PT1370691E - Processo para a detecção de modelos de metilação de citosina com grande sensibilidade - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A DETECÇÃO DE MODELOS DE METILAÇÃO DE CITOSINA COM GRANDE SENSIBILIDADE" A presente invenção é relativa a um processo para a detecção de metilação de citosina em amostras de ADN.

Os níveis de observação bem estudados de acordo com os métodos desenvolvidos dos últimos anos tratam-se dos próprios genes, da tradução destes genes em ARN e das proteínas daí originadas. Em que altura do decorrer do desenvolvimento dum indivíduo, que gene é que é activado e como se controla a activação e a inibição de certos genes em determinadas células e em determinados tecidos, é algo que pode ser correlacionado com a grandeza e o carácter da metilação dos genes ou do genoma. Neste sentido, ocorre uma expressão dos estados patogénicos num modelo de metilação alterado de genes individuais ou do genoma. A 5-metilcitosina é a base modificada de forma covalente mais frequente no ADN de células eucarióticas. Desempenha, por exemplo, um papel na regulação da transcrição, na impressão genética e na génese de tumores. A identificação da 5-metilcitosina como componente de informação genética tem, por isso, um interesse considerável. No entanto, as posições de 5-metilcitosina não podem ser identificadas por sequenciação, visto que a 5-metilcitosina apresenta o mesmo comportamento de emparelhamento de bases da citosina. Além disso, numa amplificação de PCR perde-se a informação ipigenética que as 5-metilcitosinas têm.

Um método relativamente novo e entretanto aquele que é com 2 maior frequência empregue para estudar o ADN na 5-metilcitosina, tem a ver com a reacção especifica do bissulfito com a citosina, que é transformada depois de posterior hidrólise alcalina em uracilo, e que no seu comportamento de emparelhamento de bases corresponde à timidina. Em contrapartida, a 5-metilcitosina não é modificada sob estas condições. Com isto, o ADN original é transformado de modo a que a metilcitosina, que originalmente não pode ser distinguida da citosina pelo seu comportamento de hibridização, pode então ser detectada por técnicas "normais" de biologia molecular como única citosina permanecente, através, por exemplo, de amplificação e de hibridização ou de sequenciação. Todas estas técnicas são relativas ao emparelhamento de bases, que é então totalmente aproveitado. O estado da técnica em termos de sensibilidade é definido por um processo que inclui o ADN a ser estudado numa matriz de agarose, impedindo assim a difusão e a renaturação do ADN (o bissulfito reage apenas a ADN de cadeia única) e substituindo todas as etapas de precipitação e de purificação por diálise rápida (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24): 5064-6). Com este método, é possivel analisar células individuais, o que evidencia o potencial do método. Em todo o caso, até à data são apenas analisadas regiões individuais até cerca de 3 000 pares de bases de comprimento, não sendo possivel uma análise global de células em milhares de análises de metilação possíveis. De qualquer forma, este processo também não consegue analisar de forma fiável fragmentos muito pequenos de pequenas quantidades de amostras. Apesar da protecção de difusão, estes perdem-se pela matriz. 3

Um panorama de outras possibilidades conhecidas de detectar as 5-metilcitosinas pode ser encontrado no seguinte artigo sumário: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15; 26(10): 2255-64. A técnica de bissulfito é até à data apenas aplicada na investigação, tirando algumas excepções (por exemplo: Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dõrfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar -Apr; 5(2) : 94-8). No entanto, fragmentos específicos curtos de um gene conhecido são sempre amplificados depois dum tratamento com bissulfito, e são completamente sequenciados (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov.; 17(3) : 275-6), ou diferentes posições de citosina são detectadas através de uma "Primer-Extension-Reaction" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12) : 2529-31, patente WO 9500669) ou de um fragmento de enzima (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12) : 2532-4). Além disso, também foi feita a descrição da detecção por meio de hibridização (Olek et al., WO 99 28498). A ureia melhora a eficiência do tratamento com bissulfito antes da sequenciação da 5-metilcitosina em ADN genómico (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'- 4 methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21) : 5009-10).

Outras publicações acerca da aplicação da técnica com bissulfito para a detecção de metilação no caso de diferentes genes são:

Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.; 16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dõrfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar, 6 (3) : 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene andin its expression in human breast câncer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157 (1-2):261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 e WO 45560.

Outro processo conhecido é a denominada PCR sensível a metilação (Herman JG, Graft JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB, (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei USA. Sep 3; 93(18): 9821-6). Neste processo emprega-se primers que apenas hibridizam numa sequência, originada pelo tratamento com bissulfito de um ADN não metilado na posição em causa, ou então o inverso, um primer que se liga 5 apenas a um ácido nucleico, originado pelo tratamento com bissulfito de um ADN não metilado na posição em causa. Com estes primers, é assim possível produzir amplificados, cuja detecção fornece por sua vez dados acerca da existência de uma posição metilada ou não metilada na amostra, a que se ligam os primers.

Um processo mais recente é também a detecção de metilação de citosina por meio de PCR TaqMan, que ficou conhecido por Methyl-Light (WO 00/70090) . Com este processo é possível detectar o estado de metilação de posições individuais ou de poucas posições, directamente no decorrer da PCR, não sendo necessária uma posterior análise dos produtos.

Orum H. PCR clamping. Curr Issues Mol Biol, 2000 Jan; 2 (1) : 27 - 30 e Yu et al. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5' to 3' exonucleasedeficient DNA Polymerase. Biotechniques, Eaton Publishing, US, 1997 Oct; 23(4): 716-20, descrevem por sua vez a utilização de moléculas bloqueadoras, de modo a atingir uma amplificação de PCR específica da sequência alvo.

Um panorama do estado da técnica no fabrico de matrizes de oligómeros pode ser visto numa edição especial de Janeiro de 1999 da Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, volume 21, Janeiro de 1999), na literatura aí citada e na patente US 5994065, acerca de métodos para o fabrico de suportes sólidos para moléculas alvo, como os oligonucleótidos no sinal de fundo inespecífico enfraquecido. 6

Para a detecção de uma matriz de ADN imobilizada, utilizaram-se várias vezes sondas marcadas com fluorescência. Especialmente adequada a marcações com fluorescência, é a aplicação simples de corantes Cy3 e Cy5 no 5'-OH da respectiva sonda. A detecção da fluorescência das sondas hibridizadas ocorre através, por exemplo, de microscópio confocal. Os corantes Cy3 e Cy5 podem ser obtidos no mercado a par de muitos outros. A espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um desenvolvimento muito eficiente para a análise de biomoléculas (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal. Chem. 1988 Oct. 15; 60(20) : 2299-301). Um analito é incorporado numa matriz de absorção de luz. Através dum curto pulso de laser, evapora-se a matriz e encaminha-se a molécula de analito assim desfragmentada para a fase gasosa. Através de choques com moléculas de matriz, consegue-se a ionização dos analitos. A aplicação de tensão acelera os iões para um tubo aéreo com ausência de campo. Devido às respectivas diferentes massas, os iões são acelerados com diferentes intensidades. Iões de menores dimensões chegam ao detector antes dos maiores. A espectroscopia MALDI-TOF adequa-se de forma extraordinária à análise de péptidos e de proteínas. A análise de ácidos nucleicos é algo mais difícil (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1 : 147 - 157) . No caso dos ácidos nucleicos, a sensibilidade é aproximadamente 100 vezes pior do que no caso dos péptidos, 7 e decresce progressivamente com um aumento do tamanho dos fragmentos. No caso dos ácidos nucleicos que têm uma linha dorsal de carga em muito negativa, o processo de ionização através da matriz é essencialmente nada eficiente. Na espectroscopia MALDI-TOF, a escolha da matriz desempenha um papel eminentemente importante. Para a dessorção de péptidos, descobriu-se algumas matrizes muito eficientes, que dão origem a uma cristalização muito fina. Para o ADN existem entretanto algumas matrizes atractivas, mas contudo não se reduziu com isso a diferença a nível da sensibilidade. A diferença a nível da sensibilidade pode ser reduzida, ao modificar quimicamente o ADN de modo a ficar semelhante a um péptido. Os ácidos nucleicos de tioato de fósforo, nos quais os fosfatos habituais da linha dorsal estão substituídos por tiofosfatos, podem ser transformados por uma química simples de alquilação num ADN de carga neutra (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367 - 1373). O acoplamento de uma "etiqueta de carga" (charge tag) a este ADN modificado, tem por resultado um aumento da sensibilidade na mesma ordem de grandeza encontrada para os péptidos. Outra vantagem de etiquetagem de carga (charge tagging) é a maior estabilidade da análise em relação a impurezas que dificultam muito a detecção de substratos não modificados. 0 ADN genómico é obtido por métodos padrão de ADN de amostras de células, de tecidos ou de outras amostras experimentais. 8

Esta metódica padrão encontra-se em referências como Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Por conseguinte, imensos processos para a análise de metilação são até à data estado da técnica. A presente invenção deverá contudo resolver o problema de os processos correntes não serem capazes de amplificar de forma dirigida um ADN a ser analisado que se encontra num fluido corporal ou na linfa, se ao mesmo tempo estiverem presentes outras secções de ADN de sequências homólogas de outra origem.

0 ADN a ser analisado e os demais ácidos nucleicos existentes, em seguida denominados ADN de fundo, são de qualquer modo amplificados de igual forma, visto que os primers utilizados também não são capazes de fazer a distinção entre o ADN a ser analisado e o ADN de fundo. Uma possibilidade de diferenciar estes ADN resulta contudo dos diferentes modelos de metilação. Um processo corrente é a PCR sensível a metilação, com a abreviatura MSP (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996). Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei USA. Sep 3; 93(18): 9821-6). Este processo consiste em várias etapas parciais. Primeiro, realiza-se um tratamento com bissulfito que corresponde ao estado da técnica, o qual leva por sua vez a que todas as bases citosina sejam transformadas em uracilo, enquanto as bases citosina metiladas (5-metilcitosina) permanecem inalteradas. Na etapa seguinte, emprega-se então primers que sejam totalmente complementares dum ADN transformado com bissulfito e metilado, mas não dum respectivo ADN que originalmente se encontrava não metilado. Isto leva, na realização duma PCR 9 com um primer destes, a que exclusivamente o ADN metilado de origem seja amplificado. Em conformidade, é possível utilizar um primer que, pelo contrário, amplifique apenas o ADN não metilado. Deste modo é possível, se estiverem presentes ADN a ser analisado e ADN de fundo, produzir de forma selectiva exclusivamente os fragmentos de ADN a serem analisados, desde que estes se diferenciem, em termos do respectivo estado de metilação numa posição CpG, do ADN de fundo. 0 estado da técnica trata-se de, a partir da detecção de uma molécula de ADN destas a ser analisada, tirar conclusões acerca do estado de metilação ou da existência dum ADN a ser analisado, o que em princípio permite por sua vez um diagnóstico, por exemplo, de uma doença tumoral em pacientes, visto saber-se que, por exemplo, a concentração de ADN linfático sofre um aumento em certa medida de forma drástica em pacientes com tumores. Apenas o ADN proveniente de tumores deverá então ser detectado a par do ADN de fundo. Em princípio equiparável é a análise de ADN noutros fluidos corporais. 0 processo aqui descrito, que deverá ser considerado o próximo estado da técnica, tem contudo algumas desvantagens. Por exemplo, não é possível tirar conclusões, a partir da detectabilidade de um fragmento amplificado de ADN a ser analisado, acerca da quantidade existente na linfa. Já quantidades ínfimas deste ADN chegam para atingir um resultado positivo, o que por um lado é uma vantagem, mas que poderá também ser muito desfavorável, caso se queira, por exemplo, avaliar o efeito de uma ressecção de tumor sobre o ADN linfático. A maior desvantagem é contudo a de que existem muitas posições de metilação, nas quais o ADN a ser analisado e o ADN de fundo apenas se diferenciam gradualmente. É evidente que o processo de MSP existente 10 apenas pode ser levado a cabo, quando se sabe que o ADN de fundo se distingue do ADN a ser analisado na posição CpG em causa de forma definitiva e a 100%, não se querendo arriscar resultados positivos errados. Em contrapartida, é típico num tecido tumoral, que em, por exemplo, 95% das células tumorais, uma determinada posição se encontre metilada, na qual o demais ADN de fundo existente se encontra, no entanto, no máximo 5% metilado, não sendo possível com o método de MSP produzir resultados convincentes, dado que uma quantificação do ADN template não é em princípio possível por meio de PCR ou é apenas possível com grandes custos. Além disso, a invenção assenta no conhecimento de que com frequência se encontram modelos de estados de metilação num fragmento de ADN, que são típicos de um determinado tipo de células, por exemplo, de uma célula tumoral.

Por sua vez, é estado da técnica um processo desenvolvido pela Epigenomics, que amplifica do mesmo modo ADN a ser analisado e ADN de fundo pelo tratamento com bissulfito, e que analisa depois as antigas posições CpG contidas no fragmento por meio de técnicas de hibridização; em alternativa por meio de minissequenciação ou de outros processos correntes. Isto tem a vantagem de obter-se um quadro quantitativo em termos das posições de metilação analisadas, ou seja, ocorre a determinação do grau de metilação de uma multiplicidade de posições, o que permite, por exemplo no caso de tumores sólidos, uma classificação com grande precisão. No entanto, a desvantagem deste método é o de não conseguir dar certezas nos casos em que o ADN de fundo prevalece fortemente, visto este ser amplificado tal e qual como o ADN a ser analisado, sendo os dois analisados na mistura. Este problema não existe na análise de tumores 11 sólidos, onde se pode escolher de forma dirigida o material a ser analisado, mas pode dificultar a análise de, por exemplo, ADN linfático. 0 objectivo da presente invenção é então o de superar as desvantagens do estado da técnica e de combinar as vantagens dos dois processos para a detecção de fluidos corporais e de linfa. 0 objectivo é atingido ao conseguir-se um processo destinado à detecção de metilação de citosina em amostras de ADN, no qual se realizam as seguintes etapas: trata-se de forma quimica uma amostra de ADN genómico, a qual inclui ADN a ser analisado e ADN de fundo, de modo a que todas as bases citosina não metiladas sejam transformadas em uracilo, enquanto as bases 5-metilcitosina permanecem inalteradas; amplifica-se a amostra de ADN quimicamente tratada, mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers, assim como de uma polimerase, indo o ADN a ser analisado ser preferido em detrimento do ADN de fundo como template, e indo analisar-se os amplificados e tirar uma conclusão, a partir da existência de um amplificado e/ou a partir da análise de outras posições, acerca do estado de metilação no ADN a ser analisado.

Em conformidade com a invenção, prefere-se que se obtenha as amostras de ADN a partir de linfa ou de outros fluidos corporais de um indivíduo.

Além disso, prefere-se em conformidade com a invenção que 12 se obtenha as amostras de ADN a partir de linhas celulares, sangue, expectoração, fezes, urina, linfa, liquido céfalo-raquidiano, tecido incorporado em parafina, por exemplo tecido de olhos, intestino, rim, cérebro, coração, próstata, pulmão, mama ou fígado, lâminas histológicas e todas as combinações possíveis destes.

Em conformidade com a invenção, é dada total preferência a que o tratamento químico seja realizado com um bissulfito (= dissulfito, hidrogenossulfito) . Também se prefere que o tratamento químico seja feito depois da incorporação do ADN em agarose. Também se prefere ainda que, no tratamento químico, esteja presente um reagente desnaturante da cadeia dupla de ADN, e/ou um captor de radicais. É dada preferência a que a amplificação seja realizada na segunda etapa, na presença de pelo menos outro oligonucleótido, o qual se ligue a um 5'-CG-3'-dinucleótido, a um 5'-TG-3'-dinucleótido ou a um 5'-CA-3'-dinucleótido; indo o outro oligonucleótido de preferência ligar-se ao ADN de fundo, e indo prejudicar a respectiva amplificação. É dada particular preferência a que o ponto de ligação do outro oligonucleótido ou do oligómero de ANP se sobreponha aos pontos de ligação dos primers sobre o ADN de fundo, e o outro oligonucleótido impeça a ligação de pelo menos um oligonucleótido primer ao ADN de fundo.

Por sua vez, é dada particular preferência a que pelo menos outros dois oligonucleótidos ou oligómeros de ANP sejam utilizados, indo o respectivo ponto de ligação por sua vez se sobrepor ao ponto de ligação de um primer no ADN de 13 fundo, e indo os demais oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP impedir a ligação dos dois oligonucleótidos primers ao ADN de fundo.

Além disso, é dada particular preferência a que respectivamente um dos demais oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP impeça a ligação do forward-primer, enquanto o outro impeça a ligação do reverse-primer. É dada particular preferência a que os outros oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP se encontrem numa concentração pelo menos 5 vezes superior aos oligonucleótidos primers.

Noutra variante processual especialmente preferida, os demais oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP ligam-se ao ADN de fundo e impedem, com isso, o prolongamento completo do oligonucleótido primer na reacção de polimerase. Neste caso, prefere-se por sua vez em especial que a polimerase utilizada não apresente actividade de 5'-3 '-exonuclease. Outra variante preferida é a de que os demais oligonucleótidos se encontrem modificados na extremidade 5' e que, com isso, não possam ser decompostos de forma significativa por uma polimerase com actividade de 5'-3'-exonuclease.

Além disso, prefere-se em conformidade com a invenção que se amplifique a amostra de ADN quimicamente tratada na segunda etapa - mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers e de outro oligonucleótido, que é hibridizado num dinucleótido 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de pelo menos um oligonucleótido repórter, que se hibridiza num dinucleótido 14 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de uma polimerase; indo o outro oligonucleótido de preferência ligar-se ao ADN de fundo e indo prejudicar a respectiva amplificação; e indo o oligonucleótido repórter de preferência ligar-se ao ADN a ser analisado e indo mostrar a respectiva amplificação. Neste caso, constitui uma vantagem que se utilize, a par do oligonucleótido repórter, outro oligómero marcado com corante fluorescente, que se hibridize directamente adjacente ao oligonucleótido repórter, e que se possa detectar esta hibridização por meio de transferência energética de ressonância fluorescente. Além disso, é vantajoso que se realize um ensaio TaqMan. Também se prefere que se realize um ensaio LightCycler.

Em conformidade com a invenção, prefere-se ainda que os oligonucleótidos, utilizados além dos primers, não disponham de uma função 3'-OH. Além disso, prefere-se que os oligonucleótidos repórter tenham pelo menos uma marcação fluorescente. Também se prefere ainda que as moléculas repórter mostrem a amplificação por meio de um aumento ou de uma redução da fluorescência. Neste caso, é particularmente favorável que também se utilize o aumento ou a redução da fluorescência directamente na análise e se tire conclusões, a partir do sinal de fluorescência, acerca de um estado de metilação do ADN a ser analisado.

Em termos preferenciais segundo a invenção, o ADN de fundo encontra-se numa concentração de 100 vezes o ADN a ser analisado. Prefere-se, além disso, que o ADN de fundo se encontre numa concentração de 1 000 vezes a do ADN a ser analisado. 15

Além disso, prefere-se que a análise ou eventualmente a maior análise seja realizada por meio de hibridização em matrizes de oligómeros, podendo os oligómeros ser ácidos nucleicos ou moléculas semelhantes nas suas propriedades de hibridização, como os ANP.

Em conformidade com a invenção, também constitui uma vantagem que os oligómeros se hibridizem sobre uma secção com um comprimento de 12 - 22 bases no ADN a ser analisado, e que incluam um dinucleótido CG, TG ou CA. É dada preferência a que o estado de metilação de mais de 20 posições de metilação do ADN a ser analisado seja detectado numa experiência.

Além disso, prefere-se que o estado de metilação de mais de 60 posições de metilação do ADN a ser analisado seja detectado numa experiência.

Em conformidade com a invenção, também se prefere que a análise ou eventualmente a maior análise seja feita por medição do comprimento do ADN a ser analisado amplificado, incluindo os métodos de medição de comprimento: electroforese em gel, electroforese capilar em gel, cromatografia (por exemplo, HPLC), espectrometria de massa e outros métodos apropriados. Neste caso, também constitui uma vantagem que os métodos de sequenciação incluam o método de Sanger, o método de Maxam-Gilbert e outros métodos como sequenciação por hibridização (SBH).

Em conformidade com a invenção, também se prefere um processo em que se realiza a sequenciação para cada ou para um pequeno grupo de posições CpG com respectivamente um 16 oligonucleótido primer separado, e em que o prolongamento do primer perfaz apenas uma ou poucas bases; e em que se conclui, a partir do tipo de prolongamento do primer, acerca do estado de metilação das posições em causa no ADN a ser analisado.

Prefere-se ainda que se conclua, a partir do grau de metilação nas diferentes posições CpG analisadas, acerca da existência de uma doença ou de outro estado médico do paciente.

Constitui uma vantagem que os próprios amplificados estejam providos de uma marcação detectável com vista à detecção. Além disso, constitui uma vantagem que as marcações sejam marcações fluorescentes e/ou que as marcações sejam radionuclidos, e/ou que as marcações sejam marcações de massa separáveis, que são detectadas num espectrómetro de massa.

Prefere-se ainda que, na amplificação, um dos primers esteja ligado a uma fase sólida.

Em conformidade com a invenção, também se prefere que os amplificados sejam ao todo detectados no espectrómetro de massa e sejam, com isso, caracterizados de forma inequívoca pela respectiva massa.

Outro objecto da presente invenção consiste igualmente na utilização de um processo em conformidade com a invenção no diagnóstico e/ou no prognóstico de acontecimentos desfavoráveis aos pacientes ou aos indivíduos, indo estes acontecimentos desfavoráveis pertencer a pela menos uma das seguintes categorias: efeitos indesejados dos medicamentos; 17 doenças cancerígenas; disfunções, danos ou doenças do SNC; sintomas agressivos ou distúrbios comportamentais; consequências clínicas psicológicas e sociais de danos cerebrais; distúrbios psicóticos e distúrbios de personalidade; demência e/ou síndromas associados; doença, disfunção e danos cardiovasculares; disfunção, danos ou doença do tracto gastrointestinal; disfunção, danos ou doença do sistema respiratório; ferimento, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danos ou doença do corpo como desvio ao processo de desenvolvimento; disfunção, danos ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danos ou doença endócrina/os e metabólica/os; dores de cabeça ou disfunção sexual.

Neste caso, é favorável a utilização de um processo segundo a invenção para distinguir os tipos de células ou de tecidos, ou para estudar a diferenciação celular. A presente invenção também tem por objecto um kit, que consiste num reagente contendo bissulfito, em primers e noutros oligonucleótidos sem função 3'-OH, no fabrico dos amplificados, e opcionalmente de uma orientação para a execução dum ensaio de acordo com a invenção. A presente invenção descreve assim um processo para a detecção do estado de metilação de amostras de ADN genómico. Em contraste com os processos conhecidos até agora, o grau de metilação de um conjunto de posições CpG é determinado num subgrupo escolhido de fragmentos de ADN, por exemplo, em linfa, pelo que também é possível uma análise na presença de um excesso de ADN de fundo não relevante para fins de diagnóstico. 18

Neste caso, o processo preferido consiste, por sua vez, em várias etapas, que podem ser agrupadas como se segue: primeiro retira-se linfa e/ou outros fluidos corporais do paciente e, quando necessário, isola-se o ADN ai contido. Em seguida, realiza-se na segunda etapa um tratamento químico, de preferência com um bissulfito (= hidrogenossulfito, dissulfito), em que, por exemplo, todas as bases citosina não metiladas são transformadas em uracilo, indo as bases citosina metiladas (5-metilcitosina) permanecer contudo inalteradas. Na terceira etapa processual, realiza-se então uma amplificação, na qual o ADN a ser analisado é de preferência amplificado, mas o ADN de fundo não ou apenas o é em reduzida escala. Na quarta etapa que se segue, os fragmentos amplificados são então analisados em termos da respectiva assinatura de metilação, e o grau de metilação de várias posições CpG antigas é determinado nos amplificados. Na quinta etapa processual, conclui-se, a partir do grau de metilação nas diferentes posições CpG analisadas, acerca da existência de uma doença ou de outro estado médico do paciente.

A essência da presente invenção é então que dois tipos de posições CpG desempenham um papel e contribuem igualmente para fins de análise, devendo ser seguidamente denominados posições qualifier (qualificadoras) e posições classifier (classificadoras). As posições qualificadoras servem para diferenciar na amplificação o ADN a ser analisado do ADN de fundo. Isto pode ser feito de diversas formas técnicas, como seguidamente exposto em detalhe. No entanto, a propriedade destas posições é a de que o seu grau de metilação no ADN a analisar é o mais diferente possível do no ADN de fundo; a qual leva a que se dê preferência ao ADN 19 a ser analisado na amplificação. Em contrapartida, as posições classificadoras servem para extrair do amplificado - preponderantemente gerado do ADN a ser analisado -através do respectivo grau de metilação, a informação significativa em termos de diagnóstico. É possível utilizar até algumas destas 100 posições classificadoras numa análise, ocorrendo a análise por exemplo em matrizes de oligómeros, mesmo se isto muitas vezes não for requerido. No entanto, neste caso não se trata da origem de um determinado amplificado, significativo para o resultado de análise, mas em vez da análise das posições CpG no mesmo amplificado. Em alguns casos é contudo seguramente possível e conveniente incluir na análise a informação a tirar da origem dum amplificado, sendo que neste caso algumas posições são ao mesmo tempo classificadoras e qualificadoras. A primeira etapa do processo, a obtenção das amostras, ocorre de preferência por retirada de fluidos corporais, tais como, por exemplo, expectoração ou então linfa, sendo contudo manifesto que o processo pode ser realizado com muitas amostras de diferentes fontes, que são aqui apresentadas sem pretensão de serem a totalidade.

Em termos preferenciais, obtém-se o ADN genómico, empregue no processo, a partir de uma amostra de ADN, indo as fontes de ADN incluir, por exemplo, linhas celulares, sangue, expectoração, fezes, urina, linfa, líquido céfalo-raquidiano, tecido incorporado em parafina, por exemplo tecido de olhos, intestino, rim, cérebro, coração, próstata, pulmão, mama ou fígado, lâminas histológicas e todas as combinações possíveis destes. 20

Em alguns casos ocorre, antes do tratamento com bissulfito, uma purificação ou uma concentração do ADN, de modo a impedir que se afecte a reacção com bissulfito e/ou a posterior PCR devido a uma quantidade demasiado grande de impurezas. No entanto sabe-se, por exemplo, que uma PCR de tecido pode ter lugar depois do tratamento com, por exemplo, proteinase K sem mais purificação, e isto também se aplica analogamente ao tratamento com bissulfito e à posterior PCR. O tratamento químico é de preferência realizado por meio do tratamento com um bissulfito (= hidrogenossulfito, dissulfito), por sua vez de preferência bissulfito de sódio (o bissulfito de amónio é menos apropriado). A reacção ou ocorre de acordo com uma variante publicada, preferindo-se neste caso a incorporação do ADN em agarose, de modo a manter o ADN no estado de cadeia única durante o tratamento; ou então ocorre, de acordo com uma nova variante, por meio do tratamento na presença de um captor de radicais e de um reagente desnaturante, de preferência um éter oligoetilenoglicoldialquílico ou, por exemplo, dioxano. Antes da reacção PCR, remove-se os reagentes por lavagem no caso do método com agarose ou dum processo de purificação de ADN (estado da técnica, precipitação ou ligação a uma fase sólida, membrana), ou então leva-se de forma simples por meio de diluição, para uma gama de concentração que deixa de influenciar de forma significativa a PCR.

Essencial à terceira etapa é que se escolha as posições qualificadoras e que seja escolhido um método apropriado, que permita a amplificação selectiva do ADN a ser analisado. A escolha das posições ocorre seguindo a 21 premissa de que devam ser diferenciadas o mais possível em termos da respectiva metilação entre ADN de fundo e ADN a ser analisado. Neste intuito, determina-se primeiro os perfis de metilação das secções respectivamente em questão de um gene, tanto para os tumores a serem analisados como também para o ADN de fundo de indivíduos saudáveis. Aquelas posições que apresentam as maiores diferenças entre ADN tumoral e ADN de fundo (por exemplo na linfa), são escolhidas como posições qualificadoras. Estas posições são já conhecidas para uma série de genes, por exemplo para o GSTpi, para o HIC-1 e para o MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of 06-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts. Oncol Res.; 4 (4-5): 167-74: Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000). Inactivation of the DNA repair gene 06-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis. Câncer Res. May 1; 60(9): 2368-71). Existem agora vários métodos que são todos preferidos, com os quais é possível de preferência amplificar o ADN a ser analisado, mediante a utilização destas posições qualificadoras.

Por um lado, é possível realizar uma reacção correspondente à MSP, empregando-se primers que se hibridizam totalmente na sequência que corresponde ao ADN a ser analisado depois de tratamento com bissulfito, mas não no ADN de fundo a ser tratado de forma análoga. Por outras palavras, os primers hibridizam numa secção de ADN, onde se encontram uma ou mais posições qualificadoras e, apenas se o respectivo 22 estado de metilação no ADN original corresponder ao caracteristico do ADN a ser analisado, poderá ocorrer uma amplificação num grau significativo. Isto trata-se duma variante em principio simples, a qual tem porém a desvantagem de as posições qualificadoras terem de se encontrar respectivamente numa ou nas duas extremidades do fragmento de ADN, ou seja, as posições classificadoras devem estar entre as posições qualificadoras (ou então, no caso de apenas uma posição qualificadora, esta não poderá encontrar-se no meio das posições classificadoras). Mesmo que seja preferido, de acordo com a invenção, realizar uma variante da MSP destas, dever-se-á por conseguinte partir do principio que ela apenas poderá ser aplicada em relativamente poucos casos, dado que a distribuição de posições qualificadoras e classificadoras apenas vai ser assim tão ideal em poucos casos. Porém, visto que é em princípio de realização simples, ela é não obstante aqui apresentada como preferida.

No entanto, é dada particular preferência a uma variante, na qual os primers não se sobrepõem a uma posição qualificadora ou hibridizam com esta, sendo a amplificação PCR em vez influenciada por pelo menos outro oligonucleótido, que não pode funcionar como primer e que se liga a uma posição qualificadora.

Isto significa que o ADN quimicamente tratado é em princípio amplificado através de dois primers, como é estado da técnica. Dentro da secção de ADN limitada pelos dois primers, encontram-se uma ou mais posições qualificadoras. Ao contrário da PCR normal, adicionam-se então outros oligonucleótidos, os quais se ligam a estas posições qualificadoras, e isto de forma selectiva se estas 23 se encontrarem metiladas ou não metiladas antes do tratamento com bissulfito. Por conseguinte, o ADN a ser analisado é depois preferencialmente amplificado, se os oligonucleótidos adicionados se ligarem de forma menos efectiva às suas posições qualificadoras do que acontece no ADN de fundo. Por outras palavras, os oligonucleótidos adicionados bloqueiam de forma selectiva a amplificação do ADN de fundo.

Em termos preferenciais, estes oligonucleótidos adicionados contêm pelo menos um dinucleótido CG, TG ou CA. Têm ainda de ter a propriedade de não poderem ser eles próprios prolongados pela polimerase empregue na reacção PCR. Isto acontece preferencialmente através da utilização de 3'-desoxioligonucleótidos ou então na posição 3' de oligonucleótidos funcionalizados de outra forma, por exemplo 3'-O-acetiloligonucleótidos. Além disso, é necessário impedir a decomposição destes oligonucleótidos pela polimerase. Isto ocorre, de preferência, através da utilização de uma polimerase sem actividade de nuclease, ou de preferência pela utilização de oligonucleótidos modificados, que apresentam, por exemplo, pontes tioato na extremidade 5' e que são, por isso, resistentes a uma decomposição.

Outra variante particularmente preferida consiste na utilização de oligómeros de ANP (ácido nucleico peptidico ou PNA = peptide nucleic acid), que são empregues nesta experiência de forma análoga aos oligonucleótidos. Os oligómeros de ANP nem são decompostos pela polimerase nem podem ser prolongados por ela, pelo que são de forma ideal adequados a esta variante processual. Os processos para a concepção e para a síntese de oligómeros de ANP são estado 24 da técnica.

Como abordado anteriormente, é possível utilizar várias posições qualificadoras e, por conseguinte, também vários oligonucleótidos, por sua vez específicos para um estado de metilação que se encontra no ADN de fundo, num processo deste tipo.

Depois da amplificação selectiva do ADN a ser analisado, é então possível determinar, preferencialmente, por processos de si conhecidos, o estado de metilação de várias posições classificadoras.

No entanto, é notório que também neste caso a origem dum fragmento de PCR pode ser mesmo em caso isolado suficientemente convincente, desde que a situação apresentada - tal como também no caso da MSP - seja a de que a posição qualificadora se encontre não metilada praticamente nos 100%, por exemplo, no ADN de fundo, encontrando-se contudo metilada no ADN a ser analisado. Caso se empregue então um oligonucleótido na PCR - o qual se liga de preferência à sequência, originada no tratamento com bissulfito a partir de ADN de fundo não metilado;- só surgirá na PCR um produto, se existir dum modo geral pelo menos uma pequena quantidade de ADN a ser analisado. Isto pode em caso isolado ser já suficiente para um diagnóstico, e tratar-se-á aqui de um processo que apresenta propriedades semelhantes à MSP. Embora uma execução deste género não seja directamente preferível, um processo deste género não é conhecido até à data, sendo por isso do mesmo modo considerado parte integrante do objecto desta invenção. 25 É dada preferência a que numa reacção PCR sejam produzidos em simultâneo vários fragmentos, ou seja, que se realize uma PCR multiplex. Na sua concepção, dever-se-á ter em atenção que não apenas os primers mas também os outros oligonucleótidos empregues não podem ser complementares uns dos outros, pelo que um elevado grau de multiplexagem é neste caso mais dificil do que o usual. No entanto, tem-se a vantagem com o ADN tratado com bissulfito de, devido ao diferente teor de G e C das duas cadeia de ADN, um forward-primer nunca poder também funcionar como reverse-primer, o que facilita por sua vez a multiplexagem e compensa fundamentalmente esta desvantagem.

No caso mais simples, são agora por sua vez detectados os fragmentos originados. Entram neste caso em questão todos os processos de biologia molecular conhecidos possíveis, tais como electroforese em gel, sequenciação, cromatografia líquida ou hibridizações, sem analisar-se os oligonucleótidos classificadores. Isto também poderá ser concebível para o controlo de qualidade das etapas processuais precedentes. Como acima apresentado, é contudo dada particular preferência à posterior análise do grau de metilação das posições classificadoras.

Existem inúmeras possibilidades de combinar de forma vantajosa a amplificação preferida do ADN a ser analisado, por meio dos processos acima descritos, com técnicas de detecção dos oligonucleótidos classificadores.

As técnicas de detecção em particular apropriadas são a hibridização em matrizes de oligómeros e, por exemplo, reacções de extensão de primers (minissequenciação). A hibridização em matrizes de oligómeros pode ser utilizada 26 sem outra alteração de protocolos relativamente ao próximo estado da técnica (Olek A, Olek S, Walter J; patente WO 9928498) . No entanto, prefere-se hibridizar os amplificados numa matriz de oligómeros, a qual consiste em pares de oligonucleótidos imobilizados numa fase sólida, dos quais um se hibridiza fortemente de preferência numa secção de ADN contendo uma CpG originalmente não metilada (posição classificadora) e o outro por sua vez fortemente de preferência na respectiva secção, na qual estava originalmente contida uma CpG metilada, antes do tratamento com bissulfito e da amplificação. Neste caso, é dada particular preferência ao amplificado ou aos amplificados marcados por fluorescência ou por radioactividade ou com etiqueta de massa separável, de modo a ser possível detectar, depois da hibridização, os fragmentos ligados aos dois oligonucleótidos de um par com base nesta marcação, e a quantificá-los. Obtém-se uma relação de intensidade, a partir da qual é possível determinar - por exemplo, depois de calibração da experiência com ADN totalmente metilado e não metilado - o grau de metilação na respectiva posição classificadora. Numa matriz de oligómeros destas (figura 1), é possível detectar uma série de fragmentos e de posições classificadoras. É conveniente e preferível que a matriz também contenha oligómeros detectores de posições qualificadoras, com vista ao controlo da experiência, visto que assim é possível determinar a relação do ADN a ser analisado no âmbito da análise para com o ADN de fundo.

As reacções de extensão de primers também podem ser realizadas em oligonucleótidos imobilizados numa fase sólida. Embora não forçosamente necessário, prefere-se a imobilização destes primers, visto que normalmente se deve analisar uma série de posições classificadoras a partir de 27 vários amplificados, podendo isto ser levado a cabo numa fase sólida, portanto numa matriz de oligómeros, de forma significativamente mais fácil e numa experiência. É dada especial preferência a que os primers se encontrem directamente junto a uma posição classificadora e que o prolongamento ocorrido seja apenas de um nucleótido. É dada particular preferência a que apenas se adicione didesoxitimidina e didesoxicitidina como nucleótidos e que estas sejam respectivamente marcadas com um diferente corante fluorescente, sendo em todo o caso também concebíveis e preferidas outras marcações distintivas, tais como etiquetas de massa. Após um tratamento com bissulfito e amplificação, as CG metiladas anteriores encontram-se na forma de CG, e as CG não metiladas então na forma de TG. Por conseguinte, a reacção de extensão de primers leva à incorporação de uma didesoxicitidina ou de uma didesoxitimidina. A partir da relação das marcações fluorescentes respectivamente detectadas para estes dois terminadores, é possível tirar conclusões acerca do grau de metilação da respectiva posição. Também é possível e preferível realizar neste caso a extensão de primer com desoxicitidina e desoxitimidina, caso não se adicione derivado de guanina, indo aliás terminar-se a extensão de primer por consequência numa sequência TG ou CG logo depois de uma base. Além disso, prefere-se igualmente realizar de forma análoga a análise na contracadeia, através da distinção entre CA e CG, e depois de forma correspondente com didesoxi-ATP e didesoxi-GTP ou respectivos derivados.

Uma variante particularmente preferida do processo é, porém, a detecçâo em simultâneo de posições qualificadoras e de posições classificadoras numa experiência, o que pode ser conseguido através da utilização de variantes 28 tecnológicas LightCycler ou TaqMan. Neste caso, adiciona-se além dos oligonucleótidos, responsáveis por uma amplificação preferida do ADN a ser analisado, outros oligonucleótidos marcados com fluorescência, e mede-se a alteração da fluorescência durante a reacção PCR. Neste caso, também se obtém preponderantemente - porque principalmente o ADN a ser analisado é amplificado -informação directamente desta alteração de fluorescência acerca do estado de metilação de diversas posições CpG classificadoras. Dado que diversos oligonucleótidos são, por sua vez, de preferência providos de diferentes corantes de fluorescência, também é possível uma distinção da alteração de fluorescência durante a PCR em separado para diferentes posições.

Esta alteração da fluorescência em função do estado de metilação pode ser conseguida por meio de inúmeros métodos, dos quais dois são aqui apresentados a título de exemplo.

Por um lado, é possível utilizar sondas de oligonucleótidos, que se ligam de forma específica a uma sequência proveniente, através de tratamento químico, de um ADN não metilado na respectiva posição; ou então de forma correspondente a uma sequência proveniente, através de tratamento químico, de um ADN metilado na respectiva posição. Estas sondas são com particular preferência providas de dois corantes fluorescentes: um corante desactivador e um corante fluorescente que serve de marcador. Os dois estão ligados à mesma sonda de oligonucleótidos. Se ocorrer então uma reacção de PCR com o ADN a ser analisado como template, a reacção PCR será nesta situação bloqueada pela sonda de oligómeros marcada com fluorescência. No entanto, visto que esta não é resistente 29 à actividade de nuclease da polimerase, ocorre uma decomposição da sonda ligada ao ADN template durante a reacção PCR, relacionada com a eficiência de ligação da sonda ao template, visto que a sonda não ligada não é decomposta pela polimerase. A decomposição da sonda torna-se então directamente visível, pelo facto que nesse caso o corante desactivador e o corante fluorescente que serve de marcador serem separados um do outro, através dum aumento da fluorescência do corante marcador. Em princípio, trata-se neste caso de uma variante do denominado ensaio TaqMan.

Portanto, prescinde-se do aparecimento dum produto de PCR do ADN a ser analisado, contudo apenas se a posição classificadora analisada também se encontrar no estado de metilação que a sonda pode detectar através de hibridização no ADN quimicamente tratado. Uma contraprova com uma sonda, que se ligaria de forma correspondente à posição classificadora no outro estado de metilação, é por isso conveniente e preferível.

Em termos preferenciais, emprega-se diversos corantes fluorescentes com diferentes comprimentos de onda emitidos a várias sondas, juntamente com o desactivador, de modo a atingir uma diferenciação das sondas e, com isso, uma multiplexagem.

Também num ensaio destes, emprega-se oligonucleótidos de ligação à posição qualificadora, que impedem uma amplificação significativa do ADN de fundo. A amplificação do ADN a ser analisado também pode ser analisada de forma a também se estudar a mesma posição com uma sonda como anteriormente descrito, detectando-se assim a amplificação através de um sonda de ligação a uma posição qualificadora. 30

Neste caso, prefere-se em particular que o oligonucleótido não decomponível se ligue de forma selectiva ao ADN de fundo, enquanto a sonda marcada com fluorescência se ligue ao ADN a ser analisado. Numa variante particularmente preferida do processo, a sonda e o oligonucleótido não decomponível apresentam a mesma sequência até preferencialmente uma nucleobase, mas não mais de duas nucleobases.

Além disso, prefere-se em particular uma variante, na qual as várias posições passíveis de metilação são definidas como posições qualificadoras, utilizando-se para cada uma destas posições pelo menos um oligonucleótido de preferência de ligação ao ADN de fundo, assim como uma sonda. Visto que a amplificação do ADN de fundo é neste caso suprimida por vários oligonucleótidos, este processo adequa-se em particular aos casos em que o excesso de ADN de fundo é particularmente grande em comparação com o ADN a ser analisado. Em muitos casos, face a esta variante e à existência de várias posições qualificadoras num fragmento, não é necessária uma maior análise de posições classificadoras, visto que, com os equipamentos actualmente disponíveis, também não é possível detectar em simultâneo um número arbitrariamente grande de corantes diferentes (na maior parte das vezes trata-se de 4 - 5) . A análise de outras posições classificadoras é então preferencialmente realizada com uma das outras técnicas de detecção acima mencionadas.

Também se prefere ser possível analisar com uma sonda várias posições em simultâneo, em termos do respectivo grau de metilação. 31

Caso se pretenda uma quantificação mais precisa do grau de metilação das posições classificadoras, poder-se-á igualmente empregar de preferência duas sondas concorrentes entre elas com diferentes corantes, indo uma preferencialmente ligar-se no caso de uma posição não metilada no ADN a ser analisado; a outra em vez no caso de uma posição metilada. A partir da relação dos aumentos de fluorescência para os dois corantes, pode tirar-se conclusões acerca do grau de metilação da posição analisada.

Em principio outro processo, no qual também ocorre contudo uma alteração da fluorescência durante a PCR, é actualmente conhecido por tecnologia LightCycler™. Neste caso, aproveita-se o facto de apenas poder ocorrer uma transferência energética de ressonância fluorescente (FRET) entre dois corantes, se estes se encontrarem em directa proximidade, ou seja, a uma distância de 1 - 5 nucleótidos um do outro. Apenas então se pode excitar o segundo corante pela emissão do primeiro corante e, depois, por seu lado, emitir luz com outro comprimento de onda, a qual é então detectada.

No presente caso da análise de metilação, ocorre uma hibridização de uma sonda marcada com fluorescência no ADN quimicamente tratado em questão, numa posição classificadora; e a ligação desta sonda depende por seu turno de se o ADN a ser analisado se encontrava metilado ou não metilado nesta posição. Directamente adjacente a esta sonda, liga-se outra sonda com outro corante fluorescente. Esta ligação ocorre de preferência em função da metilação, se na secção da sequência em causa se encontrar outra posição passivel de metilação. Durante a amplificação 32

aumenta-se então o ADN, pelo que se ligam cada vez mais sondas marcadas com fluorescência na vizinhança da posição em questão, deste que esta apresente o estado de metilação necessário a esse fim, medindo-se por isso uma FRET crescente.

Também neste processo ocorre de preferência uma multiplexagem com várias sondas diferentes marcadas com fluorescência.

Também neste caso é possível e preferível, que se meça uma posição qualificadora. Partindo do princípio que o ADN de fundo se encontra não metilado na posições em causa, e que resulta um dinucleótido TG nesta posição após tratamento químico e amplificação; e que, em contrapartida, o ADN a ser analisado e metilado dá origem a um dinucleótido CG, uma sonda marcada com fluorescência ligar-se-á à sequência contendo um CG; enquanto um oligómero concorrente, que não está marcado, se liga à respectiva sequência TG do ADN de fundo.

Neste caso, é importante que o oligonucleótido não metilado iniba a amplificação devido à sua temperatura de fusão claramente mais elevada, ao contrário dos oligonucleótidos das sondas mais curtos. Nesta medida, as sondas e os oligómeros que se ligam ao ADN de fundo quimicamente tratado não são idênticos a não ser em até poucas bases, sendo em vez essencialmente mais compridos (em 5-15 bases) . Também é em compensação possível e preferível empregar oligonucleótidos modificados e/ou ANP. Também neste caso, todas as sondas e todos os oligonucleótidos estão bloqueados até ao primer na sua extremidade 3', de modo a impedir um prolongamento na PCR. Isto pode ocorrer, 33 por exemplo, com um grupo fosfato.

Os dois processos distinguem-se no resultado, principalmente pelo facto de, num caso, se medir uma redução da fluorescência, e, no outro caso, um aumento da fluorescência. Em ambos os casos, foi possível medir tanto posições qualificadoras como classificadoras.

Em suma, dá-se particular preferência a um processo destinado à detecção de metilação de citosina em amostras de ADN, no qual se realiza as seguintes etapas: primeiro, trata-se quimicamente uma amostra de ADN genómico, a qual inclui ADN a ser analisado e ADN de fundo, de modo a que todas as bases citosina não metiladas sejam transformadas em uracilo, enquanto as bases 5-metilcitosina permanecem inalteradas; depois amplifica-se a amostra de ADN quimicamente tratada, mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers, assim como de uma polimerase, indo o ADN a ser analisado ser preferido em comparação com o ADN de fundo como template; e indo analisar-se, na etapa seguinte, os amplificados e concluir-se, a partir da existência de um amplificado e/ou a partir da análise de outras posições, acerca do estado de metilação no ADN a ser analisado.

Numa variante processual particularmente preferida, o ADN de amostra é obtido de linfa ou de outros fluidos corporais de um indivíduo. Prefere-se, do mesmo modo, que o ADN de amostra seja obtido de linhas celulares, sangue, expectoraçâo, fezes, urina, linfa, líquido céfalo-raquidiano, tecido incorporado em parafina, por exemplo tecido de olhos, intestino, rim, cérebro, coração, 34 próstata, pulmão, mama ou fígado, lâminas histológicas e todas as combinações possíveis destes.

Numa variante particularmente preferida do processo, o tratamento químico é realizado com um bissulfito (= dissulfito, hidrogenossulfito). Também se prefere que o tratamento químico seja feito depois da incorporação do ADN em agarose. Também se prefere ainda que, no tratamento químico, esteja presente um reagente desnaturante da cadeia dupla de ADN e/ou um captor de radicais.

Numa variante processual particularmente preferida, a amplificação é realizada na segunda etapa na presença de pelo menos outro oligonucleótido, o qual se liga a um dinucleótido 5'-CG-3', a um dinucleótido 5'-TG-3' ou a um dinucleótido 5'-CA-3', indo o outro oligonucleótido de preferência ligar-se ao ADN de fundo, e indo prejudicar a respectiva amplificação.

Além disso, é dada particular preferência a que a amostra de ADN quimicamente tratada na segunda etapa, seja amplificada mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers e de outro oligonucleótido, que se hibridiza num dinucleótidos 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de pelo menos um oligonucleótido repórter, que se hibridiza num dinucleótido 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de uma polimerase; indo o outro oligonucleótido ligar-se de preferência ao ADN de fundo, prejudicando a respectiva amplificação; e indo o oligonucleótido repórter ligar-se de preferência ao ADN a ser analisado, mostrando a respectiva amplificação. 35

Também se prefere utilizar, além do oligonucleótido repórter, outro oligómero marcado com corante fluorescente, que se hibridiza directamente adjacente ao oligonucleótido repórter; e que se possa detectar esta hibridização por meio de transferência energética de ressonância fluorescente (FRET).

Com especial preferência, realiza-se um ensaio TaqMan para fins de análise. Também é dada preferência à realização dum ensaio LightCycler (como acima descrito).

Com especial preferência, os oligonucleótidos utilizados além dos primers não dispõem duma função 3'-OH. Além disso, os oligonucleótidos repórteres têm com particular preferência pelo menos uma marcação de fluorescência.

Prefere-se em particular que as moléculas repórter mostrem a amplificação através dum aumento ou de uma redução da fluorescência, e que o aumento ou a redução da fluorescência também seja directamente empregue na análise; e se conclua, a partir do sinal de fluorescência, acerca dum estado de metilação do ADN a ser analisado.

Numa variante processual particularmente preferida, a análise ou a maior análise ocorre por meio de hibridização em matrizes de oligómeros, podendo os oligómeros ser ácidos nucleicos ou moléculas semelhantes em termos das respectivas propriedades de hibridização, como os ANP. Em termos preferenciais, os oligómeros hibridizam sobre uma secção com um comprimento de 12 - 22 bases no ADN a ser analisado, e incluem um dinucleótido CG, TG ou CA. Com este método, detecta-se de preferência o estado de metilação de mais de 20 posições de metilação do ADN a ser analisado 36 numa experiência, com particular preferência mais de 60 posições de metilação.

Também se dá particular preferência a um processo, no qual a maior análise ocorre por medição do comprimento do ADN a ser analisado amplificado, indo os métodos de medição do comprimento incluir electroforese em gel, electroforese capilar em gel, cromatografia (por exemplo, HPLC), espectrometria de massa e outros métodos apropriados.

Particularmente preferido é também um processo, no qual a maior análise é feita por sequenciação, indo os métodos de sequenciação incluir os métodos de Sanger, de Maxam-Gilbert e outros métodos como a sequenciação por hibridização (SBH). Por sua vez preferido é um processo em que a sequenciação (de acordo com Sanger) é realizada para cada ou para um pequeno grupo de posições CpG, com respectivamente um oligonucleótido primer separado; e em que o prolongamento do primer apenas perfaz uma ou poucas bases; e em que se conclui, a partir do tipo de prolongamento do primer, acerca do estado de metilação das posições em questão no ADN a ser analisado.

Numa variante processual particularmente preferida, conclui-se, a partir do grau de metilação em diferentes posições CpG analisadas, acerca da existência de uma doença ou de outro estado médico do paciente.

Com especial preferência, os próprios amplificados são providos de uma marcação detectável para fins de detecção. Estas marcações tratam-se preferencialmente de marcações fluorescentes, radionuclidos ou marcações de massa separáveis, que são detectadas num espectrómetro de massa. 37

Além disso, prefere-se um processo no qual um dos primers está ligado a uma fase sólida na amplificação.

Também se prefere uma variante processual, em que os amplificados são ao todo detectados no espectrómetro de massa e são assim caracterizados de forma inequívoca pela respectiva massa.

Outro objecto da presente invenção é a utilização de um dos processos descritos, no diagnóstico e/ou no prognóstico de acontecimentos desfavoráveis aos pacientes ou indivíduos, indo estes acontecimentos desfavoráveis pertencer a pelo menos uma das seguintes categorias: efeitos indesejados de medicamentos; doenças cancerígenas; disfunções, danos ou doença do SNC; sintomas agressivos ou distúrbios comportamentais; consequências clínicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; distúrbios psicóticos e distúrbios de personalidade; demência e/ou síndromas associados; doença, disfunção e danos cardiovasculares; disfunção, danos ou doença do tracto gastrointestinal; disfunção, danos ou doença do sistema respiratório; ferimento, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danos ou doença do corpo como desvio ao processo de desenvolvimento; disfunção, danos ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danos ou doença endócrina/os e metabólica/os; dores de cabeça ou disfunção sexual. É dada ainda preferência à utilização de um dos processos descritos, na distinção de tipos de células ou de tecidos ou na investigação da diferenciação celular.

Outro objecto da presente invenção consiste num kit 38 composto por um reagente contendo bissulfito, por primers e por outros oligonucleótidos sem função 3'-OH, no fabrico dos amplificados, assim como opcionalmente por uma orientação para levar a cabo pelo menos uma das variantes processuais descritas.

Os exemplos que se seguem explicam a invenção:

Exemplo 1: Amplificação sensível a metilação do gene MDRl, mediante a utilização de amostras de bloqueio de ANP (PCR clamping) no gene MDR-1 a) PCR especifica de metilação com sondas de ANP (amostras de bloqueio de ANP), cujos pontos de ligação não se sobrepõem aos dos primers

Primeiro, definiu-se as condições da PCR para ADN tratado com bissulfito, sob as quais é reconhecível uma influência especifica de alelo da amostra de bloqueio de ANP sobre a PCR. Nesta primeira experiência, não há sobreposição dos pontos de ligação entre ANP e os primers.

Primeiro, testou-se numa experiência a influência de um ANP llmero da sequência AAAATGTGTT numa PCR com os primers TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG e TAAAAACTATCCCCATAATAACTCCCAAC. Uma influência do ANP sobre a reacção PCR não é mensurável sob as condições padrão da PCR, a uma temperatura de hibridização de 55°C. 0 programa cycler padrão utilizado para a amplificação do fragmento MDRl recorre às seguintes etapas programadas:

Etapa 1: T = 96°C Etapa 2: T = 96°C 20 min 30 s 39

Etapa 3: T = 56°C 1,15 min

Etapa 4: T = 72°C 2,00 min

As etapas 2 a 4 são percorridas 40 vezes como ciclo.

Etapa 5: T = 72°C 15 min

Etapa 6: arrefecimento para os 4°C e manutenção da temperatura.

Por consequência, é necessário adaptar o comprimento dos primers, a temperatura de hibridização e o comprimento de amostra de ANP de forma óptima, de modo a atingir uma supressão especifica de alelo da amplificação. De modo a permitir uma hibridização óptima aos primers e ao ANP, testou-se numa reacção PCR primers 21mero mais curtos TAAGTATGTTGAAGAAAGATT e AATCCCCATAAACTTACCAAA com um ANP 13mero mais comprimido AAAGACGTGTTAT. Outras experiências foram realizadas com primers 18mero, 19mero e 20mero, que se distingem das sequências anteriores apenas pelo facto de serem suprimidas bases na extremidade 3'. Os primers 21mero foram testados com um gradiente da temperatura de hibridização. Numa preparação paralela, adicionou-se o ANP 13mero AAAGACGTGTTAT respectivamente o ANP AAAGATGTGTTAT adaptado a uma sequência proveniente dum alelo não metilado, em diversas concentrações de 20 - 100 pmol/μΐ. Uma influência clara sobre a PCR foi observada com temperaturas de hibridização de 49,4°C e de 46,7°C, com a adição do ANP numa concentração de 70 e 100 pmol/μΐ. O efeito mais notório verificou-se com a utilização de um primer 18mero.

Analisou-se então em que medida uma temperatura de extensão mais baixa de 54°C influi no efeito de inibição dos ANP. Neste intuito, juntou-se a uma preparação de PCR, respectivamente os ANP 13mero acima mencionados ou os dois 40 ANP 13mero em conjunto numa concentração de 50 e 70 pmol/μΐ. Era observável uma clara supressão da PCR em comparação com o controlo positivo sem ANP (figura 2, electroforese em gel de agarose, concentrações dos ANP para as sondas de ANP 13mero utilizadas; anotação: MDR1-5FM: ANP 13mero AAAGACGTGTTAT; MDR1-5FU: ANP 13mero AAAGATGTGTTAT). As experiências sugerem que o ADN utilizado nas experiências se encontrava preponderantemente não metilado nas posições em questão, o que pôde ser confirmado por sequenciação com bissulfito. Portanto, é já possível mostrar nesta experiência uma clara especificidade de alelos da amostra de bloqueio de ANP, o que leva a uma amplificação preferida dos fragmentos não metilados. b) PCR específica de metilação com sondas de ANP (amostras de bloqueio de ANP), cujos pontos de ligação se sobrepõem aos dos primers ("exclusão de primer")

Nas experiências anteriores, os primers foram escolhidos de modo a que a sequência alvo de ANP se encontrasse aproximadamente ao meio da área a ser amplificada. A disposição terá sido descrita como mais sensível, se a sequência do primer e a do ANP estivessem adjacentes ou se sobrepusessem. Numa ligação específica da sequência do ANP, deveria observar-se nesta disposição um efeito do ANP logo no caso de menores concentrações de ANP.

Para esta experiência escolheu-se um primer com a sequência TTATGTGAATTTTGAAAG, de modo a sobrepor-se à sequência de ANP (exclusão de primer). Numa preparação de reacção, adicionou-se os dois ANP 13mero AAAGACGTGTTAT e AAAGATGTGTTAT em 3 concentrações diferentes. Uma supressão total da reacção PCR foi logo conseguida com uma 41 concentração de 25 pmol/μΐ. Na experiência precedente, só era reconhecível uma supressão total da PCR, no caso da adição dos dois ANP numa concentração de 70 pmol/μΐ. c) Exclusão de primer com fragmentos correspondentes a ADN não metilado

Para detectar uma ligação específica de sequência, estudou-se noutras experiências a acção dos ANP sobre os templates bem caracterizados em termos de estado de metilação. O ADN template utilizado nesta experiência correspondia a um ADN totalmente não metilado tratado com bissulfito. Este foi empregue como template numa PCR. Nesse intuito, empregou-se as seguintes etapas programadas:

As etapas 2 a 4 são percorridas 36 Etapa 5: T = 72°C 15 min Etapa 6: arrefecimento para os temperatura. vezes como ciclo. 4°C e manutenção da

Etapa 1: T = 96°C 20 min Etapa 2: T = 96°C 30 s Etapa 3: T = 49°C 1,15 min Etapa 4 : T = 54 °C 2,00 min À preparação de reacção, adicionou-se os 13meros como acima descrito em 3 concentrações diferentes. Neste caso do template não metilado, esperar-se-ia que o ANP MDR1-5-FU (3) adaptado a este template tivesse uma influência claramente mais forte do que o MDR1-5-FM (3) . Na figura 3 (para anotação ver a figura 2) está apresentado que isto também se verifica com concentrações de ANP relativamente baixas. 42

Estes resultados mostram que a supressão da reacção PCR possibilita amplificações específicas de metilação através de ANP de ligação específica. Em experiências de controlo com ANP não complementares do MDR-1, foi possível mostrar que estes ANP não exercem influência significativa sobre a PCR, no caso das concentrações em questão (não mostrado).

Exemplo 2: Amplificação sensível a metilação de um fragmento do gene GSTpi

Determinadas posições CpG do gene GSTpi foram identificadas como marcadores tumorais do cancro da próstata. No caso do par de primers escolhido para as experiências GGAAAGAGGGAAAGGTTTT e TACTAAAAACTCTAAACCCCAT, um primer está localizado de modo a estar exactamente adjacente à sequência de ANP CCCCGAAAACGCG (OU CCCTGAAAATGTG). A sequência de ANP inclui, na diferença para os ANP utilizados para o fragmento MDR1, apenas três posições CpG relevantes. As CpG relevantes a serem analisadas do fragmento GSTpi encontram-se em ADN "normal", ou seja, não em ADN não metilado proveniente de pacientes com tumores. 0 ANP "GSTP-down" deitado na preparação de reacção com a sequência CCCTGAAAATGTG deverá, por conseguinte, ter uma influência reconhecível sobre a reacção PCR, mas não o respectivo ANP "GSTP-up" CCCCGAAAACGCG. Juntou-se à preparação da experiência o ANP "GSTP-down" em três concentrações diferentes. Testou-se um gradiente da temperatura de hibridização.

Os resultados da experiência encontram-se representados na figura 4. A supressão mais forte da PCR através da adição do ANP (GSTP-down), pode ser detectada a uma temperatura de hibridização de 55°C. Em comparação com o controlo positivo 43 (sem adição de ANP), é possível reconhecer que a reacção PCR pôde ser suprimida de forma significativa logo através da adição do ANP numa concentração de 20 mol/μΐ.

Em seguida confrontou-se - de modo a detectar uma ligação específica de sequência (e com isso por último sensível a metilação) - a influência dos ANP "GSTP-up" e "GSTP-down" sobre as amplificações de um ADN não metilado na amostra, e de um ADN metilado proveniente de tecido de tumor da próstata como template. O ADN não metilado e o ADN da próstata foram empregues como template numa PCR. Juntou-se à preparação de reacção, os ANP "GSTP-up" ou "GSTP-down" em três concentrações diferentes. A adição do ANP "GSTP-down" tem uma influência visível sobre o template down-metilado: a PCR é totalmente suprimida com a adição do ANP numa concentração de 70 pmol/μΐ. No caso da adição do ANP "GSTP-up" é, em contrapartida, apenas reconhecível um efeito de inibição fraco por parte do ANP sobre a PCR. A adição do ANP "GSTP-up" ao ADN de teste de tecido de próstata tem um efeito consideravelmente inibidor sobre a PCR (figura 5) . A adição do ANP numa concentração de 20 pmol/μΐ já suprime de forma clara a PCR. Uma supressão total da PCR pode ser detectada no caso de uma adição do ANP numa concentração de 50 pmol/μΐ. Em contrapartida, a adição do ANP "GSTP-down" ao ADN de próstata tem um efeito claramente menor. Também uma adição do ANP numa concentração de 70 pmol/μΐ não suprime totalmente a PCR.

As experiências mostram ser possível suprimir de forma 44 selectiva, por meio de sondas de oligómeros de bloqueio, a amplificação de alelos metilados ou não metilados em posições definidas. No sentido desta invenção, as posições em causa servirão de posições qualificadoras, ou seja, suprimir-se-á de forma selectiva a amplificação de templates indesejadamente metilados do ADN de fundo.

Exemplo 3: Diversas possibilidades de utilização de sondas de supressão da PCR com especificidade de metilação no exemplo do gene GSTpi

Na figura 6 encontram-se representadas várias possibilidades de como, numa certa sequência de template, os primers devem estar dispostos com vista a uma amplificação sensível a metilação. Para fins elucidativos, a figura 6a mostra os templates existentes depois do tratamento com bissulfito; o ADN 1 em conformidade com uma amostra de ADN originalmente metilada, o ADN 2 em conformidade com uma amostra de ADN originalmente não metilada. A figura 6b mostra a disposição de um dos primers no sentido de uma PCR específica de alelos ou de uma PCR específica de metilação (MSP). Neste caso, só seria possível realizar a amplificação do ADN 1 metilado mediante a utilização do primer mostrado.

As figuras 6c e 6d mostram como é possível empregar em conformidade primers específicos de não metilação, seja mediante a utilização de posições degeneradas (6c) ou então de bases universais (aqui a irosina) na figura 6d.

Na figura 7 encontram-se representadas várias possibilidades de dispor, no caso de uma certa sequência de template, primers e sondas ("bloqueadores"), tendo em vista 45 uma amplificação sensível a metilação. Nestes exemplos, os primers utilizados não são eles próprios específicos de metilação, atingindo-se a especificidade de metilação unicamente através das sondas ("bloqueadores") . Para o ADN 1 e para o ADN 2, emprega-se sondas específicas como bloqueadores, respectivamente.

Na figura 7a não ocorre a sobreposição de primer e de sonda, indo a sonda em vez juntar-se directamente à extremidade 3' do primer. A sonda representada é um oligonucleótido modificado na extremidade 3', que não pode ser ele próprio prolongado na amplificação. De modo análogo, também é possível utilizar ANP, que neste exemplo têm contudo de ser mais curtos em conformidade com a respectiva temperatura de fusão. Na figura 7b emprega-se os mesmos primers, ocorrendo contudo aqui a sobreposição da sonda de ADN ao primer (exclusão de primer).

Na figura 7c e na 7d ocorre a sobreposição de um primer provido de posições degeneradas e da sonda específica de metilação. De modo análogo, também se pode empregar bases universais nos primers.

Na figura 8 está de forma análoga representado um exemplo com forward-primer e reverse-primer, no qual se utiliza uma sonda que não se sobrepõe a nenhum dos primers.

Estes exemplos deverão explicar as inúmeras possibilidades de utilização de sondas de oligómeros na amplificação específica de metilação, de modo a suprimir o ADN de fundo face ao ADN a ser analisado. No entanto, o âmbito da invenção não se deverá restringir às execuções aqui apresentadas a título de exemplo. 46

Exemplo 4: Fabrico de ADN não metilado e metilado e tratamento com bissulfito

No fabrico de ADN metilado, tratou-se ADN genómico humano com S-adenosilmetiona e com a CpG metilase (Sssl, New England Biolabs) segundo as instruções do fabricante. No fabrico de ADN não metilado, amplificou-se o fragmento genético ELK-1 com OS primers GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA (SEQ-ID: 1) e AGGTGGTGGTGGCGGTGG (SEQ-ID: 2) a partir de ADN genómico humano, por meio de PCR. 0 ADN não metilado e metilado assim produzido, assim como o ADN genómico humano, foram tratados mediante a utilização de bissulfito (hidrogenossulfito, dissulfito), de modo a que todas as citosinas não metiladas na posição 5 da base fossem modificadas de modo a surgir uma base diferente em relação ao comportamento de emparelhamento de bases, enquanto as citosinas metiladas na posição 5 permanecem inalteradas. Caso se utilize na reacção bissulfito numa concentração compreendida entre 0,1 moles e 6 moles, então ocorrerá uma adição às bases citosina não metiladas. Além disso, é necessário que estejam presentes um solvente ou um reagente desnaturante e um captor de radicais. Uma posterior hidrólise alcalina leva então à transformação de nucleobases de citosina não metiladas em uracilo. Este ADN transformado serve para detectar citosinas metiladas.

Exemplo 5: Fabrico das sondas genéticas marcadas com Cy5 A partir das amostras de ADN tratadas com bissulfito, amplifica-se cada fragmento definido com o comprimento de 595 bp da região promotora do gene ELK-1. A amplificação é realizada com os oligonucleótidos primers ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT (SEQ-ID: 3) e 47 TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT (SEQ-ID: 4). Através da utilização de oligonucleótidos primers marcados com o corante fluorescente Cy5, o fragmento é directamente marcado na PCR. Como ADN de matriz, utiliza-se ADN tratado com bissulfito (hidrogenossulfito, dissulfito) (1) não metilado, (2) metilado e (3) genómico humano. Em seguida, analisa-se estes três fragmentos diferentes de ADN em hibridizações separadas, relativamente ao seu grau de metilação numa posição CpG específica.

Exemplo 6: Realização da hibridização e avaliação de um "chip" de ADN hibridizado

As sondas genéticas produzidas no exemplo 5 são hibridizadas num chip de ADN. No chip tinha-se previamente imobilizado oligonucleótidos. As sequências de oligonucleótidos derivam do fragmento amplificado nomeado no exemplo 2 do gene ELK-1, e representam os dinucleótidos CG, que englobam o ambiente directo. O comprimento dos oligonucleótidos é de 14 - 22 nucleótidos, a posição do dinucleótido CG dentro dos oligonucleótidos é variável. Depois da hibridização, faz-se o varrimento do chip de ADN (ver a figura 1) e avalia-se numericamente os sinais de hibridização (as datas não são mostradas) . 0 resultado da hibridização para os oligonucleótidos CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5) e CTACTCAACAAAAACAA (SEQ-ID: 6) é mostrado na figura 1. Neste caso, o CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5) hibridiza-se de preferência se a citosina do fragmento de ELK-1, que se encontra na posição 103 do amplificado, estiver metilada; CTACTCAACAAAAACAAA (SEQ-ID: 6) se esta citosina não estiver metilada.

Na figura 1 está representado um chip de ADN após 48 hibridização com o fragmento promotor. Está representada a imagem de cores erróneas produzida depois do varrimento. Em contraste com a reprodução a preto e branco aqui representada, o scanner produz uma imagem a cores. A intensidade das diversas cores representa o grau de hibridização, indo este grau de hibridização decrescer de vermelho (que se reconhece na figura 1 como ponto claro) para azul (que se reconhece na figura 1 como ponto escuro).

Exemplo 7: Fabrico do ADN template e estabelecimento da PCR de GSTpl

Como ADN template, usou-se ADN humano de sangue periférico (Promega, Madison EUA), não tratado e enzimaticamente metilado in vitro, que foi sujeito a um tratamento com bissulfito. Para a metilação de todos os dinucleótidos CG, transformou-se 6 pg de ADN num volume de reacção de 150 μΐ com Sssl (New England Biolabs, Frankfurt/Main), segundo as instruções do fabricante. O tratamento com bissulfito ocorreu de acordo com um processo publicado (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method of bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24(24): 5064-6).

Um fragmento de 153 bp de GSTpl (posição 1242 - 1393 na sequência com o n.° de conta M24485.1) foi amplificado com o primer específico de ADN-bissulfito 2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT e 2cr TCCTAAATCCCCTAAACC num volume de reacção de 25 μΐ (1 x tampão de reacção, Qiagen; 1 U HotstarTaq, Qiagen; dNTP cada 200 μΜ, cada primer 500 nM, 0,05 - 10 ng de ADN template tratado com bissulfito) sob as seguintes condições da PCR (95°C - 15 min; 46 ciclos: 96°C 49 - Ο : 45 min, 52°C - Ο : 45 min, 72°C - O : 20 min; 72°C -10 min) (ver a figura 9 e a 10) . Através da sequenciação dos fragmentos do GSTpl, foi possível mostrar que o ADN humano de sangue periférico não tem para este fragmento nenhuns dinucleótidos CG metilados, indo, no ADN tratado com Sssl, todos os dinucleótidos CG encontrarem-se na forma metilada (ver a figura 9) . A sequenciação do fragmento do GSTpl confirmou outros resultados (ver, por exemplo, o WO 9955905), de que, no gene GSTpl, ao contrário da sequência publicada (n.° de conta do banco de genes M24485.1), existe um nucleótido G adicional (entre as posições 1273 e 1274 no n.° de conta M24485.1 do banco de genes; posição 33 no fragmento de PCR GSTpl, ver a figura 9) . Em termos da eficiência da PCR, não existe diferença entre o ADN template CpG-metilado e CpG-não metilado (ver a figura 10).

Exemplo 8: Amplificação selectiva de fragmentos de GSTpl metilados

Na figura 11 está representada em esquema a concepção experimental para a amplificação selectiva de fragmentos de GSTpl metilados. A amplificação do fragmento de GSTpl com os primers 2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT e 2 cr TCCTAAATCCCCTAAACC em ADN template não metilado é impedida por dois oligonucleótidos bloqueadores (B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P; B15 + 17RT11, TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P, ver a figura 11), cuja sequência corresponde ao ADN tratado com bissulfito e não metilado. Estes oligonucleótidos estão modificados na extremidade 3' por um grupo fosfato, de modo a impedir a sua extensão durante a PCR. A PCR foi realizada num volume de reacção de 25 μΐ com o seguinte programa cycler (95°C - 15 min; 46 ciclos: 96°C - 0 : 45 min, 52°C - 0 : 45 min, 72°C - 0 : 20 50

min; 72°C - 10 min) . A preparação da PCR tinha a seguinte composição: 1 x tampão de reacção (Qiagen, Hilden); 2 U

HotstarTaq (Qiagen, Hilden); dNTP cada 200 μΜ, cada primer 500 nM, cada bloqueador 10 μΜ (B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P e B15 + 17RT11, TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P) , 20 ng - 20 pg de ADN template tratado com bissulfito. Sob estas condições de PCR, foi possível suprimir totalmente a amplificação do fragmento GSTpl em 25 μg de ADN template não metilado (ver a figura 12 A vestígio 8) . Se a PCR tiver sido realizada sem oligonucleótidos de bloqueio, então o fragmento de GSTpl terá sido amplificado (ver a figura 12, D vestígio 8) . Em contrapartida, foi possível detectar o produto de PCR do GSTpl sob as mesmas condições de PCR, com e sem oligonucleótidos bloqueadores, em 100 pg de ADN template metilado (ver a figura 12, C vestígio 7, F vestígio 7) . A sensibilidade absoluta da PCR encontra-se assim nos pelo menos 100 pg de ADN template metilado.

De modo a estudar a sensibilidade relativa da PCR, produziu-se misturas de ADN template metilado e não metilado, nas quais a relação de ADN não metilado para ADN metilado era de 1 : 1 a 1 : 1 000. Para o fabrico destas misturas de ADN, misturou-se ADN humano de sangue periférico (Promega Madison; EUA), com ADN tratado com Sssl (ver o exemplo 7), em conformidade com as relações a serem atingidas, e sujeitou-se então a um tratamento com bissulfito. Os resultados da PCR nestas misturas de ADN template (25 pg de ADN total), obtidos com e sem oligonucleótidos bloqueadores, estão representados na figura 12 A,B ou na figura 12 D,E. Mostram que é possível detectar de forma reproduzível uma cópia do gene GSTpl 51 metilado num fundo de 200 cópias do gene GSTpl não metilado (ver a figura 12 A vestígio 6, B vestígio 6). Uma sensibilidade relativa de 1 : 1 000 parece poder ser atingida através de uma maior optimização da condição da PCR (ver a figura 12 B vestígio 7). A análise da sequência dos produtos de PCR, amplificados a partir da mistura de ADN (1 : 200, relação de ADN não metilado para ADN metilado), com (ver a figura 12 A vestígio 6) e sem B (ver a figura 12 D vestígio 6) bloqueador mostrou o resultado esperado. O produto de PCR gerado na PCR sem bloqueador, correspondia a um gene GSTpl não metilado, pelo que o fragmento do gene GSTpl, produzido na PCR com oligonucleótidos bloqueadores, tinha um estado epigenético metilado.

Também se testou com êxito outra modificação 3', como ddNTP ou nucleótidos adicionais, que não correspondem à respectiva sequência de nucleótido do GSTpl.

Exemplo 9: Amplificação selectiva de fragmentos do GSTpl metilados num LightCycler O LightCycler (Roche) é um equipamento para realizar a PCR e para a detecção simultânea e para a análise dos produtos de PCR. O manuseamento do equipamento ocorreu de acordo com as instruções do fabricante. A análise quantitativa e qualitativa da PCR foi feita com a versão 3.5 do software do LightCycler. A amplificação selectiva de fragmentos do gene GSTpl metilados foi realizada em 10 μΐ de volume de reacção (1 x tampão de reacção (Quiagen, Hilden); 5 U HotstarTaq 52 (Quiagen, Hilden); cada dNTP 250 μΜ, cada primer 625 nM (2cf, GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT; 2cr, TCCTAAATCCCCTAAACC, bloqueador 4 μΜ (B5 + 9FT16, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGTT-P), 0,25 μς/μΐ de BSA (Sigma, Munique), 250 nM de oligonucleótidos âncora (GSTpl-Fluo, TTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT-fluorescência; TibMolBiol, Berlim), 250 nM de sonda de hibridização (GSTpl-Red 705, Red705-GTATTAGGTTTGGGTTTTTGGT-P; TibMolBiol, Berlim e/ou GSTpl-Red 650, Red650-TAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGG-P, TibMolBiol, Berlim), 20 ng - 20 pg de ADN template, com o seguinte programa cycler: 95°C - 15 min; 46 ciclos: desnaturação 96°C - 4 s, hibridização 52°C - 30 s, extensão 72°C - 20 s. A detecção ocorreu em cada ciclo de amplificação, através de sondas de detecção LightCycler especificas de gene e de metilação, na etapa de hibridização passados 10 s. A detecção do fragmento de PCR do GSTpl terá ocorrido se tanto a sonda âncora especifica de metilação, GSTpl-Fluo, como uma das sondas especificas de metilação GSTpl-Red 705 ou GSTpl-Red 650 hibridizarem com o fragmento da PCR.

Para testar a especificidade de metilação das sondas de detecção, amplificou-se cada 15 ng de ADN template metilado e não metilado, tratado com bissulfito no LightCycler. Para fins de detecção, a PCR continha a sonda âncora GSTpl-Fluo e uma mistura equimolar da sonda de hibridização GSTpl-Red 705 e GSTpl-Red 650. A fluorescência da sonda, para o gene GSTpl metilado, GSTpl-Red 650 foi medida no canal de detecção F2/F1 do LightCycler, detectando-se a sonda para o gene GSTpl não metilado, GSTpl-Red 705, no canal F3/F1 (ver a figura 3) . As experiências mostraram que a GSTpl-Red 650 detecta especificamente o gene GSTpl metilado, a versão não 53 metilada não gerou qualquer sinal de fluorescência (ver a figura 13 A) . A sonda GSTpl-Red 705 detectou, pelo contrário, o gene GSTpl não metilado e o metilado, o último com uma eficiência significativamente menor (ver a figura 13 B) . A sensibilidade absoluta e relativa da amplificação do fragmento do GSTpl metilado foi analisada em analogia com o exemplo 8. Para determinar a sensibilidade absoluta, as PCR do GSTpl foram realizadas com diferentes quantidades de ADN template tratado com bissulfito e metilado no LightCycler, com e sem oligonucleótido bloqueador. Para fins de detecção, utilizou-se, a par da sonda "âncora", a sonda de hibridização GSTpl-Red650. Os resultados encontram-se reunidos na figura 14. O cálculo dos "Crossing points" foi feito com a versão 3.5 do software do LightCycler e indica o número de ciclos da PCR, em que foi possível detectar pela primeira vez o produto da PCR do GSTpl com um sinal maior do que o controlo negativo. Isto significa que, quanto mais baixo for o valor de "Crossing point", de forma mais eficiente terá ocorrido a amplificação do fragmento do GSTpl. Nenhuma indicação do "Crossing point" significa que não foi possível detectar nenhum produto da PCR. Na experiência representada, o GSTpl também pôde ser amplificado na presença do bloqueador, com 75 pg de ADN template tratado com bissulfito e metilado (ver a figura 14) .

Para determinar a sensibilidade relativa, foram realizadas PCR do GSTpl com 20 ng das misturas de ADN template (ver o exemplo 8) com e sem oligonucleótidos bloqueadores (figura 15) . Para fins de detecção, a PCR continha uma sonda âncora GSTpl-Fluo e uma mistura equimolar da sonda de hibridização 54 GSTpl-Red 705 e GSTpl-Red 650. A fluorescência da sonda para o gene GSTpl metilado, a GSTpl-Red 650, foi medida no canal de detecção F2/F1 do LightCycler, detectando-se a sonda para o gene GSTpl não metilado, a GSTpl-Red 705, no canal F3/F1.

Os "crossing points" determinados mostraram que é possível detectar de forma reproduzível numa PCR com oligonucleótido bloqueador, uma cópia do gene GSTpl metilado, num fundo de 500 cópias do gene GSTpl não metilado (ver a figura 15, posição do rotor 17, coluna F2/F1). Isto correspondia a uma sensibilidade absoluta de 40 pg de ADN template metilado. Sem oligonucleótidos bloqueadores, foi apenas possível atingir uma sensibilidade relativa de 1 : 10 (ver a figura 15, posição do rotor 3, coluna F2/F1) . Sob as mesmas condições, suprime-se completamente a amplificação do gene GSTpl de 15 ng de ADN template tratado com bissulfito e não metilado (ver a figura 15, posição do rotor 19 e 9, coluna F3/F1) .

Exemplo 10: Amplificação selectiva de fragmentos do GSTpl metilados num TaqMan O TaqMan (Applied Biosystems, Weiterstadt) é outro equipamento para realizar a PCR e em simultâneo para a detecção e para a análise dos produtos da PCR. O manuseamento do equipamento foi feito de acordo com as instruções do fabricante. A análise quantitativa e qualitativa da PCR ocorreu com o software TaqMan. A amplificação selectiva de fragmentos do gene GSTpl metilados foi realizada em 20 μΐ de volumes de reacção (1 x tampão de reacção (Applied Biosystems); 2 U Amplitaq Gold 55 (Applied Biosystems); 3,5 mM MgC12, cada dNTP 400 μΜ, cada primer 500 mM (2 cft, GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGTA; 2cr, TCCTAAATCCCCTAAACC, bloqueador 1 7,5 μΜ (B5 + 9FT6, GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P) , bloqueador 2 7,5 μΜ (B15 + 17RT19, TAAACCCCCATCCCAAATCTC-P), 450 nM sonda TaqMan (Taq 1, black hole-TAATTCGTAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGGTAGGG-FAM; Biosearch Technologies), 10 ng de ADN template) com o seguinte programa cycler: 95°C - 10 min; 3 ciclos: desnaturação 96°C - 15 s, hibridização 60°C - 60 s; 3 ciclos: desnaturação 96°C - 15 s, hibridização 58°C- 30 s, extensão 60°C - 30 s; 3 ciclos: desnaturação 96°C - 15 s, hibridização 55°C - 30 s, extensão 60°C - 30 s; 40 ciclos: desnaturação 96°C - 15 s, hibridização 52°C - 30 s, extensão 60°C - 40 s). A detecção ocorreu em cada ciclo de amplificação, através das sondas TaqMan especificas de gene depois da etapa de extensão.

Para determinar a sensibilidade relativa, realizaram-se PCR do GSTpl com 10 ng das misturas de ADN template (ver o exemplo 8) com e sem oligonucleótidos bloqueadores (figura 16). O cálculo do ciclo limiar (threshold cycle) ocorreu por meio do software TaqMan e fornece, relativamente aos valores de "Crossing point" do LightCycler", o número dos ciclos da PCR em que o produto da PCR do GSTpl pôde ser pela primeira vez detectado com um maior sinal do que o controlo negativo. Isto significa que, quanto menor for o valor de ciclo limiar, com maior eficiência terá ocorrido a amplificação do fragmento do GSTpl.

Os valores de ciclo limiar apurados mostraram que, numa PCR com oligonucleótido bloqueador, é possível detectar de forma reproduzível uma cópia do gene GSTpl metilado, num 56 fundo de 200 cópias do gene GSTpl não metilado (ver a figura 16) . Isto corresponde a uma sensibilidade absoluta de 50 pg de ADN template metilado. Sob as mesmas condições, suprime-se totalmente a amplificação do gene GSTpl de 10 ng de ADN template tratado com bissulfito e não metilado (ver a figura 16).

Descrição das figuras

Figura 10: Gel de agarose de fragmentos de PCR do GSTpl. A PCR foi realizada com 10 ng, 5 ng, 1 ng, 0,5 ng e 0,1 ng de ADN template tratado com bissulfito, metilado (A) e não metilado (B).

Figura 11: Sequência do fragmento do GSTpl com posição dos primers e dos oligonucleótidos bloqueadores.

Figura 12: Géis de agarose de fragmentos de PCR do GSTpl. A sensibilidade relativa da amplificação do gene GSTpl metilado (A, B, D, E) e a sensibilidade absoluta (C, F) da amplificação do gene GSTpl metilado foram analisadas. As PCR do GSTpl foram realizadas com oligonucleótido bloqueador (A, B, C) e sem oligonucleótido bloqueador (D, E, F). Empregou-se como ADN template: 20 ng de ADN tratado com bissulfito e metilado (Al, Bl, Dl, El, Cl, Fl, C2, F2) e 20 ng de ADN tratado com bissulfito e não metilado (A8, B8, D8, E8); ADN tratado com bissulfito, metilado e não metilado na relação de mistura de 1 : 2 (A2, B2, D2, E2), 1 : 10 (A3, B3, D3, E3) , 1 : 20 (A4, B4, D4, E4), 1 : 100 (A5, B5, D5, E5) , 1 : 200 (A6, B6, D6, E6) , 1 : 1 000 (A7, B7, D7, E7); 10 ng (C3, F3), 2 ng (C4, F4), 1 ng (C5, F5),

0,2 ng (C6, F6) , 0,1 ng (C7, F7) , 0,02 ng (C8, F8), ADN tratado com bissulfito e metilado e nenhum ADN (A9, D9). 57

Figura 13: Análise da especificidade de metilação das sondas de detecção. A figura mostra a evolução de fluorescência, durante a PCR do GSTpl, de ADN tratado com bissulfito e metilado (linha tracejada) e de ADN tratado com bissulfito e não metilado (linha ponteada), detectados com a sonda de hibridização GSTpl-Red 650 (A) ou GSTpl-Red 705 (B).

Figura 14: Determinação da sensibilidade absoluta da PCR do GSTpl no LightCycler. As PCR do GSTpl foram realizadas com oligonucleótido bloqueador (posição do rotor 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18) e sem oligonucleótido bloqueador (posição do rotor 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 17) . Como ADN template empregou-se: ADN tratado com bissulfito e metilado: 7,5 ng (posição do rotor 1, 9), 3,7 ng (posição do rotor 2, 10), 0,75 ng (posição do rotor 3, 11), 0,37 ng (posição do rotor 4, 12), 0,075 ng (posição do rotor 5, 13), 0,037 ng (posição do rotor 6, 14), 0,015 ng (posição do rotor 7, 15), 0,0075 ng (posição do rotor 8, 16) e nenhuma ADN (posição do rotor 17, 18).

Figura 15: Determinação da sensibilidade relativa da amplificação do gene GSTpl metilado. A amplificação do gene GSTpl metilado foi realizada com LightCycler. É indicada a detecção com a sonda de hibridização GSTpl-Red 650 (F2/F1, Crossing point) e com a GSTpl-Red 705 (F3/F1, Crossing point). As PCR do GSTpl foram realizadas com oligonucleótido bloqueador (posição do rotor 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20) e sem oligonucleótido bloqueador (posição do rotor 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10). Empregou-se como ADN template: 15 ng de ADN tratado com bissulfito e metilado (posição do rotor 1, 11) e 15 ng de ADN tratado com bissulfito e não metilado (posição do rotor 10, 20), 58 ADN tratado com bissulfito, metilado e não metilado numa relação de mistura de 1 : 2 (posição do rotor 2, 12), 1 : 10 (posição do rotor 3, 13), 1 : 20 (posição do rotor 4, 14), 1 : 100 (posição do rotor 5, 15), 1 : 500 (posição do rotor 7, 17) , 1:1 000 (posição do rotor 8, 18) e nenhum ADN (posição do rotor 10, 20).

Figura 16: Determinação da sensibilidade relativa da amplificação do gene GSTpl metilado. A amplificação do gene GSTpl metilado foi realizada com TagMan. 59

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A o T-1 T-1 V Epigenomics AG <120> Processo para a detecção de modelos de metilação de citosina com grande sensibilidade <130> E01/1289/EP <160> 43 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 24 Λ C\] l-1 C\] V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 1 gctctatggt cttgtctaac cgta 24 <210> 2 <211> 18 Λ CNI I-1 CNI V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer 60 < 4 0 0 > 2 aggtggtggt ggcggtgg 18

<210> 3 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer < 4 0 0 > 3 atggttttgt ttaatygtag agttgttt 28

<210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 4 taaacccraa aaaaaaaaac ccaatat 27

<210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido 61 < 4 Ο Ο > 5 ctactcaacg aaaacaaa 18 <210> 6 <211> 18 A C\] I-1 C\] V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido < 4 0 0 > 6 ctactcaaca aaaacaaa 18 <210> 7 <211> 28 Λ C\l I-1 C\l V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 7 taagtatgtt gaagaaagat tattgtag 28 <210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer 62 < 4 Ο Ο > 8 taaaaactat cccataataa ctcccaac 28

<210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 9 taagtatgtt gaagaaagat t 21

<210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 10 aatccccata aacttaccaa a 21

<210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer 63 < 4 Ο Ο > 11 ttatgtgaat tttgaaag 18

<210 > 12 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer < 4 0 0 > 12 ggaaagaggg aaaggtttt 19

<210 > 13 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer < 4 0 0 > 13 tactaaaaac tctaaacccc at 22

<210 > 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer 64 < 4 Ο Ο > 14 gttttctgtt attagtgagt 20

<210 > 15 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer < 4 0 0 > 15 tcctaaatcc cctaaacc 18

<210 > 16 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <220> <221> base_modifiçada <222> (21)..(21) <223> Timidina modificada com grupo fosfato <400> 16 gtgagtatgt gtggtttgtg t 21 <210> 17 <211> 22

<212> ADN 65 <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <220> <221> base_modifiçada <222> (21)..(21) <223> Adenina modificada com grupo fosfato <400> 17 taaaccccca tcccaaatct ca 22

<210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <220> <221> base_modifiçada <222> (22)..(22) <223> Timidina modificada com grupo fosfato <400> 18 gtgagtatgt gtggtttgtg tt 22

<210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 66 <223> Oligonucleótido âncora GSTpl-Fluo <220> <221> base_modifiçada <222> (27)..(27) <223> Timidina modificada com fluorescência <400> 19 tttagagttt ttagtatggg gttaatt 27

<210> 20 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de hibridização GSTpl-Red 705 <220> <221> base_modifiçada <222> (1)..(1) <223> Guanina modificada com Red 707 <220> <221> base_modifiçada <222> (22)..(22) <223> Timidina modificada com fosfato <400> 20 22 gtattaggtt tgggtttttg gt 67

<210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de hibridização GSTpl-Red 650 <220> <221> base_modifiçada <222> (1)..(1) <223> Timidina modificada com Red 650 <220> <221> base modificada <222> (23) . . (23) <223> Guanina modificada com fosfato <400> 21 tagtattagg ttcgggtttt cgg 23

<210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 22 gttttctgtt attagtgagt a 21 <210> 23 68

<211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <220> <221> base_modifiçada <222> (21)..(21) <223> Citosina modificada com fosfato <400> 23 taaaccccca tcccaaatct c 21

<210> 24 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda TaqMan <220> <221> base_modifiçada <222> (1) .. (1) <223> Timidina modificada com black hole <220> <221> base_modifiçada <222> (35)..(35)

<223> Guanina modificada com FAM 69 < 4 Ο Ο > 24 taattcgtag tattaggttc gggttttcgg taggg 35

<210> 25 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ADN tratado com bissulfito <400> 25 ttgtcgtcgt àgtmegtt âttagtgagt acgcgçggtt cgcgttttcg gggatggggt 60 ttagag 66

<210> 26 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ADN tratado com bissulfito <400> 26 ttgttgttgt agttcttgtt attagtgagt atgtgtggtt tgtgttrttg gggatggggt 60 tcagag 66

<210> 27 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 70 <223> Primer <400> 27 atcactcatg cgcgc 15

<210> 28 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 28 atcactcatr crcrc 15

<210> 29 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <220> <221> Caracteristica_misc <222> (10)..(10) <223> Inosina <220> <221> Caracteristica_misc <222> (12) .. (12) <223> Inosina <220> 71 <221> Característica misc <222> (14) . . (14) <223> Inosina <400> 29 atcactcatn cncnc 15

<210> 30 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 30 aataatcact cat 13 <210> 31 <211> 16 Λ C\] l-1 cn V ADN <213> <220> Sequência artificial <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 31 acacaccaaa cacaaa 16 <210> 32 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 72 <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 32 agtgagtaac acaccaa 17 <210> 33 <211> 18 Λ C\] l-1 cn V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 33 atcactcata gagagcaa 18 <210> 34 <211> 18 Λ C\l I-1 C\l V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 34 atcactcatr crcrccaa 18 <210> 35 <211> 18

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> 73 <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 35 acacaccaaa cacaaaaa 18

<210> 36 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 36 acacaccaaa cacaaaaac 19 <210> 37 <211> 14 Λ C\l I-1 C\l V ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <400> 37 acaccaaaca caaa 14 <210> 38 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 74 <223> Primer <4 Ο Ο> 38 cccctacccc aaa 13

<210> 39 <211> 153 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Produto de amplificação de um fragmento de 153 bp do GSTpl (posição 1242 - 1393 na sequência com o n.° de conta M24485.1) com primers específicos de ADN-bissulfito <400> 39 gtttttgtta ttagtgagta tgtgtggttt gtgtttttgg ggatggggtt tagagttttt 60 agtatggggt taatttgtag tattaggttt gggtttttgg tagggttttt tgtttatttt 120 gagatttggg atgggggttt aggggattta gga 3,53

<210> 40 <211> 153 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Fragmento de ADN tratado com sssl <400> 40 75 gttttcgtta mgtgagta cgcgcggttc gcgttttcgg ggatggggtt tagagttttt 6Ô agtatggggt taattcgtag tattaggttc gggttttcgg tagggttttt cgtttstttc 120 gagattcggg acgggggttt aggggattta gga 153

<210> 41 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer < 4 0 0 > 41 gttttrgtta ttagtgagt 19

<210> 42 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido bloqueador <220> <221> base_modifiçada <222> (1) . . (1) <223> Adenina modificada com fosfato <400> 42 actctaaacc ctacccccaa at 22 <210> 43 <211> 18 76

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer <400> 43 ccaaatcccc taaatcct 18

Lisboa, 20 de Agosto de 2007

Claims (40)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção de metilação da citosina em amostras de ADN, caracterizado pelo facto de realizar-se as seguintes etapas: a) trata-se de forma química uma amostra de ADN genómico, a qual inclui ADN a ser analisado e ADN de fundo, de modo a que todas as bases citosina não metiladas sejam transformadas em uracilo, enquanto as bases 5-metilcitosina permanecem inalteradas, b) amplifica-se a amostra de ADN quimicamente tratada, mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers, de uma polimerase e de pelo menos outro oligonucleótido ou de um oligómero de ANP, que se liga a um dinucleótido 5'-CG-3', a um dinucleótido 5'-TG-3' ou a um dinucleótido 5'-CA-3', indo o outro oligonucleótido ou oligómero de ANP ligar-se de preferência ao ADN de fundo e indo prejudicar a respectiva amplificação, sendo preferido na amplificação o ADN a ser analisado em detrimento do ADN de fundo como template, e c) analisa-se os amplificados e tira-se uma conclusão, a partir da existência de um amplificado e/ou a partir da análise de outras posições, acerca do estado de metilação no ADN a ser analisado, sendo o processo realizado fora do corpo humano.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de obter-se as amostras de ADN a partir de linfa ou de outros líquidos corporais de um indivíduo. 2

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de obter-se as amostras de ADN a partir de linhas celulares, sangue, expectoração, fezes, urina, linfa, liquido céfalo-raquidiano, tecido incorporado em parafina, por exemplo tecido de olhos, intestino, rim, cérebro, coração, próstata, pulmão, mama ou fígado, lâminas histológicas e todas as combinações possíveis destes.

4. Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de realizar-se o tratamento químico com um bissulfito (= dissulfito, hidrogenossulfito).

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o tratamento químico ser realizado depois da incorporação do ADN em agarose.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de, no tratamento químico, estarem presentes um reagente de desnaturação da dupla hélice de ADN e/ou um captor de radicais.

7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de este ponto de ligação do outro oligonucleótido ou do oligómero de ANP se sobrepor aos pontos de ligação do primer sobre o ADN de fundo, e de o outro oligonucleótido impedir a ligação de pelo menos um oligonucleótido primer ao ADN de fundo.

8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, 3 caracterizado pelo facto de pelo menos outros dois oligonucleótidos ou oligómeros de ANP serem empregues, indo o respectivo ponto de ligação sobrepor-se, por sua vez, ao ponto de ligação de um primer no ADN de fundo, e de os demais oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP impedirem a ligação dos dois oligonucleótidos primers ao ADN de fundo.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de respectivamente um dos outros oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP impedir a ligação do forward-primer, enquanto que o outro impede a ligação do reverse-primer.

10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de os outros oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP se encontrarem numa concentração pelo menos 5 vezes superior aos oligonucleótidos primers.

11. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de os outros oligonucleótidos e/ou oligómeros de ANP se ligarem ao ADN de fundo e, com isso, impedirem o prolongamento completo de oligonucleótidos primers na reacção de polimerase.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a polimerase utilizada não apresentar actividade de 5'-3'-exonuclease.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de os outros oligonucleótidos se encontrarem modificados na extremidade 5', não 4 podendo por isso ser decompostos de forma significativa por uma polimerase com actividade de 5'-3'-exonuclease.

14. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo facto de os oligonucleótidos, utilizados além dos primers, não disporem de uma função 3'-0H.

15. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de amplificar-se a amostra de ADN quimicamente tratada na segunda etapa, mediante a utilização de pelo menos 2 oligonucleótidos primers e de pelo menos outro oligonucleótido ou oligómero de ANP, que se hibridiza num dinucleótido 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de pelo menos um oligonucleótido repórter, que se hibridiza num dinucleótido 5'-CG-3', num dinucleótido 5'-TG-3' ou num dinucleótido 5'-CA-3', e de uma polimerase; indo o outro oligonucleótido ou oligómero de ANP ligar-se de preferência ao ADN de fundo, prejudicando a respectiva amplificação, e indo o oligonucleótido repórter ligar-se de preferência ao ADN a ser analisado, mostrando a respectiva amplificação.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de utilizar-se, além do oligonucleótido repórter, outro oligómero marcado com um corante fluorescente, que se hibridiza directamente adjacente ao oligonucleótido repórter, sendo possível detectar esta hibridização por meio de transferência energética de ressonância fluorescente.

17. Processo de acordo com uma das reivindicações 15 e 16, 5 caracterizado pelo facto de realizar-se um ensaio TaqMan.

18. Processo de acordo com uma das reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo facto de realizar-se um ensaio LightCycler.

19. Processo de acordo com uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo facto de os oligonucleótidos repórter terem pelo menos uma marcação de fluorescência.

20. Processo de acordo com uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo facto de as moléculas repórter mostrarem a amplificação através dum aumento ou de uma redução da fluorescência.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de também se utilizar o aumento ou a redução da fluorescência directamente para fins de análise e se concluir, a partir do sinal de fluorescência, acerca do estado de metilação do ADN a ser analisado.

22. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o ADN de fundo se encontrar numa concentração 100 vezes maior do que o ADN a ser analisado.

23. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o ADN de fundo se encontrar numa concentração 1 000 vezes maior do que o ADN a ser analisado. 6

24. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a análise ou, no caso de um processo de acordo com uma das reivindicações 6 a 10, a maior análise ocorrer por meio de hibridização em matrizes de oligómeros, podendo os oligómeros ser ácidos nucleicos ou moléculas semelhantes em termos das respectivas propriedades de hibridização, como os ANP.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de os oligómeros se hibridizarem sobre uma secção com um comprimento de 12 - 22 bases no ADN a ser analisado, e de incluírem um dinucleótido CG, TG ou CA.

26. Processo de acordo com uma das reivindicações 24 e 25, caracterizado pelo facto de o estado de metilação de mais de 20 posições de metilação do ADN a ser analisado ser detectado numa experiência.

27. Processo de acordo com uma das reivindicações 24 e 25, caracterizado pelo facto de o estado de metilação de mais de 60 posições de metilação do ADN a ser analisado ser detectado numa experiência.

28. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo facto de a análise ou, no caso das reivindicações 15 a 18, a maior análise, ocorrer por medição do comprimento do ADN a ser analisado amplificado, indo os métodos de medição do comprimento incluir electroforese em gel, electroforese capilar em gel, cromatografia (por exemplo, HPLC), espectrometria 7 de massa e outros métodos apropriados.

29. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo facto de a análise ou, no caso das reivindicações 15 a 18, a maior análise, ocorrer por sequenciação, indo os métodos de sequenciação incluir o método de Sanger, o método de Maxam-Gilbert e outros métodos como a sequenciação por hibridização (sequencing by hybridisation = SBH).

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de realizar-se a sequenciação para cada ou para um pequeno grupo de posições CpG, com respectivamente um oligonucleótido primer separado, e de o prolongamento do primer perfazer uma ou poucas bases; e de concluir-se, a partir do tipo de prolongamento do primer, acerca do estado de metilação das posições em questão no ADN a ser analisado.

31. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de concluir-se, a partir do grau de metilação nas diversas posições CpG analisadas, acerca da existência de uma doença ou de outro estado médico do paciente.

32. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os próprios amplificados estarem providos de uma marcação detectável para fins de detecção.

33. Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de as marcações serem marcações de fluorescência.

34 . Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de as marcações serem radionuclidos.

35. Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de as marcações serem marcações de massa separáveis, que são detectadas num espectrómetro de massa.

36. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de, na amplificação, um dos primers estar ligado a uma fase sólida.

37. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo facto de os amplificados serem ao todo detectados no espectrómetro de massa e serem, com isso, caracterizados de forma inequívoca pela sua massa.

38. Utilização de um processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, no diagnóstico e no prognóstico de acontecimentos desfavoráveis aos pacientes ou indivíduos, indo estes acontecimentos desfavoráveis pertencer a pelo menos uma das seguintes categorias: efeitos indesejados dos medicamentos; doenças cancerígenas; disfunções, danos ou doença do SNC; sintomas agressivos ou distúrbios comportamentais; consequências clínicas, psicológicas e sociais de danos cerebrais; distúrbios psicóticos e distúrbios de personalidade; demência e/ou síndromas associados; doença, disfunção e danos cardiovasculares; disfunção, 9 danos ou doenças do tracto gastrointestinal; disfunção, danos ou doença do sistema respiratório; ferimento, inflamação, infecção, imunidade e/ou convalescença; disfunção, danos ou doença do corpo como desvio ao processo de desenvolvimento; disfunção, danos ou doença da pele, dos músculos, do tecido conjuntivo ou dos ossos; disfunção, danos ou doença endócrina/os e metabólica/os; dores de cabeça ou disfunção sexual.

39. Utilização de um processo de acordo com uma das reivindicações anteriores na distinção entre tipos de células ou de tecidos, ou na análise da diferenciação celular.

40. Kit composto por um reagente contendo bissulfito, por primers e por outros oligonucleótidos sem função 3'-OH, que se ligam a um dinucleótido 5'-GC-3', a um dinucleótido 5'-TG-3' ou a um dinucleótido 5'-CA-3', indo os outros oligonucleótidos ligar-se de preferência ao ADN de fundo e indo prejudicar a respectiva amplificação, no fabrico dos produtos amplificados. Lisboa, 20 de Agosto de 2007