JP4484431B2 - シトシンメチル化の高感度での検出方法 - Google Patents

Description

本発明はＤＮＡ試料のシトシンメチル化の検出方法に関する。

近年の分子生物学における手法の開発による研究的観察は遺伝子自体、この遺伝子のＲＮＡの解読、そこから発生する蛋白などについてである。個々の開発過程で、どの遺伝子が評価されるか、そして、いかにして、特定の細胞および組織における特定の遺伝子の活動及び阻害が制御されるか、は遺伝子またはゲノムのメチル化の程度及び性格と関連づけることができる。個々の遺伝子またはゲノムが変化したメチル化サンプルにおいて、病気の状態が表現される。

５−メチルシトシンはしばしば、共有結合反応させられる、真核細胞のＤＮＡの塩基である。これは例えば、遺伝子刷り込み時の転写規制及び腫瘍遺伝子において、一定の役割を演じる。遺伝子情報の構成部分としての５−メチルシトシンの同定は、それ故に、非常に興味ある問題である。５−メチルシトシンの位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同様な塩基対挙動を示すので、シーケンシングによっては同定することができない。ＰＣＲ増幅では５−メチルシトシンを有する後成的情報は完全に失われている。

比較的新しく、最も頻繁に使用されるＤＮＡの５−メチルシトシンの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特殊な反応に基づく。シトシンは後続するアルカリ加水分解により、ウラシルに変化し、これはその塩基対挙動がチミンに対応する。それに対して、５−メチルシトシンは、この条件下では変化しない。このようにして、元のＤＮＡが変化し、元来、シトシンの二本鎖形成挙動によっては、シトシンと区別できなかった５−メチルシトシンは、今や、通常の分子生物学的技法によって、唯一、残存するシトシンが、例えば、増幅及び二本鎖形成またはシーケンシングによって、検出され得るようになった。これら全ての技法は、現在、完全に利用し尽くされている塩基対に基づく。従来の技術では、感度に関して、調査するＤＮＡをアガロースマトリックスに包埋し、それによって、ＤＮＡの拡散及び変成復元化（重亜硫酸塩は単鎖ＤＮＡとのみ反応する）が阻害され、全ての沈殿および精製工程が迅速な透析によって、取って代られる（Olek A、Oswald J、Walter J. 変化し、改善された重亜硫酸塩ベースのシトシンメチル化分析。Nucleic Acids Res.1996 Dec 15; 24 (24): 5064〜6）。これらの方法によって、個々の細胞を調べることができ、この方法の潜在的効果が具体的に説明される。勿論、これまでに、単に、個々の領域で、約３，０００塩基対長までが調べられたに過ぎず、数千に及ぶ細胞のメチル化解析の調査は可能ではない。またこれらの方法では、僅かな量の試料からの小さな断片から、信頼性のある解析は不可能である。これらの方法では拡散防止の措置にも拘らず、マトリックスから、これら試料が逸失される。

５−メチルシトシンを検出する既知の可能性についての概観は、以下の概観の刊行物から知ることができる。即ち、Rein T、DePamphilis ML、Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res .1998 May 15; 26 (10): 2255〜64。重亜硫酸塩を使用した技法は、これまで僅かな例外[z. B. Zeschnigk M、Lich C、Buiting K、Doerfler W、Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar〜Apr; 5 (2)：94〜8 ]が研究の中で使用されていたに過ぎない。常に、既知の遺伝子の、短い、特殊な断片が、重亜硫酸塩処理によって、増幅されるか、または、相補的に配列されるか[Olek A 、Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint、Nat Genet. 1997 Nov; 17（3）: 275〜6 ] または、個々のシトシン位置を、プライマー伸長反応 [Gonzalgo ML、Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-ＳNuPE) .Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25 (12): 2529〜31、WO-Patent 9500669] によって、または、一つの酵素断片[Xiong Z、Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12): 2532〜4 ]によって検出される。そのために、二本鎖形成により検出される（Olek et al.、WO 99 28498）。

尿素はゲノムＤＮＡの５−メチルシトシンのシーケンシング前の重亜硫酸塩処理の効率を高める[Paulin R、Grigg GW、Davey MW、Piper AA. 尿素はゲノムＤＮＡの５'−メチルシトシンのシーケンシング前の重亜硫酸塩の処理の効率を高める。Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1; 26 (21): 5009〜10 ]。

その他の、個々の遺伝子のメチル化検出のために重亜硫酸塩技法を使用することについて、記載されている刊行物は以下のものである。
Grigg G、Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun. ; 16 (6): 431〜6、431; Zeschnigk M、Schmitz B、Dittrich B、Buiting K、Horsthemke B、Doerfler W、Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndorome region as determined by the genomic sequencing method. Hum mol Genet. 1997 Mar; 6 (3): 387〜95; Feil R、Charlton J、Bird AP、Walter J、Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res.1994 Feb 25; 22 (4): 695〜6; Martin V、Ribieras S、Song- Wong X、Rio MC、Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene.1995 May 19; 157 (1〜2): 261〜4; WO 9746705、WO 9515373及びWO 95 45560。

更に公知の方法は、所謂、メチル化感受性ＰＣＲである[Herman JG、Graff JR、Myohanen S、 Nelkin BD、Baylin SB (1996)、 Methylation-specific PCR: CpG島のメチル化状態の新規なＰＣＲアッセイ。Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93 (18): 9821〜6]。この方法には、当該位置がメチル化されていないＤＮＡの重亜硫酸塩処理により発生する、配列のみを二本鎖形成するか、または、当該位置がメチル化されていないＤＮＡの重亜硫酸塩処理により発生する、核酸にのみ結合する、リバースプライマであるかの、何れかのプライマーが使用される。このプライマーで、その検出が、再び、プライマーが結合する、試料中のメチル化または非メチル化位置を提示する増幅産物により生産される。

より新しい方法は、メチル-ライト（Methyl-Light）として知られている、タクマン（Taqman）PCRによるシトシンメチル化の検出である（WO00/70090）。この方法により、個々のまたは少数の位置のメチル化状態を、直接ＰＣＲの過程で検出することが可能であるから、続いて産生物の分析をする必要がない。

オリゴマーアレーの製造における従来の技術の概観は１９９９年１月のネイチャージェネティックスの特別版に記載がある（Nature Genetics特別版、21巻１９９９年１月）。そこで引用されている文献及び、米国特許５９９４０６５号には、非特異的背景信号での、オリゴヌクレオチドのような目的分子の 固体担体による製造方法が記載されている。

固定ＤＮＡアレーの調査には、多重蛍光マーカーを帯びたプローブが使用されている。特に、その都度、プローブの５'−ＯＨにＣy３及びＣy５色素を一回帯びさせた蛍光マーカーが好適である。二本鎖形成プローブの蛍光の検出は、例えば、コンフォカール顕微鏡を使用して行なわれる。Ｃy３及びＣy５色素は他の類似物と共に市販されている。

マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は分子生物学の解析において非常に有力な発展を齎した[Karas M、Hillenkamp F.１０，０００ダルトンを超える分子量の蛋白のレーザー脱離イオン化。Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20) : 2299〜301 ]。ある被分析物は光吸収性マトリックス中に埋め込まれる。短時間のレーザー照射によって、マトリックスが蒸発し、被分析分子は断片化せずに、ガス相に移行する。マトリックス分子の衝撃により、被分析物のイオン化が達成される。電圧をかけられてイオンが飛行管中へ加速される。分子量の差により、イオンは異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオンよりも早い時期に検出器に達する。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は蛋白質及びペプチドの解析（分析）にとりわけ優れている。核酸の分析用としてはやや難点がある[Gut、I. G. und Beck S. (1995)、DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147〜157 ]。核酸については、検出感度がペプチドの場合の１００倍も悪く、断片の衝撃が増えるに従がって、超比例的に減少する。骨格に多くの負電荷を有している核酸は、マトリックスによるイオン化が本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ではマトリックスの選択が、非常に重要な役割を演じる。
ペプチドの脱離には、非常に細かい結晶の、有用なマトリックスを使用することが発見された。ＤＮＡのためには、幾つかの請求項記載のマトリックスがあり、その使用によって、感度の差異は減少しない。感度の差異は、ＤＮＡをペプチッドに類似するように化学変化させることにより、減少させることができる。通常の骨格の燐酸塩が、チオ燐酸塩によって、置換されるところの、核酸リンチオエートは、簡単なアルキル化反応によって、電荷的に中性なＤＮＡに変換される[Gut I. G.und Beck S. (1995)、ＤＮＡの選択的アルキル化及び質量分析による検出法。Nucleic Acids Res. 23: 1367〜1373 ]。チャージタッグスのこの変化したＤＮＡへの結合は、ペプチドに見られるのと同じ程度の感度上昇を齎す。付加的なチャージタッギングの利点は、変化しない基質の検出を著しく困難にする不純物の分析安定性を高めることである。

ゲノムＤＮＡは標準的方法によって、細胞、組織または他の試料から得られる。
この標準的方法はフリッチェ及びマニアティスによる、分子クローン：研究手引１９８９年のような参考文献に載っている。

これまでの、各種のメチル化解析の方法は、従来技術に従がったものである。本発明は、もし、他の、配列が同じＤＮＡ断片が、他の元来のものと同時に存在するときは、従来の方法では、体液または血清中の調査するＤＮＡの増幅を達成できない、という問題を解決する。

調査するＤＮＡ及び他の下記のバックグラウンドＤＮＡで挙げられた核酸が、調査するＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡの間を区別する状態にないので、使用されたプライマーが、同様に増幅される。これらＤＮＡの区別の可能性は異なるメチル化型により生じた。従来の方法はメチル化感受性ＰＣＲ、短ＭＳＰである。[Herman JG、Graff JR、Myohanen S、Nelkin BD、Baylin SB (1996)、Methylation-specific PCR: CpG島のメチル化状態の新規なＰＣＲアッセイ。Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93 (18): 9821〜6]。これらの方法は、多くの部分的段階からなっている。先ず第一に、従来の技術に対応する重亜硫酸塩処理が行なわれ、この処理により、全てのシトシン塩基はウラシルに変化するが、一方、メチル化シトシン塩基（５−メチルシトシン）は変化せずそのままである。次の段階で、メチル化され、重亜硫酸塩で変化したＤＮＡに完全に、相補的であるプライマーのみが使用され、元々メチル化されていない、対応するＤＮＡには相補的でないものは使用されない。ＰＣＲの実施では、最終的に、元々メチル化されていたＤＮＡが増幅されるようなプライマーが使用される。それに対応する対策として、非メチル化ＤＮＡのみを増幅するプライマーを使用することが可能である。これらの方法で、解析すべきＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡが存在するときは、バックグラウンドＤＮＡのＣpＧ位置におけるメチル化状態に関して、区別される限り、最終的に、調査されるべきＤＮＡ断片が選択的に生成される。今や従来技術は、そのような、調査するＤＮＡ分子の検出からメチル化状態を逆推理するか、または、調査するＤＮＡの提示からメチル化状態を逆推理することが、例えば、腫瘍患者の血清中のＤＮＡ濃度が部分的に急激に上昇するので、例えば、患者の腫瘍の診断においては原理的に可能である。腫瘍由来のＤＮＡのみが、そのとき、バックグラウンドＤＮＡ近傍で検出される。その他の、体液中のＤＮＡの解析は原理的に比較可能である。

ここに述べられた、最も新しい従来技術と見なされる方法は、幾つかの問題点を有している。それは、例えば、調査するＤＮＡの、増幅された断片の検出可能性から、血清中に存在する量を決定することが不可能であることである。陽性の結果を得るには、僅かな量のＤＮＡで十分であり、それが利点であるが、例えば、腫瘍切除の効果を血清ＤＮＡで判断しようとすると、非常に問題点として働く。しかし、最大の問題点は、調査するＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡとを区別する唯一の手段であるメチル化の位置が多数存在することである。バックグラウンドＤＮＡが調査するＤＮＡから、当該ＣpＧ位置で、常時、１００%区別できることが知られていれば、誤りの陽性結果が得られるようなリスクを冒すことを望まないが、現存のＭＳＰ法が、そのときだけ実施されることが明らかである。それと対照的に、腫瘍組織においては典型的である、特定の位置が例えば、腫瘍細胞の９５%がメチル化されており、その腫瘍細胞には、他に、バックグラウンドＤＮＡが存在するが、そのメチル化率は５％であり、それで、鋳型ＤＮＡの定量化が原理的に、ＰＣＲによっては不可能であるが、更に努力すれば、達成され得るので、ＭＳＰ法によっては、情報に値するような結果が得られない。またこの発明はメチル化のタイプが、しばしば、特殊タイプ細胞、例えば、腫瘍のＤＮＡ断片中に存在するという知識に基づいている。

従来技術は、調査するＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡとを、後成的方法で発展させた方法を含んでいる。重亜硫酸塩処理後に、同等に増幅し、二本鎖形成された断片に含まれる前者のＣpＧ位置を、ミニシーケンシングまたは他の現時の方法を二者択一に使用して調べる。これは調査されるメチル化位置に関して、数量的形態が得られるという利点、即ち、多数のメチル化位置のメチル化度を決定することができ、この事実は例えば、強力な腫瘍の正確な分類を可能にする。この方法の不利な点は、バックグラウンドＤＮＡが、著しく優勢であり、調査するＤＮＡとともに、正確に増幅され、両者が混合物として、解析されるような場合には、正確な情報を供給できない点である。この問題は強力な腫瘍の解析にあるのではない。この腫瘍では、調査される物質が目的の方法で選別されるが、例えば、血清ＤＮＡの解析を困難にする。

本発明の目的は、従来技術の問題点を克服し、体液及び血清の検出に関する二つの方法の利点を結びつけることである。

課題は、以下の段階を実施して、ＤＮＡ試料中のシトシンのメチル化を検出する方法により解決される。
調査するＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ試料を、メチル化されないシトシン塩基はウラシルに変化させ、一方、５−メチルシトシン塩基は変化されずに、そのままであるように化学処理し、化学処理されたＤＮＡ試料は、少なくとも、二つのプライマーオリゴヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下に増幅し、このとき、バックグラウンドＤＮＡに対して、調査するＤＮＡを鋳型として優先させ、増幅産物を解析し、増幅産物の存在及び／または、付加的なジヌクレオチドの解析結果から、調査するＤＮＡにおけるメチル化状態を決定する。

本発明においてはＤＮＡ試料を各個人の血清または他の体液から得ることが好ましい。

更に、本発明においてはＤＮＡ試料を細胞系、血液、痰、尿、腎臓、血清、脳脊髄液；例えば、眼球、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓等のパラフィン包埋組織；組織スライド及びこれらの可能な組合わせから得ることが好ましい。

本発明においては、化学処理を重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）で実施することが特に好ましく、化学処理をＤＮＡをアガロースに包埋して行なうことが好ましい。化学処理を、二重鎖ＤＮＡ変性剤及び／またはラジカル捕捉剤の存在下に行なうことが更に好ましい。

第二段階の増幅が、一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドに結合する、少なくとも、付加的なオリゴヌクレオチドの一種またはＰＮＡオリゴマーの一種の存在下、行なわれ、その際、付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーが、優先的に、バックグラウンドＤＮＡに結合し、その増幅反応を阻害することが好ましい。

付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーのバックグラウンドＤＮＡへの、これらの結合位置が、プライマーのバックグラウンドＤＮＡへの結合位置と重複し、付加的なオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの、プライマーオリゴヌクレオチドのバックグラウンドＤＮＡへの結合を阻害することが特に好ましい。

少なくとも、二つの、付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーが組入れられ、その際、それらの結合位置が、再び、プライマーのバックグラウンドＤＮＡへの結合位置と重複し、付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーが、二つのプライマーオリゴヌクレオチドのバックグラウンドＤＮＡへの結合を阻害することが、また、特に好ましい。

付加的なオリゴヌクレオチド及びＰＮＡオリゴマーの一種がフォワードプライマーの結合を阻害し、一方、他方がリバースプライマーの結合を阻害することが特に好ましい。

付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーがプライマーオリゴヌクレオチドに比較して、少なくとも５倍の濃度であることが特に好ましい。

付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーがバックグラウンドＤＮＡに結合し、それによってポリメラーゼ反応におけるプライマーオリゴヌクレオチドの完全な伸長を阻害する、変化した本発明の方法が特に好ましい。このとき、使用されたポリメラーゼが５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を示さないことが、特に好ましく、更に、付加的なオリゴヌクレオチドがその５'末端で反応し、それによって、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの一種による著しい分解が起こされ得ない変法が特に好ましい。

更に、本発明においては、化学処理されたＤＮＡ試料が第二段階で、一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドで、二本鎖形成される、少なくとも二つのプライマーオリゴヌクレオチド及び付加的なオリゴヌクレオチド、または、一つのＰＮＡオリゴマー、及び一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドで、二本鎖形成される、少なくとも一つの、リポーターオリゴヌクレオチド、ならびに、増幅されるポリメラーゼの一種の使用下、付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーが優先的にバックグラウンドＤＮＡに結合し、その増幅を抑制し、リポーターオリゴヌクレオチドが優先的に調査するＤＮＡに結合し、その増幅を示すことが、本発明においては更に好ましい。その際、蛍光色素で標識化したオリゴマーをリポーターオリゴヌクレオチドに添加し、このオリゴマーは、直接リポーターオリゴヌクレオチドの近傍に二本鎖形成され、この蛍光による二本鎖形成が共鳴エネルギー転移を示すことが、好都合である。更にこのとき、TaqMan（登録商標名）アッセイが行なわれることが好都合であり、LightCycler（登録商標名）アッセイが行なわれることが好ましい。

更に、本発明においては、プライマーに添加して使用するオリゴヌクレオチドは３'−ＯＨ基を有しないことが好ましい。更に、リポーターオリゴヌクレオチドが、少なくとも、一つの蛍光標識を有することが好ましい。更に、リポーター分子が蛍光の増加または減少により、増幅を示すことが好ましい。このとき、蛍光の増加または減少を直接解析に使用し、蛍光信号から、解析すべきＤＮＡのメチル化状態を決定することが特に好ましい。

バックグラウンドＤＮＡの濃度が調査するＤＮＡの濃度の１００倍であることが好ましい。バックグラウンドＤＮＡの濃度が調査するＤＮＡの濃度の１０００倍であることが更に、好ましい。

解析または場合によっては、オリゴマーアレーの二本鎖形成による付加的な解析が為され、その際、オリゴマーは、核酸またはハイブリダイゼーション特性が類似するＰＮＡのような分子であることが、更に好ましい。

本発明においては、１２〜２２塩基長断片のオリゴマーを解析すべきＤＮＡに二本鎖形成し、該オリゴマーは、ＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含有することが好都合である。

解析すべきＤＮＡの、２０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することが好ましい。

解析すべきＤＮＡの、６０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することが、更に好ましい。

本発明においては、解析または増幅された、調査するＤＮＡの鎖長の測定による、付加的な解析が為され、その際、鎖長の測定方法が、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法を含有することが好ましい。その際、シーケンシングの方法が、サンガー法、マクサムギルバート法及びシーケンシングバイハイブリダイゼーション法（ＳＢＨ法）のような他の方法を含有することが好ましい。

ＣpＧ位置毎の、または、ＣpＧ位置の小グループのシーケンシングが、それぞれ別のプライマーオリゴヌクレオチドによって、実施され、プライマーの鎖長伸長がほんの一つまたは２〜３の少ない塩基で為され、プライマー鎖長伸長法から調査するＤＮＡにおける当該位置のメチル化状態が決定されるような、本発明の方法が好ましい。

種々の、調べられたＣpＧ位置におけるメチル化度から、疾病または患者の他の医療状態が推定されることが更に好ましい。

増幅産物自体が、検出のために、検出可能な標識を備えていることが好都合である。更に、標識が蛍光標識であること、及び／または、標識が放射性核種であること、及び／または、標識が質量分析計で検出される、分離可能な質量標識であることが好都合である。

増幅において、プライマーの一つが固相に結合していることが更に好ましい。

本発明においては、増幅産物が全て質量分析計で検出され、その質量によって、一義的に同定される。

本発明の付加的な対象は、本発明の方法を、患者または各個人にとって、好ましくない症状の診断及び／または予診のために使用することであり、その好ましくない症状は下記のカテゴリーの少なくとも一つに属する。
薬の副作用；癌；ＣＮＳ機能欠損、障害または疾病；攻撃的徴候または異常行動；脳障害による臨床的、心理的及び社会的帰結；精神異常及び人格異常；痴呆及び／または社会的徴候；心臓血管系疾患、その機能欠損及び傷害；胃腸の領域の機能欠損、傷害または疾病；呼吸器系の機能欠損、傷害または疾病；障害、炎症、感染、免役性及び／または回復期；発育期の偏向的な機能欠損、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織、または骨の機能欠損、傷害または疾病；内分泌系及び代謝系の機能欠損、傷害または疾病；頭痛または性的機能欠損。

細胞タイプまたは組織の区分または細胞分化の調査のための本発明の使用が好都合である。

本発明の対象は、重亜硫酸塩の一種を含有する薬剤、プライマー及び増幅産物製造のための３'−ＯＨ基を有しない他のオリゴヌクレオチド、ならびに、選択的に、本発明における一つのアッセイの実施のための手引書からなるキットである。

本発明はゲノムＤＮＡのメチル化状態の検出方法である。これまで知られた方法に対して、例えば、血清中のＤＮＡ断片の下位グループのＣpＧ位置の一揃いのメチル化状態が決められるので、診断に無関係なバックグラウンドＤＮＡの過剰量の存在下で解析が可能である。

このとき、好ましい本発明は以下に要約するような多数の段階からなる。
先ず、患者から血清及び／または他の体液が採取され、必要ならば、その中に存在するＤＮＡが分離される。次いで、第二段階で、化学処理が、好ましくは、重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）で実施される。このとき、例えば、メチル化されないシトシン塩基はウラシルに変化し、一方、メチル化シトシン塩基（５−メチルシトシン）は変化せずに、そのまま残る。第三段階で、増幅が実施され、調査するＤＮＡが増幅され、僅かな量のバックグラウンドＤＮＡは増幅されない。次いで、第四段階で、増幅された断片がそのメチル化符号に基づき解析され、増幅産物中の以前の多数のＣpＧ位置のメチル化度が決定される。第五段階で、多くの、調査されたＣpＧ位置のメチル化度から、患者の疾病または他の医療状態の実体が決定される。

本発明の本質は、二種類のＣpＧ位置が、一つの役割を演じ、同様に解析に貢献し、次いで、この二種類のＣpＧ位置が評価的位置及び分類的位置と命名されることである。評価的位置は増幅において、解析されるＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡを区別する働きをする。これは、技術的に、下記に詳述するように、異なる種類及び方法により為される。この位置の特性は、調査するＤＮＡのメチル化度が可能な限りバックグラウンドＤＮＡと異なり、増幅では、調査するＤＮＡが優先することである。分類的位置は、これと対照的に、調査するＤＮＡからよりも、増幅産物から、その都度、メチル化度について診断にとって重要な情報を引き出す働きをする。数百の分類的位置が解析のために使用され、そんなに多くはないが、例えば、オリゴマーアレーの解析に使用される。この場合、調査結果にとって重要な、一定の増幅産物が生成するのではなく、むしろ、同じ増幅産物におけるＣpＧ位置の解析が行なわれる。二、三の場合、増幅産物の生成から導かれる情報が解析に関係があることが確実、可能で、有意義であり、この場合は、二、三の位置が同等に分類的且つ評価的である。

本発明の方法の第一段階では、試料の入手では、例えば、痰または血清などの体液から採取するのが好ましく、明らかに、本発明の方法は、ここで、請求項以外で列挙される、異なる採取源からの多数の試料が使用可能である。

本発明の方法で、ゲノムＤＮＡはＤＮＡ試料から得られる。このＤＮＡ源は、例えば、細胞系、血液、痰、尿、腎臓、血清、脳脊髄液；例えば、眼球、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓等のパラフィン包埋組織；組織スライド及びこれらの可能な組合わせを含む。

重亜硫酸塩処理の幾つかの場合、重亜硫酸塩反応及び／または後続するＰＣＲの、過度の不純物による、阻害を避ける為に、ＤＮＡの清浄化と濃縮が行なわれる。例えば、処理後の組織からのＰＣＲは、例えば、プロテナーゼＫで、たちまち、清浄化が可能で、これは重亜硫酸塩処理及び後続するＰＣＲにとって重要であることが知られている。

化学的処理は好ましくは重亜硫酸塩処理（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）で行なわれ、更に好ましくは、重亜硫酸ナトリウム（重亜硫酸アンモニウムは好適度ではやや低い）で行なわれる。この方法の公知の変法によれば、反応の間、ＤＮＡを単鎖状に保持させるために、ＤＮＡをアガロースに包埋して行なうか、または、新変法では、ラジカル捕捉剤及び変性剤、好ましくはオリゴエチレングリコールジアルキルエーテル、または、例えば、ジオキサンの存在下行なう。ＰＣＲ反応の前に、反応剤はアガロース法の場合は、洗浄またはＤＮＡ清浄化法（従来技術、沈殿または固相膜への結合）で、除去されるか、または、簡単に、ＰＣＲが大きな影響を受けない程度の濃度範囲まで希釈される。

第三段階で、評価的位置が選別され、調査するＤＮＡの選択的増幅を許容する、好適な方法が選ばれる。位置の選別は、それがバックグラウンドＤＮＡと調査するＤＮＡの間で、それらのメチル化に関して、区別が十分可能であるという前提によって行なわれる。そのためには先ず、腫瘍及び健常者のバックグラウンドＤＮＡの遺伝子の、問題になる断片のメチル化の概観が決められる。腫瘍ＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡ（例えば血清中）の間の最大の差異を示す位置は、評価的位置として選別される。そのような位置は多くの遺伝子、例えば、GSTp１、HIC−１及びMGMTで既に公知である。[von Wronski MA、Harris LC、Tano K、Mitra S、Bigner DD、Brent TP. (1992) ヒト横紋筋肉腫細胞系及び異種移植片におけるシトシンメチル化及びO6-メチルグアニン-ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現の抑制。Oncol Res. ; 4(4〜5): 167〜74；Esteller M、Toyota M、Sanchez- Cespedes M、Capella G、Peinado MA、Watkins DN、Issa JP、 Sidransky D、Baylin SB、Herman JG. (2000)、ＤＮＡ修復遺伝子O6-メチルグアニン-ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの過メチル化による不活性化は結腸直腸の腫瘍形成のＫ−ラスにおける、ＧからＡへの突然変異に関係する。Cancer Res. May 1; 60 (9): 2368〜71]。調査するＤＮＡをこの評価的位置において、増幅するのに使用される、総じて好ましい、多数の方法がある。

我々にとっては、ＭＳＰに適合する反応、即ち、プライマーを使用し、完全に配列を増幅し、調査するＤＮＡに重亜硫酸塩処理後に適合するが、しかし、同様に処理されたバックグラウンドＤＮＡには適合しないような反応、を実施することが可能である。換言すれば、プライマーがＤＮＡ断片を増幅し、その断片には、一つまたは、多数の評価的位置が存在し、元のＤＮＡのメチル化状態が、調査するＤＮＡに特性的に、適応するときのみ、増幅が著しく行なわれ得るのである。原理的に簡単な変法である。これは（変法は）、評価的位置がＤＮＡ断片の一端または両端に存在せねばならず、即ち、分類的位置が評価的位置の間に存在せねばならぬという問題点を有している（または、一方に存在する評価的位置のみにおいて、後者が分類的位置の真中に存在する必要はない）。本発明は、好ましいことではあるが、このようなＭＳＰ変法を実施することは、評価的位置と分類的位置の分布が少ないケースでのみ、理想的であるので、それが使用されるケースが比較的少ないということから、出発している。原理的に簡単に実施されることが、ここでは好ましいとして、挙げられている。

その方法においては、プライマーが評価的位置と重複しないか、または、これを増幅し、ＰＣＲ増幅がむしろ、プライマーとして機能せず、評価的位置に結合する、少なくとも一つの、他の、オリゴヌクレオチドによって影響を受けるような、特に好ましい変法がある。

即ち、化学処理されたＤＮＡは原理的に、従来技術のように、二つのプライマーによって増幅される。二つのプライマーによって限定されているＤＮＡ断片内に、一つまたは多数の評価的位置が存在する。通常のＰＣＲに対して、これらの評価的位置に結合し、しかも、これらが、重亜硫酸塩処理前にメチル化または非メチル化されているとき選択的である、付加的なオリゴヌクレオチドが加えられる。調査するＤＮＡはその後、好ましくは、加えられたオリゴヌクレオチドがバックグラウンドＤＮＡの場合よりも、これらの評価的位置に結合するのが効果的でない場合に増幅される。換言すれば、加えられたオリゴヌクレオチドはバックグラウンドＤＮＡの増幅を選択的に妨害する。

これら加えられるオリゴヌクレオチドは、少なくとも、一つのＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含有する。これらは、更に、ＰＣＲ反応において加えられる、ポリメラーゼによって、それ自体が変化させられることはあり得ないという特性を有する。これは３'−デソキシオリゴヌクレオチドまたは３'−位置がその他の機能化されたオリゴヌクレオチド、例えば、３'−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドの添加によって惹起されるのが好ましい。更にこれらオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって分解されねばならぬ。これは好ましくは、ヌクレアーゼ活性欠如のポリメラーゼの使用、または、好ましくは、例えば、５'末端でチオエート架橋が示され、それ故、分解に対して抵抗性を示す。

更に、他の、特に好ましい変法は、オリゴヌクレオチドのような意味に即した、この実験で使用される、ＰＮＡ（ペプチド核酸）オリゴマーの使用である。
ＰＮＡオリゴマーはポリメラーゼで分解されず、また、これらによって伸長されもしない。それで、これらはこの変法にとって理想的に好適である。設計方法及びＤＮＡオリゴマーの合成法は従来技術である。

上述のように、多数の修飾部位及びバックグラウンドＤＮＡで示されるメチル化状態に特異的なオリゴヌクレオチドが、このような方法において使用される。

調査するＤＮＡの選択的増幅の後、公知の方法によって、多数の分類的部位のメチル化状態が決定される。

ＭＳＰにおいては、以下のように、修飾部位が、例えば、バックグラウンドＤＮＡにおいて、現実に１００％まで非メチル化で存在し、調査するＤＮＡでは、メチル化で、存在している状況である限り、この場合、個々の場合の、あるＰＣＲ断片自体の生成は、十分情報的価値があることは明らかである。もし、ＰＣＲにおいて、優先的に、非メチル化バックグラウンドＤＮＡから重亜硫酸塩処理で形成される配列に結合する、オリゴヌクレオチドを使用すれば、そのときは、少なくとも、調査するＤＮＡの少量と同じ長さのＰＣＲで、 たった一つの産物が形成される。これは診断のための個々の場合において、十分であり、ＭＳＰのそれに類似する性質を有する方法を含んでいる。そのような手法は、好ましいものではないが、未だ、殆ど知られておらず、結果として、本発明の目的に属するものと見なされる。

幾つかの断片が同時に、例えば、多重ＰＣＲが行なわれるＰＣＲ反応で産生されることが好ましい。その設計においてはプライマーだけではなく、付加的に使用されているオリゴヌクレオチドも互いに相補的であってはならない。他方、高度な多重化は、この場合、通常の場合より更に困難である。しかも、亜硫酸塩処理の場合、二本鎖ＤＮＡの異なるＧ及びＣの含有量に基づく、フォワードプライマーもリバースプライマーも全く機能しない。この事実で、多重化が達成され、本質的に不利な点を補償する。

最も簡明な場合では、生成断片が検出される。分類的オリゴヌクレオチドを解析せずに、ゲル電気泳動法、シーケンシング、液体クロマトグラフィーまたはハイブリダイゼーションのような、全ての、可能な公知の分子生物学的検出手法が考えられ得る。
前記の方法の各段階の特性制御が考えられ得る。上記のように、分類的位置のメチル化度の後続の解析は特に好ましい。

調査するＤＮＡの、分類的オリゴヌクレオチドの検出技術を内容とする前記、有益な方法による、好ましい増幅を組合わせる多数の可能性が存在する。

特に好適な検出技術はオリゴマーアレーの二本鎖形成及び例えば、プライマー伸長（ミニシーケンシング）反応である。オリゴマーアレーの二本鎖形成は最新の従来技術に対向するプロトコルの即時変化が使用され得る（Olek A、Olek S、Walter J; WO-Patent 9928498）。しかし、それによって、元の非メチル化ＣpＧ（分類的位置）を含むＤＮＡ断片を二本鎖形成し、対応する断片を二本鎖形成し、その都度、重亜硫酸塩処理及び増幅の前に、その中に、元のメチル化ＣpＧが含まれている、固相に固定されている、オリゴヌクレオチドの塩基対からなる、オリゴマーの一つのアレーを二本鎖形成することが好ましい。この場合、特に、増幅産物または蛍光または放射性核種または分離可能な質量標識を付された増幅産物が好ましく、それで、二本鎖形成後に塩基対の二つのオリゴヌクレオチドに結合した断片をこれらのマーカーによって検出し、定量化することができる。例えば、完全にメチル化されたまたは非メチル化ＤＮＡによる実験の測定値によって、分類的位置のメチル化度を決定できるような強度比が得られる。そのようなオリゴマーアレー（図１）に基づき多数の断片及び分類的位置が同時に検出される。解析で得られた調査するＤＮＡに対するバックグラウンドＤＮＡの比が決定され得るので、アレーが分類的位置を検出するオリゴマーを実験の制御のために含むことは、有意義であり、且つ、好ましい。

プライマー伸長反応は固相に固定されたオリゴヌクレオチド上で行なわれる。
差し迫って必要ではないが、このプライマーの固定は、規定内で、多くの増幅産物中の多数の分類的位置が調査され、これが固相上で、一つのオリゴマーアレーに、容易に、一つの実験で実施可能である。プライマーが直接分類的位置の隣りにあり、伸長が、ただ、一つのヌクレオチドのために行なわれることが、特に好ましい。単に、ジデソキシチミジン及びジデソキシシチジンがヌクレオチドとして加えられ、これらが、その都度、異なる蛍光色素で標識され、このとき、勿論、他の、質量標識のような、識別可能な標識が考えられ、且つ、これが好適なことが特に好ましい。重亜硫酸塩処理及び増幅後、これより前のメチル化ＣＧがＣＧとして、非メチル化ＣＧがＴＧとして存在する。それ故、プライマー伸長反応はジデソキシシチジンまたはジデソキシチミジンの組入れを行なう。これら二つの末端形成体について、検出された蛍光標識の関係から、その都度の位置のメチル化度が決定される。グアニン誘導体なしで、ＴＧまたはＣＧ配列で、既に、一つの塩基の後に、これによって、プライマー伸長が完了するときは、この場合、ジデソキシシチジン及びジデソキシチミジンによるプライマー伸長を実施することが可能であり、好ましい。ジデソキシ−ＡＴＰ及びジデソキシ−ＧＴＰまたはそれらの誘導体に対応して、ＣＡ及びＣＧ類似体の識別による対向鎖の解析を実施することは同様に好ましい。

しかし、本発明の特に好ましい変法は、一つの実験で、評価的位置及び分類的位置を同時に検出することである。これはタクマン（Taqman）またはLightCycler技術変法を使用することによって達成される。このとき、調査するＤＮＡの好ましい増幅を惹起するオリゴヌクレオチドへ、他の蛍光標識されたオリゴヌクレオチドが添加され、ＰＣＲ反応の間、蛍光物質の変化が測定される。このとき、主として、調査するＤＮＡが増幅されるので、この蛍光物質の変化から、直接、異なる分類的ＣpＧ位置のメチル化状態に関する情報が優先的に得られる。異なるオリゴヌクレオチドが異なる蛍光色素を有しているので、ＰＣＲの間の蛍光物質の変化は異なる位置毎に分離可能である。

メチル化状態に依存するこの蛍光物質を変化させることは、多数の方法により達成可能であり、そのうちの二つはここで例示される。

化学的処理によって、対応する位置が非メチル化されているＤＮＡから生成する配列に特異的に結合するか、または、化学的処理によって、対応する位置がメチル化されているＤＮＡから生成する、対応する配列に結合するオリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。これらのプローブは特に、消光及び標識として機能する二つの蛍光色素を帯びている。両者は同じオリゴヌクレオチドに結合する。今、調査するＤＮＡとのＰＣＲ反応が行なわれれば、ＰＣＲ反応は蛍光標識されたオリゴプローブによってブロックされる。これらがポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を持たないならば、非結合プローブはポリメラーゼによって分解されないので、鋳型ＤＮＡに結合するプローブの、鋳型ヘのプローブの結合効果に相関関係を有しない、分解がＰＣＲ反応の間に起こる。プローブの分解は、消光色素及び標識として機能する蛍光色素が互いに分離していること、及び、標識色素の蛍光物質の増加によって、直接、視覚で捕らえ得る。原理的に、ここでは、所謂タクマンアッセイの変法が重要である。

測定物は調査するＤＮＡからの生成ＰＣＲ産物である。しかし、もし、調査される分類的位置がメチル化状態の中に存在するときに限り、化学的処理されたＤＮＡへの二本鎖形成によって、試料を検出できる。
他のメチル化状態の対応する分類的位置に結合する、プローブ含有対照試料はそれ故、目的に適い、且つ、好ましい。

プローブを区別し、それによって、多重化を達成するために、異なる放出波長を有する異なる蛍光染料は数種のプローブに、まとめて消光体と共に使用されるのが好ましい。

このようなアッセイにおいては、評価的位置に結合し、バックグラウンドＤＮＡの著しい増幅を阻害する、オリゴヌクレオチドが使用される。調査するＤＮＡの増幅は、同じ位置が一つのプローブによって上記のように調べられ、増幅が評価的位置に結合するプローブによって検出されるように、解析され得る。この場合、分解しないオリゴヌクレオチドを選択的に、バックグラウンドＤＮＡに結合させ、一方、蛍光標識を帯びたプローブを調査するＤＮＡに結合させることが特に好ましい。本発明の特に好ましい変法においては、プローブ及び好ましくは一つであって、二つを超えない、核塩基を有する分解しないオリゴヌクレオチドが、同じ配列を示すことが特に好ましい。

本発明の特に好ましい変法では、多数のメチル化可能な位置が評価的位置として定義され、これらの位置に、少なくとも一つの、好ましくは、バックグラウンドＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドならびに一つのプローブが使用される。この場合、バックグラウンドＤＮＡの増幅が多数のオリゴヌクレオチドによって抑制され、この方法は、特に、バックグラウンドＤＮＡの過剰量が調査するＤＮＡに対して、特に大きいことが好適である。多くの場合、この変法及び一つの断片の多くの評価的位置の提示において、今日では、意のままに行なうことができる器具による、多くの異なる色素（４〜５以下）の同時検出を任意にはできないので、分類的位置の付加的な調査は不要である。付加的な分類的位置の調査が他の上記の検出技術の一つによって行なわれることが好ましい。

一つのプローブで、多くの位置のメチル化度を同時に調査できることが好ましい。

メチル化状態の正確な定量化が望まれるならば、異なる色素を含む、二つの互いに競合する、プローブが組入れられ得ることが好ましい。このとき、一つは、調査するＤＮＡにおける非メチル化位置の場合に、他の一つは、逆に、メチル化位置の場合に、結合するのが好ましい。異なる両色素の蛍光物質の増量の関係から、調査される位置のメチル化度が決定される。

ＰＣＲの間に、蛍光物質の変化が起こる、基本的に異なる本発明の方法は、LightCycler技術として知られている。このとき、もし、これらが、直接、近くに存在すれば、即ち、１〜５ヌクレオチドだけ互いに離れていれば、このとき、二つの色素間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こり得る。そのとき、２番目の色素は、最初の色素の放出によって、刺激され、他の一つの波長の光が放射され、それが検出される。

当面のメチル化解析の場合において、分類的位置の当該化学的処理されたＤＮＡの蛍光標識されたプローブの二本鎖形成が行なわれ、このプローブの結合は、この位置での調査するＤＮＡが、メチル化されているか、メチル化されていないかに依存している。このプローブに直接隣接する他の蛍光色素を帯びた、他のプローブが存在する。この結合は当該配列断片において、他のメチル化可能な位置が存在すれば、メチル化に依存して行なわれる。一方、増幅は、今や、ＤＮＡを増加させ、益々多くの蛍光標識されたプローブが当該位置に隣接して、結合し、これらの、それにとって必須のメチル化状態が示される限り、それ故、増加するＦＲＥＴが測定される。

この方法においては、多数の異なる蛍光標識化された多重化が行なわれることが好ましい。

ここでは、また、評価的位置が測定されることが可能であり、好ましい。当該位置のバックグラウンドＤＮＡが非メチル化状態であり、化学的処理及び増幅後に、一つのＴＧジヌクレオチドが、この位置にあることが明らかになり、これに対して、メチル化された調査するＤＮＡには一つのＣＧジヌクレオチドが存在することが、推定され、蛍光標識プローブがＣＧ含有配列に結合し、一方、標識されていない、競合しない、オリゴマーがバックグラウンドＤＮＡの対応するＴＧ配列に結合する。

このとき、非メチル化オリゴヌクレオチドが、より短いプローブオリゴヌクレオチドに比較して、その明らかに高い融点に基づき、増幅を阻害することが、重要である。この場合、プローブ及び化学処理されたバックグラウンドＤＮＡに結合したオリゴマーが少数の塩基について、同一でない限り、これらは本質的に（５〜１５塩基だけ）長い。また、この場合、ＰＣＲにおける伸長を回避するために、全てのプローブ及びオリゴヌクレオチドはプライマーの３'末端で封鎖される。これは例えば、フォスフェートグループと共に行なわれる。

両方法は結果として、主として、ある場合には蛍光物質の測定値が減少し、他の場合には、測定値が増加するする点で、区別される。両者の場合、評価的位置でも分類的位置でも測定することができる。

本発明を要約すると、ＤＮＡ試料におけるシトシンのメチル化を検出する方法が特に好ましい。この方法においては、以下の各段階が実施される。
第一に、調査するＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン塩基はウラシルに変化させ、一方、５−メチルシトシン塩基は変化させずに、そのまま残るように、化学的処理し、化学的処理されたＤＮＡ試料は、少なくとも、二つのプライマーオリゴヌクレオチド及び一種のポリメラーゼの存在下に増幅し、このとき、バックグラウンドＤＮＡに対して、調査するＤＮＡを鋳型として優先させ、次いで、増幅産物を解析し、得られた一つの増幅産物及び／または付加的な位置の解析結果から、調査するＤＮＡにおけるメチル化状態を推定する。

特に好ましい本発明の変法においては、ＤＮＡ試料は各個体の血清または他の体液から得られる。同様にして、ＤＮＡ試料は細胞系、血液、痰、尿、腎臓、血清、脳脊髄液；例えば、眼球、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓等のパラフィン包埋組織；組織スライド及びこれらの可能な組合わせから得られる。

特に好ましい本発明の変法は、化学処理が重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）によって実施される。化学処理が、ＤＮＡをアガロースに包埋して行なわれることが好ましい。化学処理において、二重鎖ＤＮＡ変性剤及び／またはラジカル捕捉剤が添加されることが好ましい。

特に好ましい本発明の変法は、第二段階の増幅が、一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドに結合し、その際、付加的なオリゴヌクレオチドが、優先的に、バックグラウンドＤＮＡに結合し、その増幅反応を阻害するような、少なくとも一つの付加的なオリゴヌクレオチドの存在下に実施される。

第二段階で化学処理されたＤＮＡ試料が、少なくとも二つのプライマーオリゴヌクレオチド、及び、一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドで、二本鎖形成される、付加的なオリゴヌクレオチド、及び、一つの５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは一つの５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドで、二本鎖形成される、少なくとも一つの、リポーターオリゴヌクレオチド、及び、一種のポリメラーゼで増幅され、その際、付加的なオリゴヌクレオチドが優先的にバックグラウンドＤＮＡに結合し、その増幅を抑制し、その際、リポーターオリゴヌクレオチドが優先的に調査するＤＮＡに結合し、その増幅を明示することが好ましい。

付加的な一つの蛍光色素で標識化された、直接、リポーターオリゴヌクレオチドの近傍に二本鎖形成され、この蛍光による二本鎖形成が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により、検出されるオリゴマーをリポーターオリゴヌクレオチドに添加することが好ましい。

解析のためにTaqmanアッセイが行なわれることが好ましい。同様に、LightCycler（前記のように）が行なわれることが好ましい。

付加的にプライマーに使用されるオリゴヌクレオチドが３'−ＯＨ基を有しないことが特に好ましい。

リポーター分子が蛍光の増加または減少により、増幅を告知し、蛍光の増加または減少を直接、解析に使用し、蛍光信号から、解析すべきＤＮＡのメチル化状態を決定することが特に好ましい。

本発明の特に好ましい変法においては、解析または他のオリゴマーアレーへの二本鎖形成による解析が為され、その際、オリゴマー核酸、または、その二本鎖形成の特性がＰＮＡに類似する分子が存在し得る。１２〜２２塩基長断片のオリゴマーが、解析すべきＤＮＡを二本鎖形成し、これが各々一つのＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含有することが好ましい。この方法によって、解析すべきＤＮＡの、２０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することが好ましく、解析すべきＤＮＡの、６０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することが特に好ましい。

本発明においては、増幅され、調査するＤＮＡの鎖長の測定による、付加的な解析が為され、その際、鎖長の測定方法が、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法を含有することが特に好ましい。

本発明においては、シーケンシングによる付加的な解析が為され、その際、シーケンシングの方法が、サンガー法、マクサムギルバート法及びシーケンシングバイハイブリダイゼーション法（ＳＢＨ法）のような他の方法を含有することが特に好ましい。また、ＣpＧ位置毎、または、ＣpＧ位置の小グループのシーケンシング（サンガー法による）が、それぞれ別のプライマーオリゴヌクレオチドによって、実施され、プライマーの鎖伸長がほんの一つまたは２〜３の少ない塩基で為され、プライマー鎖伸長法から調査するＤＮＡにおける当該位置のメチル化状態が推定されることが好ましい。

本発明の特に好ましい変法においては、種々の、調査されたＣpＧ位置におけるメチル化度から、疾病、または、患者の他の医療状態が推定される。

増幅産物自体が、検出のために、検出可能な標識を備えていることが特に好ましい。この標識においては、蛍光標識、放射性核種、質量分析計で検出される、分離可能な質量標識であることが重要である。

更に、増幅において、プライマーの一つが固相に結合していることが好ましい。

本発明の変法においては、増幅産物全体が質量分析計で検出され、それによりその質量で一義的に決定されることが好ましい。

本発明の付加的な対象は、患者または各個人にとって、好ましくない症状の診断及び／または予診のための、前記方法の使用であり、その際、これらの好ましくない症状は下記のカテゴリーの少なくとも一つに属する。
薬の副作用；癌；ＣＮＳ機能欠損、障害または疾病；攻撃的徴候または異常行動；脳障害による臨床的、心理的及び社会的帰結；精神異常及び人格異常；痴呆及び／または社会的徴候；心臓血管系疾患、その機能欠損及び傷害；胃腸の領域の機能欠損、傷害または疾病；呼吸器系の機能欠損、傷害または疾病；障害、炎症、感染、免役性及び／または回復期；発育期の偏向的な機能欠損、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織、または骨の機能欠損、傷害または疾病；内分泌系及び代謝系の機能欠損、傷害または疾病；頭痛または性的機能欠損。

細胞タイプまたは組織の区分または細胞分化のための調査に、本発明の方法を使用することが好ましい。

本発明の付加的な使用は、重亜硫酸塩の一種を含有する薬剤、プライマー及び増幅産物製造のための３'−ＯＨ基を有しない他のオリゴヌクレオチド、ならびに、選択的に、少なくとも、前記本発明の変法の一つの実施のための手引書を含むキットである。

下記の実施例は本発明を解説するものである。

（実施例１）
ＭＤＲ１遺伝子におけるＰＮＡブロックキング試料（ＰＣＲクランピング）の使用下の、ＭＤＲ１遺伝子のメチル化感受性増幅。
a)その結合位置がプライマーのそれと重複せず、且つ、ＰＮＡプローブ（ＰＮＡブロッキング試料）によるメチル化特異性ＰＣＲ
先ず、重亜硫酸塩処理のためのＰＣＲの条件が定義され、その条件下に、ＰＮＡブロックキング試料の一つの対立遺伝子特異性のＰＣＲに対する影響を認識する。この最初の実験で、ＰＮＡ及びプライマー間の結合位置は重複しない。

先ず、配列ＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴの１１量体ＰＮＡプライマーの影響が、プライマーＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧ及びＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣによるＰＣＲにおいて試験された。ＰＣＲ反応におけるＰＮＡの影響はＰＣＲの標準的条件下に５５℃のアニール温度では測定不能である。ＭＤＲ１断片の増幅のために使用された標準サイクラープログラムには、下記のプログラム段階が使用された。
段階１：Ｔ＝９６℃、２０分；段階２：Ｔ＝９６℃、３０秒；段階３：Ｔ＝５６℃、１．１５分；段階４：Ｔ＝７２℃、２．００分；
段階２〜４までは、４０回サイクルで行なわれる。段階５：Ｔ＝７２℃、１５分；段階６：４℃まで冷却し、この温度を保持する。
この結果、増幅の一つの対立遺伝子特異性の抑制を達成するためにプライマー鎖長はアニール温度及びＰＮＡ試料の鎖長に、通常、適合させられねばならぬ。

プライマーとＰＮＡに一つの通常のアニールを可能にするために、ＰＣＲ反応で、短い２１量体の鎖長を超えるプライマーＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴ及びＡＡＴＣＣＣＣＡＴＡＡＡＣＴＴＡＣＣＡＡＡが他のより長い１３量体の鎖長のＰＮＡのＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＡＴで試験される。付加的な試験は、上記配列が、塩基が３'末端で抜け落ちていることによってのみ区別される、１８、１９及び２０量体の鎖長のプライマーで実施される。２１量体の鎖長のプライマーはアニール温度変化度によって試験された。同時の開始点で、１３量体の鎖長の配列ＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＡＴのＰＮＡがそれぞれ、非メチル化対立遺伝子由来の配列に適合する配列ＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＴＡＴのＰＮＡに異なる濃度２０〜１００pmol/μlで添加される。ＰＣＲに対する明確な影響はアニール温度４９．４℃及び４６．７℃で、ＰＮＡの追加濃度７０および１００pmol/μlの添加で、観察される。効果は１８量体プライマーの使用で最も明確であった。

さて、５４℃という低い伸長温度で、どの程度ＰＮＡsへの阻害影響があるかが調査された。
ここでは、ＰＣＲの開始に、前記１３量体ＰＮＡまたは二つの１３量体ＰＮＡを同時に、５０〜７０pmol/μlの濃度で添加する。
観察されることは、ＰＮＡなしでの陽性制御に比べての、ＰＣＲの明確な抑制である（図２、アガロース電気泳動法、使用される１３量体ＰＮＡプローブに対するＰＮＡの濃度；注釈：ＭＤＲ１−５ＦＭ：１３量体ＰＮＡ、ＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＡＴ；ＭＤＲ１−５ＦＵ：１３量体ＰＮＡ、ＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＴＡＴ）。試験は、試験で使用されるＤＮＡの当該位置が圧倒的に非メチル化状態であり、そのことは重亜硫酸塩シーケンシングにより証明できることを示す。これら実験で、既に、非メチル化断片の好ましい増幅となる、ＰＮＡブロッキング試料の明確な対立遺伝子特異性が明示され得る。

b)その結合位置がプライマーのそれと重複する（プライマー排斥）、ＰＮＡプローブによるメチル化特異性ＰＣＲ（ＰＮＡブロッキング試料）。
上記実験では、プライマーはＰＮＡ目的配列が増幅される範囲の中央に確実に存在するように、選択された。もし、プライマー配列及びＰＮＡ配列は相互に限定されるかまたは重複していれば、その位置はより感受性の高いものであろう。ＰＮＡの配列特異性結合では、この配列で、既に、僅かのＰＮＡ濃度でみられたＰＮＡの効果が観察される。

それがＰＮＡ配列と重複する（プライマー排斥）、この実験には配列がＴＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＡＧであるプライマーが選択される。反応の最初に、二つの１３量体ＰＮＡである、ＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＡＴとＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＴＡＴが、３種類の濃度で添加される。
ＰＣＲ反応の完全な抑制は、既に、濃度２５pmol/μlで達成された。既に行なわれた実験では、ＰＣＲの完全な抑制が、二つのＰＮＡsの添加濃度７０pmol/μlで達成されることが知られている。

c)非メチル化ＤＮＡに対応しない断片によるプライマー排斥
配列特異性結合の検出のために、付加的な実験で、メチル化状態に関して、よく特徴を表している鋳型に対するＰＮＡの影響力が調べられた。この実験のために使用された鋳型ＤＮＡは重亜硫酸塩処理され、完全な非メチル化ＤＮＡに対応する。
これらは鋳型としてＰＣＲに添加された。そのために、下記のプログラム段階が使用された。
段階１：Ｔ＝９６℃、２０分；段階２：Ｔ＝９６℃、３０秒；段階３：Ｔ＝４９℃、１．１５分；段階４：Ｔ＝５４℃、２．００分；
段階２〜４までは、３６回サイクルで行なわれる。段階５：Ｔ＝７２℃、１５分；段階６：４℃まで冷却し、この温度を保持する。
反応の最初に、前記の１３量体が３種類の濃度で添加された。この非メチル化鋳型の場合、この鋳型に適合するＰＮＡのＭＤＲ１−５−ＦＵ（３）が明確に、ＭＤＲ１−５−ＦＭより強力な影響力を有することが期待される。図３（注解、図２参照）には、比較的低濃度のＰＮＡの場合が示されている。

この結果、ＰＣＲ反応に対する抑制は特異的に結合するＰＮＡメチル化特異性増幅によって可能であることを示す。ＭＤＲ１に相補的でないＰＮＡによる対照実験では、この重要な影響力、考慮の対象になる濃度で、ＰＣＲには及ばないことが示され得た（図示されない）。

（実施例２）
ＧＳＴp１遺伝子の断片のメチル化感受性増幅
ＧＳＴp１遺伝子の特定のＣpＧ位置は前立腺癌の腫瘍標識として同定される。
実験のために選択されたプライマー対としてのＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴ及びＴＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＣＡＴでは、一つのプライマーが、ＰＮＡ配列のＣＣＣＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧ（または、ＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧ）と厳密に隣接するように存在する。ＰＮＡ配列はＭＤＲ１断片に使用されるＰＮＡとは異なり、三つの重要なＣpＧ位置を含有する。ＧＳＴp１断片の、調査される重要なＣpＧは正常の、即ち、腫瘍患者由来ではないＤＮＡとして非メチル化である。反応開始時に、添加される、配列ＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧであるＰＮＡのＧＳＴＰダウンは、それ故、ＰＣＲ反応に対する認識可能な影響を有し、しかし、対応する配列ＣＣＣＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧであるＰＮＡのＧＳＴＰアップは影響を有さない。試験開始時にＰＮＡのＧＳＴＰダウンは、三種類の濃度で添加される。アニール温度の勾配（変化度）が試験される。

実験の結果は図４に示されている。ＰＮＡ（ＧＳＴＰダウン）の添加によるＣＲの最も強力な抑制はアニール温度５５℃で実現することができる。陽性（ポジティブ）対照（ＰＮＡの追加なし）との比較から、ＰＣＲ反応が濃度２０pmol/μlのＰＮＡの追加によって、著しく抑制されることが解る。

続いて、配列特異性（それによって、最終的にはメチル化感受性）結合を検出するために、最初の試料の非メチル化ＤＮＡ及び前立腺腫瘍組織由来のメチル化ＤＮＡＰＮの増幅に対する、ＰＮＡのＧＳＴＰアップ及びＧＳＴＰダウンの影響が鋳型として対比させられる。
非メチル化ＤＮＡ及び前立腺ＤＮＡは鋳型としてＰＣＲに添加される。反応の
開始点で、ＰＮＡのＧＳＴＰアップ及びＧＳＴＰダウンが、３種類の濃度で添加された。

ＰＮＡのＧＳＴＰダウンを添加すると、ダウンメチル化鋳型へ明瞭な影響を及ぼす。即ち、ＰＣＲはＰＮＡの添加濃度７０pmol/μlで、完全に抑制される。それに対して、ＰＮＡのＧＳＴＰアップの添加では、ＰＣＲに対するＰＮＡの影響は弱く、且つ、阻害的である。

ＰＮＡのＧＳＴＰアップの前立腺組織の被試験ＤＮＡへの添加は、ＰＣＲヘの強い阻害的影響を与える（図５）。ＰＮＡの濃度７０pmol/μlの添加ＰＣＲを明確に抑制する。ＰＣＲの完全な抑制はＰＮＡ濃度５０pmol/μlで確認され得る。それに対して、ＰＮＡのＧＳＴＰダウンを前立腺ＤＮＡに添加すると、影響がそれより明確に弱い。ＰＮＡの濃度７０pmol/μlの添加では、ＰＣＲは完全には抑制されない。

実験ブロックされたオリゴマープローブにより選択的に、一定の位置がメチル化または非メチル化された対立遺伝子を増幅することが可能であることを示す。本発明の内容において、当該位置が評価的位置として働く、即ち、バックグラウンドＤＮＡの望ましくないメチル化鋳型の増幅が選択的に抑制される。

ＧＳＴＰ１遺伝子の例における、メチル化特異的にＰＣＲを抑制するプローブの使用における複数の可能性
図６においては、与えられた鋳型配列において、メチル化感受性増幅の考えで、プライマーが配列される、多数の可能性が示される。解説のために、図６aは重亜硫酸塩処理による鋳型が示され、ＤＮＡ１は最初のメチル化ＤＮＡ試料に対応し、ＤＮＡ２は最初の非メチル化ＤＮＡ試料に対応する。
図６bは対立遺伝子特異性ＰＣＲまたはメチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）の思考によるプライマーの一つの配列を示す。この場合、メチル化ＤＮＡ１の増幅が図示されるプライマーの使用下に行なわれ得る。

図６c及び６dは、非メチル化特異性プライマーに対応して、添加される状態を示し、変性した位置の使用による場合（６c）、または、一般的な塩基（ここではイノシン）が図６dで示される。

図７は、与えられた、鋳型配列プライマー及びプローブ（ブロッカー）が、メチル化感受性増幅の思考で配列される様子を示す。この例では、使用されたプライマーはそれ自体、メチル化特異性ではなく、メチル化特異性はプローブ（ブロッカー）によってのみ達成される。ＤＮＡ１及びＤＮＡ２には、特異性プローブがブロッカーとして使用される。

図７aでは、プライマーとプローブは重複しないで、プローブは直接プライマーの３'末端を閉じる。図示されるプローブは、増幅では自体は伸長され得ない、３'末端が変性されたオリゴヌクレオチドである。この例で融点に対応する短い、ＰＮＡも使用され得る。図７bではここでは、ＤＮＡプローブがプライマーと重複しないが、同じプライマーが使用される（プライマー排斥）。

図７c及び７dでは、変性された位置に存在するプライマー及びメチル化特異性プローブが重複する。類似体は使用されるプライマーにおける一般的塩基である。

図８には、何れのプライマーとも重複しない、プローブが使用されている、フォワード及びリバースプライマーの類似例が示されている。

これらの例は、解析されるＤＮＡに対してバックグラウンドＤＮＡを抑制するために、メチル化特異性増幅に使用され得るオリゴマープローブの多数の具体的可能性を示す。本発明の範囲はここで例示される実施例によって限定されない。

（実施例４）
非メチル化及びメチル化ＤＮＡの製造及び重亜硫酸塩処理
メチル化ＤＮＡの製造のため、ヒトゲノムＤＮＡを、Ｓ−アデノシルメチオン及びＣpＧメチラーゼ（SssI、New England Biolabs）で、製造者の指図書にしたがって処理した。非メチル化ＤＮＡの製造のため、遺伝子断片ＥＬＫ−１を、ヒトゲノムＤＮＡ由来のプライマーであるＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＡＡＣＣＧＴＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：１）及びＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧ
（ＳＥＱ−ＩＤ：２）で、ＰＣＲによって増幅した。このようにして製造された非メチル化及びメチル化ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡと同様にして、重亜硫酸塩
（亜硫酸水素塩、重亜硫酸塩）の存在下、全ての塩基の５位置がメチル化されないシトシンは、塩基対挙動が異なる塩基となるように処理され、一方、塩基の５位置がメチル化されたシトシン変化せずそのまま残るように処理される。この反応には、重亜硫酸塩は０．１Mol〜６Mol濃度範囲で使用され、非メチル化シトシン塩基に付加される。化学処理は、変性剤またはラジカル捕捉剤のような溶剤を添加して行なわれる。最後にアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシン核塩基がウラシルに変化する。この変化したＤＮＡはメチル化シトシンの検出に使用される。

（実施例５）
Ｃy５で標識された遺伝子プローブの製造
重亜硫酸塩処理ＤＮＡ試料から出発して、ＥＬＫ−１遺伝子のプロモーター範囲由来の５９５塩基長の限定断片が増幅される。増幅はプライマーオリゴヌクレオチドのＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ（ＳＥＱ−ＩＤ：３）及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ（ＳＥＱ−ＩＤ：４）によって行なわれる。蛍光色素Ｃy５で標識されたプライマーオリゴヌクレオチドの使用により、断片は直接ＰＣＲ時に標識される。マトリックスＤＮＡとして、重亜硫酸塩処理（１）非メチル化、（２）メチル化及び（３）ヒトゲノムＤＮＡが使用される。最後に、これら、各々異なる二本鎖形成による、異なる３種のＤＮＡ断片が、特異的ＣpＧ位置におけるメチル化度について調べられる。

（実施例６）
二本鎖形成の実施及び二本鎖形成ＤＮＡチップの測定
実施例５で製造された遺伝子プローブはＤＮＡチップに二本鎖形成される。チップ上には、前以って、オリゴヌクレオチドが固定される。オリゴヌクレオチド配列は実施例２で挙げられた、ＥＬＫ−１遺伝子の増幅された断片から導かれ、直接周辺に挿入される、ＣＧジヌクレオチドを代表する。オリゴヌクレオチドの鎖長は１４〜２２であり、そのオリゴヌクレオチド内のＣＧジヌクレオチドの位置は変化する。二本鎖形成の後、ＤＮＡチップはスキャンされ（図１参照）、ハイブリッド信号は数値として測定される（データは示されていない）。オリゴヌクレオチドの二本鎖形成の結果、即ち、ＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：５）及びＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：６）が図１に示される。ここで、増幅産物１０３位置に存在する、ＥＬＫ−１断片のシトシンが、もし、メチル化されていれば、ＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：５）が優先的に二本鎖形成され、もし、このシトシンが非メチル化であれば、ＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：６）が優先的に二本鎖形成される。

図１には、プロモーター断片により、二本鎖形成された一つのチップが示される。スキャナーによるため、実際のものとは異なる表示がされている。ここに示された黒〜白の画像とは異なりスキャナーでは一色の画像になる。複数の色の強度は二本鎖形成の程度を表している。このとき、二本鎖形成度は赤（図１では、明るいスポットとして認識される）から、ブルー（図１では、薄ぐらいスポットとして認識される）まで減少する。

（実施例７）
鋳型ＤＮＡの製造及びＧＳＴp1ＰＣＲの創造
鋳型ＤＮＡとしてヒト末梢血液から採取されたＤＮＡが使用され、無処理で、試験管中で、重亜硫酸塩処理の一種を伴う、酵素的メチル化を施される。全てのＣＧジヌクレオチドのメチル化が、ＤＮＡの６μｇが反応液１５０μｌ中に加えられ、SssI（New England Biolabs、Frankfurt/Main）と共にメーカーの手引書にしたがって、行なわれた。重亜硫酸塩処理は公知の方法により行なわれた[Olek A、Oswald J、Walter J. 変化し、且つ、改善された、重亜硫酸塩ベースのシトシンメチル化解析法。Nucleic Acids Res. 1996 Dec. 15; 24（24）: 5064〜6]。

１５３塩基対ＧＳＴp1断片（配列中の位置１２４２〜１３９３Acc-Nr、M24485.1）が重亜硫酸塩ＤＮＡ特異性プライマーである、２cf ＧＴＴＴＴ（ＣＴ）ＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴ及び２cr ＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＣで、２５μｌ反応液（1x反応緩衝液、Qiagen;1 U HotstarTaq、Qiagen; dNTPs 各200μM、各プライマー 500nM、0.05〜10 ng重亜硫酸塩処理鋳型ＤＮＡ）中、以下のＰＣＲ条件（95℃〜15分；46サイクル：96℃〜0.45分、52℃〜0.45分、72℃〜0.20分；72℃〜10分）下増幅される（図９及び１０参照）。ＧＳＴp1断片のシーケンシングにより、ヒト末梢血液からの、この断片のＤＮＡはメチル化ＣＧジヌクレオチドを所有しない。それに対して、SssI処理ＤＮＡでは全てのＣＧジヌクレオチドメチル化タイプである（図９参照）。ＧＳＴp1断片のシーケンシングは他の結果を検出する（例えば、WO9955905）、即ち、ＧＳＴp1遺伝子において、公知の配列（遺伝子バンク、Acc-Nr.M24485.1）とは逆に、一つの付加的Ｇヌクレオチドが存在する（遺伝子バンクのAcc-Nr.M24485.1の位置1273〜1274間；ＧＳＴp1ＰＣＲ断片の位置33、図９参照）。ＰＣＲ効率に関して、ＣpＧメチル化及びＣpＧ非メチル化鋳型ＤＮＡの間には差異はない（図１０参照）。

（実施例８）
メチル化ＧＳＴp1断片の選択的増幅
図１１はメチル化ＧＳＴp1断片の選択的増幅の実験設計を図示したものである。ＧＳＴp1断片の、プライマー２cf ＧＴＴＴＴ（ＣＴ）ＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴ及び２cr ＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＣによる、非メチル化鋳型ＤＮＡにおける増幅は、その配列が非メチル化、重亜硫酸塩処理ＤＮＡに対応する、二つのブロックカーオリゴヌクレオチド（Ｂ５＋９ＦＴ６、ＧＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴ−Ｐ；Ｂ１５＋１７ＲＴ１１、ＴＡＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡ−Ｐ、図１１参照）阻害される。これらのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの間その伸長を阻害するために、３'末端で、フォスフェートグループによって変化させられる。ＰＣＲは２５μｌの反応液で、以下のサイクルプログラム（95℃〜15分；46サイクル：96℃〜0.45分、52℃〜0.45分、72℃〜0.20分；72℃〜10分）で実施される。ＰＣＲ開始時には下記の反応液組成で実施される。即ち、1x反応緩衝液（Qiagen、Hilden）；２ U HotstarTaq（Qiagen、Hilden）； dNTP 各200μM、各プライマー 500nM、各ブロックカー 10μM（Ｂ５＋９ＦＴ６、ＧＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴ−Ｐ及びＢ１５＋１７ＲＴ１１、ＴＡＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡ−Ｐ）、20ng〜20pg重亜硫酸塩処理鋳型ＤＮＡ。このＰＣＲ条件下、ＧＳＴp1断片の増幅が２５μgの非メチル化鋳型ＤＮＡにおいて、完全に行なうことができる（図１２Ａシュプール８参照）。ＧＳＴp1断片の増幅はブロックカーオリゴヌクレオチドなしのＰＣＲで実施される（図１２Ａシュプール８参照）。ＧＳＴp1ＰＣＲ産物が同じＰＣＲ条件下、ブロックカーオリゴヌクレオチドの共存またはなしで、１００pgのメチル化鋳型ＤＮＡにおいて検出される（図１２、Ｃシュプール７、Ｆシュプール７参照）。ＰＣＲの絶対的感度は少なくとも１００pgのメチル化鋳型ＤＮＡにおいて実現する。

ＰＣＲの相対的感度を調査するため、非メチル化鋳型ＤＮＡのメチル化鋳型ＤＮに対する比１：１〜１：１０００である、非メチル化鋳型ＤＮＡ及びメチル化鋳型ＤＮＡの混合物が製造された。このＤＮＡ混合物の製造のため、ヒト末梢血液（Promega Madison; USA）から採取されたＤＮＡ、SssI処理ＤＮＡ（実施例7参照）が前記比で混合され、次で、重亜硫酸塩処理された。この鋳型ＤＮＡ混合物（２５μgトータルＤＮＡ）における、ブロックカーオリゴヌクレオチドの共存またはなしで、行なわれたＰＣＲの結果は図１２のＡ、Ｂまたは図１２のＤ、Ｅに示される。この結果は、メチル化ＧＳＴp1遺伝子の一つのコピーが複製可能な非メチル化ＧＳＴp1遺伝子の２００コピーのバックグラウンドで、検出され得ることを示している。１：１０００の相対感度は、ＰＣＲ条件を、更に最善のものにすることによって、達成できると見なされる（図１２Ｂシュプール７）。

ＰＣＲ産物の配列解析はＤＮＡ混合物（非メチル化ＤＮＡのメチル化ＤＮに対する比が１：２００）をＢブロックカーを使用し（図１２Ａシュプール６）または使用しない（図１２Ｄシュプール６）で、期待する成果を示した。ブロッカーなしのＰＣＲで生成するＰＣＲ産物は、非メチル化ＧＳＴp1遺伝子に対応し、それに対し、ブロッカーオリゴヌクレオチドが存在する、ＰＣＲで生成するＧＳＴp1遺伝子断片はメチル化された後成的位置を有する。

他のｄｄＮＴＰまたは付加的ヌクレオチドのようなＧＳＴp1ヌクレオチド配列に対応しない、３'修飾の実験は大成功であった。

（実施例９）
LightCyclerにおけるメチル化ＧＳＴp1遺伝子断片の選択的増幅
LightCycler（Roche）はＰＣＲ及び同時に実施する検出及びＰＣＲ産物の解析を実施する装置である。装置の操作はメーカーの手引書による。ＰＣＲの量的、質的解析はLightCycler・ソフトウエア・ヴァージョン３．５にしたがって行なわれる。

メチル化ＧＳＴp1遺伝子断片の選択的増幅は、１０μｌ反応液{1x反応緩衝液（Qiagen、Hilden）；５ U HotstarTaq（Qiagen、Hilden）； dNTPs 各250μM、各プライマー 625nM、[２cf、ＧＴＴＴＴ（ＣＴ）ＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴ及び２crＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＣ]、ブロックカー4μM（Ｂ５＋９ＦＴ１６、ＧＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＴ−Ｐ）、0.25μg/μlＢＳＡ（Sigma、Muenchen）、250nMアンカーオリゴヌクレオチド（GSTp1-Fluo、ＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴ−フルオレセイン；TibMo1Biol、Berlin）、250nM二本鎖形成プローブ（GSTp1-Red 705、Red 705−ＧＴＡＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＧＧＴ−Ｐ；TibMo1Biol、Berlin）及び／または（GSTp1-Red650 、Red 650−ＴＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＣＧＧ−Ｐ、 TibMo1Biol、Berlin）、20ng〜20pg鋳型ＤＮＡ}で、以下のサイクラープログラムにより実施される。即ち、プログラムは95℃〜15分；46サイクル：変性96℃〜4秒、アニール52℃〜30秒、伸長72℃〜20秒で実施される。検出は各増幅サイクルで、遺伝子及びメチル化特異性LightCycler検出プローブにより、アニール段階、１０秒で行なわれた。ＧＳＴpＰＣＲ断片の検出はメチル化特異性アンカープローブ、GSTp１-Fluo及びメチル化特異性プローブGSTp１-Red 705またはメチル化特異性プローブGSTp1-Red 650の一つとＰＣＲ断片で二本鎖形成されるときに行なわれた。

検出プローブのメチル化特異性の検査は、各１５ngの重亜硫酸塩処理メチル化鋳型ＤＮＡ及び重亜硫酸塩処理非チル化鋳型ＤＮをLightCyclerで増幅して行なわれる。検出にはＰＣＲはアンカープローブGSTp１-Fluo及び二本鎖形成プローブGSTp１-Red 705及びGSTp1-Red 650の等量混合物を含む。メチル化GSTp1遺伝子、GSTp1-Red 650のためのプローブの蛍光物質は、LightCyclerのＦ１／Ｆ２検出溝で測定され、それに対して、非メチル化GSTp1遺伝子、GSTp1-Red 705のためプローブはＦ３／Ｆ１検出溝で測定される（図１３参照）。実験によって、GSTp1-Red 650が特異的にメチル化GSTp1遺伝子を検出し、非メチル化ヴァージョンは蛍光信号を発しないことを示した（図１３Ａ参照）。プローブGSTp１-Red 705は、非メチル化及びメチル化GSTp1遺伝子の比較では、後者が著しく効果を低下させることを検知した（図１３Ｂ参照）。

メチル化GSTp1断片の増幅の絶対及び相対感度は実施例８と同様に調査される。絶対感度の決定は、GSTp1ＰＣＲが異なる量のメチル化、重亜硫酸塩処理、鋳型ＤＮＡで、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在及び不存在下で、LightCyclerで、実施される。検出には、アンカープローブの他に、二本鎖形成プローブ、GSTp1-Red650が使用された。結果は図１４に纏めて示した。交差点の計算は、LightCycler・ソフトウエア・ヴァージョン３．５にしたがって行なわれ、そこで、GSTp1ＰＣＲ産物が最初に、ネガティブコントロールとしてのより高い信号で、検出され得るところのＰＣＲサイクルの数値が与えられる。これは、交差点の値が低くなればなるほど、益々、GSTp1断片の増幅が効率的に行なわれることを意味する。交差点が与えられないということは、ＰＣＲ産物が検出され得ないことを意味する。表示された実験において、GSTp1が、ブロッカーの存在下、７５pgのメチル化、重亜硫酸塩処理、鋳型ＤＮＡによって増幅され得る（図１４参照）。

相対感度の決定は、GSTp1のＰＣＲが２０ngの鋳型ＤＮＡ混合物（実施例８参照）と共に、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在及び不存在下で、実施される。検出には、ＰＣＲは、アンカープローブGSTp１-Fluo及び、二本鎖形成プローブGSTp１-Red 705とGSTp1-Red 650の等量混合物、を含む。メチル化GSTp1遺伝子、GSTp1-Red 650のためのプローブの蛍光物質は、LightCyclerのＦ１／Ｆ２検出溝で測定され、それに対して、非メチル化GSTp1遺伝子、GSTp1-Red 705のためプローブはＦ３／Ｆ１検出溝で測定される。

得られた交差点は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下のＰＣＲでは、メチル化ＧＳＴp1遺伝子の一つのコピーが、複製可能な非メチル化ＧＳＴp1遺伝子の２００コピーのバックグラウンドで、検出され得ることを示している（図１５参照、ローター位置３、Ｆ１／Ｆ２分割）。同じ条件下、GSTp1遺伝子の増幅は１５ngの非メチル化、重亜硫酸塩処理、鋳型ＤＮＡによって、完全に抑制される（図１５参照、ローター位置１９及び９、Ｆ３／Ｆ１分割）。

（実施例１０）
Taqmanによるメチル化ＧＳＴp1の選択的増幅
Taqman（Applied Biosystems、Weiterstadt）はＰＣＲの実施及びＰＣＲ産物の検出及び解析を同時に行なうもう一つの装置である。装置の取り扱いはメーカーの手引書に従がって行なう。ＰＣＲの量的及び質的解析はTaqmanソフトウエアによって行なう。

メチル化ＧＳＴp1断片の選択的増幅は、２０μｌ反応液{1x反応緩衝液（Applied Biosystems）；２ U Amplitaq Gold（Applied Biosystems）；3.5mM MgCl₂、 dNTPs 各400μM、各プライマー 500nM、[２cft、ＧＴＴＴＴ（ＣＴ）ＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＡ；２cr、ＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＣ]、ブロックカー1を7.5μM（Ｂ５＋９ＦＴ６、ＧＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴ−Ｐ）、ブロックカー2を7.5μM（Ｂ１５＋１７ＲＴ１９、ＴＡＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣ−Ｐ）、450nM Taqmanプローブ（Taq1、ブラックホール−ＴＡＡＴＴＣＧＴＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＡＧＧＧ−ＦＡＭ；Biosearch Technologies）、10ng鋳型ＤＮＡ}中で、下記のサイクラープログラムで実施された。即ち、プログラムは95℃〜10分；3サイクル：変性96℃〜15秒、アニール60℃〜60秒；3サイクル：変性96℃〜15秒、アニール58℃〜30秒、伸長60℃〜30秒；3サイクル：変性96℃〜15秒、アニール55℃〜30秒、伸長60℃〜30秒；40サイクル：変性96℃〜15秒、アニール52℃〜30秒、伸長60℃〜40秒で実施された。検出は各増幅サイクルで、遺伝子特異性Taqmanプローブにより、伸長段階後に行なわれた。

相対感度の決定は、GSTp1のＰＣＲが１０ngの鋳型ＤＮＡ混合物（実施例８参照）と共に、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在及び不存在下で、実施された（図１６）。サイクル閾の計算はTaqman・ソフトウエアにしたがって行なわれ、LightCyclerの交差点の値に比較可能な、GSTp1ＰＣＲ産物が最初に、ネガティブコントロールとしてのより高い信号で、検出され得るところのＰＣＲサイクルの数値が与えられる。これは、サイクル閾値が低くなればなるほど、益々、GSTp1断片の増幅が効率的に行なわれることを意味する。

得られたサイクル閾値は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下のＰＣＲでは、メチル化ＧＳＴp1遺伝子の一つのコピーが、複製可能な非メチル化ＧＳＴp1遺伝子の２００コピーのバックグラウンドで、検出され得ることを示している（図１６参照）。これは５０pgのメチル化鋳型ＤＮＡの絶対的感度に対応する。同じ条件下、GSTp1遺伝子の増幅は１０ngの非メチル化、重亜硫酸塩処理、鋳型ＤＮＡによって、完全に抑制される（図１６参照。）

（図面の説明）
図１０：GSTp1ＰＣＲ断片のアガロースゲル。
ＰＣＲは１０ng、５ng、１ng、０．５ng、０．１ngのメチル化（Ａ）及び非メチル化（Ｂ）、重亜硫酸塩処理鋳型ＤＮＡで実施された。

図１１：プライマー位置及びブロックカーオリゴヌクレオチドを有するGSTp1断片の配列。

図１２：GSTp1ＰＣＲ断片のアガロースゲル。
メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅の相対的感度（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）及び絶対的感度（Ｃ、Ｆ）が解析された。GSTp1ＰＣＲが、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び非存在下（Ｄ、Ｅ、Ｆ）実施される。鋳型ＤＮＡとして、２０ngのメチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡ（Ａ１、Ｂ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｃ１、Ｆ１、Ｃ２、Ｆ２）及び非メチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡ（Ａ８、Ｂ８、Ｄ８、Ｅ８）；メチル化及び非メチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡの１：２混合物（Ａ２、Ｂ２、Ｄ２、Ｅ２）、１：１０混合物（Ａ３、Ｂ３、Ｄ３、Ｅ３）、１：２０混合物（Ａ４、Ｂ４、Ｄ４、Ｅ４）、１：１００混合物（Ａ５、Ｂ５、Ｄ５、Ｅ５）、１：２００（Ａ６、Ｂ６、Ｄ６、Ｅ６）、１：１０００（Ａ７、Ｂ７、Ｄ７、Ｅ７）；１０ng（Ｃ３、Ｆ３）、２ng（Ｃ４、Ｆ４）、１ng（Ｃ５、Ｆ５）、０．２ng（Ｃ６、Ｆ６）、０．１ng（Ｃ７、Ｆ７）、０．０２ng（Ｃ８、Ｆ８）、メチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡの存在及びＤＮＡの非存在（Ｃ９、Ｆ９）。

図１３：検出プローブのメチル化特異性の解析。
図はメチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡ（実線）、非メチル化、重亜硫酸塩処理、ＤＮＡ（点線）のＧＳＴp1ＰＣＲの間の蛍光物質の変化を示し、二本鎖形成プローブＧＳＴp1-Red650（Ａ）及び二本鎖形成プローブＧＳＴp1-Red705（Ｂ）検出されている。

図１４：LightCyclerによる、ＧＳＴp1ＰＣＲの絶対感度の決定。
ＧＳＴp1ＰＣＲはブロックカーオリゴヌクレオチド（ローター位置９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８）及びブロックカーオリゴヌクレオチドなしで（ローター位置１、２、３、４、５、６、７、８、１７）、行なわれた。鋳型ＤＮＡとしては、以下のものが使用される。即ち、メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡ７．５ng（ローター位置１、９）、３．７ng（ローター位置２、１０）、０．７５（ローター位置３、１１）、０．３７ng（ローター位置４、１２）、０．０７５ng（ローター位置５、１３）、０．０３７ng（ローター位置６、１４）、
０．０１５ng（ローター位置７、１５）、０．００７５ng（ローター位置８、１６）及びＤＮＡなし（ローター位置１７、１８）である。

図１５：メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅の相対的感度の決定。
メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅はLightCyclerによって行なわれた。二本鎖形成プローブＧＳＴp1-Red650（Ｆ２／Ｆ１、交差点）及びＧＳＴp1-Red705（Ｆ３／Ｆ１、交差点）による検出は提示されている。ＧＳＴp1ＰＣＲは、ブロックカーオリゴヌクレオチド（ローター位置１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０）及びブロックカーオリゴヌクレオチドなしで（ローター位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）で行なわれる。鋳型ＤＮＡとしては、以下のものが使用される。即ち、メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡ１５ng（ローター位置１、１１）、及びメチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡ１５ng（ローター位置１０、２０）、メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡ及び非メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡの組成比１：２の混合物（ローター位置２、１２）、１：１０（ローター位置３、１３）、１：２０（ローター位置４、１４）、１：１００（ローター位置５、１５）、１：５００（ローター位置７、１７）、１：１０００（ローター位置８、１８）及びＤＮＡなし（ローター位置１０、２０）である。

図１６：メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅の相対的感度の決定。
メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅はTaqmanによって行なわれた。

本発明の方法を、患者または各個人にとって、好ましくない症状の診断及び／または予診のために使用することができる。

プロモーター断片により、二本鎖形成された一つのチップを示す。 アガロース電気泳動法による分析結果を示す。 比較的低濃度の、３種類の、１３量体ＰＮＡがＰＣＲに添加された場合の、電気泳動法による分析結果が示されている。 ＧＳＴp１遺伝子の断片のメチル化感受性増幅実験結果を示す。 ＰＮＡのＧＳＴＰアップの前立腺組織の被試験ＤＮＡへの添加は、ＰＣＲヘの強い阻害的影響を与えることを示す。 与えられた鋳型配列において、メチル化感受性増幅の考えで、プライマーが配列される、多数の可能性が示されている。 与えられた、鋳型配列プライマー及びプローブ（ブロッカー）が、メチル化感受性増幅の思考で配列される様子を示す。 何れのプライマーとも重複しない、プローブが使用されている、フォワード及びリバースプライマーの類似例が示されている。 ＧＳＴp1断片が、重亜硫酸塩ＤＮＡ特異性プライマーで、特定反応液中、特定ＰＣＲ条件下増幅された結果を示す。 ＧＳＴp1断片が、重亜硫酸塩ＤＮＡ特異性プライマーで、特定反応液中、特定ＰＣＲ条件下増幅された結果を示す。 プライマー位置及びブロックカーオリゴヌクレオチドを有するGSTp1断片の配列を示す。 GSTp1ＰＣＲ断片のアガロースゲルを示す。 検出プローブのメチル化特異性の解析結果を示す。 LightCyclerによる、ＧＳＴp1ＰＣＲの絶対感度の決定結果を示す。 メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅の相対的感度の決定結果を示す。 メチル化ＧＳＴp1遺伝子の増幅の相対的感度の決定結果を示す。

配列表

Claims (31)

1. 人体の外で下記の各段階を実施することを特徴とするＤＮＡ試料中のシトシンメチル化の検出方法。
   ａ）調査するＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ試料を、メチル化されていないシトシン塩基はウラシルに変化させ、一方、５−メチルシトシン塩基は変化させないでそのまま残るように、重亜硫酸塩を用いて化学処理し、
   ｂ）該化学処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも二つのプライマーオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ及び５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドに結合する、少なくとも一つの付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーの存在下に増幅し、それら付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーは、優先的にバックグラウンドＤＮＡに結合してその増幅を阻害し、それにより、該増幅において、調査するＤＮＡをバックグラウンドＤＮＡよりも鋳型として優先させ、
   ｃ）増幅産物を解析し、増幅産物の存在及び／または付加的なジヌクレオチドの解析から、調査するＤＮＡにおけるメチル化状態を決定する
2. ＤＮＡ試料を、個人の血清または他の体液から得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ＤＮＡ試料を、細胞系、血液、痰、尿、腎臓、血清、脳脊髄液、パラフィン包埋組織、組織スライド及びこれらの可能な組合わせから得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 組織が、眼球、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓のいずれかである請求項３に記載の方法。
5. 重亜硫酸塩を用いた化学処理が、ＤＮＡをアガロースに包埋して行なわれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 重亜硫酸塩を用いた化学処理が、二重鎖ＤＮＡ変性剤及び／またはラジカル捕捉剤の存在下、行なわれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーのバックグラウンドＤＮＡへの結合位置が、プライマーのバックグラウンドＤＮＡへの結合位置と重複し、付加的なオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチドのバックグラウンドＤＮＡへの結合を阻害することを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 少なくとも二つの他のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーを使用し、その際、それらの結合位置がプライマーのバックグラウンドＤＮＡへの結合位置と重複し、付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーが、二つのプライマーオリゴヌクレオチドのバックグラウンドＤＮＡへの結合を阻害することを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 付加的なオリゴヌクレオチド及びＰＮＡオリゴマーのうちの一つがフォワードプライマーの結合を阻害し、他方がリバースプライマの結合を阻害するすることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーがプライマーオリゴヌクレオチドに比較して、少なくとも５倍の濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 付加的なオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーがバックグラウンドＤＮＡに結合し、それによってポリメラーゼ反応におけるプライマーオリゴヌクレオチドの完全な伸長を阻害することを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 使用されるポリメラーゼが、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を示さないことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 付加的なオリゴヌクレオチドが、その５'末端で修飾されて存在しており、それによって、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる著しい分解が起こらないことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
14. プライマーのほかに使用されるオリゴヌクレオチドが、３'−ＯＨ基を有しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ試料が、請求項１に係る方法の第二段階（段階ｂ）で、
    少なくとも二つのプライマーオリゴヌクレオチド及び、
    ５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドと二本鎖を形成する、一つの付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマー及び、
    ５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＴＧ−３'ジヌクレオチドまたは５'−ＣＡ−３'ジヌクレオチドと二本鎖を形成する、少なくとも一つのリポーターオリゴヌクレオチド、及び
    ポリメラーゼで増幅され、
    上記の付加的なオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーは優先的にバックグラウンドＤＮＡに結合して、その増幅を抑制し、
    上記のリポーターオリゴヌクレオチドは優先的に調査するＤＮＡに結合し、その増幅を示すことを特徴とする請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
16. リポーターオリゴヌクレオチドに加えて、蛍光色素で標識化されたオリゴマーを使用し、このオリゴマーは、直接リポーターオリゴヌクレオチドの近傍で二本鎖を形成し、この二本鎖形成は、蛍光共鳴エネルギー転移によって検出されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. リポーターオリゴヌクレオチドは、TaqMan（登録商標名）プローブであり、TaqMan（登録商標名）アッセイを行うことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
18. リポーターオリゴヌクレオチドと近傍で二本鎖形成するオリゴマーは、LightCycler（登録商標名）プローブであり、LightCycler（登録商標名）アッセイを行うことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
19. リポーターオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの蛍光標識を有することを特徴とする請求項１５〜１８の何れか１項に記載の方法。
20. リポーター分子が蛍光の増加または減少により、増幅を示すことを特徴とする請求項１５〜１９の何れか１項に記載の方法。
21. 蛍光の増加または減少を直接解析に使用し、蛍光信号から、解析すべきＤＮＡのメチル化状態を決定することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. バックグラウンドＤＮＡの濃度が、調査するＤＮＡの濃度の１００倍であることを特徴とする請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
23. バックグラウンドＤＮＡの濃度が、調査するＤＮＡの濃度の１０００倍であることを特徴とする請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
24. 解析または請求項６〜１０の方法では付加的な解析として、オリゴマーアレイへのハイブリダイゼーションを行い、その場合に、オリゴマーは核酸であることを特徴とする請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
25. １２〜２２塩基長断片のオリゴマーを解析すべきＤＮＡと二本鎖形成させ、該オリゴマーはＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 解析すべきＤＮＡの、２０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することを特徴とする請求項２４または２５に記載の方法。
27. 解析すべきＤＮＡの、６０以上のメチル化位置のメチル化状態を一回の実験で検出することを特徴とする請求項２４または２５に記載の方法。
28. 解析または請求項１５〜１８の方法では付加的な解析として、調査するＤＮＡの鎖長の測定が為され、その際、鎖長の測定方法が、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー、及び質量分析を含有することを特徴とする請求項１〜２７の何れか１項に記載の方法。
29. クロマトグラフィーがＨＰＬＣである請求項２８に記載の方法。
30. 解析または請求項１５〜１８の方法では付加的な解析として、シーケンシングを行い、その際、シーケンシングの方法が、サンガー法、及びマクサムギルバート法を含有することを特徴とする請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
31. シーケンシングを、ＣpＧ位置毎、または、ＣpＧ位置の小グループに対して行い、それぞれ別のプライマーオリゴヌクレオチドによって実施し、プライマーの鎖長伸長がほんの一つ、または、２〜３の少ない塩基で為され、プライマー伸長のタイプから、調査するＤＮＡにおける当該位置のメチル化状態を決定することを特徴とする請求項３０に記載の方法。

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