CN104357573B - 精确验证未知基因甲基化程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种精确验证未知基因甲基化程度的方法,最新精确验证未知基因甲基化程度的方法,通过分别对实验组和对照组目标基因进行特异性引物设定,利用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)的差异定性,其产物通过添加转化剂,DNA外切酶酶解,利用LC‑MS/MS对其中胞嘧啶(或腺嘌呤)含量百分比进行精确定量,通过上述两步实验得到的定性及定量数据,总结细胞或组织分化中癌变几率和甲基化程度的关系,以便建立关联数据库,从而在癌症的超早期诊断中发挥作用的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因的甲基化程度验证方法,特别涉及一种利用高分辨率熔解曲线(HRM)与LC-MS/MS 技术精确验证未知基因甲基化程度的方法。
背景技术
1、高分辨率熔解曲线(HRM)与LC-MS/MS 技术
a) HRM技术原理:
高分辨率熔解曲线分析(HRM)是通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况。单核苷酸多态性(SNP)位点因不匹配会使双链DNA 在升温过程中先解开,荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放,从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP,而且不同SNP 位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型;而同理,经过将DNA 先用重亚硫酸盐处理,这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变,随后行引物特异性的PCR。
可使用Lightscaner检测PCR产物样本,依据杂合异源双链的原理或者不同样品DNA双链的Tm值差异的原理。在PCR反应前加入LC Green饱和荧光染料(LC Green荧光染料只结合DNA双链,对PCR不会有任何抑制作用),然后将PCR产物(96/384孔板)直接放入LightScanner进行熔解,在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性,使DNA双链逐渐解链,此时LC Green荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落,96孔板中的每一个孔里的荧光信号均下降。
b)液质联用LC-MS/MS:
近年来,由于液相色谱-质谱,质谱(LC-MS/MS)联用新技术的不断出现,LC-MS/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。LC/MS的联用始于70年代,90年代以来,由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展,液相色谱与质谱的联用,特别是与串联质谱(MS/MS)的联用得到了极大的重视和发展。LC-MS/MS联用的优点非常显著,因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质,而液相色谱则把分离范围大大拓宽了,生物大分子也能分离,LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合,可对复杂样品进行实时分析,即使在LC难分离的情况下,只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描,则可发现并突出混和物中的目标化合物,显著提高信噪比。液-质联用是通过一个“接口”来实现的。在接口研制方面,前后发展了有20多种,其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透薄膜界面、热喷雾界面和粒子束界面,但这些技术都有不同方面的限制和缺陷,直到大气压电离技术成熟后,液-质联用才得以迅速发展,成为科研和日常分析的有力工具。在此我们仅对电喷雾电离(ESI)技术做简单介绍。
溶液中样品流出毛细管喷口后,在雾化气(N2)和强电场(3~6kV)作用下,溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发,电场增强,离子向液滴表面移动并从表面挥发,产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得[M+H]+ 或[M-H]-单电荷离子,生物大分子产生多电荷离子,由于质谱仪测量的是质荷比(m/z),可测定的生物大分子的质量数高达几十万。ESI是很软的电离,可直接测定热不稳定的极性化合物,多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子,调节离子源(源内ID))电压可以控制离子的断裂,给出结构信息。
c)DNA甲基化与癌症早期诊断间的联系:
过去的三十年中,人们已经在分子水平上展开了有关癌症的成因与致病机制探讨。近期的研究结果表明:表观遗传学异常也是肿瘤形成的重要原因。表观遗传改变主要包括DNA甲基化的丢失、获得、以及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。这些表观遗传的改变,特别是启动子的超甲基化引起的基因沉默,影响着肿瘤发展的各个阶段。与正常细胞基因组相比肿瘤细胞基因组呈现出整体甲基化水平降低和特定位点基因启动子的甲基化水平升高的趋势。肿瘤的发生过程中细胞基因组的整体甲基化水平降低的机制还知道的不多,但是近期的研究结果表明整体甲基化水平降低可能会引起基因组不稳定、染色质结构改变以及一些基因(原癌基因)表达上升。
DNA 甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制,是一种酶介导的化学修饰过程。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共价键结合一个甲基基团。CpG二核苷酸序列在基因组中出现的比例远低于基因组中其他二核苷酸序列。 但是在基因组中有一些长度约0.5-4 kb的区域,这些区域CpG密度很高,称其为CpG岛。56%基因的邻近启动子区域带有CpG岛。在正常的细胞中CpG岛通常是处于非甲基化状态。但是,在癌细胞中,肿瘤相关基因启动子的这些区域发生了超甲基化,这个现象被认为是肿瘤发生过程中最为重要的表观遗传学改变。启动子的甲基化在各个类型的肿瘤的发生中都有被发现,并且和转录水平的基因异常沉默有关。
2 、生物分子作用力及其在生物质谱中的应用
生物大分子之间的作用力有很多种,如范德华力,氢键作用力,二硫键等,也有共价键等强作用力。而分子间的作用力以非共价键为主。包括抗原抗体的亲和作用力,酶和底物间的相互作用力,供受体间的相互作用等等,这些由次级键控制的分子间的作用方式在生物体内起到了巨大的作用。分子间的作用力非常广泛,而甲基化是一种可逆性的生化反应,在生物体内有可逆性。而在体外,这种共价键相当稳定,可在生物质谱中被发现并定量。
3、 DNA甲基化的定性和初步定量
现有方法一般都是利用Light scanner仪对目标照片熔解曲线进行检测可以作为甲基化程度定性的手段,并通过测序来对甲基化位点进行定位。测序定位工作带来大量的冗余数据,加大基因数据分析者的工作量,且十分耗时耗力耗财;况且在排除大量的同义突变和无义突变后,很难再将有效的致癌突变从大量数据中筛选出来,更无法直接和癌症发病率及肿瘤生长时期进行有效关联。
还有一种方法是通过化学突变后,利用基因克隆技术[1],将突变后的基因接入复制型质粒中,然后表达测序。这种方法,可以在具体突变位点上对突变进行确认,并通过大量测序结果分析其甲基化位点与癌症发病率的联系。然而,仅仅得到这一数据并不能从根本上解决高通量数据间和癌症诊断的比例关系。若采用产物测序,虽能解决点突变即甲基化位点,首先成本高,测序时间周期较长;其次因为突变并非存在于所有的样本中,因此大量数据为冗余数据,比如无义突变,同义突变,或测序误差导致的假阳性突变,这些原因都将增加测序成本以及后续数据的处理难度,盲目性较大,对于有效数据高通量筛选十分不利[2,3];再次,传统利用HPLC方法进行定量的方法速度和分辨率都难以达到精确定量的程度,由于传统HPLC方法建立在紫外吸光度检测基础上,对于利用二级离子质荷比来检测微量单核苷酸变化的质谱来说,存在专一性不强,分辨率和精密度都不及质谱检测更加精准。
参考文献
[1] Joseph Sambrook,David Russell,et al. Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 3rd Revised edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Press,U.S.
[2] Wheeler DA,SrinivasanM,EgholmM,et al.The complete genome of anindividual by massively parallel DNA sequencing.Nature,2008,452(7189):872-876.
[3] GiladY,PritchardJK,ThorntonK.Characterizing natural variationusingnext generation sequencing technologies.TrendsinGenetics,2009,25(10):463-471。
发明内容
本发明的发明目的是为了克服背景技术的不足之处,提供一种利用LC-MS/MS对酶解后PCR产物的甲基化程度精确定量的共同检测方法。
本发明的技术方案是:一种精确验证未知基因甲基化程度的方法,该方法是利用LC-MS/MS对酶解后PCR产物的甲基化程度精确定量的共同检测方法,包括如下步骤:
步骤一、DNA模板制备及引物设计:采用DNA提取试剂盒(包括但不限于Qiagen公司DNeasy Tissue Kit试剂盒)或参考《分子克隆实验指南》进行细胞或组织的DNA提取,所提取DNA作为模板;采用化学诱变法处理DNA模板(包括但不限于默克密理博公司CpGenome™Turbo Bisulfite Modification Kit试剂盒),通过对某一或者多个待测片段目的基因进行引物设计;扩增区域长度在100~300bp间;
步骤二、熔解曲线定性及PCR产物酶切:按照HRM仪器设定参数完成高分辨率熔解曲线数据采集,并根据Tm值变化情况,初步排除未突变样本;采用PCR纯化试剂盒或者参考《分子克隆实验指南》进行PCR产物纯化(包括但不限于Qiagen公司PCR纯化试剂盒);利用1μg/mL DNA模板进行DNA标准曲线制备(包括但不限于十倍稀释法),利用荧光定量PCR,测定PCR产物浓度;用去离子ddH2O将待测所有PCR产物和同步配制的QC样品进行稀释至统一浓度,用混合DNA外切酶进行最优酶切条件孵育;
步骤三、酶切后单核苷酸片段回收及质谱鉴定:将所有酶解后待测产物用液液萃取法纯化,方法是将其转移至96孔板,加入150uL乙腈沉淀蛋白,3700rpm离心20min后,上清液转移至96孔进样板,并用去离子ddH2O进行1:1稀释,振荡器上混匀1分钟后待质谱进样检测。分别监测胞嘧啶(C)浓度减少量和腺嘌呤(A)的增量(变化量记为δCon.C),试验分六个平行对照。计算δCon.C,并给出RE及RSD值。QC样品的胞嘧啶(C)浓度不能高于或低于理论浓度的10%。
上述共同检测方法是指利用HRM来检测待测基因熔解曲线(Tm值)变异情况和利用LC-MS/MS检测胞嘧啶含量变化的程度,通过HRM的测定,判定突变存在的基础上,利用LC-MS/MS来测定PCR酶解后产物中胞嘧啶或腺嘌呤浓度变化的方法。
上述的PCR,是利用引物设计软件,实时定量特异性扩增待测基因甲基化区域,获得PCR产物的方法,该引物设计软件包括但不限于Beacon Designer 7.0及以上版本,ABI公司Primer Express V3.0 及以上版本, DNAman6.0和Primer Premier 5.0及以上版本等生物软件。
上述化学诱变法是利用重亚硫酸盐分别处理DNA对照组的 DNA和样品组DNA,使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
上述的测定HRM的仪器包括但不限于Light scanner,Light cycle 480 System等仪器。
上述的LC-MS/MS仪器包括但不限于ABI 3000,ABI 4000,MALDI TOF,TSQ,LTQ等。
上述DNA外切酶包括但不限于λ噬菌体核酸外切酶(λexo 5000unit)和核酸外切酶Ⅶ(exoⅦ 2000unit))。
上述的胞嘧啶或腺嘌呤含量变化的程度是δCon.C(A) = ∣对照组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C0- 样品组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C1∣;以及Con.C = 对照组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C0- 样品组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C1;该程度值需要6次平行重复结果的RE及RSD值作为可靠性分析的结果,RSD值小于3且RE绝对值小于5时,该次实验结果为可信,反之则为不可信,或者需要重新验证。6次平行重复实验结果均大于0.25℃,则有LC-MS/MS继续检测的必要性,反之则无。
上述的对照组的 DNA样品和样品组DNA样品,分别来自于正常细胞和待测细胞或组织;也包括但不限于来自药物处理及非处理的细胞或组织,同时研究药物抑制或激发甲基化的程度。
上述的“酶解后待测产物”的纯化包括但不限于蛋白沉淀的液液萃取法,还可包括固相萃取等。
上述的最优酶切条件为:产物用λ噬菌体核酸外切酶(λexo 5000unit)和核酸外切酶Ⅶ(exoⅦ 2000unit)混合酶液进行酶切,优选的产物体积和酶液体积比为1:20,50μL的PCR产物加入2.5μL混合酶液,37℃温箱孵育4至16小时。
本发明的有益效果是:本发明应用于早期肿瘤细胞,中期肿瘤细胞和晚期肿瘤组织的样品DNA的检测,建立甲基化程度与癌症发病率关联数据库,利用HRM和LC-MS/MS方法计算甲基化程度,数据将参与统计学计算,以此来和癌症早期诊断的其他数据进行相互印证,并能有效的从甲基化程度角度预测肿瘤发生。
附图说明
图1(a)代表胞嘧啶液相峰的保留时间;
图1(b)代表胞嘧啶的特征离子对;
图1(c)代表内标化合物峰的保留时间;
图1(d)代表内标化合物的特征离子对;
图2为胞嘧啶检测色谱流动相梯度示意图。
具体实施方式
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
步骤一:
HRM产物获得:
1、模板DNA的提取和处理:
a、模板DNA提取(采用Qiagen公司DNeasy Tissue Kit试剂盒)或参考《分子克隆实验指南》进行细胞或组织的DNA提取;
b、待测及参照组模板DNA的转化,采用默克密理博公司极速重亚硫酸盐处理试剂盒(CpGenome™ Turbo Bisulfite Modification Kit),使未被甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶。
2、按照“实验参数说明二”中设置进行PCR扩增。
3、按照HRM仪器设定参数完成高分辨率熔解曲线数据采集,并根据Tm值变化情况,初步排除未突变样本,并设定突变组数以便进行下一步测试。
4、Tm值变化的目的基因产物进行纯化处理:采用Qiagen公司PCR纯化试剂盒或者参考《分子克隆实验指南》进行DNA纯化。
步骤二:
HRM产物定量及酶切:
5、利用1μg/mL DNA模板进行DNA标准曲线制备,即十倍稀释法,利用荧光定量PCR,测定PCR产物浓度。
6、用去离子ddH2O将待测所有PCR产物进行稀释,统一稀释至100ng/mL(体积至50uL)。
7、产物用λ噬菌体核酸外切酶(λexo 5000unit)和核酸外切酶Ⅶ(exoⅦ2000unit)混合酶液进行酶切,优选的产物体积和酶液体积比为1:20,50μL的PCR产物加入2.5μL混合酶液,37℃温箱孵育12小时(不低于4小时,不超过16小时)。
8、将所有待测产物转移至96孔板,加入150uL乙腈沉淀蛋白,3700rpm离心20min后,上清液转移至96孔进样板,并用去离子ddH2O进行1:1稀释,振荡器上混匀1分钟后待质谱进样检测。
步骤三
实验主要检测项目:
实验组和对照组:分别监测胞嘧啶(C)浓度减少量和腺嘌呤(A)的增量(变化量记为δCon.C),试验分六个平行对照。计算δCon.C,并给出RE及RSD值。
实验质控组:
利用A、T、C、G的纯品配制一定梯度的质控溶液,均为100ng/mL,分别为:
Working A( C=0.1%; G=0.1%; A=49.9%; T=49.9%);
Working B( C=0.5%; G=0.5%; A=49.5%; T=49.5%);
Working C( C=1%; G=1%; A=49%; T=49%);
Working D( C=10%; G=10%; A=40%; T=40%);
Working E( C=20%; G=20%; A=30%; T=30%);
Working F( C=40%; G=40%; A=1%; T=1%).
上述质控溶液同样品及对照组同时进行“步骤二 7-8”中处理,并随样品进样。
实验参数说明一:
1. 英文缩写名称对照:
MeOH:甲醇;
ACN:乙腈
FA:甲酸
Taq mix:DNA聚合酶混合体系
ddH2O:双重蒸馏水
dNTP:混合单脱氧核糖核酸
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethyloxydiformate)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
HRM:高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting)
DNA:脱氧核糖核酸
Cytosine (C):胞嘧啶
2.荧光定量PCR工作液:高分辨熔解扩增试剂盒 (ROCHE)
3.API 4000 LC-MS/MS 分析参数:
流动相A: H2O(0.1% FA);流动相B: ACN(0.1% FA);
注:流动相B也可用MeOH(0.1% FA)替代;
流速:0.4 mL/min;
分析柱:Phenomenex Luna 3u CN, 100A; 50*2.00mm
梯度程序:
4.API 4000 LC-MS/MS 检测参数(以胞嘧啶为例):
扫描模式:MRM 扫描类型:正离子模式
Q1:112.1 Q2:95.0
Gas1:50 Gas2:40
CAD:12 Curtain Gas: 20
CE:26 CXP: 16
Ionsprayvoltage(V):4500 TME:500℃ DP:60。
实验参数说明二:
PCR扩增条件及熔解曲线条件:
1、反应体系如下:
PCR的反应程序为:
实验结果:。
1、胞嘧啶扫描二级质谱图及色谱图的结果如图1(a)、图1(b)、图1(c)、图1(d):
图1(a):代表胞嘧啶液相峰的保留时间,反映了胞嘧啶液相峰;
图1(b):代表胞嘧啶的特征离子对,Q1+/Q3+为112.1/95.0,反映了利用质谱法定量的胞嘧啶的质核比;
图1(c):代表内标化合物峰的保留时间,反映了内标化合物的液相峰;
图1(d):代表内标化合物的特征离子对,Q1+/Q3+为494.2/169.1,反映了内标化合物的质核比。
胞嘧啶液相峰面积与内标化合物的液相峰面积之比(ratio值),同质控样品的ratio值比对,计算出其胞嘧啶相对含量。或利用胞嘧啶标准品,建立标准曲线,通过胞嘧啶与对待测样品胞嘧啶和QC样品的胞嘧啶进行绝对定量。
2、如图2所示为胞嘧啶检测色谱流动相梯度示意图。
图1和图2仅代表该方法的液相保留时间和质核比。其计算方法用Analyst软件或质谱自带的专业定量软件进行峰面积计算。最终得到胞嘧啶或者其他待测物的浓度变化值。
3、甲基化程度可根据δCon.C计算公式:
δCon.C(A) =∣对照组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C0- 样品组胞嘧啶(或腺嘌呤)浓度C1∣。
Claims (4)
1.一种精确验证未知基因甲基化程度的方法,其特征是该方法包括如下步骤:
a)DNA 模板制备及引物设计:进行DNA 提取,所提取的DNA 作为模板,采用化学诱变法处理DNA 模板,通过对某一或者多个待测片段目的基因进行引物设计;待测基因内部或全部的核酸序列扩增长度应在100~300bp 间;
b)熔解曲线定性及PCR 产物酶切:按照HRM 仪器设定参数完成高分辨率熔解曲线数据采集,并根据Tm 值变化情况,初步排除未突变样本;进行PCR 产物纯化;利用1μg/mL DNA模板进行DNA 标准曲线制备;利用荧光定量PCR,测定PCR 产物浓度;用去离子ddH2O 将待测PCR 产物和同步配制的QC 样品进行稀释至统一浓度,用DNA 外切酶进行最优酶切条件孵育;
c)酶切后单核苷酸片段回收及质谱鉴定:将酶切后待测产物用液液萃取法纯化,方法是将其转移至96 孔板,加入150μL乙腈沉淀蛋白,3700rpm 离心20min 后,上清液转移至96孔进样板,并用去离子ddH2O 进行1:1 稀释,振荡器上混匀1 分钟后待质谱进样检测,分别监测胞嘧啶(C)浓度减少量和腺嘌呤(A)的增量,变化量记为δCon.C,试验分六个平行对照,计算δCon.C,并给出RE 及RSD 值,QC 样品的胞嘧啶(C)浓度不能高于或低于理论浓度的10%,所述的胞嘧啶或腺嘌呤含量变化的程度是δCon.C(A) = 对照组胞嘧啶或腺嘌呤浓度C0-样品组胞嘧啶或腺嘌呤浓度C1 ;以及Con.C = 对照组胞嘧啶或腺嘌呤浓度C0- 样品组胞嘧啶或腺嘌呤浓度C1 ;该程度值需要6 次平行重复结果的RE 及RSD 值作为可靠性分析的结果,RSD 值小于3 且RE 绝对值小于5时,该次实验结果为可信,反之则为不可信,或者需要重新验证;6 次平行重复实验结果均大于0.25℃,则有LC-MS/MS 继续检测的必要性,反之则无。
2.根据权利要求1 所述的精确验证未知基因甲基化程度的方法,其特征是步骤a)中所述的化学诱变法是利用重亚硫酸盐分别处理DNA 对照组的 DNA 和样品组DNA,使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
3.根据权利要求1 所述的精确验证未知基因甲基化程度的方法,其特征是步骤b)中所述的DNA 外切酶为λ 噬菌体核酸外切酶或核酸外切酶Ⅶ,或二者的任意比例混合。
4.根据权利要求3所述的精确验证未知基因甲基化程度的方法,其特征是产物用λ 噬菌体核酸外切酶(λexo)5000unit和核酸外切酶Ⅶ(exo Ⅶ)2000unit混合酶液进行酶切,产物体积和酶液体积比为1:20,50μL 的PCR 产物加入2.5μL 混合酶液,37℃温箱孵育4 至16小时。
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