CN104502492B - 一种化学衍生化方法及其在lc-ms法检测核酸修饰中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用。本发明使用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮（BDAPE）对DNA中5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的衍生化策略。在显著改善了这些修饰核苷在反相液相色谱中的保留行为的同时，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，且无需进行繁琐的样品前处理，就可以定量检测DNA中极低丰度的胞嘧啶修饰，可以应用在分析疾病与5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶相互关系的研究中。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学衍生化结合LC-MS的方法及其在DNA和RNA修饰分析中的应用。
背景技术
在哺乳动物的DNA中，胞嘧啶5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。5-mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调控等是一种重要的表观遗传学修饰。5-甲基胞嘧啶可以被TET蛋白进一步地连续氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-foC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)，形成新的修饰。这些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，异常的DNA修饰水平只会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等疾病。
研究这些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定量分析，然而这些DNA修饰的丰度非常低，甚至每106个胞嘧啶中还不到1个，并且DNA中其它大量的未修饰成分(胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤)化学结构与修饰成分类似，在检测这些修饰成分时会对其造成严重干扰。所以上述两点是导致定量分析DNA修饰十分困难的原因需要高灵敏度、高选择性且准确的检测方法。可是目前缺乏能同时定量分析胞嘧啶全部四种修饰(5-mC、5-hmC、5-foC和5-caC)的方法。
LC-MS法本身具有很高的灵敏度和选择性。在目前检测DNA胞嘧啶修饰的分析方法中，其是最灵敏的方法。但是，直接用LC-MS法分析DNA修饰的灵敏度还是有限，在定量分析前需要对DNA样品中的修饰核苷进行预先的HPLC富集纯化处理，以消除大量未修饰核苷对检测的干扰，从而改善LC-MS法的检测灵敏度。可是这种样品预处理的方式操作繁琐，费时费力。并且若是不进行HPLC的富集纯化处理则LC-MS法的灵敏度可能不足以检测到基因组DNA中的5-foC或5-caC。因此，在DNA修饰分析中迫切需要发展一种新的、简便的、高灵敏度、高选择性、准确的检测方法。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种能应用于DNA和RNA修饰检测领域中，结合化学衍生化策略的具有高灵敏度和高选择性的LC-MS分析方法。本发明首先通过固相萃取将DNA消解物中所含的四种修饰脱氧胞苷，即5-甲基脱氧胞苷(5-mdC)、5-羟甲基脱氧胞苷(5-hmdC)、5-醛基脱氧胞苷(5-fodC)和5-羧基脱氧胞苷(5-cadC)或RNA消解物中所含的四种修饰胞苷，即5-甲基胞苷(5-mrC)、5-羟甲基胞苷(5-hmrC)、5-醛基胞苷(5-forC)和5-羧基胞苷(5-carC)脱盐，然后用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮(BDAPE)衍生化标记修饰的胞嘧啶核苷，再用LC-MS定量分析这些经过标记的胞嘧啶核苷。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种化学衍生化方法，包括以下步骤：
(1)首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶对核酸进行消解，得到消解液，除去酶；
(2)将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样至固相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烷、甲醇、浓氨水体积比为6～8：2～4：0.2～0.5的解吸液进行解析；然后在37℃下用氮气将解析液吹干，得到固体残留物；
(3)将固体残留物溶于乙腈中，然后依次加入碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50～70℃下避光震荡反应4～16小时即成；所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：2000～16000：2500～100000，碱性催化剂的浓度为1～8mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为1.25～50mM。
所述步骤(1)中除去酶的方式为：将消解液装入微型超滤膜中，在12000r/min的速率下离心即除去S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶。
所述的解吸液中二氯甲烷、甲醇、浓氨水的体积比为6：4：0.5。
所述的碱性催化剂为叔铵类化合物、吡啶、氨水或三乙胺。
所述步骤(3)中的振荡速率为1500r/min。
所述步骤(3)中的反应温度为60℃，反应时间为6小时。
所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：8000：8000，三乙胺的浓度为4mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为4mM。
样品衍生化完成后，样品在37℃下用氮气吹干，然后复溶于水中直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析。
本发明所述的衍生化反应是指含有溴乙酮基的试剂与含胞嘧啶的化合物之间的成环反应。本发明所采用的衍生化试剂2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮(BDAPE)，其具有下列特征：
1)具有溴乙酮基团，可以与含胞嘧啶的化合物反应，脱去一分子HBr和H2O，形成稳定的5元环化学结构，如下所示：
2)带有较强的疏水性结构，包括苯环、长链烷烃(烷烃数n>3)；
3)带有在电喷雾质谱中容易发生离子化的结构，包括季铵盐、叔胺基、含氮杂环类。
BDAPE带有疏水苯环结构和在ESI源中易电离的叔胺基团，标记修饰核苷之后一方面可以使这些修饰核苷疏水性增强，显著改善它们在反相液相色谱柱上的保留行为，达到更好的分离，减少干扰。另一方面可以使这些修饰核苷带上易电离的叔胺基团，显著增强它们在ESI-MS中的离子化效率，从而使LC-MS法的灵敏度和选择性发生进一步提高。
RNA胞嘧啶修饰成分与DNA胞嘧啶修饰成分类似，消解物中核苷与脱氧核苷只是戊糖环2’位有无羟基的区别，对衍生化反应无影响，并且核苷和脱氧核苷的LC-MS检测方式无太大差异，所以本发明也可以应用在RNA胞嘧啶修饰的分析。
本发明的有益效果如下：
1.本发明中，方法操作简便，无需繁琐的样品前处理，标记后直接用LC-MS分析消耗有机溶剂。
2.本发明可以同时处理数量较多的样品，具有省时省力的优点。
3.本发明用到的衍生化试剂在色谱上很容易与衍生化产物基线分离，可以通过柱切换除去，避免污染质谱。
4.本发明涉及的衍生化反应具有较高的衍生化效率(99％)，利于定量分析。
5.本发明涉及的衍生化反应可显著改善修饰的胞嘧啶核苷在LC中的分离以及其在ESI-MS检测灵敏度(信号响应提高两个数量级)，从而在DNA修饰和RNA修饰分析领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
图2为本发明中四种修饰脱氧胞苷衍生化反应图；图2(A)为5-mdC的衍生化反应图；图2(B)为5-hmdC的衍生化反应图；图2(C)为5-fodC的衍生化反应图；图2(D)为5-cadC的衍生化反应图。
图3为本发明中四种修饰脱氧胞苷衍生化产物质谱图；图3(A)为5-mdC的衍生化产物质谱图；图3(B)为5-hmdC的衍生化产物质谱图；图3(C)为5-fodC的衍生化产物质谱图；图3(D)为5-cadC的衍生化产物质谱图。
图4为本发明中衍生化前后LC-MS检测效果对比图；图4(A)为衍生化之前用LC-MS检测四种修饰脱氧胞苷的色谱图；图4(B)为衍生化之后用LC-MS检测四种修饰脱氧胞苷的衍生化产物的色谱图。
图5为本发明用于检测HeLa细胞DNA样品的色谱图；图5(A)为检测5-mdC的色谱图；图5(B)为检测5-hmdC的色谱图；图5(C)为检测5-fodC的色谱图；图5(D)为检测5-cadC的色谱图；图中标记的色谱峰1、2、3、4分别对应5-mdC、5-hmdC、5-fodC、5-cadC。
具体实施方式
1、首先配制工作溶液：将衍生化试剂2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮(BDAPE)溶解于色谱纯乙腈中，使其浓度为40mM，同时将三乙胺用色谱纯乙腈稀释至100mM；在1mL固相萃取小柱中填上50mg石墨化碳黑。
2、从生物样品组织或细胞中提取出的DNA溶于水中，采用超微量紫外分光光度计定量。取2-40μg核酸，真空干燥，依次加入17μL水和2μLS1核酸酶缓冲液(300mM醋酸钠，pH4.6，2800mM氯化钠，10mM硫酸锌)，置于95℃水浴中5分钟，再迅速置于冰水浴中淬火2分钟，使DNA双链解开(若是RNA，可以免去淬火这一步操作)，加入1μLS1核酸酶(180U/μL)置于37℃水浴中温育12-16小时。然后依次加入65μL水、10μL碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl，100mM氯化镁，pH9.0)、1μL碱性磷酸酶(30U/μL)、4μL蛇毒磷酸二酯酶(0.001U/μL)用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶，置于37℃水浴中温育4小时将DNA消解成核苷小分子。将消解后的样品转移至微型超滤膜(10kDa)中，在12000r/min的转速下离心过滤，除去消解物水溶液中的酶。
3、将固相萃取小柱用1mL水进行活化，再将消解物水溶液上样至小柱中，用2mL水进行清洗脱去盐分，最后用600μL解析液将核苷解析下来，解析液为体积比为6～8：2～4：0.2～0.5的二氯甲烷：甲醇：浓氨水，优选为二氯甲烷、甲醇、浓氨水的体积比为6：4：0.5，37℃下用氮气吹干解析液。
4、将步骤(3)中所得的样品复溶于乙腈中，依次加入碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的乙腈溶液，碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮在反应体系中的浓度分别为1～8mM和1.25～50mM，反应体系中胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：2000～16000：2500～100000，反应溶液的体积为200μL，在50～70℃下用小型加热振荡器避光反应4～16个小时，反应时的振荡速率为1500r/min；所述的碱性催化剂可为叔铵类化合物、吡啶、氨水或三乙胺。优选地，反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：8000：8000，三乙胺的浓度为4mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为4mM。
5、反应结束后，将样品在37℃下真空干燥，复溶于水中，直接进行LC-MS分析。
表1衍生化前后检测灵敏度对比
若未特别指明，实施例中所用的技术手段(包括核酸的提取、酶解)为本领域技术人员所熟知的常规手段。LC-MS法中所用质谱仪为AppliedBiosystems公司的AB3200QTRAPmass固相萃取ctrometer(FosterCity，美国)，使用电喷雾离子源(TurboIonspray)。液相色谱为ShimadzuLC-20ADHPLC(Tokyo，日本)，装配有LC-20AD二元高压梯度泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20AC恒温柱温箱和DGU-20A3脱气机。使用C18反相色谱柱(150mm×2.1mmi.d.，5μm)进行化合物分离，柱温控制在35℃。流动相为：(溶剂A)含0.05％甲酸的水和(溶剂B)乙腈。色谱流速为0.2mL/min，流动相梯度为：起始5％的B相，以1.5％/min的梯度从5％升高至65％，以上百分比为体积分数。
实施例1：人类细胞DNA分析
三种人类细胞系：HeLa(宫颈癌细胞)、Jurkat-T(白血病淋巴细胞)和293T(人胚肾细胞)。取一定数量培养的细胞用PBS缓冲液清洗后，置于1.5mL离心管中，2000g离心20s沉淀细胞，倒掉上清液。加入0.5mL细胞裂解液A(320mM蔗糖，5mMMgCl2，10mMTris，0.1mM去铁胺，pH7.5，1％TritonX-100)，用微型旋涡混合仪强烈振荡30s。样品在16000g下离心20s，倒掉上清液，再重复一遍之前的过程。然后加入0.2mL细胞裂解液B(10mMTris，5mMEDTA，0.15mM去铁胺，pH8.0，1％十二烷基肌氨酸钠)，用微型旋涡混合仪强烈振荡30s。加入10μLRNaseA(1mg/mL)和3μLRNaseT1(1U/μL)，在50℃水浴中温育15min除去RNA。再加入10μL蛋白酶K(20mg/mlinH2O)，在37℃水浴中温育1小时降解蛋白质。接着加入0.4mLNaI水溶液(7.6MNaI，40mMTris，20mMEDTA，0.3mM去铁胺，pH8.0)以及0.6mL冰异丙醇，置于-20℃冰箱中30min，16000g下离心25min沉淀DNA，用冰冷的70％乙醇(v/v)清洗DNA三遍。
提取出的DNA溶于水中，采用超微量紫外分光光度计定量。取10-30μgDNA，真空干燥，依次加入17μL水和2μLS1核酸酶缓冲液(300mM醋酸钠，pH4.6，2800mM氯化钠，10mM硫酸锌)，置于95℃水浴中5分钟，再迅速置于冰水浴中淬火2分钟，使DNA双链解开，加入1μLS1核酸酶(180U/μL)置于37℃水浴中温育12-16小时。然后依次加入65μL水、10μL碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl，100mM氯化镁，pH9.0)、1μL碱性磷酸酶(30U/μL)、4μL蛇毒磷酸二酯酶(0.001U/μL)用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶，置于37℃水浴中温育4小时将DNA消解成核苷小分子。将消解后的样品转移至微型超滤膜(10kDa)中，在12000r/min的转速下离心过滤，除去消解物水溶液中的酶。
将固相萃取小柱用1mL水进行活化，再将消解物水溶液上样至小柱中，用2mL水进行清洗脱去盐分，最后用600μL二氯甲烷：甲醇：浓氨水(6:4:0.5，v/v/v)的解析液将核苷解析下来，37℃下用氮气吹干，复溶于172μL乙腈中。依次加入20μL浓度为40mM的2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮和8μL浓度为100mM的三乙胺，混合均匀，形成反应体系；反应体系在60℃下避光震荡反应6个小时，振荡速率为1500r/min。
衍生化反应之后，37℃下用氮气将样品吹干，复溶于100μL水中，用LC-MS分析，进样50μL。图5是应用本发明所提供分析方法检测HeLa细胞DNA修饰的色谱图。
实施例2：结直肠癌病人癌症组织和癌旁组织DNA分析
取经福尔马林固定、石蜡包埋处理的结直肠病人组织切片(5-10片，约30mg)，用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(FFPEDNAKit，OmegaCo.)提取组织里的DNA。提取出的DNA溶于水中，采用超微量紫外分光光度计定量。取2-20μgDNA，真空干燥，依次加入17μL水和2μLS1核酸酶缓冲液(300mM醋酸钠，pH4.6，2800mM氯化钠，10mM硫酸锌)，置于95℃水浴中5分钟，再迅速置于冰水浴中淬火2分钟，使DNA双链解开，加入1μLS1核酸酶(180U/μL)置于37℃水浴中温育12-16小时。然后依次加入65μL水、10μL碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl，100mM氯化镁，pH9.0)、1μL碱性磷酸酶(30U/μL)、4μL蛇毒磷酸二酯酶(0.001U/μL)用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶，置于37℃水浴中温育4小时将DNA消解成核苷小分子。将消解后的样品转移至微型超滤膜(10kDa)中，在12000r/min的转速下离心过滤，除去消解物水溶液中的酶。
将固相萃取小柱用1mL水进行活化，再将消解物水溶液上样至小柱中，用2mL水进行清洗脱去盐分，最后用600μL二氯甲烷：甲醇：浓氨水(6:4:0.5，v/v/v)的解析液将核苷解析下来，37℃下用氮气吹干，复溶于172μL乙腈中。依次加入20μL浓度为40mM的2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮和8μL浓度为100mM的三乙胺，混合均匀，形成反应体系；反应体系在60℃下避光震荡反应6个小时，振荡速率为1500r/min。
衍生化反应之后，37℃下用氮气将样品吹干，复溶于100μL水中，用LC-MS分析，进样50μL。
实施例3：酵母细胞DNA分析
十种酵母菌株：酿酒酵母BY4741(SaccharomycescerevisiaeBY4741)、酿酒酵母W1588-4C(SaccharomycescerevisiaeW1588-4C)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、布拉迪酵母(Saccharomycesboulardii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)培养后，将酵母细胞悬浊液在4600g下离心5分钟，收集细胞沉淀用水清洗，除去残留的培养基。将酵母细胞分散在1mL细胞裂解液中(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl，10g/LSDS，20g/LTritonX-100)，再加入等体积的苯酚/氯仿(1:1，v/v，苯酚用10mMTris饱和，1mMEDTA，pH8)和1.5g玻璃珠(425-600μm)，用微型旋涡混合仪强烈振荡10min。然后往溶液中加入1mLTE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA,pH8.0)，在13500g下离心5分钟。将上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积的异丙醇于-20℃下1小时，然后在16000g下离心25min沉淀DNA，用冰冷的70％乙醇(v/v)清洗DNA三遍。复溶于水中，在提取的DNA样品中加入RNaseA(5μL，10μg/μL)和RNaseT1(0.5μL，1000U/μL)在37℃水浴中温育8～12小时，之后再重复一遍DNA沉淀和清洗步骤获得纯的DNA样品。
提取出的DNA溶于水中，采用超微量紫外分光光度计定量。取20-40μgDNA，真空干燥，依次加入17μL水和2μLS1核酸酶缓冲液(300mM醋酸钠，pH4.6,2800mM氯化钠，10mM硫酸锌)，置于95℃水浴中5分钟，再迅速置于冰水浴中淬火2分钟，使DNA双链解开，加入1μLS1核酸酶(180U/μL)置于37℃水浴中温育12-16小时。然后依次加入65μL水、10μL碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl,100mM氯化镁，pH9.0)、1μL碱性磷酸酶(30U/μL)、4μL蛇毒磷酸二酯酶(0.001U/μL)用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶，置于37℃水浴中温育4小时将DNA消解成核苷小分子。将消解后的样品转移至微型超滤膜(10kDa)中，在12000r/min的转速下离心过滤，除去消解物水溶液中的酶。
将固相萃取小柱用1mL水进行活化，再将消解物水溶液上样至小柱中，用2mL水进行清洗脱去盐分，最后用600μL二氯甲烷：甲醇：浓氨水(6:4:0.5，v/v/v)的解析液将核苷解析下来，37℃下用氮气吹干，复溶于172μL乙腈中。依次加入20μL浓度为40mM的2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮和8μL浓度为100mM的三乙胺，混合均匀，形成反应体系；反应体系在60℃下避光震荡反应6个小时，振荡速率为1500r/min。
衍生化反应之后，37℃下用氮气将样品吹干，复溶于100μL水中，用LC-MS分析，进样50μL。
实施例4：人类细胞RNA分析
三种人类细胞系：HeLa(宫颈癌细胞)、Jurkat-T(白血病淋巴细胞)和293T(人胚肾细胞)。用细胞总RNA提取试剂盒(HPTotalRNAKit，OmegaCo.)提取组织里的RNA。提取出的DNA采用超微量紫外分光光度计定量。取20-40μgRNA，真空干燥，依次加入17μL水和2μLS1核酸酶缓冲液(300mM醋酸钠，pH4.6，2800mM氯化钠，10mM硫酸锌)、1μLS1核酸酶(180U/μL)置于37℃水浴中温育12-16小时。然后依次加入65μL水、10μL碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl，100mM氯化镁，pH9.0)、1μL碱性磷酸酶(30U/μL)、4μL蛇毒磷酸二酯酶(0.001U/μL)用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶，置于37℃水浴中温育4小时将RNA消解成核苷小分子。将消解后的样品转移至微型超滤膜(10kDa)中，在12000r/min的转速下离心过滤，除去消解物水溶液中的酶。
将固相萃取小柱用1mL水进行活化，再将消解物水溶液上样至小柱中，用2mL水进行清洗脱去盐分，最后用600μL二氯甲烷：甲醇：浓氨水(6:4:0.5，v/v/v)的解析液将核苷解析下来，37℃下用氮气吹干，复溶于172μL乙腈中。依次加入20μL浓度为40mM的2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮和8μL浓度为100mM的三乙胺，混合均匀，形成反应体系；反应体系在60℃下避光震荡反应6个小时，振荡速率为1500r/min。
衍生化反应之后，37℃下用氮气将样品吹干，复溶于100μL水中，用LC-MS分析，进样50μL。
Claims (9)
1.一种化学衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶对核酸进行消解，得到消解液，除去酶；
(2)将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样至固相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烷、甲醇、浓氨水体积比为6～8：2～4：0.2～0.5的解吸液进行解吸；然后在37℃下用氮气将解吸液吹干，得到固体残留物；
(3)将固体残留物溶于乙腈中，然后依次加入碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50～70℃下避光震荡反应4～16小时即成；所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：2000～16000：2500～100000，碱性催化剂的浓度为1～8mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为1.25～50mM。
2.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤(1)中除去酶的方式为：将消解液装入微型超滤膜中，在12000r/min的速率下离心即除去S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶。
3.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的解吸液中二氯甲烷、甲醇、浓氨水的体积比为6：4：0.5。
4.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的碱性催化剂为叔胺类化合物、吡啶或氨水。
5.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤(3)中的振荡速率为1500r/min。
6.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤(3)中的反应温度为60℃，反应时间为6小时。
7.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：8000：8000，碱性催化剂的浓度为4mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为4mM。
8.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：样品衍生化完成后，反应液在37℃下用氮气吹干，所得固体复溶于水中直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析。
9.权利要求1～8任一项所述的化学衍生化方法在核酸修饰分析领域中的应用。
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