CN113502327A - 一种癌症筛检的检验套组 - Google Patents

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CN113502327A CN202110582167.3A CN202110582167A CN113502327A CN 113502327 A CN113502327 A CN 113502327A CN 202110582167 A CN202110582167 A CN 202110582167A CN 113502327 A CN113502327 A CN 113502327A
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Abstract

本发明涉及一种癌症的生物标记分子及筛检的检验套组与其检测方法，利用分析检体标的基因PAX1、ZNF582、SOX1以及NKX6‑1甲基化区域，设计数段对标的基因特异性的寡核苷酸引子或探针，利用该寡核苷酸探针检测标的基因甲基化的有无，进一步判断癌症发生的可能性。甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应(methylation‑specific PCR,MSP)、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应(quantitative methylation‑specific PCR,QMSP)、亚硫酸盐定序(bisulfitesequencing,BS)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变性高效液相色谱(denaturing high‑performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或酵素免疫分析法(Enzyme‑linked immunosorbentassay,ELISA)等。

Description

一种癌症筛检的检验套组
本申请为分案申请，该分案申请的母案的申请号为201210310989.7，申请日为2012年8月28日，发明名称为“一种癌症筛检的检验套组”。
技术领域
本发明涉及一种癌症的生物标记分子及筛检的检验套组，利用分析检体标的基因甲 基化区域，设计数段对标的基因具特异性的寡核苷酸引子或探针，利用该具特异性寡核苷酸检测标的基因甲基化的有无，以判断癌症发生的可能性。
背景技术
根据2008世界卫生组织调查结果显示，癌症是目前世界上十大死亡原因之一，其中男性又以肺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、口腔癌致死率较高；女性则为乳癌、肺癌、子 宫颈癌、大肠癌致死率较高。因此各国研究者对于能提早预防性检测或是罹癌预后检测 的方法都积极研究，且大多数早期癌症若能提早筛检出来，治愈的机率都提高许多。传 统检验癌症的有无，例如X光、抹片、血液肿瘤标志、超音波等等，癌症筛检率约为 0.2～0.3％，若再加上消化道内视镜检查，筛检率提高约0.5％，但是上述数据还不足以 说服大众这些一般性健康检查能有效的早期诊断癌症。然而这些检验与判读往往耗工费 时，方便性不足，且筛检率仍然偏低。
目前科学界普遍了解异常的表遗传(epigenetic)修饰，对于改变基因表达和诱导肿瘤的形成，发挥了至关重要的作用(Ting et al.,2006)，其中DNA甲基化修饰就是 其中一种。影响表现型(phenotype)的讯息，可能存于被修饰过的碱基5-甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine)中，5-甲基胞嘧啶被发现存在于哺乳类动物细胞内的回文序列 5’-CpG-3’中，在哺乳类动物细胞内除了一些被称为“CpG岛”(CpG islands, CGIs)的区域之外，大多数的CpG双核苷酸对都被甲基化，CpG岛是指在大约1000个 碱基对(1Kb)的区域内含有大量的GC-以及CpG-，通常位于基因的附近，且在广泛表 现的基因之启动子附近。胞嘧啶的甲基化发生在DNA合成后，自一甲基捐赠者s-腺核 苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)将一甲基经酵素转移到胞嘧啶第5个碳的 位置上，该酵素反应系由DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs)执行， DNMT1是哺乳类动物主要的甲基转移酶，系负责将半甲基化位置复制后修复(post- replicative restoration)为全甲基化，被称为维持甲基化(maintenance methylation)；反之，DNMT3A及DNMT3B则被认为主要负责甲基化新的位置，进行一 种称为重新甲基化(de novo methylation)的步骤。CpG双核苷酸对甲基化的遗失(loss of methylation)，意即一般的低度甲基化，是癌细胞内的第一个超遗传异常(epigenetic abnormality)；然而，在过去几年内的研究却显示，特定位置(例如： 一些肿瘤抑制基因)的高度甲基化(site-specific hypermethylation)与其功能的丧 失有关，这可能会在癌症生成时提供选择优势(selective advantages)；在启动子区 域上CpG岛的高度甲基化，可以通过组蛋白修饰(histone modification)伴随接续而 来的基因默化现象(gene silencing)，来引起染色质改造(chromatin remodeling)；除了染色体缺失及基因突变之外，经由启动子的高度甲基化所造成肿瘤 抑制基因的超遗传默化现象(epigeneticsilencing)也常见于人类癌症中(Estelle et al.,1999；Herman et al.,2003)。
最近的流行病学研究显示，血清叶酸盐(serum folate)的浓度(一种甲基的主要来源)与HPV的感染和清除有关联；在甲基周期(methyl cycle)的代谢作用中，酵素 的基因多型性(genetic polymorphisms)也曾被报导与子宫颈上皮内病变的发展有 关；如同超基因演化的观念一般，DNA甲基化与子宫颈癌间关联的研究也同样盛行，子 宫颈癌的DNA甲基化研究日与遽增，显示使用甲基化作为子宫颈癌筛检的可能性；由于 遗传与环境交互作用的特性，肿瘤抑制基因甲基化程度，因不同的基因及不同的族群而 异，不同的疾病也会有不同的甲基化表现型(methylator phenotypes)；然而，子宫 颈癌的甲基化表现型以及其与HPV基因型的关联仍未知，而子宫颈癌中有何特定的基因 会被甲基化，以及需要多少基因方可达到临床应用的需求，这些问题仍是未来需要被确 认的议题。
赖鸿政博士先前已于中国台湾地区(TW Pat.Pub.No.200831900、TW Pat.Pub.No.201038739)、中国(CN Appl.No.200810094659.2、CN Appl.No. 200910135501.X)、马来西亚(UI20085354)及美国(US Pat.Pub.No. 20080311570、US Pat.Pub.No.20110045465)于所属技术领域中提出相关发明及其 不同的技术手段与方法，包括专利之申请(下称前案)。基因甲基化检测学理虽然发展 时间不短，也为学术研究者广泛使用，然如欲应用于医疗检测等临床相关领域，则测试 稳定度及具有重复性是非常重要，而甲基化基因检测目前于医疗检测上尚未普遍应用， 其部分原因除需大量研究来支持标定基因临床意义及相关验证外，如何提供稳定的测试 方法也有相当的技术障碍。
本发明发明人深刻了解前案的不足与缺陷，加以改良创新，并经多年苦心孤诣潜心 研究后，终于成功研发完成本发明可适用多种癌症筛检的方法及其检验套组，也使相关标的基因的甲基化检测具产业可利用性，例如定义标的基因相关序列及浓度范围，另外 于癌症应用领域也提供更多信息予以验证支持，使标的基因检测得有重复性结果，并得 以应用于医疗领域。本设计癌症筛检套组可更精确检验，并设计以试剂盒的形式，达到 更快更方便与更有效率，提供检验上的一完善产品。
发明内容
本发明目的在于，提供一种用于检测子宫颈腺癌、子宫颈鳞状细胞癌或子宫颈癌的检测套组，其特征在于，包括一用于检测目标基因CpG序列甲基化程度的引子对；其 中，所述目标基因包括PAX1；所述引子对包括PAX1引子对，所述PAX1引子对的序列 包括选自SEQ ID No：1-25所示的核苷酸序列所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述标的基因进一步包括ZNF582、SOX1或NKX6-1；所述引子对进一步包括ZNF582引子对、SOX1引子对或 NKX6-1引子对；其中，所述ZNF582引子对的序列包括选自SEQ ID No：26-40所示的 核苷酸序列所组成的群组，所述SOX1引子对的序列包括选自SEQ ID No：41-56所示的 核苷酸序列所组成的群组；所述NKX6-1引子对的序列包括选自SEQ ID No：57-70所示 的核苷酸序列所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一PAX1探针，所述PAX1探针的序列包括选自SEQ ID No：1-25所示的核苷酸序列所组成 的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一PAX1探针、一ZNF582探针、一SOX1探针或一NKX6-1探针；其中，所述PAX1探针的 序列包括选自SEQ ID No：1-25所示的核苷酸序列所组成的群组，所述ZNF582探针的 序列包括选自SEQID No：26-40所示的核苷酸序列所组成的群组，所述SOX1探针的序 列包括选自SEQ ID No：41-56所示的核苷酸序列所组成的群组；所述NKX6-1探针的序 列包括选自SEQ ID No：57-70所示的核苷酸序列所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述引子对为浓度范围在20nM-1250nM的引子对混合液。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一内部控制基因引子对；其中，所述内部控制基因为选自Col2A、β-Globin、GAPDH及 β-actin一种或多种所组成的群组；其中，所述内部控制基因引子对的序列包括选自 SEQ ID No：71-80所示的核苷酸序列所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其特征在于，所述子宫颈腺癌、所述子宫颈鳞状细胞癌或所述子宫颈癌为HPV(+)表现。
本发明还提供一种上述检测套组在制备用于检测子宫颈腺癌、子宫颈鳞状细胞癌或子宫颈癌的试剂盒中的应用。
可达成上述发明目的之应用，其特征在于，所述试剂盒可用于分辨HPV(+)或 HPV(-)表现。
可达成上述发明目的之应用，其特征在于，所述试剂盒是用于所述癌症的癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
本发明的再一目的在于，提供一种检测套组，其用以测定一检测检体中标的基因CpG序列甲基化的存在，也即先由检体萃取出其gDNA，此gDNA经过适当前处理及化学 反应，即可使用本检测套组进行标的基因甲基化的存在测试，本检测套组包括：
(1)一浓度范围在20nM-1250nM标的基因引子混合液，其至少包含有一正向引子与一反向引子，该正向引子、反向引子的序列选自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至 少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种，最佳为序列完 全相同；
(2)一浓度范围在20nM-1250nM内部控制基因核酸分子侦测混合液，其至少包含有一 正向引子及一反向引子；
(3)一聚合酶连锁扩增反应主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及镁盐。
可达成上述发明目的之一种检验套组，该一内部控制基因核酸分子侦测混合液，其 中正向引子、反向引子所包含的序列也选自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种，最佳为序列完全相同。其中标的基因与内部控制基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
可达成上述发明目的之一种检验套组，该标的基因引子混合液更包含探针，其探针 序列选自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种或其互补序列，最佳为序列完全相同；该内部控制基因 核酸分子侦测混合液，更包含可侦测内部控制基因扩增产物的探针。通过本发明进一步 提供包含其中内部控制基因正向引子、反向引子所包含的序列系选自SEQ ID No：71- 80所示之核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种 或多种，最佳为序列完全相同；探针序列系选自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序 列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种或互补序 列，最佳为序列完全相同。其中标的基因与内部控制基因的引子可混和成为单管核酸分 子侦测混合液。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其聚合酶连锁反应主要混合液，更包含可辨 识连锁扩增反应产物的荧光物质或与选自可与DNA双股作用产生荧光进而被侦测到的物 质，此物质包含SYBR系列物质如SYBER Green,Syber Gold等。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其中该检测检体中之内部控制基因选自于由 以下至少一种或一种以上之基因：Col2A、-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、-actin所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其标的基因与内部控制组基因的探针具有荧 光标记，此荧光标记系选自由于任一荧光：FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、 Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2及 BHQ-3所组成之群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其中该检测检体中之基因选自于由以下至少 一种或一种以上之基因：PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其可更进一步用以检测不正常细胞增生现象。其中不正常细胞增生包含癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测 或愈后效果检测。其中该恶性肿瘤系为下列群组之一：子宫颈癌、口腔癌、头颈癌、食 道癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺腺癌以及皮肤癌。
可达成上述发明目的之检验套组，其中连锁扩增产物之鉴定方法可用荧光法、定序 法(sequencing)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变 性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、 焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
术语“检测检体”指离体之检测样本，该样本包括子宫颈抹片、腹水、血液、尿 液、粪便、痰、口腔黏膜细胞、胃液、胆汁、子宫颈上皮细胞、或手术后的癌症组织等 离体的检体样本。本发明的癌症筛检方法，用于检测该些离体样本中的目标基因甲基化 的状态，以作为各类癌症的筛检指标。本发明所提供的癌症筛检方法及其筛检指标，可 供检测研究人员于实验室中进行检测。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术及其所能达到的效果，以下对本发明的较佳实施例进 行详细说明。
本发明目的在于，提供一种检测套组，其系用以测定一检测检体中基因CpG序列甲基化的存在，也即先由检体萃取出其gDNA，此gDNA经过适当前处理及化学反应，即可 使用本检测套组进行基因甲基化的存在测试，本检测套组包括：
(1)一浓度范围在20nM-1250nM标的基因引子混合液，其至少包含有一正向引子与一反向引子，该正向引子、反向引子的序列选自SEQ ID No：
1-70所示的核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列 的一种或多种，最佳为序列完全相同；
(2)一浓度范围在20nM-1250nM内部控制基因核酸分子侦测混合液，其至少包含有一正向引子及一反向引子；
(3)一聚合酶连锁扩增反应主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及 镁盐。
可达成上述发明目的之一种检验套组，该一内部控制基因核酸分子侦测混合液，其 中正向引子、反向引子所包含的序列选自由SEQ ID No：
71-80所示的核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序 列之一种或多种，最佳为序列完全相同。其中标的基因与内部控制基因的引子可混和成为单管核酸分子侦测混合液。
可达成上述发明目的之一种检验套组，该标的基因引子混合液更包含探针，其探针 序列系选自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种或其互补序列，最佳为序列完全相同；该内部控制基 因核酸分子侦测混合液，更包含可侦测内部控制基因扩增产物的探针。通过本发明进一 步提供包含其中内部控制基因正向引子、反向引子所包含的序列选自SEQ ID No：71- 80所示之核苷酸序列至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种 或多种，最佳为序列完全相同；探针序列选自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列 至少有80％的序列同一性或至少连续十个核苷酸相同之序列之一种或多种或互补序列， 最佳为序列完全相同。其中标的基因与内部控制基因的引子可混和成为单管核酸分子侦 测混合液。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其聚合酶连锁反应主要混合液，更包含可辨 识连锁扩增反应产物的荧光物质或与选自可与dna双股键结产生荧光进而被侦测到的物 质。此物质包含SYBR系列物质如SYBER Green,Syber Gold等。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其中该检测检体中的内部控制基因选自于由 以下至少一种或一种以上之基因：Col2A、-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、-actin所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其标的基因与内部控制组基因的探针具有荧 光标记，此荧光标记系选自由于任一荧光：FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、 Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2及 BHQ-3所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其中该检测检体中之基因选自于由以下至少 一种或一种以上之基因：PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1所组成的群组。
可达成上述发明目的之一种检验套组，其可更进一步用以检测不正常细胞增生现象。其中不正常细胞增生包含癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测 或愈后效果检测。其中该恶性肿瘤系为下列群组之一：子宫颈癌、口腔癌、头颈癌、食 道癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺腺癌以及皮肤癌。
可达成上述发明目的之检验套组，其中连锁扩增产物之鉴定方法可用荧光法、定序 法(sequencing)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变 性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、 焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
以下为相关具体实施例的叙述，包括材料与检测方法等，以进一步阐述本发明的技 术特征与效果；惟，可以理解的是，本发明具体实施例或方式不应作为限缩或被解释为实施本发明之限制或仅限于该些所述实施例或方式。
实施例一 材料与方法
检体样本，先抽取其DNA，在经过重亚硫酸盐(bisulfite)的转换，并以表1至 表4揭示可用于扩增含有PAX1、ZNF582、SOX1、NKX6-1以及内部控制组甲基化区域的 引子对及探针组(如表1至5)，来进行检测。试剂盒主要组成如下表6：
表1 用来扩增标的基因PAX1甲基化区域的引子对及探针组
Figure BDA0003082124620000061
Figure BDA0003082124620000071
表2 用来扩增标的基因ZNF582甲基化区域的引子对及探针组
Figure BDA0003082124620000072
Figure BDA0003082124620000081
表3 用来扩增标的基因SOX1甲基化区域的引子对及探针组
ID No： SOX1引子对及探针组
SEQ ID No:41 5’gcgttttttttttttcgttattggc 3’
SEQ ID No:42 5’tgcgttttttttttttcgttattggcg 3’
SEQ ID No:43 5’cgcggcgcgtcgttttgtta 3’
SEQ ID No:44 5’tggaggtcgttgaggatcg 3’
SEQ ID No:45 5’cggcggtcggcgaggagata 3’
SEQ ID No:46 5’gcgttttcgtttcgagcgta 3’
SEQ ID No:47 5’aggatcgagcgtaggaggaa 3’
SEQ ID No:48 5’cgcgctatctccttcctcctacg 3’
SEQ ID No:49 5’gccgctacgcgctatctcc 3’
SEQ ID No:50 5’gcaacccaaacgccctcgac 3’
SEQ ID No:51 5’cgatacgctaaacccgacccg 3’
SEQ ID No:52 5’cgcggcgcgtcgttttgtta 3’
SEQ ID No:53 5’cgatcctcaacgacctcca 3’
SEQ ID No:54 5’cgatacgctaaacccgacccg 3’
SEQ ID No:55 5’gctcgatcctcaacgacctc 3’
SEQ ID No:56 5’acgatcgaaatcgccgtctt 3’
表4 用来扩增标的基因NKX6-1甲基化区域的引子对及探针组
ID No： NKX6-1引子对及探针组
SEQ ID No:57 5’tgtcgtttttcgcgtggaggg 3’
SEQ ID No:58 5’cgtggtcgtgggatgttagc 3’
SEQ ID No:59 5’tcggcgtggtcgtgggatgttagc 3’
SEQ ID No:60 5’acggttttcggcgtggtcgt 3’
SEQ ID No:61 5’ttcgggcgcgtcgagtgtt 3’
SEQ ID No:62 5’aacatcccacgaccacgccg 3’
SEQ ID No:63 5’acgaccacgccgaaaaccgt 3’
SEQ ID No:64 5’acaaacaacgaaaaatacgcg 3’
SEQ ID No:65 5’gacaaacaacgaaaaatacgcga 3’
SEQ ID No:66 5’acgacgaaaaaaacgacgacg 3’
SEQ ID No:67 5’cgctaccgaaaattactcg 3’
SEQ ID No:68 5’cgaataccctccattacc 3’
SEQ ID No:69 5’acaaacaacgaaaaatacgcg 3’
SEQ ID No:70 5’aacactcgacgcgcccgaa 3’
表5 用来扩增内部控制组基因甲基化区域的引子对及探针组
Figure BDA0003082124620000091
Figure BDA0003082124620000101
表6 试剂盒主要成分
Figure BDA0003082124620000102
PCR扩增反应如下：(i)在95℃下活化聚合酶10分钟，(ii)在95℃下变性 DNA模板10秒及在60℃下键合/延长DNA链40秒，及(iii)进行变性/键合/延长循 环30至50次。
PCR扩增反应，其中一组混合物包括一个目标基因及内控组基因的引子对及其探针 混和物，引子对为包含一个正向引子及一个反向引子，不同探针则以不同波长且互相干扰性低的荧光进行标记，于本实施例，目标基因探针用FAM标记，内控组探针用VIC标 记。除荧光染料外，所有探针也会加上quencher基团，因此当探针序列和扩增序列能 互补结合，则荧光染料会被释出荧光，进而被侦测到。目标基因甲基化基因的程度由 Cp值(循环数值)及讯号强度来决定，而内控基因则可用以校正及侦错。以本实施例 中的PAX1为例，如果PAX1的Cp值和内控基因Cp值差距不超过12，则表示有PAX1有 显著甲基化。其他目标基因依此类推。
实施例二 不同癌症细胞株目标基因的甲基化程度分析
本测试应用表1至表4所揭示可用于扩增含有PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1甲基 化区域之引子对及探针组，来进行不同癌症细胞株检测，其甲基化状态分析结果如表7所示。结果显示，于子宫颈癌相关的细胞株Hela中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1 都侦测到有甲基化；子宫颈癌相关的细胞株SiHa中，PAX1、ZNF582及SOX1侦测到有 甲基化；子宫颈癌相关的细胞株CaSki中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都侦测到有 甲基化；子宫颈癌相关的细胞株C-33A中，ZNF582、SOX1及NKX6-1侦测到有甲基 化。大肠癌相关的细胞株COLO 205中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都侦测到有甲 基化；大肠癌相关的细胞株Caco-2中，ZNF582、、SOX1及NKX6-1侦测到有甲基化； 大肠癌相关的细胞株HT-29中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都侦测到有甲基化。肝 癌相关的细胞株HuH-7中，SOX1及NKX6-1侦测到有甲基化；肝癌相关的细胞株 Mahlavu中，ZNF582及SOX1侦测到有甲基化。肺癌相关的细胞株A549中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1无侦测到甲基化。皮肤癌相关的细胞株A-375中，PAX1、 ZNF582、SOX1及NKX6-1无侦测到甲基化。卵巢癌相关的细胞株A2780中，ZNF582及 SOX1侦测到有甲基化。乳癌相关的细胞株T47D中，PAX1及NKX6-1侦测到有甲基化； 乳癌相关的细胞株BT474中，PAX1、ZNF582及SOX1侦测到有甲基化；乳癌相关的细胞 株MDA-MB-231中，ZNF582、SOX1及NKX6-1侦测到有甲基化；乳癌相关的细胞株ZR- 75-1中，ZNF582、SOX1及NKX6-1侦测到有甲基化；乳癌相关的细胞株HCC1954中， ZNF582及SOX1侦测到有甲基化；乳癌相关的细胞株MCF-7中，PAX1、ZNF582、SOX1及 NKX6-1侦测到有甲基化。舌癌相关的细胞株SAS中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都 侦测到有甲基化。口腔癌相关的细胞株Ca9-22中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都 侦测到有甲基化。
由此可知，于子宫颈癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、口腔癌、肺癌、肺 腺癌以及皮肤癌相关之细胞株中，该四个基因至少其中之一侦测到甲基化现象。因此 PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1至少其中之一被甲基化确实可作为筛检癌症有无的筛检 指标。
表7 不同癌症细胞株目标基因有无甲基化分析
Figure BDA0003082124620000111
Figure BDA0003082124620000121
实施例三 子宫颈癌样本内目标基因的甲基化程度分析
本测试使用279位中国台湾地区已知诊断的正常与疾病的子宫颈抹片样本，如表8所示分别为正常239位(85.7％)、轻度(CIN1)22位(7.9％)、中度(CIN2)2位 (0.7％)、重度(CIN3)/原位癌(CIS)12位(4.3％)、鳞状细胞癌4位(1.4％)， 并抽取其DNA，在经过重亚硫酸盐(bisulfite)的转换，并以表1至表4揭示可用于 扩增含有PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1甲基化区域之引子对及探针组，来进行检测。 如表9所示，相较于正常子宫颈抹片样本，分别以PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1作为 标的基因侦测重度以上子宫颈抹片样本有85.45倍(95％信赖区间＝33.95～215.11)、 289.17倍(95％信赖区间＝39.20～2133.14)、67.69倍(95％信赖区间＝ 20.55～223.01)及2.56倍(95％信赖区间＝1.36～4.82)的危险会罹患重度子宫颈癌。 如表10所示，当同时合并个别甲基化标的基因与子宫颈抹片检测疾病时，意即只要任 一甲基化标的基因或子宫颈抹片检测结果为阳性，则认定该测试样本的子宫颈癌筛检结 果为阳性。相较于正常子宫颈抹片样本，分别以PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1作为标 的基因侦测并搭配子宫颈抹片检测重度以上子宫颈抹片样本有475.64倍(95％信赖区间 ＝63.94～3538.43)、543.31倍(95％信赖区间＝33.11～8914.18)、95.08倍(95％信赖 区间＝20.55～223.01)及14.25倍(95％信赖区间＝6.12～33.18)的危险会罹患重度子宫颈癌，且各项敏感度相对于没有搭配子宫颈抹片检测结果都有提升(PAX1：75％提 升至94％、ZNF582：87％提升至94％、SOX1：75％提升至100％、NKX6-1：50.00％提升至84.78％)。
表8 正常子宫颈样本与不同时期之子宫颈癌样本(切片结果)
Figure BDA0003082124620000131
表9
标的基因 敏感度 特异度 P-值 胜算比(95％信赖区间)<sup>*</sup>
PAX1 75％ 95％ &lt;0.0001<sup>a</sup> 85.45(33.95～215.11)
ZNF582 87％ 58％ &lt;0.0001<sup>a</sup> 289.17(39.20～2133.14)
SOX1 75％ 98％ &lt;0.0001<sup>a</sup> 67.69(20.55～223.01)
NKX6-1 50.00％ 73.05％ 0.0015<sup>a</sup> 2.56(1.36～4.82)
表10
Figure BDA0003082124620000132
a依据卡方检验b依据费雪精确性检定
*CIN3以上的胜算比(odds rations,OR)(不含CIN1及CIN2)
CIN：子宫颈上皮内赘瘤(Cervical intraepithelial neoplasia)
SCC：鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)
Pap：子宫颈抹片检测(Papanicolaou test)
实施例四：
本测试使用8位已知诊断的正常与疾病的口腔抹片样本，并抽取其DNA，在经过重亚硫酸盐(bisulfite)的转换，并以表1至表4揭示可用于扩增含有PAX1、ZNF582、 SOX1及NKX6-1甲基化区域之引子对及探针组，来进行检测，其甲基化状态分析结果如 表11所示。结果显示，于口腔1中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都无甲基化；口 腔2中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都无甲基化；口腔3中，PAX1及ZNF582有甲 基化；口腔4中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1都甲基化；口腔5中，PAX1及 ZNF582有甲基化。口腔6中，ZNF582有甲基化；口腔7，ZNF582、SOX1及NKX6-1有 甲基化。口腔8中，PAX1及ZNF582有甲基化。由此可知，于口腔癌于不同时期不同症 状中，该四个基因至少其中之一大幅地被甲基化。因此PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1 至少其中之一甲基化程度确实可作为筛检口腔癌的筛检指标。
表11 不同症状的口腔癌样本其目标基因甲基化程度分析
Figure BDA0003082124620000141
序列表
<110> 湖南宏雅基因技术有限公司
<120> 一种癌症筛检的检验套组
<130> IP120841
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acgacgaaaa aaacgacgac g 21
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 67
cgctaccgaa aattactcg 19
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 68
cgaataccct ccattacc 18
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 69
acaaacaacg aaaaatacgc g 21
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 70
aacactcgac gcgcccgaa 19
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 71
agggttattt tgaaaaggga gatat 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 72
ttttaagggg aagatgggat agaag 25
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子或探针
<400> 73
agaggtgggg ataggtattg ggt 23
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
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cttctatccc atcttccc 18
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 75
ttcattctaa cccaatacct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 76
tgttagagta aagtatagag t 21
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 77
aacccaatac ctatccccac ctc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 78
aacaattata aactccaacc accaaac 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 79
actccaacca ccaaaccttc attct 25
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子或探针
<400> 80
accgacccca ctaatacccg 20

Claims (10)

1.一种用于检测子宫颈腺癌、子宫颈鳞状细胞癌或子宫颈癌的检测套组，其特征在于，包括一用于检测目标基因CpG序列甲基化程度的引子对；其中，所述目标基因包括PAX1；所述引子对包括PAX1引子对，所述PAX1引子对的序列包括选自SEQ ID No：1-25所示的核苷酸序列所组成的群组。
2.据权利要求1所述的检测套组，其特征在于，所述标的基因进一步包括ZNF582、SOX1或NKX6-1；所述引子对进一步包括ZNF582引子对、SOX1引子对或NKX6-1引子对；其中，所述ZNF582引子对的序列包括选自SEQ ID No：26-40所示的核苷酸序列所组成的群组，所述SOX1引子对的序列包括选自SEQ ID No：41-56所示的核苷酸序列所组成的群组；所述NKX6-1引子对的序列包括选自SEQ ID No：57-70所示的核苷酸序列所组成的群组。
3.据权利要求1所述的检测套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一PAX1探针，所述PAX1探针的序列包括选自SEQ ID No：1-25所示的核苷酸序列所组成的群组。
4.根据权利要求2所述的检测套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一PAX1探针、一ZNF582探针、一SOX1探针或一NKX6-1探针；其中，所述PAX1探针的序列包括选自SEQID No：1-25所示的核苷酸序列所组成的群组，所述ZNF582探针的序列包括选自SEQ ID No：26-40所示的核苷酸序列所组成的群组，所述SOX1探针的序列包括选自SEQ ID No：41-56所示的核苷酸序列所组成的群组；所述NKX6-1探针的序列包括选自SEQ ID No：57-70所示的核苷酸序列所组成的群组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测套组，其特征在于，所述引子对为浓度范围在20nM-1250nM的引子对混合液。
6.根据权利要求1至4中任一所述的检测套组，其特征在于，所述检测套组进一步包含一内部控制基因引子对；其中，所述内部控制基因为选自Col2A、β-Globin、GAPDH及β-actin一种或多种所组成的群组；其中，所述内部控制基因引子对的序列包括选自SEQ ID No：71-80所示的核苷酸序列所组成的群组。
7.根据权利要求l至4中任一项所述的检测套组，其特征在于，所述子宫颈腺癌、所述子宫颈鳞状细胞癌或所述子宫颈癌为HPV(+)表现。
8.一种权利要求1至6中任一项所述的检测套组在制备用于检测子宫颈腺癌、子宫颈鳞状细胞癌或子宫颈癌的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可用于分辨HPV(+)或HPV(-)表现。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒是用于所述癌症的癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
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