ES2325363T3 - Procedimiento y acidos nucleicos para el analisis de un trastorno proliferativo de celulas de colon. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las células de colon que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico, b) extraer dicho ADN genómico, c) convertir las bases de citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo o en otra base que sea diferente de la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases y d) identificar el estado de metilación de una o más posiciones de citosina del gen TPEF y/o sus regiones reguladoras.
Description
Procedimiento y ácidos nucleicos para el
análisis de un trastorno proliferativo de células de colon.
Los niveles de observación que han sido
estudiados mediante los desarrollos metodológicos de los últimos
años en Biología Molecular son los propios genes, la traducción de
estos genes en ARN y las proteínas resultantes. La cuestión de qué
gen es activado en un determinado momento del desarrollo de un
individuo, y cómo se controlan la activación y la inhibición de
genes específicos en células y tejidos específicos guarda
correlación con el grado y el carácter de la metilación de los
genes o del genoma. A este respecto, las condiciones patógenas se
pueden manifestar en un patrón de metilación modificado de los genes
o del genoma del individuo.
El cáncer colorrectal es la cuarta mayor causa
de mortalidad por cáncer en hombres y mujeres, aunque figura como
la tercera causa más frecuente en hombres y la segunda en mujeres.
La tasa de supervivencia de 5 años es del 61% en todos los
estadíos, siendo la detección temprana un requisito esencial para la
terapia curativa de la enfermedad. Hasta el 95% de todos los
cánceres colorrectales son adenocarcinomas de grados de
diferenciación variables.
El cáncer de colon esporádico se desarrolla en
un procedimiento de múltiples etapas que comienza con la
transformación patológica del epitelio de colon normal en un genoma
que progresa consecutivamente en un cáncer invasivo. La velocidad
de progresión de los adenomas benignos de colon depende enormemente
de su aparición histológica: mientras que es más raro que los
adenomas de tipo tubular tiendan a progresar hacia tumores malignos,
los adenomas vellosos, particularmente, si son de un diámetro mayor
de 2 cm, tienen un significativo potencial maligno.
Durante la progresión de las lesiones
proliferativas benignas a los neoplasmas malignos, tienen lugar
varias alteraciones genéticas y epigenéticas. La mutación somática
del gen APC parece ser uno de los hechos más tempranos en el 75 al
80% de los adenomas y carcinomas colorrectales. Se cree que la
activación de K-RAS es una etapa de importancia
fundamental en la progresión hacia el fenotipo maligno.
Consecutivamente, se van acumulando las mutaciones en otros
oncogenes, así como las alteraciones que conducen a la desactivación
de los genes de supresión
tumoral.
tumoral.
La metilación anómala del ADN en las islas CpG
se encuentra entre las alteraciones más tempranas y comunes en los
tumores malignos humanos que conducen a la abrogación o la
sobre-expresión de un amplio espectro de genes.
Además, se ha demostrado que la metilación anormal tiene lugar en
los elementos reguladores ricos en CpG en partes intrónicas y
codificantes de los genes de ciertos tumores. Al contrario de la
hipermetilación específica de genes de supresión tumoral, se puede
observar una hipometilación global del ADN en las células
tumorales. Esta disminución de la metilación global se puede
detectar pronto, mucho antes del desarrollo de la manifestación del
tumor. Además, se ha publicado la correlación entre la
hipometilación y el aumento de la expresión génica para muchos
oncogenes. En el cáncer de colon, la metilación anómala del ADN
constituye una de las alteraciones más destacadas y desactiva
muchos genes de supresión tumoral, tales como, p14ARF, p16INK4a,
THBS1, MINT2 y MINT31, así como genes de reparación de apareamientos
erróneos del ADN, tales como hMLH1.
En la evolución molecular del cáncer
colorrectal, se ha sugerido que los errores de la metilación del ADN
desempeñan dos papeles distintos. En las células de la mucosa de
colon normal, los errores de la metilación se acumulan en función
de la edad o de hechos que dependen del tiempo, predisponiendo estas
células a la transformación neoplástica. Por ejemplo, se podría
observar la hipermetilación de varios locus ya presente en adenomas,
particularmente, en el subtipo tubulovelloso o velloso. En etapas
posteriores, el aumento de la metilación del ADN de las islas CpG
desempeña un importante papel en un subconjunto de tumores afectados
por el denominado fenotipo metilador de islas CpG (CIMP). La
mayoría de los tumores CIMP+, que constituyen aproximadamente el 15%
de todos los cánceres colorrectales esporádicos, se caracteriza por
la inestabilidad de los microsatélites (IM) debido a la
hipermetilación del promotor hMLH1 y de otros genes de reparación de
apareamientos erróneos del ADN. Por el contrario, los cánceres de
colon CIMP- evolucionan por una ruta de inestabilidad genética más
clásica (CIN), con una alta tasa de mutaciones de p53 y cambios
cromosómicos.
Sin embargo, los subtipos moleculares no sólo
muestran frecuencias variables respecto a las alteraciones
moleculares. Según la presencia de bien inestabilidad de los
microsatélites o anomalías cromosómicas, se puede subclasificar el
cáncer de colon en dos clases, que también presentan diferencias
clínicas significativas. Casi todos los tumores de IM se originan
en el colon proximal (ascendente y transversal), mientras que el 70%
de los tumores de CIN se localizan en el colon distal y en el
recto. Esto ha sido atribuido a la prevalencia variable de los
diferentes carcinógenos en las diferentes partes del colon. Se ha
sugerido que los carcinógenos de metilación, que constituyen el
carcinógeno prevaleciente en el colon proximal, desempeñan un papel
en la patogénesis de los cánceres con IM, mientras que se cree que
los tumores de CIN son causados más frecuentemente por los
carcinógenos formadores de aductos, que tienen lugar con mayor
frecuencia en partes distales del colon y del recto. Además, los
tumores de IM tienen mejor pronóstico que los tumores con un
fenotipo CIN, y responden mejor a la quimioterapia con
adyuvantes.
La identificación de marcadores de la
diferenciación del carcinoma de colon, así como la detección
temprana son los objetivos principales de la investigación
actual.
La 5-metilcitosina es la
modificación de bases covalentes más frecuente en el ADN de las
células eucariotas. Desempeña un papel en, por ejemplo, la
regulación de la transcripción, en la huella genética y en la
tumorigénesis. Por lo tanto, la identificación de la
5-metilcitosina como componente de la información
genética es de un interés considerable. Sin embargo, no es posible
identificar las posiciones de la 5-metilcitosina
mediante la secuenciación, porque la
5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de
apareamiento de bases que la citosina. Además, la información
epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde
completamente durante la amplificación por PCR.
Un procedimiento relativamente nuevo y
actualmente el más frecuentemente para el análisis de ADN para
5-metilcitosina se basa en la reacción específica
de bisulfito con citosina que, tras la posterior hidrólisis
alcalina, se convierte en uracilo que se corresponde con timidina
en su comportamiento de apareamiento de bases. Sin embargo, la
5-metilcitosina permanece invariable en estas
condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de tal
manera que la metilcitosina, que originariamente no se podía
distinguir de la citosina por su comportamiento de hibridación,
ahora puede ser detectada como la única citosina restante usando
técnicas biológicas moleculares "normales", por ejemplo, por
amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas
se basan en el apareamiento de bases que ahora se puede aprovechar
completamente. En términos de sensibilidad, la técnica anterior
está definida por un procedimiento que encierra el ADN por ser
analizado en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y la
renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con ADN
monocatenario) y que reemplaza todas las etapas de precipitación y
purificación por una diálisis rápida (Olek A., Oswald J., Walter
J., "A Modified and Improved Method for Bisulphite Based Cytosine
Methylation Analysis". Nucleic Acids Res. 15 de diciembre
de 1996; 24(24): 5064-6). Usando este
procedimiento, es posible analizar células individuales que
ilustran el potencial del procedimiento. Sin embargo, actualmente,
sólo se analizan regiones individuales de una longitud de hasta
aproximadamente 3.000 pares de bases, no siendo posible un análisis
global de las células para miles de posibles eventos de metilación.
Sin embargo, este procedimiento tampoco puede analizar con
fiabilidad fragmentos muy pequeños de cantidades de muestras
pequeñas. Éstos se pierden a través de la matriz a pesar de la
protección contra la difusión.
Es posible reunir una perspectiva general del
resto de procedimientos conocidos para la detección de
5-metilcitosina en el siguiente artículo de una
publicación: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
Hasta la fecha, salvo unas pocas excepciones (p.
ej., Zeschnigk M., Lich C., Buiting K., Doerfler W., Horsthemke B.,
"A Singletube PCR Test for the Diagnosis of Angelman and
Prader-Willi Syndrome Based on Allelic Methylation
Differences at the SNRPN", locus. Eur. J. Hum. Genet.,
Mar-Abr de 1997; 5(2):94-8),
la técnica del bisulfito sólo se usa en investigación. Sin embargo,
siempre se amplifican fragmentos específicos cortos de un gen
conocido posteriormente a un tratamiento con bisulfito, y bien se
secuencian completamente (Olek A., Walter J. "The
Pre-implantation Ontogeny of the H19
Methylation", imprint. Nat Genet., noviembre de 1997; 17
(3):275-6) o se detectan las posiciones de las
citosinas individuales mediante una reacción de prolongación de
cebadores (Gonzalgo M.L., Jones P.A., "Rapid Quantitation of
Methylation Differences at Specific Sites Using
Methylation-Sensitive Single Nucleotide Primer
Extension (Ms-SNuPE)". Nucleic Acids Res.,
15 de junio de 1997; 25(12):2529-31, WO
95/00669) o mediante digestión enzimática (Xiong Z., Laird P. W.,
"COBRA: A Sensitive and Quantitative DNA Methylation Assay",
Nucleic Acids Res., 15 de junio de 1997;
25(12):2532-4). Además, también se ha
descrito la detección por hibridación (Olek et al., WO
99/28498).
Otras publicaciones que tratan el uso de la
técnica del bisulfito para la detección de la metilación en genes
individuales son: Grigg G., Clark S. "Sequencing
5-Methylcytosine Residues in Genomic DNA",
Bioessays. Junio de 1994; 16(6):
431-6, 431; Zeschnigk M., Schmitz B., Dittrich B.,
Buiting K., Horsthemke B., Doerfler W., "Imprinted Segments in
the Human Genome: Different DNA Methylation Patterns in the
Prader-Willi/Angelman Syndrome Region as Determined
by the Genomic Sequencing Method", Hum. Mol. Genet.,
marzo de 1997; 6(3):387-95; Feil R.,
Charlton J., Bird A.P., Walter J., Reik W., "Methylation Analysis
on Individual Chromosomes: Improved Protocol for Bisulphite Genomic
Sequencing", Nucleic Acids Res., 25 de febrero de 1994;
22(4): 695-6; Martin V., Ribieras S.,
Song-Wang X., Rio M. C., Dante R., "Genomic
Sequencing Indicates a Correlation Between DNA Hypomethylation in
the 5' Region of the pS2 Gene and its Expression in Human Breast
Cancer Cell Lines", Gene., 19 de mayo de 1995;
157(1-2):261-4; WO 97/46705 y
WO 95/15373.
Es posible reunir una perspectiva general de la
técnica anterior sobre la fabricación de matrices oligoméricas de
una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics
Supplement, Volumen 21, enero de 1999), publicado en enero de
1999 y de la bibliografía citada en tal suplemento.
Habitualmente, se usan sondas marcadas
fluorescentemente para escanear las matrices de ADN inmovilizadas.
La unión simple de los colorantes Cy3 y Cy5 al OH de 5' de la sonda
específica es particularmente adecuada para los marcadores de la
fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas
hibridadas se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un
microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos
otros, se encuentran comercialmente disponibles.
La espectrometría de masas por ionización de
desorción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF)
es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas
M., Hillenkamp F., "Laser Desorption Ionisation of Proteins with
Molecular Masses Exceeding 10,000 Daltons", Anal Chem., 15
de octubre de 1988; 60(20):2299-301). Se
embebe un analito en una matriz de absorción de luz. Se evapora la
matriz mediante un pulso corto de láser, transportando así la
molécula de analito a la fase de vapor de una manera no fragmentada.
El analito es ionizado por las colisiones con las moléculas de la
matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en el tubo de vuelo
libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones son
acelerados a diferentes velocidades. Los iones más pequeños
alcanzan el detector antes que los más grandes.
La espectrometría MALDI-TOF está
adaptada de manera excelente al análisis de péptidos y proteínas. El
análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut I. G., Beck
S., "DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Mass
Spectrometry". Current Innovations and Future Trends.
1995, 1; 147-57). La sensibilidad a los ácidos
nucleicos es aproximadamente 100 veces peor que a los péptidos, y
disminuye desproporcionadamente al aumentar el tamaño del
fragmento. Para los ácidos nucleicos que tienen una estructura
cargada negativamente múltiplemente, el procedimiento de ionización
por medio de la matriz es considerablemente menos eficaz. En la
espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz
desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de
los péptidos, se han descubierto varias matrices muy eficaces que
producen una cristalización muy fina. Ahora hay varias matrices
sensibles para el ADN, sin embargo, la diferencia en la sensibilidad
no se ha reducido. Es posible reducir la diferencia en la
sensibilidad modificando químicamente el ADN de tal manera que se
vuelva más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos de
fosforotioato en los que se han sustituido los fosfatos habituales
de la estructura por tiofosfatos se pueden convertir en un ADN de
carga neutra usando una química de alquilación simple (Gut I.G.,
Beck S., "A Procedure for Selective DNA Alkylation and Detection
by Mass Spectrometry". Nucleic Acids Res., 25 de abril de
1995; 23(8):1367-73). El acoplamiento de una
etiqueta de carga con este ADN modificado da como resultado un
aumento de la sensibilidad hasta el mismo nivel que el encontrado
para los péptidos. Otra ventaja del etiquetado de cargas es el
aumento de la estabilidad del análisis frente a las impurezas, que
hacen la detección de los sustratos no modificados considerablemente
más difícil.
Usando procedimientos estándar, se obtiene ADN
genómico del ADN de muestras celulares, tisulares y de otras
muestras analíticas. Esta metodología estándar se encuentra en
referencias, tales como Sambrook, Fritsch y Maniatis eds.,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989.
Young et al., (en Young J. et al.,
"HPP1: a Transmembrane Protein-Encoding Gene
Commonly Methylated in Colorectal Polyps and Cancers"; J.
Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., enero de 2001,
2:98(1):265-70) describen el uso de la
metilación de HPP1 (TPEF) en diversos trastornos proliferativos de
células de colon, en el que la metilación se determina como una
característica de la evolución neoplástica.
Goessl et al. (en Goessl et al.,
"DNA-Based Detection of Prostate Cancer in Blood,
Urine an Ejaculates". Annals of the New York Academy of
Sciences, vol 945, N.º 1, septiembre de 2001, pp
51-58) describen el uso de la GSTP1 como un
marcador de la metilación para detectar el cáncer de próstata en
sangre, orina y eyaculados.
La invención proporciona un procedimiento para
detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las
células de colon que comprende las siguientes etapas: a)
proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN
genómico; b) extraer dicho ADN genómico; c) convertir las bases de
citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en
la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo u otra base que sea
diferente a la citosina en términos del comportamiento en el
apareamiento de bases; y d) identificar el estado de metilación de
una o más posiciones de las citosinas del gen TPEF y/o sus regiones
reguladoras.
La presente invención pone a disposición un
procedimiento para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos
del ADN genómico. El procedimiento es para su uso en la mejora del
diagnóstico, del tratamiento y del control de los trastornos
proliferativos de células de colon, más específicamente, permitiendo
la mejor identificación de y la diferenciación entre las subclases
de dicho trastorno y la predisposición genética de dichos
trastornos. La invención presenta mejoras frente al estado de la
técnica en tanto en cuanto permite una clasificación muy específica
de los carcinomas de colon, permitiendo de ese modo un mejor
tratamiento y con fundamento de los pacientes.
En una realización particularmente preferida, la
presente invención pone a disposición procedimientos que permiten
la diferenciación entre el carcinoma de colon, el adenoma de colon y
el tejido de colon normal.
Además, el procedimiento permite el análisis de
las metilaciones de las citosinas y los polimorfismos de un solo
nucleótido.
El gen que forma la base de la presente
invención se puede usar para formar un "panel de genes", i.e.,
una colección que comprende las secuencias genéticas particulares
de la presente invención y/o sus respectivos sitios de metilación
informativos. La formación de los paneles de genes permite la
realización de un análisis rápido y específico de los trastornos
con los que están relacionados. Los paneles de genes descritos en
esta invención se pueden usar con una eficacia sorprendentemente
alta para el diagnóstico, el tratamiento y el control, así como el
análisis de los trastornos proliferativos de células de colon según
lo descrito en la presente memoria. El uso de múltiples sitios CpG
de una matriz diversa de genes permite un grado relativamente
elevado de sensibilidad y especificidad en comparación con las
herramientas de diagnóstico y detección de un solo gen. Además, el
panel según lo descrito en la presente memoria se puede adaptar para
su uso en el análisis de muchos aspectos de los trastornos
proliferativos de células de
colon.
colon.
En una realización preferida, el procedimiento
comprende las siguientes etapas:
En la primera etapa del procedimiento, se debe
aislar la muestra de ADN genómico de fluidos corporales. La
extracción puede realizarse mediante procedimientos que son estándar
para cualquier experto en la técnica, incluyendo éstos el uso de
lisados de detergente, tratamiento ultrasónico y movimientos
vorticiales con perlas de vidrio. Una vez extraídos los ácidos
nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.
En una realización preferida, se puede escindir
el ADN antes de la siguiente etapa del procedimiento, pudiendo
hacerse mediante cualquier procedimiento estándar en el estado de la
técnica, en concreto, pero no limitándose a, un procedimiento con
endonucleasas de restricción.
En la segunda etapa del procedimiento, la
muestra de ADN genómico se trata de una manera tal que las bases de
citosina que están desmetiladas en la posición 5' se convierten en
uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en
términos del comportamiento en la hibridación. Esto se entenderá
como "pretratamiento" de aquí en adelante.
El tratamiento descrito anteriormente del ADN
genómico se lleva a cabo preferiblemente con bisulfito (sulfito,
disulfito) y la posterior hidrólisis alcalina que da como resultado
una conversión de las nucleobases de citosina no metiladas en
uracilo o en otra base que es diferente a la citosina en términos
del comportamiento en el apareamiento de bases. Si se usa solución
de bisulfito para la reacción, entonces tiene lugar una adición en
las bases de citosina no metiladas. Además, debe estar presente un
reactivo de desnaturalización o un disolvente, así como un
interceptor de radicales. Entonces se produce una hidrólisis
alcalina con posterioridad a la conversión de las nucleobases de
citosina no metiladas en uracilo. Luego se usa el ADN convertido
químicamente para la detección de citosinas
metiladas.
metiladas.
Se amplifican los fragmentos del ADN pretratado
usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores según SEC ID N.º
239, 240, 367 y 368, y una polimerasa preferiblemente estable al
calor. Debido a consideraciones estadísticas y prácticas, se
amplifican preferiblemente más de diez fragmentos diferentes que
tienen una longitud de 100-2.000 pares de bases. La
amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo
simultáneamente en una y la misma cuba de reacción. Habitualmente,
la amplificación se lleva a cabo por medio de una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
El procedimiento también puede ser posibilitado
por el uso de cebadores alternativos, siendo el diseño de tales
cebadores obvio para cualquier experto en la técnica. Éstos deberían
incluir al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son
inversamente complementarias o idénticas a un segmento de una
longitud de al menos 18 pares de bases de las secuencias de bases
especificadas en el apéndice (SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368).
Dichos oligonucleótidos cebadores se caracterizan preferiblemente
por no contener ningún dinucleótido CpG. En una realización
particularmente preferida del procedimiento, la secuencia de dichos
oligonucleótidos cebadores está diseñada para que se aparee
selectivamente con y amplifique sólo el ADN específico del tejido de
colon de interés, minimizando así la amplificación del ADN de fondo
o del ADN no relevante. En el contexto de la presente invención, el
ADN de fondo pretende significar el ADN genómico que no tiene un
patrón de metilación específico del tejido relevante, siendo, en
este caso, el de colon el tejido relevante, tanto sano como
enfermo.
Según la presente invención, es preferible que
haya al menos un oligonucleótido cebador unido a una fase sólida
durante la amplificación. Se pueden disponer las diferentes
secuencias de oligonucleótido y/o oligómero de ANP sobre una fase
sólida plana en forma de una retícula rectangular o hexagonal,
estando la superficie de la fase sólida compuesta preferiblemente
por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre,
níquel, plata u oro, siendo posible también el uso de otros
materiales, tales como nitrocelulosa o plásticos.
Los fragmentos obtenidos por medio de la
amplificación pueden portar un marcador directa o indirectamente
detectable. Se prefieren los marcadores en forma de marcadores de
fluorescencia, radionucleidos o fragmentos de moléculas separables
que tienen una masa típica que puede ser detectada en un
espectrómetro de masas, prefiriéndose que los fragmentos que sean
producidos tengan una sola carga neta positiva o negativa para
detectarlos mejor en el espectrómetro de masas. La detección se
puede llevar a cabo y visualizarse por medio de espectrometría de
masas de desorción/ionización en matriz inducida por láser (MALDI) o
usando una espectrometría de masas por electrospray (IES).
Los fragmentos amplificados obtenidos en la
segunda etapa del procedimiento son posteriormente hibridados con
una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de ANP. En
este contexto, la hibridación tiene lugar preferiblemente de la
manera que se describe a continuación. El conjunto de sondas usado
durante la hibridación está preferiblemente compuesto por al menos
10 oligonucleótidos u oligómeros de ANP. Sin embargo, se entiende y
también se reivindica que el procedimiento se puede realizar usando
sólo un oligonucleótido o una sonda de ANP. En el procedimiento,
los fragmentos amplificados se hibridan con los oligonucleótidos
previamente unidos a la fase sólida. Los oligonucleótidos se pueden
tomar del grupo que comprende SEC ID N.º 65 a SEC ID N.º 132 y SEC
ID N.º 519 a SEC ID N.º 1.030. Los oligonucleótidos también se
pueden tomar del grupo que comprende SEC ID N.º 895 a SEC ID N.º
1.030. Los fragmentos no hibridados son posteriormente retirados.
Dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases
que tiene una longitud de 10 nucleótidos que es inversamente
complementaria o idéntica a un segmento de las secuencias de bases
especificadas en el apéndice, segmento que contiene al menos un
dinucleótido CpG o TpG. En otra realización preferida, la citosina
del dinucleótido CpG, o en el caso de TpG, la tiamina, es el 5º o 9º
nucleótido desde el extremo 5' del 10 mero. Existe un
oligonucleótido por cada dinucleótido CpG o
TpG.
TpG.
En la quinta etapa del procedimiento, se retiran
los fragmentos amplificados no hibridados.
En la etapa final del procedimiento, se detectan
los fragmentos amplificados hibridados. En este contexto, es
preferible que los marcadores unidos a los fragmentos amplificados
sean identificables en cada posición de la fase sólida en la que
hay localizada una secuencia de oligonucleótido.
Según la presente invención, es preferible que
los marcadores de los fragmentos amplificados sean marcadores de
fluorescencia, radionucleidos o fragmentos de moléculas separables
que tengan una masa típica que pueda ser detectada en un
espectrómetro de masas. Para la detección de los fragmentos
amplificados, trozos de los fragmentos amplificados o de las sondas
que son complementarias a los fragmentos amplificados, se prefiere
el espectrómetro de masas, siendo posible llevar a cabo y visualizar
la detección por medio de espectrometría de masas de
desorción/ionización en matriz inducida por láser (MALDI) o usando
una espectrometría de masas por electrospray (IES). Los fragmentos
producidos pueden tener una sola carga neta positiva o negativa para
detectarlos mejor en el espectrómetro de
masas.
masas.
El procedimiento anteriormente mencionado se usa
preferiblemente para determinar parámetros genéticos y/o
epigenéticos del ADN genómico.
Para posibilitar este procedimiento, la
invención describe además el ADN modificado de los genes MDR1,
APOC2, CACNA1G, EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1,
HLA-F, ELK1, APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B
(p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B, CD44, CSPG2, DARK1, EGFR, EYA4, GSTP1,
GTBP/MSH6, HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1,
MNCA9, MSH3, MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR22,
TIMP3, TP53, TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1,
TPEF (= TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2 , ESR1, CASP8,
RASSF1, MSH4, MSH5, así como los oligonucleótidos y/o oligómeros de
ANP para detectar las metilaciones de las citosinas de dichos
genes. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los
parámetros genéticos y epigenéticos y, en concreto, los patrones de
metilación de las citosinas de ADN genómico son particularmente
adecuados para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control
de los trastornos proliferativos de células de colon. Además, la
invención permite la diferenciación entre las diferentes subclases
de trastornos proliferativos de células de colon o la detección de
una predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de
colon.
Los ácidos nucleicos según lo descrito se pueden
usar para el análisis de parámetros genéticos y/o epigenéticos del
ADN genómico.
Este objetivo se consigue según la presente
invención usando un ácido nucleico que contiene una secuencia de al
menos 18 bases de longitud del ADN genómico pretratado según una
entre SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y las secuencias
complementarias a las mismas.
El ácido nucleico modificado podía, hasta este
momento, no estar relacionado con la determinación de los parámetros
genéticos y epigenéticos relevantes para estas enfermedades.
La presente invención describe además un
oligonucleótido o un oligómero para el análisis del ADN pretratado,
para detectar el estado de la metilación de las citosinas genómicas,
conteniendo dicho oligonucleótido al menos una secuencia de bases
que tenga una longitud de al menos 10 nucleótidos que se hibride con
un ADN genómico pretratado según la SEC ID N.º 133 a la SEC ID N.º
388. Las sondas de oligómero constituyen herramientas importantes y
eficaces que, por primera vez, hacen posible la determinación de
parámetros genéticos y epigenéticos específicos durante el análisis
de muestras biológicas para las características asociadas con el
desarrollo de trastornos proliferativos de células de colon. Dichos
oligonucleótidos permiten la mejora del diagnóstico, del tratamiento
y del control de los trastornos proliferativos de células de colon,
y la detección de la predisposición a dichos trastornos. Además,
permiten la diferenciación de las diferentes subclases de trastornos
proliferativos de células de colon. La secuencia de bases de los
oligómeros contiene preferiblemente al menos un dinucleótido CpG o
TpG. Las sondas también pueden existir en forma de un ANP (ácido
nucleico peptídico) que tenga propiedades de apareamiento
particularmente preferidas. Los particularmente preferidos son los
oligonucleótidos según la presente invención en los que la citosina
del dinucleótido CpG es el 5º-9º nucleótido desde el extremo 5' del
13 mero; en el caso de los oligómeros de ANP, es preferible que la
citosina del dinucleótido CpG sea el 4º-6º nucleótido desde el
extremo 5' del 9 mero.
Los oligómeros según la presente invención se
usan normalmente en los denominados "conjuntos" que contienen
al menos un oligómero por cada uno de los dinucleótidos CpG en la
SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368. Se prefiere un conjunto que
contenga al menos un oligómero por cada uno de los dinucleótidos CpG
seleccionado entre SEC ID N.º 65 a SEC ID N.º 132 y SEC ID N.º 519
a SEC ID N.º 1.030. Se prefiere más una selección de entre el
conjunto que comprende la SEC ID N.º 895 a SEC ID N.º 1.030.
\newpage
En el caso de los conjuntos de oligonucleótidos
según la presente invención, es preferible que al menos un
oligonucleótido esté unido a una fase sólida. Es más preferible que
todos los oligonucleótidos de un conjunto estén unidos a una fase
sólida.
La presente invención se refiere además a un
conjunto de preferiblemente al menos 10 n (oligonucleótidos y/o
oligómeros de ANP) usado para detectar el estado de metilación de
las citosinas del ADN genómico usando versiones tratadas de dicho
ADN genómico (según la SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y secuencias
complementarias a las mismas). Sin embargo, se entiende y también
se reivindica que el procedimiento se puede realizar usando sólo un
oligonucleótido o un oligómero de ANP. Estas sondas permiten mejorar
el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos
proliferativos de células de colon. Particularmente, permiten la
diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos
proliferativos de células de colon y la detección de una
predisposición a padecer dichos trastornos. En una realización
particularmente preferida, el conjunto comprende SEC ID N.º 65 a
SEC ID N.º 132 y SEC ID N.º 519 a SEC ID N.º 1.030.
También se puede usar el conjunto de oligómeros
para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) usando ADN
genómico pretratado según una entre SEC ID N.º 239, 240, 367 y
368.
En la presente memoria, se describe una
disposición de diferentes oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP (la
denominada "matriz") presente de tal manera que asimismo está
unida a una fase sólida. Esta matriz de las diferentes secuencias
de oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP se puede caracterizar por
estar dispuesta sobre una fase sólida en forma de una retícula
rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida está
compuesta preferiblemente por silicio, vidrio, poliestireno,
aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. Sin embargo,
la nitrocelulosa, así como los plásticos tales como el nylon, que
existen en forma de nódulos o también como matrices de resina son
alternativas adecuadas.
En la presente memoria, se describe un
procedimiento para la fabricación de una matriz fijada a un material
vehículo para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control
de los trastornos proliferativos de células de colon, para la
diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos
proliferativos de células de colon y/o la detección de una
predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de
colon. En dicho procedimiento, se acopla al menos un oligómero como
los descritos a una fase sólida. Los procedimientos para la
fabricación de tales matrices son conocidos, por ejemplo, a partir
de la patente estadounidense n.º 5.744.305, por medio de química en
fase sólida y grupos protectores fotolábiles.
En la presente memoria, se describe un chip de
ADN para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los
trastornos proliferativos de células de colon. Además el chip de ADN
permite la detección de una predisposición a padecer trastornos
proliferativos de células de colon y la diferenciación entre las
diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de
colon. El chip de ADN contiene al menos un ácido nucleico según lo
descrito. Los chips de ADN se conocen, por ejemplo, por la patente
estadounidense n.º 5.837.832.
Además, en la presente memoria se describe un
equipo que puede estar compuesto, por ejemplo, por un reactivo que
contiene bisulfito, un conjunto de oligonucleótidos cebadores que
contiene al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias
corresponden en cada caso o son complementarias a un segmento de 18
bases de longitud de las secuencias de bases especificadas en el
apéndice (SEC ID N.º 133 a SEC ID N.º 388), oligonucleótidos y/u
oligómeros de ANP, así como las instrucciones para llevar a cabo y
evaluar el procedimiento descrito. Sin embargo, un equipo como el
descrito también puede contener sólo parte de los componentes
anteriormente men-
cionados.
cionados.
Los oligómeros o las matrices de los mismos, así
como un equipo como el descrito están destinados a ser usados para
mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los
trastornos proliferativos de células de colon. Además, el uso de
dichas invenciones se extiende a la diferenciación entre las
diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de
colon y a la detección de una predisposición a padecer trastornos
proliferativos de células de colon. Según la presente invención, el
procedimiento se usa preferiblemente para el análisis de los
parámetros genéticos y/o epigenéticos importantes del ADN genómico,
en particular, para su uso en la mejora del diagnóstico, del
tratamiento y del control de los trastornos proliferativos de
células de colon, la detección de la predisposición a padecer
dichos trastornos y la diferenciación entre las subclases de dichos
trastornos.
Los procedimientos según la presente invención
se usan, por ejemplo, para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y
el control de la progresión de los trastornos proliferativos de
células de colon, para la detección de la predisposición a padecer
dichos trastornos y para la diferenciación entre las subclases de
dichos trastornos.
Otra realización de la invención es un
procedimiento para el análisis del estado de metilación del ADN
genómico del gen TPEF sin la necesidad de un pretratamiento. En la
primera etapa del procedimiento, se debe aislar la muestra de ADN
genómico de fluidos corporales. La extracción puede realizarse
mediante procedimientos que son estándar para cualquier experto en
la técnica, incluyendo éstos el uso de lisados de detergente,
tratamiento ultrasónico y movimientos vorticiales con perlas de
vidrio. Una vez extraídos los ácidos nucleicos, se usa el ADN
bicatenario genómico en el análisis.
\newpage
En una realización preferida, se puede escindir
el ADN antes del tratamiento, pudiendo hacerse esto mediante
cualquier procedimiento estándar en el estado de la técnica, en
particular, con endonucleasas de restricción. En una segunda etapa,
se digiere entonces el ADN con una o más enzimas de restricción
sensibles a la metilación. La digestión se lleva a cabo tal que la
hidrólisis del ADN en el sitio de restricción aporta información
sobre el estado de metilación de un dinucleótido CpG
específico.
En la tercera etapa, se amplifican los
fragmentos de restricción. En una realización preferida, esto se
lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa.
En la etapa final, se detectan los fragmentos
amplificados. La detección se puede realizar mediante cualquier
procedimiento estándar en la técnica, por ejemplo, pero no
limitándose a, análisis de electroforesis sobre gel, análisis de
hibridación, incorporación de etiquetas detectables en los productos
de PCR, análisis de matrices de ADN, análisis MALDI o IES.
La presente invención se refiere además al
diagnóstico y/o al pronóstico de eventos que son perjudiciales o
relevantes para los pacientes o individuos en los que es posible
comparar parámetros genéticos y/o epigenéticos importantes del ADN
genómico, siendo dichos parámetros obtenidos por medio de la
presente invención, con otro conjunto de parámetros genéticos y/o
epigenéticos, sirviendo las diferencias como base para el
diagnóstico y/o el pronóstico de eventos que son perjudiciales o
relevantes para los pacientes o los individuos.
En el contexto de la presente invención, el
término "hibridación" debe ser entendido como un enlace de un
oligonucleótido con una secuencia completamente complementaria a lo
largo de las líneas de apareamientos de bases de
Watson-Crick en el ADN de muestra, formando una
estructura de dúplex.
En el contexto de la presente invención, los
"parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos del ADN
genómico y de las secuencias que se requieren además para su
regulación. Se designan como mutaciones, en concreto, las
inserciones, las eliminaciones, las mutaciones puntuales, las
inversiones y los polimorfismos, prefiriéndose particularmente los
PSN (polimorfismos de un solo nucleótido).
En el contexto de la presente invención
"análisis del estado de la metilación" pretende significar el
análisis de las citosinas de un ácido nucleico destinado a
determinar si están metiladas o no. En el contexto de la presente
invención, los "parámetros epigenéticos" son, en particular,
metilaciones de citosinas y otras modificaciones de bases de ADN de
ANP genómico y de las secuencias que se requieren además para su
regulación. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la
acetilación de histonas, que no se puede analizar directamente
mediante el uso del procedimiento descrito, pero que, a su vez, se
correlaciona con la metilación del ADN.
A continuación, la presente invención será
explicada más detalladamente en base a las secuencias y a los
ejemplos, sin que por ello esté limitada a los mismos.
La SEC ID N.º 1 a la SEC ID N.º 64 representan
las regiones 5' y/o reguladoras del ADN genómico de los genes MDR1,
APOC2, CACNA1G, EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1,
HLA-F, ELK1, APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B
(p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B, CD44, CSPG2, DARK1, EGFR, EYA4, GSTP1,
GTBP/MSH6, HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1,
MNCA9, MSH3, MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR2,
TIMP3, TP53, TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1,
TPEF (= TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2, ESR1, CASP8,
RASSF1, MSH4, MSH5. Estas secuencias derivan de la base de datos
ensembl (fecha 01.10.2001) (http://www.ensembl.org) y se
considerará que incluyen todas las variaciones menores del material
secuencial que actualmente no están previstas, por ejemplo, pero no
limitándose a, las eliminaciones menores y los PSN.
La SEC ID N.º133 a 388 muestran las secuencias
pretratadas del ADN derivado de los genes MDR1, APOC2, CACNA1G,
EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1, HLA-F, ELK1,
APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B (p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B,
CD44, CSPG2, DAPK1, EGFR, EYA4, GSTP1, GTBP/MSH6,
HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1, MNCA9, MSH3,
MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR2, TIMP3, TP53,
TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1, TPEF (=
TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2, ESR1, CASP8, RASSF1,
MSH4, MSH5. Se considerará que estas secuencias incluyen todas las
variaciones menores del material secuencial que actualmente no están
previstas, por ejemplo, pero no limitándose a, las eliminaciones
menores y los PSN.
La SEC ID N.º 389 a SEC ID N.º 518 presentan las
secuencias de los oligonucleótidos cebadores para la amplificación
del ADN pretratado según la SEC ID N.º 133 a la SEC ID N.º 388.
La SEC ID N.º 65 a la SEC ID N.º 132 presentan
las secuencias de los oligómeros que son útiles para el análisis de
las posiciones de CpG en el ADN genómico según SEC ID N.º 1 a SEC ID
N.º 64.
La SEC ID N.º 519 a la SEC ID N.º 1.030
presentan las secuencias de los oligómeros que son útiles para el
análisis del estado de metilación de las posiciones de CpG en el ADN
genómico según SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 64 tras el tratamiento de
dicho ADN genómico con bisulfito.
La SEC ID N.º 895 a la SEC ID N.º 1.030
presentan las secuencias de los oligómeros que son particularmente
útiles para el análisis de las posiciones de CpG en el ADN genómico
según SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 64, tras el tratamiento de dicho
ADN genómico con bisulfito, y son objeto de una realización
preferida de esta invención.
Figura 1: Diferenciación entre tejido sano de
colon y tejido de adenoma o carcinoma de colon según el ejemplo 2.
Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores
de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando
la tabla 3 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho de la figura
proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia
entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo
CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los
CpG están ordenados según su contribución a la diferenciación entre
los dos tipos de tejidos (A = sano, B = no sano), aumentado la
contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación
total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la
falta de metilación en una determinada posición, estando los grados
de metilación representados en color gris, de gris claro (baja
proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de
metilación).
Figura 2: Diferenciación entre tejido sano de
colon y tejido de carcinoma de colon según el ejemplo 2. Las
etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de
genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la
tabla 4 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho de la figura
proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia
entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo
CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los
CpG están ordenados según su contribución a la diferenciación entre
los dos tipos de tejidos (A = sano, B = carcinoma) aumentado la
contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación
total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la
falta de metilación en una determinada posición, estando los grados
de metilación representados en color gris, de gris claro (baja
proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de
metilación).
Figura 3: Diferenciación entre tejido sano de
colon y tejido de adenoma de colon según el ejemplo 2. Las etiquetas
del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de genes y
CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la tabla 5
y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho proporcionan la
relevancia (valor p y test T) de la diferencia entre las medias de
los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo CpG y cada columna
a los niveles de metilación de una muestra. Los CpG están ordenados
según su contribución a la distinción con respecto al diagnóstico
diferencial entre los dos tipos de tejidos (A = sano, B = adenoma)
aumentado la contribución de arriba a abajo. El color negro indica
la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco
representa la falta de metilación en una determinada posición,
estando los grados de metilación representados en color gris, de
gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta
proporción de metilación). Debido al formato de la página, en esta
figura sólo se muestran 40 CpG.
Figura 4: Diferenciación entre tejido de
carcinoma de colon y el tejido de adenoma de colon según el ejemplo
2. Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son
identificadores de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma
cruzada usando la tabla 6 y la tabla 7. Las etiquetas del lado
derecho proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la
diferencia entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde
a un solo CpG y cada columna a los niveles de metilación de una
muestra. Los CpG están ordenados según su contribución a la
distinción con respecto al diagnóstico diferencial entre los dos
tipos de tejidos (A = carcinoma, B = adenoma) aumentado la
contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación
total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la
falta de metilación en una determinada posición, estando los grados
de metilación representados en color gris, de gris claro (baja
proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de
metilación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 1 y
2
En los siguientes ejemplos, se llevó a cabo una
PCR multiplex sobre muestras de tejido originarias de adenomas de
colon o de carcinoma de colon. La PCR multiplex también se llevó a
cabo sobre tejido sano de colon. Se trató cada una de las muestras
de la manera descrita más adelante en el ejemplo 1 para deducir el
estado de metilación de las posiciones de CpG, siendo recopilada la
información sobre la metilación de CpG de cada muestra y luego
usada en un análisis, como se describe detalladamente en el ejemplo
2. En el ejemplo 3, se describe un procedimiento alternativo para
el análisis del estado de metilación de CpG según lo descrito en el
ejemplo 3.
Ejemplo
1
En la primera etapa, se aisló el ADN genómico de
las muestras celulares usando el equipo Wizzard de (Promega).
Se trata el ADN genómico aislado de las muestras
usando una solución de bisulfito (hidrógeno sulfito, bisulfito). El
tratamiento es tal que todas las citosinas no metiladas de la
muestra son convertidas en tiamidina y, por el contrario, las
citosinas 5-metiladas de la muestra permanecen
invariables.
\newpage
Entonces se amplificaron los ácidos nucleicos
tratados usando varias PCR multiplex, amplificando 8 fragmentos por
reacción con cebadores marcados fluorescentemente con Cy5. En la
tabla 1, se describen los cebadores de PCR. Las condiciones de la
PCR fueron las siguientes:
Solución de reacción:
- 10 ng ADN tratado con bisulfito
- MgCl_{2} 3,5 mM
- varios dNTP 400 \muM
- 2 pmoles de cada cebador
- 1 U de Taq Hot Star (Qiagen)
Se llevaron a cabo cuarenta ciclos como se
explica a continuación. Desnaturalización a 95ºC durante 15 min,
seguida por un apareamiento a 55ºC durante 45 s, alargamiento de
cebadores a 65ºC durante 2 min. Se llevó a cabo un alargamiento
final a 65ºC durante 10 min.
Entonces se hibridaron todos los productos de
PCR de cada muestra individual con portaobjetos de vidrio que
portaban un par de oligonucleótidos inmovilizados para cada posición
de CpG sometida a análisis. Cada uno de estos oligonucleótidos de
detección fue diseñado para que se hibridara con la secuencia
convertida con bisulfito alrededor de un sitio de CpG que
originariamente estaba bien desmetilado (TG) o metilado (CG). Para
más información, véase la tabla 2 de todos los oligonucleótidos de
hibridación usados (tanto los informativos como los que no
informativos). Las condiciones de hibridación se seleccionaron para
que permitieran la detección de las diferencias de un solo
nucleótido entre las variantes TG y CG.
Se diluyó un volumen de 5 \mul de cada
producto de PCR multiplex en 10 x tampón de Ssarc (10 x Ssarc: 230
ml; 20 x SSC; 180 ml de solución de
lauril-sarcosinato de sodio al 20%, diluido hasta
1.000 ml con H_{2}Od). Entonces se hibridó la mezcla de reacción
con los oligonucleótidos de detección según lo siguiente.
Desnaturalización a 95ºC, enfriamiento hasta 10ºC, hibridación a
42ºC durante una noche seguida por el lavado con 10 x Ssarc y
H_{2}Od a
42ºC.
42ºC.
Se detectaron señales fluorescentes procedentes
de cada oligonucleótido hibridado usando un escáner y un programa
informático genepix. Se calcularon las proporciones para las dos
señales (la procedente del oligonucleótido CG y la procedente del
oligonucleótido TG usados para analizar cada posición de CpG) en
base a la comparación de la intensidad de las señales
fluorescentes.
Ejemplo
2
Entonces se clasifican los datos obtenidos según
el ejemplo 1 en una matriz ordenada (según lo mostrado en las
figuras 1 a 4) según las diferencias en la metilación de los CpG
entre las dos clases de tejidos, usando un algoritmo. Las
posiciones de CpG de mayor relevancia están en la parte inferior de
la matriz, disminuyendo la relevancia hacia la parte superior. El
color negro indica la metilación total en una determinada posición
de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una
determinada posición, estando los grados de metilación
representados en color gris, de gris claro (baja proporción de
metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación). Cada
fila representa una posición de CpG específica de un gen y cada
columna muestra el perfil de metilación para los diferentes CpG de
una muestra. En el lado izquierdo, se muestra un identificador de
CpG y de gen que puede ser referenciado de forma cruzada con las
tablas anexas (tabla 1 y 7) para determinar el gen en cuestión y el
oligómero de detección usado. En el lado derecho, se muestran los
valores p para las posiciones de CpG individuales. Los valores p
son las probabilidades de que la distribución observada tenga lugar
por casualidad en el conjunto de datos.
Para las distinciones seleccionadas, se formó un
algoritmo de aprendizaje (máquina de soporte vectorial, SVM). La
SVM (según lo tratado por F. Model, P. Adorjan, A. Olek, C.
Piepenbrock, "Feature selection for DNA methylation based cancer
classification". Bioinformatics. Junio de 2001; 17 Supl.
1: S157-64) construye un discriminante óptimo entre
dos clases de muestras de formación ofrecidas. En este caso, cada
muestra se describe mediante los patrones de metilación
(proporciones entre CG/TG) en los sitios de CpG investigados. La SVM
fue preparada sobre un subconjunto de muestras de cada clase, que
fueron presentadas junto con el diagnóstico. Entonces se
presentaron muestras analíticas independientes que no habían sido
mostradas a la SVM antes para evaluar si es posible predecir
correctamente el diagnóstico en base al predictor creado en la serie
de preparación. Se repitió este procedimiento varias veces usando
diferentes divisiones de las muestras, un procedimiento denominado
validación cruzada. Cabe destacar que todas las series se realizan
sin usar ninguno de los conocimientos obtenidos en las series
anteriores. Se calculó la media del número de clasificaciones
correctas frente a todas las series, lo que proporcionó una buena
estimación de la exactitud analítica (porcentaje de muestras
clasificadas correctas frente a todas las series).
La figura 1 muestra la diferenciación entre el
tejido sano y el tejido no sano, en la que las muestras no sanas se
obtienen de tejido bien de adenoma de colon o de carcinoma de colon.
La evaluación se lleva a cabo usando posiciones de CpG informativos
procedentes de 27 genes. Las posiciones de CpG informativos se
describen más detalladamente en la tabla 3.
La figura 2 muestra la diferenciación entre el
tejido sano y el tejido de carcinoma usando posiciones de CpG
informativos procedentes de 15 genes. Las posiciones de CpG
informativos se describen más detalladamente en la tabla 4.
La figura 3 muestra la diferenciación entre el
tejido sano y el tejido de adenoma usando posiciones de CpG
informativos procedentes de 40 genes. Las posiciones de CpG
informativos se describen más detalladamente en la tabla 5.
La figura 4 muestra la diferenciación entre el
tejido de carcinoma y el tejido de adenoma usando posiciones de CpG
informativos procedentes de 2 genes. Las posiciones de CpG
informativos se describen más detalladamente en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó por PCR un fragmento del ADN
tratado con bisulfito del gen CD44 (SEC ID N.º 20) usando los
cebadores GAAAGGAGAGGTTAAAGGTTG (SEC ID N.º 429) y
AACTCACTTAACTCCAATCCC (SEC ID N.º 430). El fragmento resultante (696
pb de longitud) contenía un CpG informativo en la posición 235. Se
digirió el ADN amplificado con la endonucleasa de restricción
Apa I, sitio de reconocimiento GGGCC. La hidrólisis realizada
por dicha endonucleasa es bloqueada por la metilación del CpG en la
posición 235 del fragmento amplificado. El fragmento digerido se
usó como control.
Se aisló el ADN genómico de la muestra usando el
equipo de aislamiento de ADN DNA Wizzard (Promega). Cada muestra
fue digerida usando Apa I según las recomendaciones del
fabricante (New England Biolabs).
Entonces se amplificaron 10 ng de cada fragmento
digerido genómico usando los cebadores de PCR GAAAG
GAGAGGTTAAAGGTTG y AACTCACTTAACTCCAATCCC. Las reacciones PCR se realizaron usando un termociclador (Eppendorf GmbH), usando 10 ng de ADN, 6 pmoles de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM y 1 U de HotstartTaq (Qiagen AG). El resto de las condiciones fueron según lo recomendado por el fabricante de la polimerasa de Taq. Usando los cebadores anteriormente mencionados, se amplificaron los fragmentos génicos por PCR realizando una primera etapa de desnaturalización durante 14 min a 96ºC, seguida por 30-45 ciclos (etapa 2: 60 s a 96ºC; etapa 3: 45 s a 52ºC; etapa 4: 75 s a 72ºC) y un posterior alargamiento final de 10 min a 72ºC. Se analizó la presencia de los productos de PCR mediante electroforesis sobre gel de agarosa.
GAGAGGTTAAAGGTTG y AACTCACTTAACTCCAATCCC. Las reacciones PCR se realizaron usando un termociclador (Eppendorf GmbH), usando 10 ng de ADN, 6 pmoles de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM y 1 U de HotstartTaq (Qiagen AG). El resto de las condiciones fueron según lo recomendado por el fabricante de la polimerasa de Taq. Usando los cebadores anteriormente mencionados, se amplificaron los fragmentos génicos por PCR realizando una primera etapa de desnaturalización durante 14 min a 96ºC, seguida por 30-45 ciclos (etapa 2: 60 s a 96ºC; etapa 3: 45 s a 52ºC; etapa 4: 75 s a 72ºC) y un posterior alargamiento final de 10 min a 72ºC. Se analizó la presencia de los productos de PCR mediante electroforesis sobre gel de agarosa.
Los productos de PCR fueron detectables con ADN
hidrolizado por Apa I aislado en el que la posición de CpG
en cuestión fue metilada secuencia arriba al repetirse la etapa 2 a
la etapa 4 del programa de ciclos 34, 37, 39, 42 y 45 veces. Por el
contrario, los productos de PCR sólo fueron detectable con ADN
hidrolizado por Apa I aislado de ADN metilado secuencia
abajo (y ADN control) al repetirse la etapa 2 a la etapa 4 del
programa de ciclos 42 y 45 veces. Estos resultados se incorporaron
en un análisis de matrices de metilación de CpG según lo descrito
en el ejemplo 2.
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Claims (21)
1. Un procedimiento para detectar y diferenciar
entre los trastornos proliferativos de las células de colon que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico,
- b)
- extraer dicho ADN genómico,
- c)
- convertir las bases de citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo o en otra base que sea diferente de la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases y
- d)
- identificar el estado de metilación de una o más posiciones de citosina del gen TPEF y/o sus regiones reguladoras.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el reactivo es una solución de
bisulfito, hidrógeno sulfito o disulfito.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque los fragmentos de dicho ADN genómico
pretratado son amplificados por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) antes de la etapa d).
4. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se amplifican
más de diez fragmentos diferentes que tienen una longitud de
100-2.000 pares de bases.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa de
amplificación se lleva a cabo usando al menos dos oligonucleótidos
cuyas secuencias son cada una inversamente complementarias o
idénticas a un segmento de una longitud de al menos 18 pares de
bases de una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC
ID N.º 239, 240, 367 y 368.
6. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa de
amplificación amplifica de forma preferente ADN que es de
particular interés en tejidos de colon sanos y/o enfermos, en base
al estado de metilación genómica específica del tejido de colon, a
diferencia del ADN de fondo.
7. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la
identificación del estado de metilación de una o más posiciones de
citosina en base a dicha matriz implica una hibridación de cada
fragmento amplificado con un oligonucleótido o un oligómero de
ácido nucleico peptídico (ANP).
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque los fragmentos amplificados están
marcados.
9. El procedimiento según la reivindicación 8
que comprende además detectar los fragmentos amplificados o
fragmentos de los fragmentos amplificados mediante espectrometría de
masas.
10. Un procedimiento para detectar y diferenciar
entre los trastornos proliferativos de las células de colon que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico,
- b)
- extraer dicho ADN genómico,
- c)
- digerir el ADN genómico del gen TPEF usando una enzima de restricción sensible a la metilación y
- d)
- detectar los fragmentos de ADN generados en el fragmento digerido de la etapa d).
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que el fragmento digerido de ADN es amplificado antes de la
etapa d).
12. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la amplificación se lleva a cabo por medio de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR).
13. El procedimiento según la reivindicación 11
ó 12, en el que la amplificación de más de un fragmento de ADN se
lleva a cabo en una cuba de reacción.
14. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho procedimiento diferencia
entre tejido de colon normal y tejido de trastorno proliferativo
celular de colon, diferencia entre tejido de adenoma de colon y
tejido de colon normal, diferencia entre tejido de carcinoma de
colon y tejido de colon normal o diferencia entre tejido de adenoma
de colon y tejido de carcinoma de colon.
15. Uso de un panel de genes que comprende al
menos un ácido nucleico diana seleccionado entre el gen TPEF (=
TMEFF2; = HPP1) y/o sus regiones reguladoras para la detección de
trastornos proliferativos de células de colon en fluidos corporales
en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
16. Uso de un panel de genes según la
reivindicación 15, en el que dichos ácidos nucleicos diana se
seleccionan del grupo que comprende SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368,
y secuencias complementarias de las mismas.
17. Uso de un panel de genes según la
reivindicación 15 ó 16, en el que dicho panel está presente en forma
de una matriz de ácidos nucleicos o de ácidos nucleicos peptídicos
para el análisis de trastornos proliferativos de células de colon
asociados con el estado de metilación de dichos ácidos nucleicos
diana.
18. Uso según la reivindicación 17,
caracterizado porque la superficie de la fase sólida de dicha
matriz está compuesta por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio,
acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.
19. Uso de un oligonucleótido que contiene al
menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 10
nucleótidos que se hibrida con un ácido nucleico seleccionado del
grupo constituido por SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368 en un
procedimiento según la reivindicación 1.
20. Uso de un oligonucleótido de una longitud de
al menos 18 bases que se hibrida con un ácido nucleico seleccionado
del grupo constituido por SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368 en un
procedimiento según la reivindicación 1.
21. Uso de un oligonucleótido según cualquiera
de las reivindicaciones 19 ó 20, en el que la secuencia de bases
del mismo comprende al menos un dinucleótido CG o TG.
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