CN117214331A - 一种基于两步探针杂交纯化策略与液质技术相结合的microRNA表观遗传修饰检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种可同时对microRNA多种表观遗传修饰进行检测的方法，在microRNA两步探针杂交纯化的基础上，酶解，再进行UPLC‑MS/MS核苷分析检测，从而实现同时对microRNA多种表观遗传修饰的定量检测，该方法具有抗基质干扰能力强、检测灵敏度高、假阳性率低、定量准确，可对microRNA表观遗传修饰同时进行定性和定量分析等特点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱串联质谱技术结合两步探针杂交纯化策略的microRNA表观遗传修饰检测方法。
背景技术
RNA修饰是表观遗传学的重要组成部分，影响几乎所有RNA参与的生命过程，自发现以来即引起大量关注。微小核糖核酸（microRNA）对基因表达的调节有重要作用，在癌症等疾病的早期诊断、治疗以及环境毒理学等领域具有良好应用前景。近年来，研究发现哺乳动物microRNA中存在6-甲基腺苷（6-methyladenosine，m6A）、5-甲基胞苷（5-methylcytosine，m5C）、7-甲基鸟苷（7-methylguanidine，m7G）和核糖2'-O-甲基化（2'-Oribose methylation，2'-O-me）等修饰，这些修饰影响microRNA的生成和功能，且含量在癌症组织与正常组织中有明显差异，microRNA表观遗传修饰的重要性逐渐凸显。然而，由于缺乏适用的检测方法，microRNA表观遗传修饰未能得到广泛研究，关于microRNA序列中是否含有某些修饰依然存在争议。
液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法用于RNA修饰核苷分析，具有灵敏度高，对修饰类型识别能力强和定量准确的优点，广泛用于RNA整体修饰情况表征，以及tRNA、rRNA中修饰的发现和定量分析。由于microRNA含量较低，序列相似度高，现有方法无法从细胞和组织中获得满足LC-MS/MS方法要求数量和纯度的microRNA，导致该方法在microRNA修饰表征中应用有限。
microRNA杂交纯化方法，文献中常用的杂交形式有两种，一是RNA样品与互补序列探针分子在溶液中进行杂交，再与磁珠等固相载体结合进行分离的方式，我们称之为液相杂交；二是先将互补序列探针分子固定于磁珠等载体表面，再与RNA样品混合，进行杂交反应的方式，称为固相杂交。尽管我们对杂交过程、清洗条件等进行了多方面优化，但是，单独使用液相杂交方法或固相杂交方法，抗干扰能力均无法达到LC-MS/MS核苷分析的要求。
《3'-Terminal 2'-O-methylation of lung cancer miR-21-5p enhances itsstability and association with Argonaute 2》［1］报道了：可以使用液相杂交纯化加互补序列保护酶解的二步纯化方案，获得高纯度的目标microRNA，并将该方法与LC-MS/MS结合，成功检测到miR-21-5p中的Am修饰。我们尝试使用该纯化方法对含其他修饰的microRNA进行提取纯化，但是，由于回收率过低，无法用于microRNA修饰的定量表征。该纯化方法涉及到多步酶解，不仅步骤繁琐，且实验最佳条件窗口窄，结果易受操作影响。《A NovelMethod to Purify Small RNAs from Human Tissues for Methylation Analysis byLC-MS/MS》［2］报道了：该方法研究人员在最优条件下操作，得到的microRNA回收率也仅为2%左右。
《液相色谱-质谱技术在核酸表观遗传修饰研究中的应用与展望》［3］报道了：基于LC-MS/MS的核酸修饰检测主要有2种分析策略：一种为以核苷作为目标物的准确定量分析；另一种则基于某段寡核苷酸序列，对其中的修饰位点进行识别和鉴定，但主要是对rRNA、tRNA和mRNA修饰检测，没有报道LC-MS/MS的对microRNA表观遗传修饰的准确定量分析研究。
《基于液相色谱—质谱联用的DNA/RNA修饰分析》［4］报道了：建立了基于LC-ESI-MS/MS检测RNA中m6A含量的方法，没有报道LC-MS/MS的对microRNA表观遗传修饰的准确定量分析研究
对microRNA表观遗传修饰的准确测定，是研究microRNA修饰机制和进一步应用的基础，因此，迫切需要开发可靠的microRNA修饰表征方法，而现有技术暂未检索到对多种microRNA修饰核苷同时准确定量分析的方法。
参考文献
[1]Liang H , Jiao Z , Rong W ,et al.3'-Terminal 2'-O-methylation oflung cancer miR-21-5p enhances its stability and association with Argonaute2.[J].Oxford Academic, 2020(13).DOI:10.1093/nar/gkaa504.
[2]Yang, R.; Li, J.; Wu, Y.; Jiang, X.; Qu, S.; Wang, Q.; Liang, H.;Zen, K. A Novel Method to Purify Small RNAs from Human Tissues forMethylation Analysis by LC-MS/MS. Front. Mol. Biosci. 2022, 9, 949181
[3] 何唯唯,徐华,瞿敏敏,张雅姣,徐斌,&谢剑炜. (2021). 液相色谱-质谱技术在核酸表观遗传修饰研究中的应用与展望. 中国药理学与毒理学杂志, 035(005), 321-335.
[4] 黄维. (2016). 基于液相色谱—质谱联用的DNA/RNA修饰分析. (Doctoraldissertation, 武汉大学).
发明内容
发明所要解决的问题：
针对现有技术存在的问题，本发明建立了一种可对microRNA的多种表观遗传修饰同时进行检测的方法，在microRNA两步探针杂交纯化的基础上，酶解，再进行UPLC-MS/MS核苷分析检测，从而实现同时对microRNA多种表观遗传修饰的定量检测，该方法具有抗基质干扰能力强、检测灵敏度高、假阳性率低、定量准确，可对microRNA多种表观遗传修饰同时进行定性和定量分析等特点。
本发明第一方面，建立了microRNA两步探针杂交纯化的初步方案
概括为：对microRNA先进行液相杂交纯化，再进行固相杂交纯化。
1、microRNA液相杂交纯化初步方案
①提取的microRNA样品中加入含生物素的DNA互补序列探针，反应体系为0.5×SSC缓冲溶液，反应体积60μL；
②温和混匀后，置50℃水浴15h，进行杂交反应；
③准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用20μL 0.5×SSC重新分散；
④磁珠加入杂交反应体系，混匀，室温反应30min；
⑤磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑥加入含有2×SSC和0.2% tween20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑦加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑧加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑨加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑩加入无酶超纯水45～60μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
2、microRNA固相杂交纯化初步方案
①准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用60μL 0.5×SSC重新分散；
②加入含生物素的DNA互补序列探针，置混匀仪室温反应30min；
③分离磁珠，弃上清液，使用0.5 ×SSC缓冲溶液清洗磁珠三遍；
④将microRNA样品与已结合互补DNA序列探针的磁珠混合，保持反应体系为0.5×SSC，体积为60～80μL；
⑤温和混匀后，置50℃水浴的时间改为4h，每隔1h取出摇匀，保持磁珠分散状态；
⑥反应完成后，立刻置磁力架上分离，弃上清液，保留磁珠；
⑦加入含有2×SSC和0.2% tween20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑧加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑨加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑩加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑪加入无酶超纯水20μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
本发明第二方面，建立了对两步探针杂交纯化后的microRNA样品进行酶解的初步方案
1、纯化后的microRNA样品中加入Mix酶1μL和10倍酶解缓冲液2μL，37℃金属浴进行酶解，然后升至70℃金属浴10min终止反应；
2、酶解产物用超纯水稀释至60μL，用于UPLC-MS/MS分析。
本发明第三方面，建立了UPLC-MS/MS对microRNA多种修饰核苷同时定量检测的初步方案
UPLC条件：Acquity UPLC BEH C18反相色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm粒径，Waters）；流动相A为超纯水或乙酸-超纯水（乙酸与超纯水的体积比分别为：0.1%，0.05%，0.02%，0.01%，0.005%）或乙酸-乙酸铵（NH4Ac）水溶液（0.1%乙酸+2mM乙酸铵；0.01%乙酸+0.5mM乙酸铵）或乙酸铵水溶液（10mM乙酸铵）或碳酸氢铵水溶液（2mM NH4HCO3），流动相B为100%乙腈，梯度洗脱；进样体积为10μL；所述梯度洗脱条件如下：
0~3.0min，0% B，0.25mL/min，
3.0～6.0min，0~10.0% B，0.25mL/min，
6.0～10.0min，10.0%～50.0% B，0.25mL/min，
10.0～12.0min，100.0% B，0.25mL/min；
质谱条件：离子源为Unispray；在正离子模式下工作；数据采集为多反应监测（MRM）模式；氮气用于雾化和去溶剂化；源温度为150℃，去溶剂化温度为400℃，锥孔气流量为150L/h，去溶剂化气流量为800L/h，雾化器气流量为7.0Bar，碰撞气体采用高纯氮气，碰撞气体流量为0.15mL/min。
本发明第四方面，对上述第一、二和三方面的初步方案进行优化
1、液相杂交和固相杂交分别比较了三种探针方案
对于液相杂交方式，使用P1探针的回收率最高，P2、P3依次降低，即随着间隔臂长度增加，提取效率下降。因此，液相杂交选择使用的DNA探针互补序列与生物素之间间隔臂为AA，即P1系列探针，序列如SEQ ID NO .1、SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .3、SEQ ID NO .4、SEQ ID NO .5、SEQ ID NO .6所示；
对于固相杂交方式，使用P3探针的回收率最高，P2、P1依次降低，即随着间隔臂长度减少，提取效率下降。固相杂交使用的DNA探针互补序列与生物素之间间隔臂为AAAAAA，即P3系列探针，序列如SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .11、SEQ ID NO .12、SEQID NO .13、SEQ ID NO .14所示。
2、对探针分子使用量进行了筛选
最终确定了探针分子使用量2.5~20pmol为最优。
3、进行了单纯液相杂交纯化、单纯固相杂交纯化和两步杂交纯化（先液相杂交纯化，再固相杂交纯化）抗干扰能力和回收率的比较
结果与仅使用液相杂交或固相杂交纯化的方法相比，两步探针杂交纯化方法抗干扰能力明显提高，其回收率均高于50%，远高于文献中报道纯化方法的回收率（小于2%），最终确定了两步杂交纯化的方案。
4、酶解时间优化
通过实验确定酶解时间为120分钟。
5、对UPLC-MS/MS方法中液相色谱流动相A相进行了筛选和优化
重点比较了0.01%HAc和2mM NH4HCO3两种流动相A相，结果表明这两种流动相，对Am、Gm、m6A、m7G、m5C均具有较好的适用性，线性良好，方法灵敏。但是对于G、U、Cm、Um，流动相中添加NH4HCO3的方法线性更好，灵敏度更高。因此，综合选择2mM NH4HCO3作为流动相A相。
在上述优化的基础上，确定了最佳的两步杂交纯化方案，最佳的酶解方案及UPLC-MS/MS的UPLC和质谱条件，从而确定了在microRNA两步探针杂交纯化的基础上，酶解，再用UPLC-MS/MS对microRNA修饰核苷进行分析检测的方案。
本发明第五方面，采用本发明的检测方法对microRNA修饰核苷的定量准确性进行验证
验证结果：核苷信号的比值与microRNA修饰比例线性关系良好，表明该方法可用于microRNA中m6A和m5C含量和比例的定量评估。
本发明第六方面，将本发明的检测方法用于细胞microRNA修饰定量表征进行加标验证
验证结果：本发明的检测方法灵敏度高，定量检测准确，可用于细胞microRNA修饰核苷的定量表征。
本发明具有以下有益效果：
本发明建立了一种在两步探针杂交纯化基础上、酶解，再用UPLC-MS/MS进行核苷的分析检测，实现了microRNA样品前处理步骤的特异性和回收率提升，为microRNA多种表观遗传修饰的同时检测提供了一种灵敏度高，定量准确的检测方法。
附图说明
图1、探针间隔臂长度和杂交方式与microRNA回收率关系，其中，
L为液相杂交，S为固相杂交，P1、P2、P3为对应的miR-21-5p互补DNA探针；
图2、探针使用量对microRNA提取效果的影响；
图3、液相杂交纯化与两步杂交纯化抗干扰能力比较（使用10倍含量的单碱基错配序列进行评价）；
图4、两步杂交纯化方法抗干扰能力评价，其中，样品为混合修饰microRNA样品，
a为m6A，
b为m5C，
c为Gm，
d为Um；
图5、两步杂交纯化目标microRNA回收率；
图6、酶解时间与酶解液中m5C质谱峰面积关系，其中，
a为40fmol的miR-10a-m5C，UPLC-MS/MS测定m5C的峰面积，在80~120分钟区间达到峰值，
b为400fmol的miR-10a-m5C，UPLC-MS/MS测定m5C的峰面积，在30~60分钟区间即达到峰值；
图7、8种修饰核苷的线性拟合工作曲线，其中，
a为Am的线性拟合工作曲线，
b为Gm的线性拟合工作曲线，
c为Cm的线性拟合工作曲线，
d为Um的线性拟合工作曲线，
e为m6A的线性拟合工作曲线，
f为m7G的线性拟合工作曲线，
g为m5C的线性拟合工作曲线，
h为m6Am的线性拟合工作曲线；
图8、UPLC-MS/MS测得的m6A修饰核苷和未修饰核苷信号比值与microRNA修饰比例的线性关系；
图9、UPLC-MS/MS测得的m5C修饰核苷和未修饰核苷信号比值与microRNA修饰比例的线性关系；
图10、细胞小RNA样品加标（1 fmol miR-21-m6A）验证结果，其中，
a为m6A含量数据，左：阳性对照；中：细胞小RNA样品；右：细胞小RNA样品加标（1fmol miR-21-m6A），
b为细胞小RNA样品和细胞小RNA样品加标（1 fmol miR-21-m6A）样品中测得的m6A修饰比例；
图11、细胞小RNA样品加标（1 fmol miR-10a-m5C）验证结果，其中，
a为m5C含量数据，左：细胞小RNA样品；右：细胞小RNA样品加标（1 fmol miR-10a-m5C），
b为细胞小RNA样品和细胞小RNA样品加标（1 fmol miR-10a-m5C）样品中测得的m5C修饰比例。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
材料与试剂
链霉素亲和磁珠（SMB）和核酸消化混合酶（Mix）购买自New England Biolabs（Ipswich，MA，USA）。Tween 20购自Sigma-Aldrich（St. Louis，MO，USA），SSC缓冲溶液（20×，pH 7.4）购自贝博生物（上海），色谱级乙腈购自百灵威科技有限公司（北京）；LC/MS级乙酸，购自赛默飞世尔科技公司（美国）。无RNA/DNA酶超纯水来自Invitrogen公司（NY，USA），应用于所有涉及microRNA分离纯化的实验，其他实验使用超纯水（18.2 MΩ.cm）由Milli-Q纯水机（美国）制备；其他试剂购自国药集团（北京）；所有试剂均为分析纯或以上纯度。
部分实验中，涉及样品和溶液配置、转移等敞开实验，均于超净工作台进行。实验中使用的离心管、移液枪头均为Axygen的无RNA酶的产品（康宁，美国）。
寡核苷酸序列：
使用的生物素化单链DNA探针序列，人工合成单链RNA序列（microRNA模拟物），人工合成含甲基修饰的单链RNA序列均订制于锐博生物（广州），并用高效液相色谱法纯化后使用。各寡核苷酸的序列如表1～表3所示。
表1、单链DNA探针序列
表2、人工合成的单链RNA（microRNA模拟物）序列
表3、人工合成的含甲基修饰的单链RNA（含修饰核苷的microRNA模拟物）序列
实施例1、两步探针杂交纯化
1、microRNA液相杂交纯化
（1）提取的microRNA样品中加入10pmol含生物素的DNA互补序列探针P1（见表1），反应体系为0.5 ×SSC缓冲溶液，反应体积60μL。
（2）温和混匀后，置50℃水浴15h，进行杂交反应。
（3）准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用20μL 0.5 ×SSC重新分散。
（4）磁珠加入杂交反应体系，混匀，室温反应30min。
（5）磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（6）加入含有2×SSC和0.2% tween 20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（7）加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（8）加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（9）加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（10）加入无酶超纯水45～60μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
2、microRNA固相杂交纯化
（1）准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用60μL 0.5×SSC重新分散。
（2）加入10pmol含生物素的DNA互补序列探针P3，置混匀仪室温反应30min。
（3）分离磁珠，弃上清液，使用0.5×SSC缓冲溶液清洗磁珠三遍。
（4）将RNA样品与已结合互补DNA序列探针的磁珠混合，保持反应体系为0.5 ×SSC，体积为60～80μL。
（5）温和混匀后，置50℃水浴的时间改为4h，每隔1h取出摇匀，保持磁珠分散状态。
（6）反应完成后，立刻置磁力架上分离，弃上清液，保留磁珠。
（7）加入含有2×SSC和0.2% tween 20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（8）加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（9）加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（10）加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠。
（11）加入无酶超纯水20μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
实施例2、纯化miRNA样品的酶解
1、纯化后的microRNA样品中加入Mix酶（New England Biolabs公司产品）1μL和10倍酶解缓冲液2μL，37℃金属浴2h进行酶解，然后升至70℃金属浴10min终止反应。
2、酶解产物用超纯水稀释至60μL，用于液质分析。
实施例3、UPLC-MS/MS分析
使用Acquity UPLC BEH C18反相色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm粒径，Waters）分离核苷。流动相A为2mM碳酸氢铵水溶液，流动相B为100%乙腈。UPLC分离采用以下梯度洗脱：
0~3.0min，0% B，0.25mL/min；
3.0～6.0min，0~10.0% B，0.25mL/min；
6.0～10.0min，10.0%～50.0% B，0.25mL/min；
10.0～12.0min，100.0% B，0.25mL/min。
进样体积为10μL。
质谱仪离子源为Unispray，在正离子模式下工作，数据采集为多反应监测（MRM）模式，氮气用于雾化和去溶剂化。源温度为150℃，去溶剂化温度为400℃。锥孔气流量为150L/h，去溶剂化气流量为800L/h，雾化器气流量为7.0Bar。碰撞气体采用高纯氮气（99.999%）。碰撞气体流量为0.15mL/min。采集参数见表4。
表4、目标核苷的质谱采集参数
实施例4、两步杂交中探针间隔臂长度筛选
比较三种间隔臂探针方案和液相固相两种杂交方式对目标microRNA的提取纯化回收率。
对于液相杂交方式，使用P1探针的回收率最高，P2、P3依次降低，即随着间隔臂长度增加，提取效率下降。
对于固相杂交方式，使用P3探针的回收率最高，P2、P1依次降低，即随着间隔臂长度减少，提取效率下降。
液相杂交使用的互补序列DNA探针为P1系列探针，固相杂交为P3系列探针可获得较优的回收率，提高两步杂交方案整体回收率，如图1所示。
因此，液相杂交选择使用的DNA探针互补序列与生物素之间间隔臂为AA，即P1系列探针；固相杂交中选择使用的DNA探针互补序列与生物素之间间隔臂为AAAAAA，即P3系列探针。
实施例5、探针分子使用量筛选
以miR-21-me为目标RNA序列，生物素化的互补序列探针分子添加量分别为2.5，5，10，15，20pmol时，提取得到的miR-21-me酶解产物质谱信号无明显差异，结果如图2所示。探针分子添加量为25pmol时，信号有一定下降，可能此时磁珠链霉素亲和位点已经饱和，导致部分与探针杂交的miR-21-me未被磁珠捕获。所以探针分子使用量选择2.5～20pmol。
实施例6、液相和固相两步杂交纯化与单纯液相杂交纯化一步法或固相杂交纯化一步法比较
通过连续使用液相杂交纯化方法和固相杂交纯化方法，即两步杂交纯化方法，对样品中目标microRNA序列进行提取纯化。
液相和固相两步杂交纯化方法，比单纯液相杂交纯化一步法，或固相杂交纯化法，具有更佳的抗干扰能力，如图3所示。
使用10倍含量的单碱基错配序列进行测试，两步杂交纯化方法中检测到的单碱基错配序列含量，为单纯液相杂交纯化方法的1/3。
使用混合修饰microRNA样品对两步杂交方案抗干扰能力进行评价，发现已经基本检测不到互补序列以外其他修饰microRNA的修饰核苷，对于同族单碱基错配的探针（Let-7a-5p与Let-7e-5p），可检测到修饰核苷含量为完全互补序列探针的10%，结果见图4。与仅使用液相杂交或固相杂交纯化的方法相比，方法抗干扰能力明显提高。对两步杂交纯化方法进行回收率评价，五种microRNA模拟物回收率见图5，其回收率均高于50%，远高于文献中报道纯化方法回收率（小于2%）。
实施例7、酶解时间的筛查和优化
对40 fmol的miR-10a-m5C，UPLC-MS/MS测定m5C的峰面积，在80~120分钟区间达到峰值，结果见图6（a)；
对400 fmol的miR-10a-m5C，UPLC-MS/MS测定m5C的峰面积，在30~60分钟区间即达到峰值，且随酶解时间增加变化不大，结果见图6（b)。
因此后续实验选择酶解时间为120分钟。
实施例8、对液相色谱流动相A相近行优化
作为优化：UPLC-MS/MS方法中对液相色谱流动相A相进行优化，测试的流动相A项包括：超纯水、乙酸-超纯水（乙酸与超纯水的体积比分别为：0.1%，0.05%，0.02%，0.01%，0.005%）；乙酸-乙酸铵（NH4Ac）水溶液（0.1%乙酸+2mM乙酸铵；0.01%乙酸+0.5mM乙酸铵）；乙酸铵水溶液（10mM乙酸铵）；碳酸氢铵水溶液（2mM NH4HCO3）。100%乙腈作为B相流动相。
结果表明，以亲水性强、在反向色谱柱上保留时间短的m5C为例，使用不同浓度的乙酸-水作为流动相，随着乙酸比例下降，m5C保留时间有稍增加，m5C质谱峰面积明显增加，以纯水作为流动相时m5C质谱峰面积最大。但是，以纯水或极低浓度的乙酸-水溶液为流动相，由于缓冲能力弱，存在易受基质干扰、保留时间/峰面积稳定性差的问题，因而综合先优选了0.01% HAc作为流动相A相。
亦考察了使用乙酸-乙酸铵体系对基质中含有酶解缓冲液的核苷样品的适用性。但是，即使添加0.5mM的乙酸铵（0.01%HAc+0.5mM NH4Ac），较乙酸体系（0.01%HAc）相比，m5C质谱信号强度大幅下降。不管是在乙酸缓冲体系中加入乙酸铵，还是直接使用乙酸铵-水溶液作为流动相，m5C质谱峰面积均比乙酸流动相体系下降约1个数量级。说明无法使用乙酸-乙酸铵体系降低检测m5C等核苷分析物时的基质效应。另外，碳酸氢铵也被用于LC-MS/MS流动相，有文献报道使用碳酸氢铵-水溶液流动相，可以极大降低基质对5-hydroxymethycytosine（5hmC）的离子化抑制效应，因此，重点比较了0.01%HAc和2mMNH4HCO3两种流动相A相。结果表明这两种流动相，对Am、Gm、m6A、m7G、m5C均具有较好的适用性，线性良好，方法灵敏。但是对于G、U、Cm、Um，流动相中添加NH4HCO3的方法线性更好，灵敏度更高。因此，综合选择2mM NH4HCO3作为流动相A相。
作为优化：对流动相中添加NH4HCO3的UPLC-MS/MS核苷分析方法进行方法学评价。8种修饰核苷拟合曲线、线性范围和线性方程及方法检出限分别见图7和表5。证明该方法具有高灵敏度和准确定量能力，对m6A、m5C、m7G、Am、Cm、Gm等多种修饰核苷的分析定量限可达pM级（0.1~0.4fmol）。
表5、核苷及修饰核苷的检测线性范围和线性方程
实施例9、microRNA修饰核苷定量分析准确性验证
通过使用合成的正常microRNA和含有甲基化核苷的microRNA，配置含不同修饰比例的microRNA混合物，考察UPLC-MS/MS方法测定的修饰核苷与未修饰核苷的比例与配置的microRNA修饰比例是否成线性关系，以对本发明方法的定量能力进行验证。
1、本发明检测方法用于microRNA中m6A修饰定量分析的准确性验证
（1）分别配置浓度为1fmol/μL的miR-21-m6A和miR-21-5p溶液，溶剂为0.5×SSC缓冲液。
（2）配置不同修饰比例的microRNA混合物：依次量取1.25μL、2.5μL、5.0μL、7.5μL、10μL、15μL的miR-21-m6A溶液，分别加入98.75μL、97.5μL、95.0μL、92.5μL、90μL、85μL的miR-21-5p溶液，混匀。同时量取100μL的miR-21-5p溶液作为修饰空白样品。
（3）按照实施例1-8的方法，对microRNA混合物溶液进行两步杂交纯化、酶解和UPLC-MS/MS分析。
（4）以m6A与A质谱峰面积的比值对microRNA混合物中miR-21-m6A的比值进行线性拟合，考察质谱测得的m6A/A比例是否与microRNA混合物中的修饰比例成线性关系
结果：测试microRNA混合物中，miR-21-m6A占总microRNA的比例（miR-21-m6A与miR-21-m6A+miR-21-5p的比值）为1.25%~15%。miR-21-5p序列中有6个A，miR-21-m6A中有5个A和1个m6A，因此，混合样品中m6A/A的比值为0.21%~2.6%。如图8所示，在该范围内，核苷信号的比值与microRNA修饰比例线性关系良好，表明本发明检测方法可用于microRNA中m6A含量和比例的定量评估。
2、本发明检测方法用于microRNA中m5C修饰定量分析的准确性验证
参考以上1中（1）-（4）的步骤，配置含不同比例miR-10a-m5C和miR-10a-5p的混合microRNA样品，进行两步杂交纯化、酶解和UPLC-MS/MS分析，考察m5C/C与microRNA修饰比例的线性关系，由于miR-10a-m5C中所有核苷均为m5C，因此，混合样品中修饰核苷的比例，与修饰microRNA的比例一致。该比例较低时，m5C/C值与m5C/(m5C+C)值接近，可用m5C/C值代替m5C/(m5C+C)值用于定量表征和评价。结果如图9所示，在该范围内，核苷信号的比值与microRNA修饰比例线性关系良好，表明本发明检测方法可用于microRNA中m5C含量和比例的定量评估。
实施例10、本发明的检测方法用于检测细胞中microRNA表观遗传修饰的验证
1、本发明检测方法用于检测细胞中microRNA中m6A修饰定量分析的准确性验证
为验证本发明检测方法的灵敏度与定量准确性，在HCT-8细胞小RNA中，加入1fmol合成的miR-21-m6A序列，然后进行miR-21-5p两步杂交提取纯化实验，来自阳性对照样品、细胞小RNA样品和细胞小RNA加标样品的miR-21-5p，酶解后，用UPLC-MS/MS分析得到的m6A含量数据和修饰比例数据见图10，其中a为含量数据，b为修饰比例数据。
在细胞小RNA加标样本中提取的miR-21-5p中检测到m6A含量为0.44±0.04fmol，计算得到m6A/A比值为0.39%±0.04%，与理论计算值（0.38%）一致。
2、本发明检测方法用于检测细胞中microRNA中m5C修饰定量分析的准确性验证
为验证本发明检测方法的灵敏度与定量准确性，在HCT-8细胞小RNA中，加入1fmol合成的miR-10a-m5C序列，然后进行miR-10a-m5C两步杂交提取纯化实验，来自阳性对照样品、细胞小RNA样品和细胞小RNA加标样品的miR-10a-m5C，酶解后，用UPLC-MS/MS分析得到的m5C含量数据和修饰比例数据见图11，其中a为含量数据，b为修饰比例数据。
在细胞小RNA加标样本中提取的miR-10a-m5C中检测到m5C含量为2.5 fmol，计算得到m5C/C比值为5.4%，与理论计算值一致。
该结果表明，本发明建立的检测方法，可用于细胞microRNA修饰核苷的定量表征。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种可同时对microRNA多种表观遗传修饰进行检测的方法，其特征在于，所述microRNA多种表观遗传修饰包含的修饰核苷为Am、Gm、Cm、Um、m6A、m7G、m5C、m6Am中的任意一种或多种，所述的方法包括如下步骤：
（1）microRNA液相杂交纯化；
（2）microRNA固相杂交纯化；
（3）纯化miRNA样品的酶解；
（4）UPLC-MS/MS分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)microRNA液相杂交纯化的操作步骤如下：
①提取的microRNA样品中加入2.5~20pmol含生物素的DNA互补序列探针P1，反应体系为0.5×SSC缓冲溶液，反应体积60μL；
②温和混匀后，置50℃水浴15h，进行杂交反应；
③准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用20μL 0.5×SSC重新分散；
④磁珠加入杂交反应体系，混匀，室温反应30min；
⑤磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑥加入含有2×SSC和0.2% tween20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑦加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑧加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑨加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑩加入无酶超纯水45～60μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)microRNA固相杂交纯化的操作步骤如下：
①准备链霉素亲和磁珠0.1mg，充分清洗后使用60μL 0.5×SSC重新分散；
②加入2.5~20pmol含生物素的DNA互补序列探针P3，置混匀仪室温反应30min；
③分离磁珠，弃上清液，使用0.5×SSC缓冲溶液清洗磁珠三遍；
④将microRNA样品与已结合互补DNA序列探针的磁珠混合，保持反应体系为0.5×SSC，体积为60～80μL；
⑤温和混匀后，置50℃水浴的时间改为4h，每隔1h取出摇匀，保持磁珠分散状态；
⑥反应完成后，立刻置磁力架上分离，弃上清液，保留磁珠；
⑦加入含有2×SSC和0.2% tween20的漂洗液200μL，置混匀仪室温清洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑧加入含有2×SSC的漂洗液200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑨加入含有0.5×SSC的漂洗液200μL，混匀后37℃温浴10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑩加入无酶超纯水200μL，置混匀仪室温漂洗10min，磁力架分离，弃上清液，保留磁珠；
⑪加入无酶超纯水20μL，混匀，80℃温浴5min，取出后立即置磁力架上分离，吸取上清液，转移至干净的无酶离心管中，用于下一步实验。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)纯化miRNA样品的酶解操作步骤如下：
①纯化后的microRNA样品中加入Mix酶1μL和10倍酶解缓冲液2μL，37℃金属浴2h进行酶解，然后升至70℃金属浴10min终止反应；
②酶解产物用超纯水稀释至60μL，用于UPLC-MS/MS分析。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)UPLC-MS/MS分析条件如下：
UPLC条件：Acquity UPLC BEH C18反相色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm粒径，Waters）；流动相A为2mM碳酸氢铵水溶液，流动相B为100%乙腈，梯度洗脱；进样体积为10μL；所述梯度洗脱条件如下：
0~3.0min，0% B，0.25mL/min，
3.0～6.0min，0~10.0% B，0.25mL/min，
6.0～10.0min，10.0%～50.0% B，0.25mL/min，
10.0～12.0min，100.0% B，0.25mL/min;
质谱条件：离子源为Unispray；在正离子模式下工作；数据采集为多反应监测（MRM）模式；氮气用于雾化和去溶剂化；源温度为150℃，去溶剂化温度为400℃，锥孔气流量为150L/h，去溶剂化气流量为800L/h，雾化器气流量为7.0Bar，碰撞气体采用高纯氮气，碰撞气体流量为0.15mL/min。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中所述的含生物素的DNA互补序列探针P1系列序列如SEQ ID NO .1、SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .3、SEQ ID NO .4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO .6所示。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤②中所述的含生物素的DNA互补序列探针P3系列序列如SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .11、SEQ ID NO .12、SEQ IDNO .13、SEQ ID NO .14所示。
8.如权利要求1所述的方法，所述修饰核苷Am、Gm、Cm、Um、m6A、m7G、m5C、m6Am的Q1离子质荷比（m/z）分别为：282、298、244、259.1、282.1、298、258、296.1，Q3离子质荷比（m/z）分别为：136、152、112、113.1、150.1、166、126、150.1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法可用于细胞microRNA表观遗传修饰的定量表征。
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