CN110577986A - Dna甲基化检测探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种DNA甲基化检测探针，包括5’端和3’端的用于与甲基化DNA互补配对的序列，其中，检测探针3’端的最后三个碱基均为鸟嘌呤，所述鸟嘌呤与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至5’端的序列反向互补配对。本DNA甲基化检测探针能够提高DNA甲基化检测的灵敏度。

Description

DNA甲基化检测探针

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种DNA甲基化检测探针。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，下一个重要任务之一就是解密遗传系统， 即人体细胞在生长过程中是如何运用遗传物质来决定某一特定基因在何时何 地得到表达。

DNA甲基化因其能影响基因表达的遗传状态，已成为表观遗传系统中的 一个重要部分。哺乳动物的DNA甲基化大多发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶上， 即在胞嘧啶的嘧啶环上5号碳位置加入甲基。

在正常细胞中，甲基化主要发生在重复的基因组区域，包括遗传元件和 卫星脱氧核苷酸，然而与基因启动子和外显子相关的CpG岛屿通常是没有甲 基化的。但是在这些区域上突变性的DNA甲基化能导致癌症抑制基因的转录 沉默，这种突变性的DNA甲基化可以作为各种疾病包括癌症的标志。CpG岛 屿上特定区域的甲基化可能与特定类型的癌症相关。因此，人类基因组中任 一给定位置上DNA甲基化的准确定量对于人类癌症的早期治疗是非常重要 的。

传统的已有多种用于分析单个CpG位置或短序列中DNA甲基化的检测方 法。甲基化特异性的PCR(MSP)开启了将聚合酶链反应(PCR)用于甲基化 分析的大门，但由于MSP的分析结果是通过观察凝胶电泳的现象，导致MSP 仅能提供实验的定性分析而非定量分析。荧光标记实时监测PCR和甲基化特 异性的量子点的荧光共振能量转移(MSq-FRET)等方法都需要精密控温的PCR 仪，且一般需要使用荧光染料分子标记的探针，大大加重了实验成本。结合 亚硫酸盐的限制性消化分析方法(COBRA)给定量且灵敏的DNA甲基化的检 测提供了另一种选择，但是COBRA的前提条件是分析样品中要有甲基化敏感 性的限制性消化酶的酶切位点。基于表面增强拉曼光谱法和单核苷酸扩增方 法，由于较低的灵敏度导致应用受限。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种DNA甲基化检测探针，旨在提高DNA甲 基化检测的灵敏度。

为实现上述目的，本发明提出一种DNA甲基化检测探针，包括5’端和3’ 端的用于与甲基化DNA互补配对的序列，其中，检测探针3’端的最后三个碱 基均为鸟嘌呤，所述鸟嘌呤与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测 探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向 互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的 临近脱氧核苷酸至5’端的序列反向互补配对。

优选的，所述检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。

优选的，所述3’端包括13个碱基。

优选的，所述5’端包括21个碱基。

优选的，所述DNA甲基化检测探针还包括中间部分的用于引发超分支滚 环扩增反应的特异性序列，所述特异性序列包括正向引物和反向引物。

优选的，所述正向引物的长度为25个。

优选的，所述正向引物为SEQ ID NO:3。

优选的，所述反向引物的长度为23个。

优选的，所述反向引物为SEQ ID NO:4。

本技术方案中，DNA甲基化检测探针3’端的最后三个碱基均为鸟嘌呤， 能够更大概率的检测到发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶上的DNA甲基化，因此， 相对于现有技术，具有灵敏度高的特点。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成上述目的所采取的技术手段及功效，以下 结合较佳实施例，对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解，此处 所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一实施方式的DNA甲基化检测探针包括5’端和3’端的用于与甲基化DNA 互补配对的序列以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增反应的特异性序 列，其中，检测探针3’端的最后三个碱基为鸟嘌呤，与甲基化DNA中部的甲 基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部甲基化胞嘧 啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部 甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至另5’端的序列反向互补配对。

该DNA甲基化检测探针3’端的最后一个碱基对应甲基化DNA中部的甲基 化胞嘧啶，能特异性的与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形 成而互补配对。

在一可选实施方式中，若待测DNA为甲基化DNA，则其能与检测探针完 全互补配对，且互补配对后导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连 接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA，不会被消化液消 化。

其中，非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨 基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能与鸟嘌呤互补 配对，非甲基化的DNA不能与检测探针完全互补配对，没有环状DNA的形成， 从而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。

环状DNA可以通过后续的HRCA反应及信号检测定量分析待测DNA的甲 基化程度，由于HRCA具有超高扩增能力(109倍信号放大)，从而保证了检 测的超高灵敏度要求。且该检测探针能与众多甲基化的DNA融合，兼容性好。 此外，使用该探针，检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记的探针或进行PCR 扩增，检测的成本大大降低。

在一可选实施方式中，H157(人类非小细胞肺癌细胞系)及H209(人类 小细胞肺癌细胞系)细胞系的甲基化DNA检测流程如下：

1、DNA提取及消化

1.1分别培养H157和H209两种细胞系。

正常的H157细胞系中p16启动子区域是高度甲基化的，而正常的H209 细胞系中的这些区域是没有甲基化的。

培养条件：将两种细胞系分别置于含有10％牛血清白蛋白的DMEM培养 液中，放置在加湿处理的含有5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。

1.2提取DNA

用DNA提取试剂盒分别提取上述两种细胞系的基因组DNA，并采用分光 光度计检测该DNA提取溶液在260纳米处的吸收值，换算出DNA浓度。

1.3用Pst I和BstE II两种限制性消化酶分别处理提取的DNA，以消化基因 组DNA为较短的碱基片段，得到待测DNA。

在其他实施例中，细胞系中DNA的提取这个步骤可以省略，采用直接购 买的方式获得甲基化的DNA和未甲基化的DNA。

2、亚硫酸氢钠处理待测DNA，使所述待测DNA中未甲基化的胞嘧啶转 化成尿嘧啶。

处理条件为：1μg待测DNA中加入至20μL体积的浓度为0.35mol/L的氢 氧化钠溶液中，37℃反应20分钟后，将一定体积的的亚硫酸氢钠溶液和对苯 二酚加至上述溶液中使其终浓度分别为3.2mol/L和0.5mmol/L，50℃反应16-18 小时，然后使溶液过脱盐柱，回收DNA；向回收的DNA中加入一定体积的氢 氧化钠溶液，使其在50μL的溶液中终浓度为0.3mol/L，37℃反应15分钟，然 后用醋酸氨将该溶液完全中和，最后在乙醇中沉淀，干燥得到DNA粉末。将 得到的DNA粉末溶于超纯水中，于-20℃保存备用。

3、连接反应

3.1根据待测DNA的序列设计锁式探针

在本实施例中，待测DNA的序列分别如下：甲基化DNA序列为：

GAG GGT GGG GmCG GAC mCGmC GTG mCGC TmCGGmCG GCT G(SEQ ID NO:2)，其中，mC表示甲基化的胞嘧啶；

未甲基化DNA序列为：GAG GGT GGG GCG GAC CGC GTG CGC TCGGCG GCT G(SEQ IDNO:5)。

设计的锁式探针的序列：

AC GCG ATC CGC CCC ACC CTC ATT AGG TTACTG CGA TTA GCA CAA GCA CCA AGAGCA ACT ACA CGAATT CCA ACCGCC GAA CG(SEQ ID NO:1)。

在本实施例中，为了增强检测的特异性，在锁式探针的序列上做了特别 设计：锁式探针的总长为83个碱基，与甲基化DNA互补配对的5’端有21个 碱基，3’端有13个碱基，中间成环部分49个碱基，这种两端互补配对的不对 称序列结构，将有利于目的基因与锁式探针的结合；其次，锁式探针的3’端 的最后一个碱基被设定为鸟嘌呤，特异性与甲基化DNA的甲基化胞嘧啶通过 三个氢键的形成而互补配对，而未甲基化DNA通过亚硫酸氢钠的处理，胞嘧 啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，不能与鸟 嘌呤互补配对。

在其他实施例中，锁式探针可以采用其他合理的设计方案，例如5’端的 用于互补配对的序列长度不限于21bp，3’端的用于互补配对的序列长度也不 限于13bp。锁式探针的设计只要满足实验要求即可。即确保锁式探针5’和3’ 端的序列分别与目的甲基化DNA的5’和3’的序列反向互补配对。

3.2连接反应的条件

将不同浓度的2L待测DNA与2L的1mol/L的锁式探针混合，制备20L的 混合液，混合液中含有：20mmol/LTris-HCl(pH 7.6)缓冲液，25mmol/L醋酸 钾，10mmol/L醋酸镁，1mmol/L的烟酰胺腺苷二核苷酸和0.1％Triton X-100。 95℃反应5分钟，然后加入12单位的TaqDNA连接酶，65℃反应60分钟。

用亚硫酸氢盐处理待测DNA后，未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲 基化的胞嘧啶不发生变化，在连接反应中，甲基化的DNA能与锁式探针的两 端完全互补配对，使锁式探针的3’端和5’端靠近，在连接酶的作用下，锁式 探针的3’端和5’端连接起来，形成环状锁式探针。未甲基化的DNA由于序列 有了重大区别，不能与锁式探针完全互补配对，因此3’端和5’端不能被连接 酶连接起来，从而甲基化DNA与未甲基化DNA可以由此区分，由于锁式探针 的环化连接特异性强，因此这种利用锁式探针的环化连接用于甲基化检测的 方法具有高特异性。

3.3连接反应产物的验证

为了证明该方法的可行性，在本实施方式中，选用电泳实验来验证，在 此，其中的电泳实验，可以是连接反应产物的标准银染的变性的10％的聚丙 烯酰胺凝胶电泳。由于线性锁式探针比环状锁式探针跑得快，电泳证明连接 反应产物的存在，方法可行。

4、消化反应

4.1消化反应的条件

取10L连接反应后的溶液与10L消化液混合，37℃反应2小时，最后在 95℃10分钟失活。10L消化液中含有1mmol/L的DTT，6.7mmol/L的氯化镁， 67mmol/L的pH 9.5的甘氨酸-氢氧化钾缓冲液，10单位的DNA外切酶I和外 切酶III。

DNA外切酶I和外切酶III能消化非环状DNA，但不能消化环状DNA，从 而得到纯的环状锁式探针。在本实施例中，非环状DNA指的是甲基化DNA、 未甲基化DNA及未发生连接反应的锁式探针。

4.2消化反应产物的验证

在本实施例中，选用电泳实验来验证，所有非环状DNA均被消化干净， 除了环状锁式探针。环状锁式探针的存在进一步证明了连接反应的可行性， 同时为了减少后面的扩增反应中非连接特异性扩增的发生，进一步提高特异 性，外切酶的消化作用非常重要。

5、超分支滚环扩增反应

5.1根据锁式探针设计两条引物

引物1序列(正向引物)为：3’CTT GTG CTA ATC GCA GTA ACC TAA T 5’(SEQ IDNO:3)；

引物2序列(反向引物)为：3’ACC AAG AGC AAC TAC ACG AAT TC 5’(SEQ ID NO:4)。

5.2超分支滚环扩增反应的条件

将10L的消化反应产物与20L扩增溶液混合，63℃反应1小时。扩增溶液 中含有：0.05μmol/L的引物1和引物2，400μmol/L的脱氧核苷三磷酸混合液 和8个单位的Bst DNA聚合酶。

随着两引物的浓度由1μmol/L到0.05μmol/L的降低，甲基化基因与未甲 基化基因的荧光强度的差值逐渐增大，因此，本实施例选定0.05μmol/L为两 种引物的最优浓度，因为较高浓度的引物，将会引起引物自身的二聚和非特 异性的扩增。另外，随着dNTPs底物浓度由2μmol/L到400μmol/L的增加，甲 基化基因与未甲基化基因的荧光强度的差值逐渐增大，因此本实施例选用 400μmol/L为dNTPs底物的最佳浓度。

5.3超分支滚环扩增反应产物的验证

在本实施例中，选用电泳实验来验证，通过超分支滚环扩增反应产物以 SYBRGreen I为染料的琼脂糖凝胶电泳图可以看到，甲基化基因能通过环化锁 式探针进而扩增得到大量的DNA产物，而空白实验和未甲基化DNA不能扩增， 因而得不到产物。

6、检测

6.1检测条件

将30μL超分支滚环扩增反应后的溶液和1μL的SYBR Green I(20倍)混合， 加去离子水至100μL。室温孵育10分钟，后用荧光光度计检测该溶液，荧光 检测条件：激发光波长为488纳米，光谱采集范围为500-650纳米，在520 纳米处计量其发射波强度。

6.2检测结果

DNA甲基化的高灵敏度的准确定量对于癌症的早期治疗是非常重要的。 为了证明该方法的高灵敏性，本实施例研究了不同浓度的甲基化基因的荧光 检测结果。随着甲基化基因浓度的增大，其荧光检测值也增大，且浓度与信 号强度值成指数关系，即浓度的对数值与信号强度值成线性关系，且线性关 系覆盖4个数量级，由1fmol/L到10pmol/L。线性关系式为：If＝ 34.54+102.98log10C，其中If为荧光信号强度值，C为甲基化基因的浓度(费摩尔每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值的荧光强度得到检测限为0.8 费摩尔每升。这个检测限值比用金纳米的比色方法高出8个数量级，比用单 碱基扩增的拉曼增强光谱得到的高3个数量级。

此外，本实施例还将甲基化基因与未甲基化基因以一定比例混合得到的 人工混合液，并对其甲基化程度做了检测。随着甲基化程度的增加，得到的 荧光强度值也跟着增大。检测得到的甲基化程度与实际加入的甲基化程度几 乎吻合。并且，该方法能成功检测混合样品中0.01％的甲基化基，明显比下列 方法得到的分辨率高：MALDI-MS质谱(5％)，基于量子点的荧光能量转移 (1％)，阳离子共轭聚合电解质方法(1％)，甲基化特异的PCR(0.1％)，甚至 可以和MS-qFRET(0.01％)相比。

在本实施例中，为了进一步验证上述检测方法的可靠性，对实际样品进 行检测。用此方法考察了非小细胞肺癌细胞系H157和小细胞肺癌细胞系H209 中p16启动子区域片段中的六个CpG岛屿的甲基化情况。用本分析方法检测 细胞系的实际样品时，本实施例在实验之前用限制性消化酶处理了基因组 DNA，目的是为了防止在随后的试验中DNA的形成的超螺旋或超环化等二级 结构。随着基因组DNA的量的增加，检测H157得到的荧光强度随之增大， 而H209则保持不变，且H157的检测限为2ng。由此表明，本专利中的检测 方法能较高灵敏度的检测肺癌细胞系中DNA甲基化的情况。

本技术方案中，DNA甲基化检测探针3’端的最后三个碱基均为鸟嘌呤，能 够更大概率的检测到发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶上的DNA甲基化，因此，相 对于现有技术，具有灵敏度高的特点。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是 利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效功能变换，或直接或间接运用 在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种DNA甲基化检测探针，其特征在于，包括5’端和3’端的用于与甲基化DNA互补配对的序列，其中，检测探针3’端的最后三个碱基均为鸟嘌呤，所述鸟嘌呤与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至5’端的序列反向互补配对。

2.如权利要求1所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述3’端包括13个碱基。

4.如权利要求1所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述5’端包括21个碱基。

5.如权利要求1所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述DNA甲基化检测探针还包括中间部分的用于引发超分支滚环扩增反应的特异性序列，所述特异性序列包括正向引物和反向引物。

6.如权利要求5所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述正向引物的长度为25个。

7.如权利要求5所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述正向引物为SEQ ID NO:3。

8.如权利要求5所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述反向引物的长度为23个。

9.如权利要求5所述的DNA甲基化检测探针，其特征在于，所述反向引物为SEQ ID NO:4。