fluorescente, que se hibride de un modo inmediatamente contiguo con respecto al oligonucleótido reportero, y que esta hibridación se pueda detectar mediante una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).

De modo preferido especialmente, para el análisis se lleva a cabo un ensayo de Taqman. Asimismo es preferido llevar a cabo un ensayo de LightCycler (tal como arriba se ha descrito).

De manera especialmente preferida, los oligonucleótidos, utilizados de manera adicional con respecto a los cebadores, no disponen de ninguna función 3'-OH. Además, los oligonucleótidos reporteros son portadores de manera especialmente preferida de por lo menos una marcación fluorescente.

Es especialmente preferido que las moléculas reporteras indiquen la amplificación ya sea mediante un aumento o mediante una disminución de la fluorescencia, y que el aumento o la disminución de la fluorescencia se utilice también directamente para el análisis, y que a partir de la señal fluorescente se saquen conclusiones acerca de un estado de metilación del ADN que se ha de analizar.

En una variante especialmente preferida del procedimiento, el análisis o los otros análisis adicionales se efectúa(n) mediante una hibridación con agrupaciones de oligómeros, pudiendo los oligómeros ser ácidos nucleicos o moléculas similares en cuanto a sus propiedades de hibridación tales como ANP's. De una manera preferida, los oligómeros se hibridan, a través de un segmento que tiene una longitud de 12-22 bases, con el ADN que se ha de analizar, y comprenden un dinucleótido CG, TG o CA. Con este método se detecta en un solo experimento preferiblemente el estado de metilación de más de 20 posiciones de metilación del ADN que se ha de investigar, de manera especialmente preferida hay más de 60 posiciones de metilación.

Es especialmente preferido también un procedimiento, en el que el análisis adicional se efectúa mediante una medición de la longitud de los ADN amplificados que se han de investigar, comprendiendo los métodos para medir la longitud una electroforesis en gel, una electroforesis en gel capilar, una cromatografía (p. ej. una HPLC), una espectrometría de masas y otros métodos apropiados.

Es especialmente preferido también un procedimiento, en el cual el análisis adicional se efectúa mediante secuenciación, comprendiendo los métodos para la secuenciación el método de Sanger, el método de Maxam-Gilbert y otros métodos, tales como la secuenciación por hibridación (SBH). Es de nuevo preferido un procedimiento en el que la secuenciación (según Sanger) para cada posición o para un pequeño grupo de posiciones CpG se realiza en cada caso con un oligonucleótido cebador separado, y en el que la prolongación de los cebadores constituye solamente una base o unas pocas bases, y a partir del tipo de la prolongación con cebadores se sacan conclusiones acerca del estado de metilación de las correspondientes posiciones en el ADN que se ha de investigar.

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En una variante de procedimiento especialmente preferida, a partir del grado de metilación en las diferentes posiciones CpG investigadas se sacan conclusiones acerca de la existencia de una enfermedad o de otro estado médico del paciente.

De manera especialmente preferida, también los materiales amplificados propiamente dichos son provistos, para la detección, de una marcación detectable. En los casos de estas marcaciones se trata preferentemente de marcaciones por fluorescencia, radionúclidos o marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.

Además, se prefiere un procedimiento en el cual, al realizar la amplificación, uno de los cebadores está fijado a una fase sólida.

También es preferida una variante de procedimiento, en la que los materiales amplificados se detectan en conjunto en el espectrómetro de masas y por consiguiente son caracterizados inequívocamente por su masa.

Un objeto adicional del presente invento es la utilización de uno de los procedimientos descritos para el diagnóstico y/o pronóstico de sucesos desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer, funciones defectuosas, daños o una enfermedad del SNC (sistema nervioso central); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos sicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/u otros síndromes asociados; una enfermedad, una función defectuosa y un daño cardiovascular; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección, una inmunidad y/o una convalecencia; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; una función defectuosa, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema endocrino y metabólico; un dolor de cabeza o una función defectuosa sexual.

Se prefiere además la utilización de uno de los procedimientos descritos para la diferenciación de tipos de células o tejidos o para la investigación de la diferenciación de células.

Un objeto adicional del presente invento lo constituye un estuche, que se compone de un reactivo que contiene un bisulfito, de cebadores y de otros oligonucleótidos sin ninguna función 3'OH, para la producción de los materiales amplificados, así como opcionalmente de unas instrucciones para la realización de por lo menos una de las descritas variantes de procedimiento.

Los siguientes Ejemplos explican el invento.

Ejemplo 1

Amplificación sensible a una metilación del gen de MDR1 mediando utilización de sondas bloqueadoras de ANP (afianzamiento por PCR) en el gen de MDR-1 a) PCR específica para una metilación con sondas de ANP (sondas bloqueadoras de ANP, del inglés PNA blocking probes), cuyos sitios de fijación no se solapan con los del cebador

Primeramente se definieron unas condiciones de la PCR para un ADN tratado con un bisulfito, bajo las cuales se puede reconocer una influencia específica para ciertos alelos de la sonda bloqueadora de ANP sobre la PCR. En este primer experimento, no se solapan los sitios de fijación entre los ANP y los cebadores.

En primer lugar, en un experimento se ensayó la influencia de un ANP 11 mero que tiene la secuencia AAAATGT
GTT en una PCR con los cebadores TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG y TAAAAACTATCCCATAATAA
CTCCCAAC. Una influencia de los ANP sobre la reacción de PCR no se puede medir en condiciones clásicas de PCR a una temperatura de reanillamiento de 55ºC. El programa clásico de ciclos, utilizado para la amplificación del fragmento de MDR1, utiliza las siguientes etapas de programa:

Etapa 1	:	T	=	96ºC	20 min
Etapa 2	:	T	=	96ºC	30 s
Etapa 3	:	T	=	56ºC	1,15 min
Etapa 4	:	T	=	72ºC	2,00 min

Las etapas 2 a 4 se recorren 40 veces como un ciclo

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Etapa 5	:	T	=	72ºC	15 min
Etapa 6	:	enfriar a 4ºC y mantener la temperatura.

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Como consecuencia, la longitud de los cebadores, la temperatura de reanillamiento y la longitud de las muestras de ANP deben estar adaptadas de una manera óptima, con el fin de conseguir una represión de la amplificación que sea específica para ciertos alelos.

Con el fin de hacer posible un reanillamiento óptimo para los cebadores y los ANP, en una reacción de PCR se ensayaron cebadores 21 meros más cortos TAAGTATGTTGAAGAAAGATT y AATCCCCATAAACTTACCAAA con un ANP 13 mero más largo AAAGACGTGTTAT. Otros ensayos se llevaron a cabo con cebadores 18, 19 y 20 meros, que se diferencian de las anteriores secuencias solamente en el hecho de que habían suprimido ciertas bases en el extremo 3'. Los cebadores 21 meros fueron ensayados con un gradiente de la temperatura de reanillamiento. En una tanda paralela se añadieron el ANP 13 mero AAAGACGTGTTAT o respectivamente el ANP AAAGATGTGTTAT adaptado para una secuencia que no ha procedido de un alelo no metilado, en diferentes concentraciones de 20-100 pmol/\mul.

Una manifiesta influencia sobre la PCR se observó a unas temperaturas de reanillamiento de 49,4ºC y 46,7ºC en el caso de la adición de los ANP en una concentración de 70 y 100 pmol/\mul.

El efecto era el más manifiesto en el caso de la utilización de un cebador 18 mero.

Se investigó entonces en qué grado una temperatura de prolongación más baja de 54ºC repercute sobre la influencia inhibidora de los ANP.

Para esto, a una tanda de PCR se le añadieron en cada caso ANP's 13 meros arriba mencionados o respectivamente ambos ANP's 13 meros en común en una concentración de 50 y 70 pmol/\mul.

Se podía observar una manifiesta represión de la PCR en comparación con el testigo positivo sin ANP's (Figura 2, electroforesis en gel de agarosa, concentraciones de los ANP's para las sondas de ANP 13 meros que se utilizaron; anotación MDR1-5FM: ANP 13 mero AAAGACGTGTTAT; MDR1-5FU: ANP 13 mero AAAGATGTGTTAT). Los ensayos sugieren que el ADN utilizado en los ensayos se presentaba predominantemente sin metilar en las correspondientes posiciones, lo cual se pudo confirmar mediante una secuenciación con un bisulfito. Por lo tanto, en este experimento ya se puede mostrar una manifiesta especificidad para ciertos alelos de la sonda bloqueadora de ANP, lo que conduce a una amplificación preferente de los fragmentos no metilados.

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b) PCR específica para una metilación con sondas de ANP (sondas bloqueadoras de ANP), cuyos sitios de fijación se solapan con los de los cebadores (exclusión con cebadores, del inglés "primer exclusion")

En los experimentos anteriores, los cebadores se seleccionaron de tal manera que la secuencia diana de los ANP se encontraba aproximadamente en el centro de la zona que se había de amplificar. Se describió como más sensible la disposición, cuando las secuencias de los cebadores y de los ANP se colindan una con otra o respectivamente se solapan. En la caso de una fijación de los ANP específica para ciertas secuencias, en el caso de esta disposición se hubiera podido observar un efecto de los ANP ya en el caso de menores concentraciones de los ANP.

Para este experimento, un cebador con la secuencia TTATGTGAATTTTGAAAG se escogió de tal manera que éste se solape con la secuencia de un ANP (exclusión con cebadores). En una tanda de reacción, ambos ANP's 13 meros AAAGACGTGTTAT y AAAGATGTGTTAT se añadieron en 3 diferentes concentraciones.

Una represión total de la reacción de PCR se consiguió ya con una concentración de 25 pmol/\mul. En el experimento precedente, una represión total de la PCR era reconocible en el caso de añadir ambos ANP's tan sólo en una concentración de 70 pmol/ul.

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c) Exclusión con cebadores con el ADN no metilado de fragmentos correspondientes

Para la detección de una fijación específica para ciertas secuencias en experimentos adicionales, se investigo el efecto de los ANP's sobre moldes bien caracterizados en lo referente a su estado de metilación. El ADN de molde utilizado para este experimento correspondía a un ADN totalmente sin metilar, tratado con un bisulfito.

Éste se empleó como molde en una PCR. Para esto se emplearon las siguientes etapas de programa

Etapa 1	:	T	=	96ºC	20 min
Etapa 2	:	T	=	96ºC	30 s
Etapa 3	:	T	=	49ºC	1,15 min
Etapa 4	:	T	=	54ºC	2,00 min

Las etapas 2 a 4 se recorren 36 veces como un ciclo

Etapa 5	:	T	=	72ºC	15 min
Etapa 6	:	enfriar a 4ºC y mantener la temperatura.

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A la tanda de reacción se le añadieron los 13 meros, como arriba se han descrito, en 3 diferentes concentraciones. En este caso del molde no metilado se hubiera podido esperar que el ANP MDR1-5-FU (3) que está adaptado para este molde tiene una influencia manifiestamente más fuerte que el MDR1-5-FM (3). En la Figura 3 (la anotación véase en la Figura 2) se representa que éste es el caso también en el caso de unas concentraciones de ANP comparativamente bajas.

Estos resultados muestran que la represión de la reacción de PCR se hace posible mediante amplificaciones específicas para una metilación de ANP's que se fijan específicamente. En experimentos testigos con ANP's no complementarios con el MDR-1, se pudo mostrar que éstos no ejercen ninguna influencia digna de mención sobre la PCR en los casos de las concentraciones que entran en cuestión (que no se muestran).

Ejemplo 2

Amplificación sensible a una metilación de un fragmento del gen de GSTpi

Determinadas posiciones CpG del gen de GSTPi se identificaron como marcadores de tumores para un cáncer de próstata.

En el caso del par de cebadores GGAAAGAGGGAAAGGTTTT y TACTAAAAACTCTAAACCCCAT elegidos para los experimentos, un cebador está situado de tal manera que colinda exactamente con la secuencia de ANP CCCCGAAAACGCG (o respectivamente CCCTGAAAATGTG). La secuencia de ANP, a diferencia de los ANP's utilizados para el fragmento de MDR1, comprende entonces tres posiciones CpG relevantes. Las CpG's relevantes que se han de investigar del fragmento de GSTPi no se presentan metiladas en un ADN "normal", es decir no procedente de pacientes con tumores. El ANP situado "hacia abajo del GSTP" con la secuencia CCCTGAAAATGTG, añadido a la tanda de reacción, debería tener por lo tanto una influencia reconocible sobre la reacción de PCR, pero no sobre el correspondiente ANP situado "hacia arriba del GSTP" CCCCGAAAACGCG.

A la tanda de ensayo se le añadió el ANP situado "hacia abajo del GSTP" en tres diferentes concentraciones. Se ensayó un gradiente de la temperatura de reanillamiento.

Los resultados del experimento se representan en la Figura 4. La más fuerte represión de la PCR mediante la adición del ANP (situado hacia abajo del GSTP) se puede comprobar a una temperatura de reanillamiento de 55ºC. En comparación con el testigo positivo (sin ninguna adición de ANP) se puede reconocer que la reacción de PCR se podía reprimir de una manera significativa ya mediante la adición del ANP en una concentración de 20 mol/\mul.

Seguidamente, con el fin de comprobar una fijación específica para ciertas secuencias (y por consiguiente a fin de cuentas sensible a la metilación), se confrontaron las influencias de los ANP's situados "hacia arriba del GSTP" y "hacia abajo del GSTP" sobre las amplificaciones de un ADN no metilado en la muestra original y de un ADN metilado que procede de un tejido de tumor de próstata, como molde.

El ADN no metilado y el ADN de próstata se emplearon como molde en una PCR. A la tanda de reacción se le añadieron los ANP's situados "hacia arriba del GSTP" o respectivamente "hacia abajo del GSTP" en tres diferentes concentraciones.

La adición de los ANP situados "hacia abajo del GSTP" tiene sobre el molde metilado en grado descendente una influencia visible: la PCR ha sido totalmente reprimida en el caso de la adición de los ANP en una concentración de 70 pmol/\mul. En el caso de la adición de los ANP situados "hacia arriba del GSTP" se puede reconocer solamente una influencia inhibidora débil de los ANP sobre la PCR.

La adición de los ANP situados "hacia arriba del GSTP" al ADN en ensayo procedente de un tejido de próstata, tiene una influencia considerablemente inhibidora sobre la PCR (Figura 5). La adición de los ANP en una concentración de 20 pmol/\mul ya reprime manifiestamente a la PCR. Una represión total de la PCR se puede comprobar en el caso de una adición de los ANP en una concentración de 50 pmol/\mul. Al contrario que esto, la adición de los ANP situados "hacia abajo del GSTP" al ADN de próstata tiene una influencia manifiestamente menor. Tampoco una adición de los ANP en una concentración de 70 pmol/\mul reprime totalmente a la PCR.

Los experimentos muestran que es posible, mediante sondas de oligómeros bloqueadores, reprimir selectivamente la amplificación de alelos metilados o no metilados en posiciones definidas. En el sentido de este invento, las correspondientes posiciones servirían como posiciones calificadoras, es decir que se reprimiría selectivamente la amplificación de moldes indeseadamente metilados del ADN de fondo.

Ejemplo 3

Diferentes posibilidades del empleo de sondas que reprimen la PCR de manera específica para una metilación en el ejemplo del gen de GSTPi

En la Figura 6 se representan varias posibilidades de cómo en el caso de una secuencia de molde dada han de disponerse los cebadores en el sentido de una amplificación sensible a la metilación. Como explicación, la Figura 6a muestra los moldes presentes después del tratamiento con un bisulfito, el ADN 1 de modo correspondiente a una muestra de ADN originalmente metilada, el ADN 2 de modo correspondiente a una muestra de ADN originalmente no metilada.

La Figura 6b muestra la disposición de uno de los cebadores en el sentido de una PCR específica para ciertos alelos o respectivamente de una PCR específica para una metilación (MSP). En este caso, la amplificación del ADN 1 metilado hubiera podido tener lugar solamente mediando utilización del cebador mostrado.

Las Figuras 6c y 6d muestran cómo se pueden emplear correspondientemente cebadores no específicos para una metilación, ya sea mediante utilización de posiciones degeneradas (6c) o también de bases universales (aquí inosina) en la Figura 6d.

En la Figura 7 se representan varias posibilidades de cómo en el caso de una secuencia de molde dada han de disponerse los cebadores y las sondas ("bloqueadoras") en el sentido de una amplificación sensible a la metilación. En estos Ejemplos los cebadores utilizados no son por sí mismos específicos para una metilación, sino que la especificidad para una metilación se consigue solamente mediante las sondas ("bloqueadoras"). Para el ADN 1 y el ADN 2 se emplean en cada caso como bloqueadoras sondas específicas.

En la Figura 7a no se solapan un cebador y una sonda, sino que la sonda sigue inmediatamente a continuación del extremo 3' del cebador. La sonda representada es un oligonucleótido modificado en el extremo 3', que por sí mismo no puede ser prolongado en la amplificación. De una manera análoga, se pueden utilizar también unos ANP's que en este Ejemplo deberían ser, sin embargo, más cortos de modo correspondiente a su temperatura de fusión. En la Figura 7b se emplea el mismo cebador, pero aquí la sonda de ADN se solapa con el cebador (exclusión con cebadores).

En Figuras 7c y 7d, se solapan un cebador provisto de posiciones degeneradas y la sonda específica para una metilación. Análogamente, también se pueden emplear bases universales en los cebadores.

En la Figura 8 se representa análogamente un ejemplo con un cebador en avance y un cebador en sentido inverso, en el que se utiliza una sonda, que no solapa con ninguno de los cebadores.

Estos Ejemplos deben explicar las numerosas posibilidades de cómo se pueden emplear sondas de oligómeros para la amplificación específica para una metilación, con el fin de reprimir a un ADN de fondo frente al ADN que se ha de analizar. La extensión del invento no debe ser limitada sin embargo a las formas de realización aquí expuestas a modo de ejemplo.

Ejemplo 4

Preparación de ADN no metilados y metilados, y tratamiento con un bisulfito

Para la preparación de ADN metilados se trataron ADN genómicos humanos con S-adenosil-metiona y con la metilasa de CpG (SssI, de New England Biolabs) de acuerdo con los datos del fabricante. Para la preparación de un ADN no metilado, el fragmento de gen ELK-1 se amplificó mediante una PCR con los cebadores GCTCTATGGTCTTGTC
TAACCGTA (SEQ-ID: 1) y AGGTGGTGGTGGCGGTGG (SEQ-ID: 2) partiendo de un ADN genómico humano. Los ADN no metilados y metilados preparados de esta manera, así como también ADN genómicos humanos se trataron mediando utilización de un bisulfito (hidrógeno-sulfito, disulfito) de tal manera que todas las citosinas no metiladas en la posición 5 de la base son modificadas de tal manera que resulta una base diferente en lo que se refiere al comportamiento de apareamiento de bases, mientras que las citosinas metiladas en posición 5 permanecen inalteradas. Si para la reacción se utiliza un bisulfito en el intervalo de concentraciones comprendido entre 0,1 moles y 6 moles, entonces con las bases de citosina no metiladas tiene lugar una reacción por adición. Además deben estar presentes un reactivo desnaturalizador o un disolvente así como un agente captador de radicales. Una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas conduce entonces a la transformación en uracilo de nucleobases de citosina no metiladas. Este ADN transformado sirve para detectar citosinas metiladas.

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Ejemplo 5

Producción de las sondas de genes marcadas con Cy5

Partiendo de las muestras de ADN tratadas con un bisulfito se amplifica en cada caso un fragmento definido con una longitud de 595 pb (pares de bases) procedente de la región de promotor del gen de ELK-1. La amplificación se lleva a cabo con los oligonucleótidos cebadores ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT (SEQ-ID: 3) y TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT (SEQ-ID: 4). Mediante utilización de oligonucleótidos cebadores, que están marcados con el colorante fluorescente Cy5, el fragmento es marcado directamente al realizar la PCR. Como ADN de matriz se utilizaron un ADN (1) no metilado, (2) un ADN metilado y (3) un ADN genómico humano, tratados con un bisulfito (hidrógeno-sulfito, disulfito). A continuación, estos tres diferentes fragmentos de ADN se investigan en hibridaciones separadas en cuanto a su grado de metilación en una posición CpG específica.

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Ejemplo 6

Realización de la hibridación y evaluación de un "chip" de ADN hibridado

Las sondas de genes producidas en el Ejemplo 5 se hibridaron sobre un chip de ADN. Sobre el chip han sido inmovilizados previamente unos oligonucleótidos. Las secuencias de oligonucleótidos se derivan del fragmento del gen ELK-1 amplificado, que se menciona en el Ejemplo 2, y representan a los dinucleótidos CG, incluyendo el entorno inmediato. La longitud de los oligonucleótidos es 14-22 nucleótidos, la posición del dinucleótido CG dentro de los oligonucleótidos es variable. Después de la hibridación se explora el chip de ADN (véase la Figura 1) y se valoran numéricamente las señales de hibridación (no se muestran los datos). El resultado de la hibridación para los oligonucleótidos CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5) y CTACTCAACAAAAACAAA (SEQ-ID: 6) se muestra en la Fig. 1. En este contexto, se hibrida de un modo preferente el CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5), cuando está metilada la citosina del fragmento ELK-1, que se encuentra en la posición 103 del material amplificado, y el CTACTCAACAAAAACAAA (SEQ-ID: 6) cuando esta citosina no está metilada.

En la Figura 1 se representa un chip de ADN después de una hibridación con el fragmento de promotor. Se representa la imagen en colores falsos, como se genera después de la exploración. Al contrario que en la reproducción en blanco y negro aquí representada, por el explorador se genera una imagen en colores. La intensidad de los diferentes colores representa el grado de la hibridación, disminuyendo el grado de hibridación desde el rojo (que se puede reconocer en la Figura 1 como motas claras) hasta el azul (que se puede reconocer en la Figura 1 como motas oscuras).

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Ejemplo 7

Preparación del ADN de molde y establecimiento de la PCR de GSTp1

Como ADN de molde sirvieron ADN humanos procedentes de sangre periférica (de Promega, Madison EE. UU), sin tratar y metilados enzimáticamente in vitro, que habían sido sometidos a un tratamiento con un bisulfito. Para la metilación de todos los dinucleótidos CG, de acuerdo con los datos del fabricante, 6 \mug de ADN en un volumen de reacción de 150 \mul se hicieron reaccionar con SssI (de New England Biolabs, Frankfurt/Main). El tratamiento con un bisulfito se efectuó de acuerdo con un procedimiento publicado (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis [Un método modificado y mejorado para un análisis de la metilación de citosina, basado en un bisulfito]. Nucleic Acids Res. 15 de Diciembre de 1996; 24(24):5064-6).

Un fragmento de GSTp1 de 153 pb (posiciones 1242-1393 en la secuencia con el Nº de acceso M24485.1) se amplificó con los cebadores 2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT y 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC, específicos para el ADN tratado con un bisulfito, en un volumen de reacción de 25 \mul (1x tampón de reacción, de Qiagen; 1 U de HotstarTaq, de Qiagen; 200 \muM de cada uno de los dNTPs, de cada uno de los cebadores 500 nM, 0,05-10 ng de un ADN de molde tratado con un bisulfito) en las siguientes condiciones de PCR (95ºC - 15 min; 46 ciclos: 96ºC - 0:45 min, 52ºC - 0:45 min, 72ºC - 0:20 min; 72ºC - 10 min) (véanse las Figuras 9 y 10). Mediante secuenciación de los fragmentos de GSTp1 se pudo mostrar que un ADN humano procedente de una sangre periférica para este fragmento no tiene ningún dinucleótido CG metilado, al contrario de lo cual en el ADN tratado con SssI todos los dinucleótidos CG se presentan en la forma metilada (véase la Figura 9). La secuenciación del fragmento de GSTp1 confirma resultados de otros casos (véase p. ej. el documento WO 9955905), de que en el gen de GSTp1, al contrario que la secuencia publicada (banco de genes Genbank Nº de acceso M24485.1), está presente un nucleótido G adicional (entre las posiciones 1273 y 1274 en el Genbank Nº de acceso M24485.1); posición 33 en el fragmento de PCR de GSTp1, véase la Figura 9. En lo referente a la eficiencia de la PCR no existe ninguna diferencia entre los ADN de molde metilados en CpG y no metilados en CpG (véase la Figura 10).

Ejemplo 8

Amplificación selectiva de fragmentos de GSTp1 metilados

En la Figura 11 se representa esquemáticamente el diseño de un experimento para la amplificación selectiva de fragmentos de GSTp1 metilados. La amplificación del fragmento de GSTp1 con los cebadores 2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT y 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC sobre un ADN de molde no metilado se impide mediante dos oligonucleótidos bloqueadores (B5+9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P; B15+ 17RT11, TAAACCCC
CATCCCAAATCTCA-P, véase la Figura 11), cuyas secuencias corresponden a las de ADN no metilados, tratados con un bisulfito. Estos oligonucleótidos están modificados junto al extremo 3' mediante un grupo fosfato, con el fin de impedir su prolongación durante la PCR. La PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 25 \mul con el siguiente programa de ciclos (95ºC - 15 min; 46 ciclos: 96ºC - 0:45 min, 52ºC - 0:45 min, 72ºC - 0:20 min; 72ºC - 10 min). La tanda de PCR estaba compuesta de la siguiente manera: 1x tampón de reacción (de Qiagen, Hilden); 2 U de Hotstar Taq (de Qiagen, Hilden); 200 \muM de cada uno de los dNTPs, 500 nM de cada uno de los cebadores, 10 \muM de cada uno de los bloqueadores (B5+ 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P y B15+17RT11, TAAACCCC
CATCCCAAATCTCA-P), 20 ng-20 pg de un ADN de molde tratado con un bisulfito. Bajo estas condiciones de la PCR era posible reprimir totalmente la amplificación del fragmento de GSTp1 con 25 \mug de un ADN de molde no metilado (véase la Figura 12A traza 8). Si la PCR se había llevadso a cabo sin oligonucleótidos bloqueadores, el fragmento de GSTp1 fue amplificado (véase la Figura 12, D traza 8). Por el contrario, el producto de la PCR de GSTp1 pudo ser detectado en las mismas condiciones de la PCR, con y sin oligonucleótidos bloqueadores, sobre 100 pg de un ADN de molde metilado (véase la Figura 12, C traza 7, F traza 7). La sensibilidad absoluta de la PCR está situada por consiguiente en por lo menos 100 pg de un ADN de molde metilado.

Con el fin de investigar la sensibilidad relativa de la PCR, a partir de ADN de molde no metilados y metilados se prepararon unas mezclas, en las cuales la relación de los ADN no metilados a los ADN metilados era de 1:1 a 1:1.000. Para la preparación de estas mezclas de ADN, un ADN humano procedente de una sangre periférica (de Promega Madison; EE.UU.) se mezcló con un ADN tratado con SssI (véase el Ejemplo 7), correspondientemente a las relaciones que se han de conseguir, y luego se sometió a un tratamiento con un bisulfito. Los resultados de las PCR sobre estas mezclas de ADN de molde (25 \mug de ADN total), que se llevaron a cabo con y sin oligonucleótidos bloqueadores, se representan en las Figuras 12 A, B o respectivamente las Figuras 12 D, E. ellas muestran que una copia del gen de GSTp1 metilado se puede detectar de manera reproducible en un fondo de 200 copias del gen de GSTp1 no metilado (véanse la Figura 12 A traza 6, B traza 6). Una sensibilidad relativa de 1:1.000 parece ser conseguible mediante una optimización adicional de la condición de PCR (véase la Figura 12 B, traza 7).

Los análisis de las secuencias de los productos de la PCR, amplificados a partir de la mezcla de ADN (1:200, relación del ADN no metilado al ADN metilado) con un bloqueador B (véase la Figura 12 A, traza 6) y sin ningún bloqueador (véase la Figura 12 D, traza 6), mostraron el resultado esperado. El producto de la PCR producido en la PCR sin bloqueador, correspondía a un gen de GSTp1 no metilado, al contrario de lo cual el fragmento de gen de GSTp1, producido en la PCR con oligonucleótidos bloqueadores, tenía un estado epigenético metilado.

Otras modificaciones en 3', tales como un ddNTP, o nucleótidos adicionales, que no corresponden a la secuencia de nucleótido GSTp1 correspondiente, se ensayaron también con éxito.

Ejemplo 9

Amplificación selectiva de fragmentos de GSTp1 metilados en un LightCycler

El LightCycler (de Roche) es un aparato para la realización de una PCR y para la detección y el análisis simultáneos de los productos de la PCR. La manipulación del aparato se efectuaba de acuerdo con los datos del fabricante. Los análisis cuantitativo y cualitativo de la PCR se efectuaron con el programa lógico LightCycler versión 3.5.

La amplificación selectiva de fragmentos del gen de GSTp1 metilado se llevó a cabo en un volumen de reacción de 10 \mul (1x tampón de reacción (de Qiagen, Hilden); 5 U de HotstarTaq (de Qiagen, Hilden); 250 \muM de cada uno de los dNTPs, 625 nM de cada uno de los cebadores (2cf, GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT; 2cr, TCCTAAATCCCC
TAAACC), de un bloqueador 4 \muM (B5+9FT16, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGTT-P), 0,25 \mug/\mul de BSA (de Sigma, Munich), 250 nM de oligonucleótidos de ancla (GSTpl-Fluo,TTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT-fluoresceína; TibMolBiol, Berlín), 250 nM de una sonda de hibridación (GSTp1-Red 705, Red705-GTATTAGGTTTGGGT
TTTTGGT-P; TibMolBiol, Berlín) y/o GSTp1-Red650, Red650-TAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGG-P, TibMolBiol, Berlín), 20 ng-20 pg de un ADN de molde) con el siguiente programa de ciclos: 95ºC - 15 min; 46 ciclos: desnaturalización 96ºC - 4 s, reanillamiento 52ºC - 30 s, prolongación 72ºC - 20 s. La detección se efectuó en cada uno de los ciclos de amplificación mediante sondas de detección para LightCycler que son específicas para el gen y para una metilación, en la etapa de reanillamiento después de 10 s. La detección del fragmento de PCR de GSTp1 se efectuó cuando se hibridan con el fragmento de la PCR tanto la sonda de ancla específica para una metilación, GSTp1-Fluo, así como una de las sondas específicas para una metilación, GSTp1-Red 705 o GSTp1-Red 650.

Con el fin de comprobar la especificidad para una metilación de las sondas de detección, se amplificaron en el LightCycler cada vez 15 ng de un ADN metilado y de un ADN de molde no metilado, tratados con un bisulfito. Para la detección, la PCR contenía la sonda de ancla GSTp1-Fluo y una mezcla equimolar de las sondas de hibridación GSTp1-Red 705 y GSTp1-Red 650. La fluorescencia de la sonda para el gen de GSTp1 metilado, GSTp1-Red 650, se midió en el canal de detección F2/F1 del LightCycler, al contrario de lo cual la sonda para el gen de GSTp1 no metilado, GSTp1-red 705, es detectada en el canal F3/F1 (véase la Figura 13). Los experimentos mostraron que la GSTp1-Red 650 detecta específicamente al gen de GSTp1 metilado, y que la versión no metilada no producía ninguna señal de fluorescencia (véase la Figura 13 A). La sonda GSTp1-Red 705 detecta, por el contrario, al gen de GSTp1 no metilado y al gen de GSTp1 metilado, este último con una eficiencia significativamente disminuida (véase la Figura 13 B).

Las sensibilidades absoluta y relativa de la amplificación del fragmento de GSTp1 metilado se investigó por analogía al Ejemplo 8. Para la determinación de la sensibilidad absoluta, las PCR de GSTp1 se llevaron a cabo con diferentes cantidades de un ADN de molde metilado, tratado con un bisulfito, en el LightCycler con y sin un oligonucleótido bloqueador. Para la detección, junto a la sonda de "ancla", se utiliza la sonda de hibridación GSTp1-Red 650. Los resultados están recopilados en la Figura 14. El cálculo de los "puntos de cruce" (en inglés crossing point) se efectuó mediante el programa lógico de LightCycler versión 3.5, e indica el número de los ciclos de la PCR, con el que el producto de la PCR de GSTP1 pudo ser detectado la primera vez, con una señal más alta que la del testigo negativo. Esto significa que, cuanto más bajo era el valor del "punto de cruce", tanto más eficientemente se efectuaba la amplificación del fragmento de GSTp1. Ningún dato del "punto de cruce" significa que no se pudo detectar ningún producto de la PCR. En el experimento representado, el GSTp1 pudo ser amplificado, también en presencia del bloqueador, con 75 pg de un ADN de molde metilado, tratado con un bisulfito (véase la Figura 14).

Para la determinación de la sensibilidad relativa, se llevaron a cabo unas PCR de GSTp1 con 20 ng de las mezclas de ADN de molde (véase el Ejemplo 8) con y sin oligonucleótidos bloqueadores (Figura 15). Para la detección, la PCR contenía la sonda de ancla GSTp1-Fluo y una mezcla equimolar de las sondas de hibridación GSTp1-Red 705 y GSTp1-Red 650. La fluorescencia de la sonda para el gen de GSTp1 metilado, GSTp1 Red 650, se midió en el canal de detección F2/F1 del LightCycler, al contrario de lo cual la sonda para el gen de GSTp1-no metilado, GSTp1-Red 705, es detectada en el canal F3/F1.

Los "puntos de cruce" determinados mostraron que en una PCR con un oligonucleótido bloqueador se puede detectar de manera reproducible una copia del gen de GSTp1 metilado, en un fondo de 500 copias del gen de GSTp1 no metilado (véase la Figura 15 "posición del rotor" 17, columna de F2/F1). Esto corresponde a una sensibilidad absoluta de 40 pg de un ADN de molde metilado. Sin oligonucleótidos bloqueadores se pudo conseguir solamente una sensibilidad relativa de 1:10 (véase la Figura 15; "posición del rotor" 3, columna de F2/F1). En las mismas condiciones se reprime completamente la amplificación del gen de GSTp1 de 15 ng de un ADN de molde no metilado, tratado con un bisulfito (véase la Figura 15, "posiciones del rotor" 19 y 9, columna de F3/F1).

Ejemplo 10

Amplificación selectiva de fragmentos de GSTp1 metilados en un TaqMan

El TaqMan (de Applied Biosystems, Weiterstadt) es otro aparato para la realización de una PCR y para una detección y un análisis simultáneas/os de los productos de la PCR. La manipulación del aparato se efectuó de acuerdo con los datos del fabricante. Los análisis cuantitativo y cualitativo de la PCR se efectuaron con el programa lógico de TaqMan.

La amplificación selectiva de fragmentos del gen de GSTp1 metilado se llevó a cabo en un volumen de reacción de 20 \mul (1x tampón de reacción (de Applied Biosystems), 2 U de Amplitaq Gold (de Applied Biosystems); 3,5 mM de MgCl2, 400 \muM de cada uno de los dNTPs, 500 nM de cada uno de los cebadores (2cft, GTTTT(CT)GTTATTAGT
GAGTA; 2cr, TCCTAAATCCCCTAAACC, 7,5 \muM del bloqueador 1 (B5+9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P), 7,5 \muM del bloqueador 2 (B15+17RT19, TAAACCCCCATCCCAAATCTC-P), 450 nM de la sonda de Taq-Man (Taq1, Black hole-TAATTCGTAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGGTAGGG-FAM; de Biosearch Technologies), 10 ng de un ADN de molde) con el siguiente programa de ciclos: 95ºC - 10 min; 3 ciclos: desnaturalización 96ºC - 15 s, reanillamiento 60ºC - 60 s; 3 ciclos: desnaturalización 96ºC - 15 s, reanillamiento 58ºC - 30 s, prolongación 60ºC - 30 s, 3 ciclos: desnaturalización 96ºC - 15 s, reanillamiento 55ºC - 30 s, prolongación 60ºC - 30 s; 40 ciclos: desnaturalización 96ºC - 15 s, reanillamiento 52ºC - 30 s, prolongación 60ºC - 40 s). La detección se efectuó con cada uno de los ciclos de amplificación mediante las sondas de TaqMan específicas para ciertos genes, después de la etapa de prolongación.

Para la determinación de la sensibilidad relativa se llevaron a cabo unas PCR de GSTp1 con 10 ng de las mezclas de ADN de molde (véase el Ejemplo 8) con y sin oligonucleótidos bloqueadores (Figura 16). El cálculo del "ciclo de umbral" (del inglés threshold cycle) se efectuó mediante el programa lógico de TaqMan e indica, de modo comparable a los valores del "punto de cruce" del Lightcycler, el número de los ciclos de las PCR en los que el producto de PCR GSTp1 podía ser detectado la primera vez, con una señal más alta que la del testigo negativo. Esto significa que cuanto más bajo es el valor del "ciclo de umbral" tanto más eficientemente se efectuaba la amplificación del fragmento de GSTp1.

Los valores determinados del "ciclo de umbral" mostraron que en una PCR con un oligonucleótido bloqueador se puede detectar de manera reproducible una copia del gen de GSTp1 metilado, en un fondo de 200 copias del gen de GSTP1 no metilado (véase la Figura 16). Esto corresponde a una sensibilidad absoluta de 50 pg de un ADN de plantilla metilado. En las mismas condiciones, se reprimió totalmente la amplificación del gen de GSTp1 de 10 ng de un ADN de molde no metilado, tratado con un bisulfito (véase la Figura 16).

Descripción de las figuras

Figura 10: Gel de agarosa con fragmentos de PCR de GSTp1. La PCR se llevó a cabo con 10 ng, 5 ng, 1 ng, 0,5 ng y 0,1 ng de ADN de molde metilado (A) y no metilado (B), tratados con un bisulfito.

Figura 11: Secuencia del gen de GSTp1 con situación de los oligonucleótidos cebadores y bloqueadores.

Figura 12: Geles de agarosa de fragmentos de PCR de GSTp1. Se analizaron la sensibilidad relativa de la amplificación del gen de GSTp1 metilado (A, B, D, E) y la sensibilidad absoluta (C, F) de la amplificación del gen de GSTp1 metilado. Las PCR de GSTp1 se llevaron a cabo con un oligonucleótido bloqueador (A, B, C) y sin ningún oligonucleótido bloqueador (D, E, F). Como ADN de molde se utilizaron: 20 ng de ADN metilados, tratados con un bisulfito (A1, B1, D1, E1, C1, F1, C2, F2) y 20 ng de ADN no metilados, tratados con un bisulfito (A8, B8, D8, E8), de ADN metilados y no metilados, tratados con un bisulfito, en las relaciones de mezcladura 1:2 (A2, B2, D2, E2), 1:10 (A3, B3, D3, E3), 1:20 (A4, B4, D4, E4), 1:100 (A5, B5, D5, E5), 1:200 (A6, B6, D6, E6), 1:1.000 (A7, B7, D7, E7); 10 ng (C3, F3), 2 ng (C4, F4), 1 ng (C5, F5), 0,2 ng (C6, F6), 0,1 ng (C7, F7), 0,02 ng (C8, F8), de ADN metilados, tratados con un bisulfito, y de ningún ADN (A9, D9).

Figura 13: Análisis de la especificidad para una metilación de las sondas de detección. La Figura muestra la evolución de la fluorescencia durante la PCR de GSTp1 de un ADN metilado, tratado con un bisulfito (línea continua), y de un ADN no metilado, tratado con un bisulfito (línea de puntos), detectada con una sonda de hibridación GSTp1-Red 650 (A) o respectivamente GSTp1-Red 705 (B).

Figura 14: Determinación de la sensibilidad absoluta de la PCR de GSTp1 en el LightCycler. Las PCR de GSTp1 se llevaron a cabo con un oligonucleótido bloqueador ("posiciones del rotor" 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18) y sin ningún oligonucleótido bloqueador ("posiciones del rotor" 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 17). Como ADN de molde se utilizaron: ADN metilados, tratados con un bisulfito 7,5 ng ("posiciones del rotor" 1, 9), 3,7 ng ("posiciones del rotor" 2, 10), 0,75 ng ("posiciones del rotor" 3, 11), 0,37 ng ("posiciones del rotor" 4, 12), 0,075 ng ("posiciones del rotor" 5, 13), 0,037 ng ("posiciones del rotor" 6, 14), 0,015 ng ("posiciones del rotor" 7, 15), 0,0075 ng ("posiciones del rotor" 8, 16) y ningún ADN ("posiciones del rotor" 17, 18).

Figura 15: Determinación de la sensibilidad relativa de la amplificación del gen de GSTp1 metilado. Las amplificaciones del gen de GSTp1 metilado se llevaron a cabo con un LightCycler. Se indica la detección con las sondas de hibridación GSTp1-Red 650 (F2/F1, punto de cruce) y GSTp1-Red 705 (F3/F1, punto de cruce). Las PCR de GSTp1 se llevaron a cabo con un oligonucleótido bloqueador ("posiciones del rotor" 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20) y sin ningún oligonucleótido bloqueador ("posiciones del rotor" 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10). Como ADN de molde se utilizaron: 15 ng de un ADN metilado, tratado con un bisulfito ("posiciones del rotor" 1, 11) y 15 ng de un ADN no metilado, tratado con un bisulfito ("posiciones del rotor" 10, 20), de ADN metilados y no metilados, tratados con un bisulfito, en las relaciones de mezcladura de 1:2 ("posiciones del rotor" 2, 12), 1:10 ("posiciones del rotor" 3, 13), 1:20 ("posiciones del rotor" 4, 14), 1:100 ("posiciones del rotor" 5, 15), 1:500 ("posiciones del rotor" 7, 17), 1:1000 ("posiciones del rotor" 8, 18) y ningún ADN ("posiciones del rotor" 10, 20).

Figura 16: Determinación de la sensibilidad relativa de la amplificación del gen de GSTp1 metilado. Las amplificaciones del gen de GSTp1 metilado se llevaron a cabo con un TaqMan.

<110> Epigenomics AG

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<120> Procedimiento para la detección de modelos de metilación de citosina con alta sensibilidad

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<130> E01/1289/EP

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<160> 43

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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gctctatggt cttgtctaac cgta

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24

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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aggtggtggt ggcggtgg

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18

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<212> ADN

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atggttttgt ttaatygtag agttgttt

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<212> ADN

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<220>

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taaacccraa aaaaaaaaac ccaatat

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27

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<213> secuencia artificial

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<212> ADN

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<220>

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<223> oligonucleótido

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ctactcaaca aaaacaaa

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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taaaaactat cccataataa ctcccaac

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28

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taagtatgtt gaagaaagat t

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido bloqueador

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<220>

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<221> base modificada

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<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con un grupo fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgagtatgt gtggtttgtg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> adenina modificada con un grupo fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaaccccca tcccaaatct ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con un grupo fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgagtatgt gtggtttgtg tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido de ancla GSTp1-Fluo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con fluoresceína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttagagttt ttagtatggg gttaatt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda de hibridación GSTp1-Red 705

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modifica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> guanina modificada con Red 707

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con un fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtattaggtt tgggtttttg gt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda de hibridación GSTp1-Red 650

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con Red 650

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> guanina modificada con un fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tagtattagg ttcgggtttt cgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Gttttctgtt attagtgagt a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> citosina modificada con un fosfato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Taaaccccca tcccaaatct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda de TaqMan

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> timina modificada con Black hole

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> guanina modificada con FAM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Taattcgtag tattaggttc gggttttcgg taggg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN tratado con un bisulfito

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN tratado con un bisulfito

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactcatg cgcgc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactcatr crcrc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactcatn cncnc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aataatcact cat

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaccaaa cacaaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgagtaac acaccaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactcata gagagcaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212>ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactcatr crcrccaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaccaaa cacha

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaccaaa cacaaaaac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido bloqueador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccaaaca caaa

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Cccctacccc aaa

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> producto de amplificación de un fragmento de GSTp1 de 153 pb (posiciones 1.242-1.393 en la secuencia con el Nº de acceso M24485.1 con cebadores específicos para ADN tratados con un bisulfito

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ADN tratado con sssI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 41

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gttttrgtta ttagtgagt

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19

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<210> 42

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido bloqueador

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<220>

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<221> base modificada

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<222> (1)..(1)

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<223> adenina modificada con un fosfato

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<400> 42

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Actctaaacc ctacccccaa at

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22

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<210> 43

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 43

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ccaaatcccc taaatcct

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18

Claims (40)

1. Procedimiento para la detección de una metilación de citosina en muestras de ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas

a) se trata una muestra de ADN genómico, que comprende un ADN que se ha de investigar y un ADN de fondo, por medios químicos, de tal manera que todas las bases de citosina no metiladas se transforman en uracilo, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen inalteradas,

b) la muestra de ADN tratada químicamente se amplifica mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores, de una polimerasa así como de por lo menos un oligonucleótido adicional o de un oligómero de ANP, que se fija a un dinucleótido 5'-CG-3' o a un dinucleótido 5'-TG-3' o a un dinucleótido 5'-CA-3', fijándose el otro oligonucleótido o el oligómero de ANP de manera preferida al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste,
siendo preferido como molde en la amplificación el ADN que se ha de investigar con respecto al ADN de fondo, y

c) se analizan los materiales amplificados y a partir de la existencia de un material amplificado y/o a partir del análisis de otras posiciones se sacan conclusiones acerca del estado de metilación en el ADN que se ha de investigar, siendo llevado a cabo el procedimiento fuera del cuerpo humano.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los ADN de las muestras se obtienen a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los ADN de las muestras se obtienen a partir de linajes celulares, una sangre, un esputo, una defecación, una orina, un suero, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojos, intestinos, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mamas o hígados, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de éstos.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el tratamiento químico se lleva a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito).

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el tratamiento químico se efectúa después de una imbibición del ADN en agarosa.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque en el caso del tratamiento químico están presentes un reactivo que desnaturaliza a los dúplex de ADN y/o un agente captador de radicales.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque este sitio de fijación del otro oligonucleótido adicional o del oligómero de ANP se solapa con los sitios de fijación de los cebadores sobre el ADN de fondo, y el otro oligonucleótido adicional impide la fijación de por lo menos un oligonucleótido cebador al ADN de fondo.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se emplean por lo menos otros dos oligonucleótidos u oligómeros de ANP adicionales, solapándose el sitio de fijación de éstos de nuevo en cada caso con el sitio de fijación de un cebador al ADN de fondo, e impidiendo los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales la fijación de ambos oligonucleótidos cebadores al ADN de fondo.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque en cada caso uno de los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales impide la fijación del cebador en avance, mientras que el respectivo otro impide la fijación del cebador en sentido inverso.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales se presentan en una concentración por lo menos cinco veces mayor en comparación con la de los oligonucleótidos cebadores.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los otros oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP adicionales se fijan al ADN de fondo y por consiguiente impiden la prolongación completa de los oligonucleótidos cebadores en la reacción de la polimerasa.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la polimerasa utilizada no tiene ninguna actividad de 5'-3' exonucleasa.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque los otros oligonucleótidos adicionales se presentan modificados en el extremo 5' y por lo tanto no pueden ser descompuestos de manera significativa por una polimerasa con actividad de 5'-3' exonucleasa.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados de manera adicional a los cebadores no disponen de ninguna función 3'-OH.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque la muestra de ADN tratada químicamente se amplifica en la segunda etapa mediando utilización de por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores y de otro oligonucleótido u oligómero de ANP adicional, que se hibrida con un dinucleótido 5'-CG-3' o con un dinucleótido 5'-TG-3' o con un dinucleótido 5'-CA-3', y de por lo menos un oligonucleótido reportero, que se hibrida con un dinucleótido 5'-CG-3' o con un dinucleótido 5'-TG-3' o con un dinucleótido 5'-CA-3', así como de una polimerasa, fijándose el otro oligonucleótido u oligómero de ANP adicional de manera preferente al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste, y fijándose el oligonucleótido reportero de manera preferente al ADN que se ha de investigar e indicando su amplificación.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente al oligonucleótido reportero se utiliza otro oligómero marcado con un colorante fluorescente, que se hibrida de manera inmediatamente contigua al oligonucleótido reportero, y esta hibridación se puede detectar mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia.

17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque se lleva a cabo un ensayo de Taqman.

18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 o 16, caracterizado porque se lleva a cabo un ensayo de Lightcycler.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque los oligonucleótidos reporteros llevan por lo menos una marcación fluorescente.

20. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque las moléculas reporteras indican la amplificación ya sea mediante un aumento o una disminución de la fluorescencia.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque el aumento o la disminución de la fluorescencia se utiliza también directamente para el análisis, y a partir de la señal de fluorescencia se sacan conclusiones acerca de un estado de metilación del ADN que se ha de analizar.

22. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el ADN de fondo se presenta en una concentración 100 veces mayor en comparación con la del ADN que se ha investigar.

23. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el ADN de fondo se presenta en una concentración 1.000 veces mayor en comparación con la del ADN que se ha de investigar.

24. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el análisis, o en el caso de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 10, el otro análisis adicional, se efectúa mediante una hibridación con agrupaciones de oligómeros, pudiendo los oligómeros ser ácidos nucleicos o moléculas similares en cuanto a sus propiedades de hibridación, tales como ANP's.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque los oligómeros se hibridan, a través de un segmento con una longitud de 12-22 bases, con el ADN que se ha de analizar, y ellos comprenden un dinucleótido CG, TG o CA.

26. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque se detecta en un solo experimento el estado de metilación de más de 20 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

27. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque se detecta en un solo experimento el estado de metilación de más de 60 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

28. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el análisis, o en el caso de las reivindicaciones 15 a 18, el otro análisis adicional, se efectúa mediante una medición de longitudes de los ADN amplificados que se han de investigar, comprendiendo los métodos para la medición de las longitudes una electroforesis en gel, una electroforesis en gel capilar, una cromatografía (p. ej. HPLC), una espectrometría de masas y otros métodos apropiados.

29. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el análisis, o en el caso de las reivindicaciones 15 a 18, el otro análisis adicional, se efectúa mediante una secuenciación, comprendiendo los métodos para la secuenciación el método de Sanger, el método de Maxam-Gilbert u otros métodos tales como una secuenciación por hibridación (SBH).

30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque la secuenciación para cada una de las posiciones CpG o para un pequeño grupo de estas posiciones se realiza en cada caso con un oligonucleótido cebador separado, y la prolongación de los cebadores constituye solamente una base o unas pocas bases, y porque a partir del tipo de la prolongación con cebadores se sacan conclusiones acerca del estado de metilación de las correspondientes posiciones en el ADN que se ha de investigar.

31. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque a partir del estado de metilación en las diferentes posiciones CpG investigadas se sacan conclusiones acerca de la existencia de una enfermedad o de otro estado médico del paciente.

32. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los materiales amplificados propiamente dichos están provistos, para la detección, de una marcación detectable.

33. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque las marcaciones son marcaciones fluorescentes.

34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque las marcaciones son radionúclidos.

35. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque las marcaciones son marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.

36. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque al realizar la amplificación uno de los cebadores está fijado a una fase sólida.

37. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 32, caracterizado porque los materiales amplificados se detectan en su totalidad en el espectrómetro de masas y por consiguiente son caracterizados inequívocamente por su masa.

38. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones para el diagnóstico y/o el pronóstico de sucesos desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos, enfermedades de cáncer, funciones defectuosas, daños o una enfermedad del SNC; síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos sicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/u otros síndromes asociados; una enfermedad, una función defectuosa y un daño cardiovascular; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección, una inmunidad y/o una convalecencia; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; una función defectuosa, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; una función defectuosa, un daño o una enfermedad del sistema endocrino y metabólico; un dolor de cabeza o una función defectuosa sexual.

39. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, para la diferenciación de tipos de células o de tejidos o para la investigación de la diferenciación de células.

40. Estuche, que se compone de un reactivo que contiene un bisulfito, de cebadores y de otros oligonucleótidos sin ninguna función 3'-OH, que se fijan a un dinucleótido 5'-CG-3' o a un dinucleótido 5'-TG-3' o un dinucleótido 5'-CA-3', fijándose los otros oligonucleótidos preferentemente al ADN de fondo y perjudicando a la amplificación de éste, destinado a la producción de los materiales amplificados.