CN109182465B - 一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，利用DNA聚合酶通过不同甲基化修饰物位点时停顿时间不同实现甲基化修饰的定量分析，并通过在待测表观遗传修饰的碱基上特异性标记具有较大空间位阻或含有较强极性的基团降低扩增效率进一步放大检测信号。该方法可避免常规核酸甲基化检测方法中繁琐、耗时、样品用量大等不足，通过简单直观的步骤，降低检测样品使用量，缩短分析时间，达到单碱基分辨率，实现在温和条件下快速、灵敏、高通量定量检测基因组中表观遗传修饰。

Description

一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法
技术领域
本发明涉及一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法。
背景技术
DNA中CpG双核苷酸位点上胞嘧啶(C)的第5位碳原子在DNA甲基化转移酶催化下发生甲基化修饰，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)的过程是重要的核酸表观遗传修饰方式之一。该甲基化修饰是一个可逆过程。5mC在TET酶作用下，会逐步氧化生成其他表观遗传修饰方式，包括5-羟基胞嘧啶(5hmC)，5-醛基胞嘧啶(5fC)和5羧基胞嘧啶(5caC)，并通过碱基切除修复(BER)过程回到胞嘧啶。DNA甲基化修饰几乎贯穿了整个基因组，并参与许多生理过程，如基因表达、转录、基因印迹、胚胎发育、染色体结构等，在基因表达中起到极为重要作用。另外，6mA广泛存在于哺乳动物的mRNA中，可能会影响miRNA诱导的转录本降解以及翻译抑制，因此对核酸的表观遗传修饰的准确定量分析，在疾病诊断，药物筛选，全能细胞研究方面具有重要意义。
当前，DNA甲基化的检测方法主要依赖液相色谱(LC)、质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)等。液相色谱方法定量能力强，重复性好，但灵敏度低，DNA样品用量较大(通常需要1-50μg)，样品前处理复杂。质谱具有特异性好、灵敏度高等特点，已应用于5mC及其他表观遗传修饰的检测，但质谱分析对样品纯度要求非常高，易受干扰，特别是由其他化合物诱导引起的离子抑制干扰；仪器精密昂贵，分析灵敏度依赖于仪器本身，难于实现高效的信号放大，以及无法对多样本的高通量检测。PCR技术能在短时间内扩增获得大量核酸样本，在DNA研究领域仍是最常用的分析方法。但PCR扩增无法保留表观遗传修饰信息，扩增出来的新链会丢失表观遗传修饰位点，经过多轮扩增反应后，检测位点被逐渐稀释，无法产生特异性信号差异。只有通过重亚硫酸盐反应预处理DNA样品，使甲基化修饰信息转化为序列差异性信息，PCR扩增才能保留甲基化修饰信息，通过测序方法实现甲基化位点的检测。此外，重亚硫酸盐反应对样本损伤很大，测序分析成本十分高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，该方法基于DNA聚合酶在合成不同的胞嘧啶修饰物停顿时间不一样，发展了一种基于DNA聚合酶和切口酶诱导的链置换扩增信号放大的方法，以实现对表观遗传修饰物的检测。
本发明所采取的技术方案是：
一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，利用DNA聚合酶通过不同甲基化修饰物位点时停顿时间不同实现甲基化修饰的定量分析。
进一步地，高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法包括以下步骤：
1)将待测DNA破碎、末端修复、连接通用接头、变性获得单链DNA模板；
2)设计与通用接头序列相匹配的引物，在引物链上引入切口酶识别位点；
3)单链DNA模板与引物杂交，在聚合酶作用下，形成双链DNA，切口酶识别切口序列，并在切口酶识别位点3’端第1个碱基切断单链DNA，产生新的含羟基的3’端，聚合酶在切口处引发新一轮扩增延伸，并通过链置换功能，释放出一条短链DNA片段；
4)聚合酶、切口酶的联合作用，切割、聚合反应连续发生，通过检测生成的短链DNA片段量，可获得待测总DNA中该表观遗传修饰的总体水平。
进一步地，引物序列从3’端到5’端依次包含如下三部分：DNA样品杂交序列、切口酶识别序列、延伸序列。
进一步地，在待测表观遗传修饰的碱基上特异性标记具有较大空间位阻或含有较强极性的基团降低扩增效率。
进一步地，将待测DNA破碎、末端修复、连接通用接头，通过化学衍生化反应在待测表观遗传修饰的碱基上特异性标记具有较大空间位阻或含有较强极性的基团，变性获得单链DNA模板。
进一步地，3-羧基苯硼酸与含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5hmC位点实现特异性标记。
进一步地，4-磺酸苯肼与含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5fC位点实现特异性标记。
进一步地，萤黄二钾盐与与含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5caC位点实现特异性标记。
本发明的有益效果是：该方法可避免常规核酸甲基化检测方法中繁琐、耗时、样品用量大等不足，通过简单直观的步骤，降低检测样品使用量，缩短分析时间，达到单碱基分辨率，实现在温和条件下快速、灵敏、高通量定量检测基因组中表观遗传修饰，具体地：
1.检测样品用量少，反应用量一般为40-80ng；
2.检测用时短，从实际样品处理到检测目标位点用时低于12h；
3.高通量检测，可结合384孔板实现多个样本的同时检测；
4.单碱基分辨率，结合化学衍生化特异性标记，可达到单碱基分辨水平检测；
5.全基因检测，连接通用接头实现基因组目标物的检测。
附图说明
图1为核酸表观遗传修饰定量分析策略；
图2为不同比例模板与引物的扩增曲线；
图3为不同浓度聚合酶的扩增曲线；
图4为不同浓度切口酶的扩增曲线；
图5为不同甲基化修饰位点扩增曲线；
图6为不同腺嘌呤修饰位点扩增曲线；
图7为gmC模板MALDI-TOF MS表征图；
图8为3-CPBA-gmC模板MALDI-TOF MS表征图；
图9为5hmC化学衍生化前后扩增曲线；
图10为3-CPBA对5hmC特异性选择；
图11为5hmC化学衍生化检测标准曲线；
图12为PHPA-5fC模板MALDI-TOF MS表征图；
图13为PHPA-5fC化学衍生化转化率；
图14为5fC化学衍生化前后扩增曲线；
图15为PHPA对5fC特异性选择；
图16为5fC化学衍生化检测标准曲线；
图17为LY-5caC模板MALDI-TOF MS表征图；
图18为5caC化学衍生化前后扩增曲线；
图19为LY对5caC特异性选择；
图20为5caC化学衍生化检测标准曲线；
图21为不同浓度模板的扩增曲线；
图22为不同引物浓度的扩增曲线；
图23为不同聚合酶浓度的扩增曲线；
图24为不同切口酶浓度的扩增曲线；
图25为目标物总DNA中5hmC的标准曲线；
图26为目标物总DNA中5fC的标准曲线；
图27为实际样品中5hmC的含量；
图28为实际样品中5fC的含量。
具体实施方式
DNA聚合酶在通过不同甲基化修饰物位点(C、5mC、5hmC、5fC、5caC、6mA)时，停顿时间也会不同，为甲基化修饰的测定提供可能。通过构建链置换恒温扩增技术，在每一轮扩增反应中，DNA聚合酶都经过甲基化修饰位点，复制出来的核苷酸作为信号形式被记录不参与模板复制，保证每一个循环过程模板以含有修饰位点的核苷酸为模板，并产生由修饰位点不同引起的差异，通过多次累积，信号差异得到放大。方法不需要精确的热循环装置，可在恒温反应器中实现扩增，降低了对仪器的要求及检测成本，并可结合384孔板，实现高通量分析。
技术方案如图1所示，从组织或细胞中提取总核酸样品，超声打断成小片段(200bp)；在每一个片段3’端连接通用接头(part B红色部分，T2)，变性获取单链核酸(partB黑色部分，T1)；设计与通用接头序列相匹配的引物探针，在引物探针链上引入切口酶识别位点(part B绿色部分，P2)；根据待测表观遗传修饰碱基的活性基团种类，设计不同化学衍生化方法，在待测表观遗传修饰的碱基上特异性标记具有较大空间位阻或含有较强极性的基团；经化学衍生化后的短链片段与引物探针杂交，在聚合酶作用下，短链片段和引物探针互为模板，分别从其3’端开始衍生，形成双链DNA；切口酶识别切口序列，并在切口酶识别位点3’端第1个碱基切断单链DNA，产生新的含羟基(-OH)3’端；聚合酶在切口处引发新一轮扩增延伸，并通过链置换功能，释放出一条短链(part B橘色部分，T4)。聚合酶-切口酶的联合作用，切割、聚合反应连续发生，产生大量短链DNA片段。DNA片段产生的速度与待测DNA中表观遗传修饰的含量相关。通过加入荧光染料检测生成的DNA片段量，可获得待测总DNA中该表观遗传修饰的总体水平。
本发明分析方法与现有检测方法相比具有较大优势，具体如下表所示：
Figure BDA0001753478780000041
本发明分析方法的具体步骤如下：
1.制备核酸样品
(1)抽提待测DNA样品：从待测组织或细胞中提取总核酸。
(2)处理核酸样品：核酸样品通过超声破碎仪破碎为200bp左右的片段；在冰上配制基因组DNA，End Prep Enzyme Mix，End Repair Reaction Buffer溶液，混合后20℃反应30min，65℃反应30min；加入Blunt/TA Ligase Master Mix，NEB Next Adaptor forIllumina和Ligation Enhancer继续在20℃反应15min；继续加入USER Enzyme在37℃反应15min。核酸柱纯化，得到含有通用接头的基因组DNA片段，作为全基因检测模板。
2.设计扩增引物
设计扩增引物，引物序列从3’端到5’端依次包含如下三部分：(1)DNA样品杂交序列P1：根据通用接头的序列设计完全互补的杂交序列；(2)切口酶识别序列P2：根据所选择的切口酶种类，设计切口酶序列；(3)延伸序列P3：根据反应温度，设计延伸序列以稳定反应过程中引物与DNA模板的杂交状态。
3.测定表观遗传修饰水平
(1)标记核酸样品
利用5hmC，5fC和5caC中的羟基、醛基、羧基，设计特异性化学衍生化反应，特异性修饰大体积官能团；经标记的核酸片段在95℃变性，置于冰上，彻底变性为单链。
(a)5hmC化学衍生化
对含有通用接头的基因组DNA片段进行糖基化反应，利用糖环上顺式的二醇结构与3-羧基苯硼酸(3-CPBA)进一步缩合。在反应管中加入含有通用接头的基因组DNA片段、T4-βGT葡萄糖转移酶、UDP-葡萄糖和NEB buffer 4。将溶液混合，37℃反应2h，核苷酸纯化小柱纯化，加入3-CPBA溶液，将溶液混合，37℃反应6h，核苷酸纯化小柱纯化，获得特异性化学标记5hmC位点的基因组DNA片段。
(b)5fC化学衍生化
选取具有较大空间位阻且水溶性的4-磺酸苯肼(PHPA)与含有通用接头的基因组DNA片段进行化学衍生化反应，在反应管中加入含有通用接头的基因组DNA片段、PHPA溶液和1×PBS缓冲液。溶液混合，37℃反应8h，核苷酸纯化小柱纯化，获得特异性化学标记5fC位点的基因组DNA片段。
(c)5caC化学衍生化
选取具有较大空间位阻且水溶性的萤黄二钾盐(LY)与含有通用接头的基因组DNA片段进行酰胺化反应，在反应管中加入含有通用接头的基因组DNA片段、Mes缓冲液、EDC溶液和NHS溶液，37℃活化1h；再加入LY溶液和Mes缓冲液，37℃反应30min；最后加入1×PBS缓冲液及NaCl溶液，37℃反应8h，核苷酸纯化小柱纯化，获得特异性化学标记5caC位点的基因组DNA片段。
(2)优化测定条件
通过单因素轮换法优化测定条件。
(a)模板与引物用量比例
为了探索模板及引物的用量对扩增反应的影响，获得最佳的扩增效果。在荧光定量PCR仪上面监控不同模板与引物比例的扩增曲线，采用固定模板用量，改变不同的引物用量方式，计算扩增曲线的斜率，斜率越大，说明扩增效率越高，选择斜率最大的扩增曲线所对应的模板与引物比例。
(b)聚合酶用量优化
为了保证扩增反应快速、高效进行，探索DNA聚合酶浓度对扩增反应的影响十分重要，选择固定其他试剂，通过梯度添加不同浓度的聚合酶分别进行扩增，监控对应浓度聚合酶的扩增曲线，计算对应扩增斜率，选择斜率最大的曲线所对应的聚合酶浓度作为线性扩增实验的最佳聚合酶用量。
(c)切口酶用量优化
切口酶可以特异性识别切口酶序列并剪切下游一个碱基处的单链，产生切口进行新一轮的链置换反应，因此切口酶的用量对扩增反应有重要影响。选择固定其他试剂，通过梯度添加不同浓度的切口酶进行扩增，监控对应浓度切口酶的扩增曲线，计算相对应的扩增斜率，选择斜率最大的曲线所对应的切口酶含量作为扩增实验的最佳切口酶用量。
(3)基因组目标样品测定标准曲线的获得
分别配制一系列含有不同浓度经化学修饰的基因组目标样品溶液，根据最佳反应条件，在冰上配制A和B两部分溶液，A部分包含切口酶缓冲液、dNTPs、引物；B部分包含聚合酶缓冲溶液、DNA聚合酶、切口酶、荧光染料。将A和B两部分溶液混合，分别加入不同浓度的基因组DNA模板溶液，立即在定量PCR仪上进行扩增并监控扩增曲线，求得扩增斜率，计算差值，根据扩增差值，得到基因组DNA样品的测定标准曲线。
(4)目标样品含量的测定
实际样品中提取出DNA，经过DNA破碎，末端修复、连接通用接头，并进行特异性化学衍生化，最后变性获得DNA单链模板。根据最佳反应条件，在冰上配制A和B两部分溶液，A部分包含切口酶缓冲液、dNTPs、引物；B部分包含聚合酶缓冲溶液、DNA聚合酶、切口酶、荧光染料。将A和B两部分溶液混合，分别加入化学修饰和未修饰的基因组DNA模板溶液，立即在定量PCR仪上进行扩增并监控扩增曲线，求得扩增斜率，计算差值，根据差值在标准曲线上查出对应的含量。
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1分析方法的建立
以5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC CGA ACC TAAAGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.1)为例。
(1)制备不同表观遗传修饰的核酸片段
8条DNA模板序列如下：
C：5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC CGA ACC TAAAGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.1)；
5mC：5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC mCGA ACCTAA AGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.2)；
5hmC：5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC hmCGA ACCTAA AGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.3)；
5fC：5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC fCGA ACCTAA AGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.4)；
5caC：5'-GAG ACC GGA GTC CGC TTT CCT CTT CCG GAA AAT GTA AGC caCGA ACCTAA AGC AAT CAC CAG GG-3'(SEQ ID NO.5)；
A：5’-GGA CTG GAC TGG ACT GGA CTG GAC TAT CAC CAG GG-3’(SEQ ID NO.6)；
mA：5’-GGA CTG GAC TGG ACT GGA CTG GmAC TAT CAC CAG GG-3’(SEQ IDNO.7)；
mA-2：5’-GGA CTG GAC TGG ACT GGmA CTG GmAC TAT CAC CAG GG-3’(SEQ IDNO.8)。
(2)设计扩增引物
P-C：5'-AGC CCG TGA GTC TCG CCC TGG TGA TTG CTT TAG GTT CGG C-3'(SEQID NO.9)；
P-A：5’-AGC CCG TGA GTC TCG CCC TGG TGA TAG TCC-3’(SEQ ID NO.10)。
(3)优化扩增反应条件
(a)模板与引物用量
固定模板用量(100nM)，配制不同浓度的引物溶液，优化最佳模板及引物比例。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。引物的反应浓度分别为1000、500、100、20和10nM，由图2可知，当引物浓度为10nM时，扩增曲线线性最佳且斜率最大，当引物浓度增大，会消耗过多的切口酶导致链置换效率下降，因此选择引物浓度为10nM，即模板与引物比例为10:1时为最优比例。
(b)聚合酶用量优化
反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。聚合酶用量分别为0.0125、0.025、0.0375、0.05和0.0625U，由图3可知，当聚合酶浓度为0.05U时，扩增曲线斜率最大，选择聚合酶的最佳反应浓度为0.05U。
(c)切口酶用量优化
反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。切口酶用量分别为0.125、0.25、0.375、0.5、0.625和0.75U，由图4可知，当切口酶浓度为0.5U时，扩增曲线斜率最大，选择切口酶的最佳反应浓度为0.5U。
(4)验证扩增反应与DNA表观遗传修饰的关系
配制含不同甲基化修饰位点的模板(C,5mC,5hmC,5fC,5caC)溶液，反应分为PartA与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链P-C(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，计算扩增曲线斜率。通过比较斜率之间差异发现对聚合效率5mC≈5mhC>C>5caC≥5fC，该方法对检测不同的胞嘧啶表观遗传修饰物具有可行性，见图5。
(5)验证扩增反应与RNA表观遗传修饰的关系
配制含不同腺嘌呤修饰位点的模板(A，mA，mA-2)溶液，反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链P-A(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线斜率，比较斜率之间差异。通过比较斜率之间差异发现对聚合效率A>mA>mA-2，该方法对检测不同的腺嘌呤表观遗传修饰物具有可行性，见图6。
(6)扩增反应与化学衍生化后的表观遗传修饰的关系
(a-1)3-CPBA对5hmC-DNA化学衍生化
配制含有5hmC位点的DNA模板链(2μM)、T4-βGT葡萄糖转移酶(0.5U)、UDP-葡萄糖(40μM)和NEB buffer 4(1×)。将溶液混合后在37℃温度下反应2h，核苷酸纯化小柱纯化，获得含gmC位点的DNA链，MALDI-TOF MS表征证明糖基化成功，见图7。加入(溶解在200mMNa2HPO4溶液)3-CPBA溶液(50mM)，将溶液混合，37℃温度反应6h，核苷酸纯化小柱纯化，获得含3CPBA-gmC位点的DNA模板链，MALDI-TOF MS表征发现成功修饰上3-羧基苯硼酸，见图8。
相同条件下，分别将含有C、5mC、5hmC、5fC和5caC位点的DNA模板链(2μM)与3-CPBA溶液(50mM)反应，核苷酸纯化小柱纯化，分别获得含与3-CPBA反应后的DNA链。
(a-2)3-CPBA-gmC的检测
配制含化学衍生标记的3-CPBA-gmC模板及未标记的5hmC模板溶液，反应分为PartA与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPS(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率。经过化学衍生化后的CPBA-gmC扩增效率比未衍生化的5hmC下降了44.59％，成功实现区分。见图9。
配制与3-CPBA反应后的DNA及相应未标记的C、5mC、5hmC、5fC和5caC模板溶液，反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率，结果如图10所示。经过化学衍生化后只有CPBA-gmC的扩增效率比未衍生化的5hmC下降了44.59％，3-CPBA对C、5mC、5fC和5caC几乎没影响。
(a-3)3-CPBA-gmC的标准曲线
配制一系列不同比例的3-CPBA-gmC与5hmC混合溶液，以5hmC溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和CPBA-gmC与5hmC的混合溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线的斜率，计算差值，根据扩增曲线斜率差值绘制相应浓度标准曲线。见图11。
(b-1)PHPA对5fC-DNA化学衍生化
配制含有5fC位点的DNA模板链(2μM)、PHPA溶液(13mM)、1×PBS缓冲液(pH 7.4)。将溶液混合后在37℃温度下反应8h，核苷酸纯化小柱纯化，获得含PHPA-5fC位点的DNA链，MALDI-TOF MS表征，证明5fC修饰成功，见图12，转化率由IM-Q-TOF-HR-LC/MS检测5fdC在相同条件下反应生成的PHPA-5fdC，根据质谱判定，原料5fdC已基本转化为PHPA-5fdC，该反应具有较高的化学反应效率。见图13。
相同条件下，分别将含有C、5mC、5hmC、5fC和5caC位点的DNA模板链(2μM)与PHPA溶液(13mM)反应，核苷酸纯化小柱纯化，分别获得含与PHPA反应后的DNA链。
(b-2)PHPA-5fC的检测
配制含化学衍生标记的PHPA-5fC模板及未标记的5fC模板溶液，反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率。经过化学衍生化后PHPA-5fC的扩增效率比未衍生化的5fC下降了25.77％，成功实现区分。见图14。
配制与PHPA反应后的DNA及相应未标记的C、5mC、5hmC、5fC和5caC模板溶液，反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率，结果见图15，经过化学衍生化后只有PHPA-5fC的扩增效率比未衍生化的5fC下降了25.77％，PHPA对C、5mC、5hmC和5caC几乎没影响。
(b-3)PHPA-5fC的标准曲线
配制一系列不同比例的PHPA-5fC与5fC混合溶液，以5fC溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和PHPA-5fC与5fC的混合溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBRGreen II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线的斜率，计算差值，根据扩增曲线斜率差值绘制相应浓度标准曲线。见图16。
(c-1)LY对5caC-DNA化学衍生化
配制含有5caC位点的DNA模板链(2μM)、EDC溶液(2mM)、Mes缓冲液(pH 5.0)和NHS溶液(0.4mM)，37℃活化1h；继续加入LY(200μM)溶液和Mes缓冲液(pH 6.0)，37℃反应30min；最后加入1×PBS缓冲液(pH 7.4)及NaCl溶液(150mM)，37℃反应8h，核苷酸纯化小柱纯化，获得含LY-5caC位点的DNA链，MALDI-TOF MS表征，证明衍生化成功，见图17。
相同条件下，配制分别含有C、5mC、5hmC、5fC和5caC位点的DNA模板链(2μM)、EDC溶液(2mM)、Mes缓冲液(pH 5.0)和NHS溶液(0.4mM)，37℃活化1h；继续加入LY(200μM)溶液和Mes缓冲液(pH 6.0)，37℃反应30min；最后加入1×PBS缓冲液(pH 7.4)及NaCl溶液(150mM)，37℃反应8h，核苷酸纯化小柱纯化，分别获得含与LY反应后的DNA链。
(c-2)LY-5caC的检测
配制含化学衍生标记的LY-5caC模板及未标记的5caC模板溶液，反应分为Part A与PartB两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率。经过化学衍生化后的LY-5caC扩增效率比未衍生化的5caC下降了53.31％，成功实现区分。见图18。
配制与LY反应后的DNA及相应未标记的C、5mC、5hmC、5fC和5caC模板溶液，反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和模板溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线反应斜率，结果见图19，经过化学衍生化后只有LY-caC的扩增效率比未衍生化的5hmC下降了53.31％，LY对C、5mC、5hmC和5fC几乎没影响。
(c-3)LY-5caC的标准曲线
配制一系列不同比例的LY-5caC与5caC混合溶液，以5caC溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(10nM)和LY-caC与5caC的混合溶液(100nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBRGreen II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.05U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.5U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应，并计算扩增曲线的斜率，计算差值，根据扩增曲线斜率差值绘制相应浓度标准曲线。见图20。
实施例2分析方法的应用
(1)实际样品总DNA等温扩增反应条件的优化
通过单因素轮换法对实际样品总DNA甲基化测定的条件进行优化
(a)模板用量
固定引物用量(100nM)，配制不同浓度的DNA片段溶液，优化最佳模板用量。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链和不同浓度的模板溶液，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。DNA的反应浓度分别为81.75、65.40、49.05、32.80和16.40nM，由图21可知，当DNA浓度为32.80nM时，扩增曲线线性最佳且斜率最大，因此选择该浓度为最佳反应浓度。
(b)引物用量
固定模板用量(32.80nM)，配制不同浓度的引物溶液，优化最佳引物用量。反应分为PartA与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链和模板溶液(32.80nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。引物的反应浓度分别为100、50、25、12.5和6.25nM，由图22可知，当引物浓度为50nM时，效率与100nM相差不大，当引物浓度继续增大，扩增效率也没有显著提高，因此选择引物浓度为50nM，为最佳浓度。
(c)聚合酶用量优化
反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和模板溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。聚合酶用量分别为0.05、0.1、0.15、0.2和0.25U，由图23可知，当聚合酶浓度为0.1U时，扩增曲线线性最佳且斜率最大。
(d)切口酶用量优化
反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和模板溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)、SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.1U)、Nt.BsmAI Nease切口酶，以上操作均在冰上进行。Part A和Part B混合，迅速置于定量PCR仪在37℃条件下进行扩增反应。切口酶用量分别为0.125、0.25、0.375、0.5和0.625U，由图24可知，当切口酶浓度为0.125U时，扩增效率已达到最佳效果，增加切口酶的用量对扩增效果影响不大。
(2)实际样品标准曲线的获得
(a)实际样品总DNA中5hmC的标准曲线
5hmC检测标准曲线的实际样品是成人脑组织DNA，5hmC在脑部组织相对于其他组织的含量丰富，适合作为实际样品标曲，能够保障不同组织5hmC位点的检测可以被包含着标准曲线范围内。
配制一系列不同比例含3-CPBA-gmC修饰位点的DNA片段与未标记的片段混合溶液，以未标记的DNA片段溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和检测模板混合溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.125U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.1U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪上监控扩增曲线，并计算扩增曲线反应斜率，计算差值，根据扩增效率下降差值绘制相应浓度标准曲线。见图25。
(b)实际样品总DNA中5fC的标准曲线
5fC检测标准曲线的实际样品提取老鼠胚胎干细胞，基于文献报道含有胚胎干细胞的DNA含有相对丰富的5fC，且获取相对简单。
配制一系列不同比例含PHPA-5fC修饰位点的DNA片段与未标记的DNA片段混合溶液，以未标记的DNA片段溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和检测模板混合溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.125U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.1U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪上监控扩增曲线，并计算扩增曲线反应斜率，计算差值，根据扩增效率下降差值绘制相应浓度标准曲线。见图26。
(c)实际样品总DNA中5caC的标准曲线
5caC检测标准曲线的实际样品提取老鼠胚胎干细胞，5caC含量十分稀少，目前主要报道主要集中在胚胎干细胞中检测出5caC，其他组织很难检测出5caC含量，因此，选择老鼠胚胎干细胞提取的DNA制备5caC实际样品的标准曲线。
配制一系列不同比例含LY-5caC修饰位点的DNA片段与未标记的片段混合溶液，以未标记的DNA片段溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和检测模板混合溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.125U)、Nt.BsmAINease切口酶(0.1U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪上监控扩增曲线，并计算扩增曲线反应斜率，计算差值，根据扩增效率下降差值绘制相应浓度标准曲线。
(3)实际样品检测
(a)5hmC实际样品含量
从不同组织提取一系列DNA样品，SD大鼠海马神经元组织DNA(SD-HN)，C56成年小鼠脑组织DNA(mA-B)，C56成年小鼠肾组织DNA(mA-K)，C56新生小鼠脑组织DNA(mN-B)和小鼠胚胎干细胞DNA(mESC)。经DNA破碎、修复加通用接头、化学衍生化及变性获取单链，配制一系列含CPBA-gmC修饰位点的不同实际样品DNA模板，以未标记的DNA片段溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和检测模板混合溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.125U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.1U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪上监控扩增曲线，并计算扩增曲线反应斜率，计算差值，根据标准曲线查出相应含量。通过实际样品检测发现5hmC在海马神经组织(SD-HN)中含量较高，小鼠成年脑组织中5hmC的含量高于新生小鼠脑组织，与文献报道5hmC在脑组织中随着年龄增长不断累积相符。见图27。
(b)5fC实际样品含量
从不同组织提取一系列DNA样品，SD大鼠海马神经元组织DNA(SD-HN)，C56成年小鼠脑组织DNA(mA-B)，成人脑组织DNA(hA-B)，C56新生小鼠脑组织DNA(mN-B)。经DNA破碎、修复加通用接头、化学衍生化及变性获取单链，配制一系列含PHPA-fC修饰位点的不同实际样品DNA模板，以未标记的DNA片段溶液为空白对照。反应分为Part A与Part B两部分配制，Part A部分包括切口酶缓冲液(1×)、dNTPs(250μM)、引物链(50nM)和检测模板混合溶液(32.8nM)，Part B部分包括聚合酶缓冲液(1×)，SYBR Green II荧光染料(2×)、KF(exo-)聚合酶(0.125U)、Nt.BsmAI Nease切口酶(0.1U)，Part A和Part B混合，以上操作均在冰上进行。迅速置于定量PCR仪上监控扩增曲线，并计算扩增曲线反应斜率，计算差值，根据标准曲线查出相应含量。通过实际样品检测发现5fC在人脑组织(hA-B)中含量比小鼠脑组织高，小鼠成年脑组织中5fC的含量低于新生小鼠脑组织，趋势与5hmC相反，且与文献报道相符。见图28。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法
<130> 20180803
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcc gaacctaaag caatcaccag 60
gg 62
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (40)..(40)
<400> 2
gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcc gaacctaaag caatcaccag 60
gg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (40)..(40)
<400> 3
gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcc gaacctaaag caatcaccag 60
gg 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (40)..(40)
<400> 4
gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcc gaacctaaag caatcaccag 60
gg 62
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (40)..(40)
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcn gaacctaaag caatcaccag 60
gg 62
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggactggact ggactggact ggactatcac caggg 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (23)..(23)
<400> 7
ggactggact ggactggact ggactatcac caggg 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (18)..(18)
<220>
<221> 甲基化修饰位点
<222> (23)..(23)
<400> 8
ggactggact ggactggact ggactatcac caggg 35
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
agcccgtgag tctcgccctg gtgattgctt taggttcggc 40
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
agcccgtgag tctcgccctg gtgatagtcc 30

Claims (3)

1.一种非疾病诊断目的的高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，其特征在于：该方法利用DNA聚合酶通过不同甲基化修饰物位点时停顿时间不同实现甲基化修饰的定量分析；
包括以下步骤：
1）将待测DNA破碎、末端修复、连接通用接头，通过化学衍生化反应对待测表观遗传修饰的碱基进行特异性标记，变性获得单链DNA模板；其中，当所述待测表观遗传修饰的碱基为5-羟基胞嘧啶时，3-羧基苯硼酸与经糖基化反应的含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5-羟基胞嘧啶位点实现特异性标记；
2）设计与通用接头序列相匹配的引物，在引物链上引入切口酶识别位点，所述引物的序列从3’端到5’端依次包含如下三部分：根据通用接头的序列设计完全互补的杂交序列、切口酶识别序列、延伸序列；
3）单链DNA模板与引物杂交，在聚合酶作用下，形成双链DNA，切口酶识别切口序列，并在切口酶识别位点3’端第1个碱基切断单链DNA，产生新的含羟基的3’端，聚合酶在切口处引发新一轮扩增延伸，并通过链置换功能，释放出一条短链DNA片段；
4）聚合酶、切口酶的联合作用，切割、聚合反应连续发生，通过检测生成的短链DNA片段量，可获得待测总DNA中该表观遗传修饰的总体水平。
2.一种非疾病诊断目的的高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，其特征在于：该方法利用DNA聚合酶通过不同甲基化修饰物位点时停顿时间不同实现甲基化修饰的定量分析；
包括以下步骤：
1）将待测DNA破碎、末端修复、连接通用接头，通过化学衍生化反应对待测表观遗传修饰的碱基进行特异性标记，变性获得单链DNA模板；其中，当所述待测表观遗传修饰的碱基为5-醛基胞嘧啶时，4-磺酸苯肼与含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5-醛基胞嘧啶位点实现特异性标记；
2）设计与通用接头序列相匹配的引物，在引物链上引入切口酶识别位点，所述引物的序列从3’端到5’端依次包含如下三部分：根据通用接头的序列设计完全互补的杂交序列、切口酶识别序列、延伸序列；
3）单链DNA模板与引物杂交，在聚合酶作用下，形成双链DNA，切口酶识别切口序列，并在切口酶识别位点3’端第1个碱基切断单链DNA，产生新的含羟基的3’端，聚合酶在切口处引发新一轮扩增延伸，并通过链置换功能，释放出一条短链DNA片段；
4）聚合酶、切口酶的联合作用，切割、聚合反应连续发生，通过检测生成的短链DNA片段量，可获得待测总DNA中该表观遗传修饰的总体水平。
3.一种非疾病诊断目的的高通量核酸表观遗传修饰定量分析方法，其特征在于：该方法利用DNA聚合酶通过不同甲基化修饰物位点时停顿时间不同实现甲基化修饰的定量分析；
包括以下步骤：
1）将待测DNA破碎、末端修复、连接通用接头，通过化学衍生化反应对待测表观遗传修饰的碱基进行特异性标记，变性获得单链DNA模板；其中，当所述待测表观遗传修饰的碱基为5-羧基胞嘧啶时，萤黄二钾盐与含有通用接头的DNA片段进行化学衍生化反应对5-羧基胞嘧啶位点实现特异性标记；
2）设计与通用接头序列相匹配的引物，在引物链上引入切口酶识别位点，所述引物的序列从3’端到5’端依次包含如下三部分：根据通用接头的序列设计完全互补的杂交序列、切口酶识别序列、延伸序列；
3）单链DNA模板与引物杂交，在聚合酶作用下，形成双链DNA，切口酶识别切口序列，并在切口酶识别位点3’端第1个碱基切断单链DNA，产生新的含羟基的3’端，聚合酶在切口处引发新一轮扩增延伸，并通过链置换功能，释放出一条短链DNA片段；
4）聚合酶、切口酶的联合作用，切割、聚合反应连续发生，通过检测生成的短链DNA片段量，可获得待测总DNA中该表观遗传修饰的总体水平。
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