JP2014023534A - CpGメチル化を用いた同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ゲノムDNAのサンプル中における特定のメチル化ヌクレオチドの同定することに基づく。
【選択図】図1
Description
(a)上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断するメチル活性切断法でサンプルを処理し;
(b)上記特定部位又はその付近においてDNAに相補するプライマーを加え;
(c)上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供し、そして当該サンプル中の特定部位においてメチル化DNAが存在する場合、増幅産物を生成し;そして
(d)上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAの存在を示す増幅産物の存在を検出する
を含む方法に関する。
(a) 上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位で塩基除去をもたらすメチル活性方法でサンプルを処理し;
(b) 切断部位又は塩基除去部位においてDNA配列を変化させ;
(c) 上記特定部位又はその付近においてDNAに相補するプライマー及び/又はプローブを加え、そしてそのうちの少なくとも1つが、変化したDNAを特異的に認識することができる;
(d) 上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供し、そしてサンプル中の特定部位においてメチル化DNAが存在する場合、増幅生成物及び/又はプローブシグナルを生成し;そして
(e)増幅生成物又はプローブシグナルが特異的に生成した場合、当該増幅産物の存在を検出し、上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAの存在を示す
を含む、方法である。
サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位においてDNAを切断するメチル活性切断方法でサンプルを処理し;
上記特定部位又はその付近においてDNAに相補するプライマーを加え;
上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供し、そして上記サンプル中の特定部位においてメチル化DNAが存在する場合、増幅産物を生成し;そして
上記増幅産物の存在を検出し、上記サンプル中の特定部位においてメチル化DNAの存在を示す
方法にさらに関する。
「アンプリコン」は、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅反応の結果として生成した二本鎖DNA分子を指す。
本発明は、メチル活性切断の幾つかの方法を包含する。メチル化CpGが存在する際にDNAを切断するが、メチル化DNAが存在しない際にDNAを切断できない任意の方法が、本発明において使用することができる。本発明の方法は、メチル活性制限酵素、例えばMcrBC(Stewart, F. J. and Raleigh E. A. (1998) Biol. Chem. 379: 611-616)及びリアーゼと組み合わせた5-メチルシチジングリコシラーゼを含むが、それらに限定されるものではない。
様々な増幅方法が、本発明により想定されており、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応、及びローリングサイクル複製が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
増幅生成物の特定種を検出する幾つかの方法が、本発明により検討される。検出方法としては、標識の取り込みと検出、プローブキャプチャー法、Taqmanアッセイ、電気泳動法、及びハイブリダイゼーション方法が挙げられるが、それらに限定されるものではない。標識は、放射性標識ヌクレオチド、フルオロフォア、量子ドット、ビオチンコンジュゲートヌクレオチド、及び発色酵素が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
以下の記載は予言的であり、実際の実験を表すものではない。
実施例1
液体サンプルを患者から採取することができる。ゲノムDNAが、既知の方法を用いて患者サンプルから抽出することもできる。
さらなる実施例では、固形腫瘍生検を患者から取得する。確立された技術を用いて、固形腫瘍生検からゲノムDNAを抽出して、サンプルを生成する。
さらなる実施例では、固形腫瘍生検は、患者から得ることができる。確立された技術を用いて、固形腫瘍生検からゲノムDNAを抽出し、サンプルを生成する。
Claims (15)
- サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAを検出する方法であって、以下の:
上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断するメチル活性切断方法で当該サンプルを処理する工程、
上記特定部位又はその付近のDNAに相補するプライマーを加える工程、
上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程であって、上記サンプルのメチル活性切断がある場合に増幅生成物を生成するが、切断が成功しなかった場合に増幅が生じない工程、そして
上記増幅生成物の存在を検出し、上記サンプル中の特定部位におけるメチル化DNAの存在を指し示す工程
を含む、前記方法。 - 前記特定部位が、既知遺伝子のプロモーター領域である、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが患者に由来するものであり、かつ前記既知遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化DNAの存在が、当該患者における癌細胞の存在を示す、請求項2に記載の方法。
- メチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断する前記メチル活性切断方法がメチル活性制限酵素である、請求項1に記載の方法。
- メチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断する前記メチル活性切断方法が、5−メチルでオキシシチジングリコシラーゼ/リアーゼでの処理である、請求項1に記載の方法。
- 患者から得たサンプル中の特定部位でメチル化DNAを検出することにより患者において癌を検出する方法であって、以下の:
上記サンプル中の特定部位にメチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断するメチル活性切断方法で当該サンプルを処理し、
上記特定部位又はその付近でDNAに相補するプライマーを加え、
上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供し、当該サンプル中の上記特定部位においてメチル化DNAが存在する場合に増幅生成物を生成し、
上記増幅生成物の存在を検出し、上記サンプル中の特定部位でメチル化されたDNAの存在を示し、そして
上記増幅生成物の存在から上記患者における癌を検出する
を含む、前記方法。 - 前記サンプルが、ゲノムDNAを含む、請求項1又は6に記載の方法。
- 前記特定部位が、既知遺伝子のプロモーター領域である、請求項5に記載の方法。
- メチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断する前記メチル活性切断方法が、メチル活性制限酵素である、請求項6に記載の方法。
- メチル化DNAが存在する際に一貫性のある部位でDNAを切断する前記メチル活性切断方法が、5−メチルでオキシシチジングリコシラーゼ/リアーゼでの処理である、請求項6に記載の方法。
- 患者由来のサンプル中のゲノムDNAの特定部位においてメチル化DNAを検出することにより、患者において癌を検出する方法であって、以下の:
上記ゲノムDNAを、メチル活性制限酵素で処理して、切断生成物を作成する工程、
前記特定部位で又は付近のDNAに相補するプライマーを加え;
上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供して、上記特定部位においてメチル化DNAが存在する場合に増幅生成物を取得する工程、
上記特定部位においてメチル化DNAの存在を示す増幅生成物の存在を検出する工程、及び
上記増幅生成物の存在を検出することにより患者において癌を検出する工程
を含む、前記方法。 - 前記特定部位が、既知遺伝子のプロモーター領域である、請求項9に記載の方法。
- 前記メチル活性制限酵素が、大腸菌(E.coli)McrBCである、請求項9に記載の方法。
- 前記方法がさらに以下の工程:
上記切断生成物に平滑末端を作成する工程、
上記切断生成物の末端をライゲーションして、当該切断生成物の閉環を作成する工程 を含み、ここで当該プライマーが、切断産物のライゲーションされた閉環からのみ生じるように配向される、
請求項11に記載の方法。 - 患者由来のサンプル中のゲノムDNAの特定部位で、メチル化DNAを検出することにより、患者で願を検出する方法であって、以下の:
ゲノムDNAをメチル化活性制限酵素で処理して切断性生物を作成し;
切断性生物に平滑末端を作成し
上記切断生成物の末端をライゲーションして、当該切断生成物の閉環を作成する工程;
前記特定部位で又は付近のDNAに相補するプライマーを加え;
ここで当該プライマーが、切断産物のライゲーションされた閉環からのみ生じるように配向される、
上記サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供して増幅生成物を取得する工程、
上記特定部位においてメチル化DNAの存在を示す増幅生成物の存在を検出する工程、及び
上記増幅生成物の存在を検出することにより患者において癌を検出する工程
を含む、前記方法。
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