ES2295607T3 - Procedimiento y acidos nucleicos para el analisis de trastornos de proliferacion de celulas colorrectales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro de diagnosticar un trastorno de proliferación de células de colon en un sujeto, que comprende las etapas de: a) obtener o más muestras de prueba de tejido o suero de colon o ambos, sangre o heces de dicho sujeto; y b) detectar un descenso de la cantidad o expresión de un polipéptido que se expresa a partir del gen EYA4 o la presencia o ausencia de ARNm que codifica un polipéptido EYA4.

Description

Procedimiento y ácidos nucleicos para el análisis de trastornos de proliferación de células colorrectales.

Campo de la invención

El cáncer colorrectal es la cuarta causa de mortalidad por cáncer en hombres y mujeres. La tasa de supervivencia a los 5 años es del 61% en todas las fases siendo la detección temprana un requisito indispensable para la terapia curativa de la enfermedad. Hasta el 95% de los cánceres colorrectales son adenocarcinomas con diferentes grados de diferenciación.

El cáncer de colon esporádico se desarrolla en un proceso de etapas múltiples que se inicia con la transformación patológica del epitelio del colon normal en un adenoma que consecutivamente progresa a cáncer invasivo. La velocidad de progresión de los adenomas de colon actualmente se predice basándose en su aspecto histológico, localización, grado de propagación y extensión de afectación del intestino. Por ejemplo, los adenomas benignos de tipo tubular raramente progresan a tumores malignos, mientras que los adenomas benignos vellosos, en particular si son mayores de 2 cm de diámetro, presentan un potencial maligno significativo.

Durante la progresión desde las lesiones proliferativas benignas hasta los neoplasmas malignos se sabe que se producen varias alteraciones genéticas y epigenéticas. La mutación somática del gen APC parece ser uno de los primeros eventos en el 75 - 80% de los adenomas y carcinomas colorrectales. Se cree que la activación de K-RAS es una etapa crítica en la progresión hacia un fenotipo maligno. Consecutivamente, se acumulan mutaciones en otros oncogenes así como alteraciones que provocan la inactivación de los genes supresores de tumores.

La metilación aberrante del ADN en las islas de CpG está entre las alteraciones más tempranas y más habituales en los cánceres humanos, produciendo una abrogación o hiperexpressión de un amplio espectro de genes. Además, se ha demostrado que la metilación anormal se produce en los elementos reguladores ricos en CpG en las partes intrónicas y codificantes de los genes de ciertos tumores. Al contrario que con la hipermetilación específica de los genes supresores de tumores, en las células tumorales puede observarse una hipometilación en conjunto del ADN. Este descenso en la metilación global puede detectarse de forma temprana, mucho antes de la formación de un tumor evidente. También, se ha reseñado la correlación entre la hipometilación y la mayor expresión génica para muchos oncogenes. En el cáncer de colon, la metilación aberrante del ADN constituye una de las alteraciones más destacadas e inactiva muchos genes supresores de tumores tales como p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2, y MINT31 y genes de reparación de los emparejamientos erróneos del ADN tales como hMLH1.

En la evolución molecular del cáncer colorrectal, se ha sugerido que los errores en la metilación del ADN desempeñan dos papeles definidos. En las células normales de la mucosa del colon, los errores de metilación se acumulan en función de la edad o de eventos que dependen del tiempo que predisponen a estas células a la transformación neoplásica. Por ejemplo, pudo demostrarse que la hipermetilación de varios locus estaba ya presente en los adenomas, en particular en los subtipos tubulovelloso y velloso. En fases posteriores, una mayor metilación del ADN de las islas de CpG desempeña un papel importante en un subconjunto de tumores afectados por el denominado fenotipo metilador de islas de CpG (CIMP). La mayoría de los tumores CIMP+, que constituye aproximadamente el 15% de todos los cánceres colorrectales esporádicos, se caracteriza por inestabilidad en los microsatélites (MIN) debida a la hipermetilación del promotor hMLH 1 y de otros genes de reparación de los emparejamientos erróneos en el ADN. Por el contrario, los cánceres de colon CIMP- evolucionan por una ruta de inestabilidad genética más clásica (CIN), con una tasa elevada de mutaciones en p53 y cambios cromosómicos.

Sin embargo, los subtipos moleculares no muestran únicamente frecuencias variables respecto a las alteraciones moleculares. De acuerdo con la presencia de inestabilidad en los microsatélites o de aberraciones cromosómicas, el cáncer de colon puede subclasificarse en dos clases, que también muestran diferencias significativas. Casi todos los tumores MIN se originan en el colon proximal (ascendente y transverso), mientras que el 70% de los tumores CIN está localizado en el colon distal y el recto. Esto se ha atribuido a la variada prevalencia de diferentes carcinógenos en diferentes secciones del colon. Se ha sugerido que los carcinógenos metilantes, que constituyen el carcinógeno prevalente en el colon proximal, desempeñan un papel en la patogénesis de los cánceres MIN, mientras que se cree que los tumores CIN son provocados más frecuentemente por carcinógenos que forman aductos, que se dan con más frecuencia en las partes distales del colon y el recto. Además, los tumores MIN presentan un mejor pronóstico que los tumores con un fenotipo CIN y responden mejor a la quimioterapia complementaria.

La identificación de los marcadores para la diferenciación del carcinoma de colon así como para la temprana detección es el objetivo principal de la investigación actual.

EYA4 es el miembro más recientemente identificado de la familia de genes Eya (ausencia de ojos en inglés) en vertebrados, un grupo de cuatro activadores de la transcripción que interactúan con otras proteínas en una jerarquía reguladora conservada para asegurar un desarrollo embriológico normal. El gen EYA4 se ha mapeado en 6q22.3 y codifica una proteína de 640 aminoácidos. La estructura de EYA4 se ajusta al patrón básico establecido por EYA 1-3, e incluye un extremo C muy conservado de 271 aminoácidos denominado región homóloga de eya (eyaHR; denominada alternativamente dominio eya o dominio de homología eya 1) y un dominio de transactivación más divergente rico en prolina-serina-treonina (PST) (34-41%) en el extremo N (Borsani G, y cols., EYA4, a novel vertebrate gen related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet enero de 1999; 8(1): 11-23). Las proteínas EYA interactúan con miembros de las familias de proteínas SIX y DACH durante el desarrollo embrionario temprano. Las mutaciones en el gen EYA4 son responsables de la pérdida auditiva autosómica dominante, progresiva y postlingual en el locus DFNA10 (Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 1 de febrero de 2001; 10(3): 195-200 con referencias adicionales).

Los documentos WO 0168912 y WO 0200926 describen la relación entre la metilación del EYA4 y el cáncer. Hiltunen y cols: "Hypermethylation of the wt1 and calcitonin gene promoter regions at chromosome 11 p in human cotorectal cancer" BRITISH JOURNAL OF CANCER, Londres, Vol. 76, n.º 9, 1997, páginas 1124-1130 describen la implicación de wt1 y la calcitonina en los trastornos proliferativos del colon.

La 5-metilcitosina es la modificación de base covalente más frecuente en el ADN de las células eucariotas. Por ejemplo, desempeña un papel en la regulación de la transcripción, en el sellado genético y en la oncogénesis. Por lo tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de la información genética es de considerable interés. Sin embargo, las posiciones de la 5-metilcitosina no pueden identificarse mediante secuenciación ya que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de emparejamiento que la citosina. Además, la información epigenética que porta 5-metilcitosina se pierde completamente durante la amplificación por PCR.

Un procedimiento relativamente nuevo y actualmente el de uso más frecuente para el análisis del ADN para determinar 5-metilcitosina se basa en la reacción específica de bisulfito con citosina que, tras la posterior hidrólisis alcalina, se convierte en uracilo que corresponde a timidina en su comportamiento de emparejamiento de bases. Sin embargo, la 5-metilcitosina no se modifica en estas condiciones. En consecuencia, el ADN original se convierte de tal forma que la metilcitosina, que originariamente no podía distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, puede detectarse ahora porque es la única citosina que queda usando técnicas biológicas moleculares "normales", por ejemplo, amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en el emparejamiento que ahora puede explotarse completamente. En términos de sensibilidad, la técnica anterior se define mediante un procedimiento que incluye el ADN a analizar en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con ADN monocatenario), y que sustituye todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 15 de diciembre de 1996; 24(24): 5064-6). Usando este procedimiento, es posible analizar células individuales, lo que ilustra el potencial del procedimiento. Sin embargo, actualmente sólo se analizan las regiones individuales de una longitud de hasta aproximadamente 3000 pares de bases, no es posible analizar de forma global las células para determinar miles de posibles eventos de metilación. Sin embargo, este procedimiento tampoco puede analizar de forma fiable fragmentos muy pequeños de cantidades de muestra pequeñas. Estas se pierden por la matriz a pesar de la protección contra la difusión.

Puede obtenerse una visión de conjunto de otros procedimientos conocidos para detectar 5-metilcitosina en el siguiente artículo recopilatorio: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Hasta la fecha, con pocas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A singletube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. Marzo-abril de 1997, 5 (2): 94-8) la técnica del bisulfito únicamente se usa en investigación. Sin embargo, siempre los fragmentos específicos cortos de un gen conocido se amplifican después de un tratamiento con bisulfito y o se secuencian completamente (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. Noviembre de 1997; 17 (3): 275-6) o se detectan las posiciones individuales de citosina mediante una reacción de extensión con cebadores (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 15 de junio de 1997; 25(12): 2529-31, documento WO 95/00669) o mediante digestión enzimática (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 15 de junio de 1997; 25(12): 25324). Además, también se ha descrito la detección mediante hibridación (Olek y cols., documento WO 99/28498).

Otras publicaciones que tratan del uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación en genes individuales son: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. Junio de 1994; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. Marzo de 1997; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 25 de febrero de 1994; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypo methylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 19 de mayo de 1995; 157(1-2): 261-4; documentos WO 97/46705 y WO 95/15373.

Puede obtenerse una visión de conjunto de la técnica anterior sobre la fabricación de matrices de oligómeros en una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Suplemento, Volumen 21, enero de 1999), publicada en enero de 1999, y en la bibliografía que se cita en ella.

Las sondas con marcadores fluorescentes se usan a menudo para el barrido de matrices de ADN inmovilizadas. La simple unión de los tintes Cy3 y Cy5 al 5' -OH de la sonda específica es particularmente adecuada para los marcadores fluorescentes. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede realizarse, por ejemplo, mediante un microscopio confocal. Los tintes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles comercialmente.

La espectrometría de masas con deserción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 15 de octubre de 1988; 60(20): 2299-301). Un analito se embebe en una matriz que absorbe la luz. La matriz se evapora mediante un pulso de láser corto transportando así la molécula de analito a la fase de vapor de forma no fragmentada. El analito se ioniza mediante colisiones con las moléculas de la matriz. La aplicación de un voltaje acelera los iones en un tubo de vuelo sin campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a velocidades diferentes. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los más grandes.

La espectrometría MALDI-TOF es perfectamente adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). La sensibilidad a los ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces peor que la de los péptidos y disminuye de forma no proporcional al aumentar el tamaño del fragmento. Para los ácidos nucleicos que tienen un esqueleto con múltiples cargas negativas, el proceso de ionización mediante matriz es considerablemente menos eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrado varias matrices que producen una cristalización muy fina. Actualmente existen varias matrices sensibles para el ADN, sin embargo, no se ha reducido la diferencia de sensibilidad. La diferencia de sensibilidad puede reducirse modificando químicamente el ADN de tal modo que se vuelve más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los que los fosfatos habituales del esqueleto se sustituyen por tiofosfatos, pueden convertirse en un ADN de carga neutra usando reacciones de alquilación simples (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 25 de abril de 1995; 23(8): 1367-73). El acoplamiento de un marcador con carga a este ADN modificado provoca un aumento de la sensibilidad al mismo nivel que el que se encuentra para los péptidos. Una ventaja adicional del marcado con cargas es la mayor estabilidad del análisis contra impurezas que hacen que la detección de los sustratos no modificados sea considerablemente más difícil.

El ADN genómico se obtiene de ADN de células, tejidos u otras muestras de prueba usando procedimientos estándar. Esta metodología estándar se encuentra en referencias tales como Sambrook, Fritsch y Maniatis editores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Descripción

La presente invención describe procedimientos novedosos para la detección de trastornos de proliferación celular. Dicha invención describe el uso del gen EYA4, así como de su promotor y de los elementos reguladores como marcadores de los trastornos proliferativos de las células de colon. De forma más específica, la materia descrita muestra la aplicabilidad de dicho gen a la detección de trastornos proliferativos de las células de colon, distinguiendo entre diferentes clases de trastornos proliferativos de las células de colon así como a la diferenciación entre los trastornos proliferativos de las células de colon y los trastornos de proliferación celular que se originan en otros tejidos.

En un aspecto de la invención, la materia descrita proporciona secuencias de ácidos nucleicos de utilidad para el análisis de la metilación en dicho gen, otros aspectos proporcionan usos novedosos del gen y el producto génico así como procedimientos, ensayos y kits dirigidos a detectar, diferenciar y distinguir trastornos proliferativos de las células de colon, así como procedimientos terapéuticos y diagnósticos de los mismos.

En una realización el procedimiento describe el uso del gen EYA4 como marcador para la diferenciación, detección y distinción de trastornos proliferativos de las células de colon. Dicho uso del gen puede posibilitarse por cualquier medio de análisis de la expresión del gen, mediante el análisis de la expresión de ARNm o mediante el análisis de la expresión de proteínas. Sin embargo, en la realización más preferida de la invención, la detección, diferenciación y distinción de trastornos proliferativos de las células de colon se posibilita mediante el análisis del estado de metilación del gen EYA4 y su promotor o elementos reguladores.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica EYA4 en un sistema de detección para el cáncer de colon, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser una muestra de biopsia de tejidos o una muestra de sangre, plasma, suero o similares. La muestra puede tratarse para extraer los ácidos nucleicos contenidos en ella. El ácido nucleico resultante de la muestra se somete a electroforesis en gel u otras técnicas de separación. La detección implica poner en contacto los ácidos nucleicos y en particular el ARNm de la muestra con una secuencia de ADN que sirve de sonda para formar cadenas dobles híbridas. Lo estricto de la hibridación se en base a un número de factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen la temperatura, potencia iónica, cantidad de tiempo y concentración de formamida. Estos factores se enumeran, por ejemplo, en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989). La detección de la cadena doble resultante habitualmente se logra mediante el uso de sondas marcadas. De forma alternativa, la sonda puede no estar marcada, pero puede detectarse por la unión específica con un ligando que está marcado, ya sea de forma directa o indirecta. Los marcadores y procedimientos de marcado de sondas y ligandos apropiados son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos que pueden incorporarse mediante procedimientos conocidos (por ejemplo, traducción de nicks o digestión con cinasas), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (por ejemplo, dioxetanos, en particular los dioxetanos activables), enzimas, anticuerpos, y similares.

Para aumentar la sensibilidad de la detección en una muestra de ARNm que codifica EYA4, puede emplearse la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa previa transcripción inversa para amplificar el ADNc trascrito a partir de ARNm que codifica EYA4. El procedimiento de la transcripción inversa /PCR es notorio en la técnica (por ejemplo, véase Watson y Fleming, referencia anterior).

El procedimiento de transcripción inversa /PCR puede realizarse de la forma siguiente. El ARN celular total se aísla, por ejemplo, mediante el procedimiento estándar con isotiocianato de guanidio y el ARN total se transcribe inversamente. El procedimiento de transcripción inversa implica la síntesis de ADN con una plantilla de ARN usando una enzima transcriptasa inversa y un cebador del extremo 3'. Habitualmente, el cebador contiene una secuencia de oligo(dT). El ADNc así producido se amplifica después usando el procedimiento de la PCR y cebadores específicos de EYA4. (Belyavsky y cols., Nucl Acid Res 17: 2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, páginas 316-325, 1987).

La presente invención también puede describirse en ciertas realizaciones como un kit para usar en la detección de un estado de enfermedad de cáncer de colon analizando una muestra biológica. Un kit representativo puede comprender uno o más segmentos de ácido nucleico tal como se describe anteriormente que se hibrida selectivamente al ARNm de EYA4 y un envase para cada uno de los uno o más segmentos de ácido nucleico. En ciertas realizaciones los segmentos de ácido nucleico también pueden combinarse en un único tubo. En realizaciones adicionales, los segmentos de ácido nucleico también pueden incluir un par de cebadores para amplificar el ARNm diana. Dichos kits también pueden incluir cualesquiera tampones, soluciones, disolventes, enzimas, nucleótidos, u otros componentes para las reacciones de hibridación, amplificación o detección. Los componentes preferidos para el kit incluyen reactivos para la PCR previa transcripción inversa, hibridación in situ, análisis de Northern y/o RPA.

La presente invención proporciona además procedimientos para detectar la presencia del polipéptido EYA4, en una muestra obtenida en un paciente. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar proteínas. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación inmunodifusión, inmunoelectroforesis, procedimientos inmunoquímicos, ensayos de enlazador y ligando, técnicas inmunohistoquímicas, aglutinación y ensayos complementarios (véase por ejemplo Basic and Clinical Immunology, Sites y Terr, editores, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. páginas 217-262, 1991). Se prefieren los procedimientos de inmunoensayo mediante enlazador y ligando que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con un epítopo o epítopos de EYA4 y desplazar competitivamente una proteína EYA4 marcada o derivada de la misma.

Ciertas realizaciones de la presente invención comprenden el uso de anticuerpos específicos contra el polipéptido codificado por el gen EYA4. Dichos anticuerpos pueden ser de utilidad para aplicaciones de diagnóstico y pronóstico para detectar el estado de enfermedad, comparando los niveles de expresión de marcadores de la enfermedad de colon de un paciente con la expresión de los mismos marcadores en individuos normales. En ciertas realizaciones puede inducirse la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales mediante el uso del polipéptido EYA4 como antígeno. Dichos anticuerpos a su vez pueden usarse para detectar las proteínas expresadas como marcadores para los estados de enfermedad humanos. Los niveles de dichas proteínas presentes en la sangre periférica o en una muestra de tejido de próstata de un paciente pueden cuantificarse mediante procedimientos convencionales. La unión entre anticuerpo y proteína puede detectarse y cuantificarse por varios medios conocidos en la técnica, tales como marcado con ligandos fluorescentes o radioactivos. La invención comprende además kits para realizar los procedimientos mencionados anteriormente, en los que dichos kits contienen anticuerpos específicos los polipéptidos EYA4.

En la técnica se conocen numerosos inmunoensayos de unión de proteínas competitivos y no competitivos. Los anticuerpos que se emplean en dichos ensayos pueden no estar marcados, por ejemplo tales como los que se usan en pruebas de aglutinación, o estar marcados para usar en una amplia variedad de procedimientos de ensayo. Los marcadores que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, tintes y similares para usar en un radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares. Los anticuerpos policlonales o monoclonales contra EYA4 o un epítopo del mismo pueden prepararse para usar en inmunoensayos mediante cualquiera de un número de procedimientos conocidos en la técnica. Una estrategia para preparar anticuerpos contra una proteína es seleccionar y preparar una secuencia de aminoácidos de toda o parte de la proteína, sintetizar químicamente la secuencia e inyectarla en un animal apropiado, habitualmente un conejo o un ratón (Milstein y Kohler Nature 256: 495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73: 1-46, Langone and Banatis editores, Academic Press, 1981). Los procedimientos para la preparación de EYA4 o de un epítopo del mismo incluyen, pero sin limitación síntesis química, técnicas de recombinación de ADN o aislamiento de muestras biológicas.

La invención proporciona mejoras significativas a la técnica porque actualmente no existen marcadores para detectar el cáncer de colon en muestras de fluidos corporales. Los procedimientos que actualmente se usan para detectar y diagnosticar los trastornos proliferativos de las células de colon incluyen colonoscopia, sigmoidoscopia, y cáncer de colon por sangre oculta en las heces. Comparada con estos procedimientos, la invención que se describe es mucho menos invasiva que la colonoscopia e igual de sensible, sino más, que la sigmoidoscopia y el FOBT. Comparada con las descripciones anteriores de estos marcadores de la bibliografía, la invención que se describe proporciona ventajas significativas en lo que se refiere a sensibilidad y especificidad debido a la ventajosa combinación usando técnicas de ensayo muy sensibles.

El objetivo de la invención puede lograrse analizando el estado de metilación de los dinucleótidos CpG en la secuencia genómica de acuerdo con la SEC ID N.º: 1 y las secuencias complementarias a la misma. La SEC ID N.º: 1 describe el gen EYA4 y su promotor y elementos reguladores, donde dicho fragmento comprende los dinucleótidos CpG que muestran un patrón de metilación específico de la enfermedad. El patrón de metilación del gen EYA4 y su promotor y elementos reguladores no se habían analizado hasta la fecha con respecto a los trastornos de proliferación celular. Debido a la degeneración del código genético, la secuencia que se identifica en la SEC ID N.º: 1 debería interpretarse como que incluye todas las secuencias sustancialmente similares y equivalentes aguas arriba de la región del promotor de un gen que codifica un polipéptido con la actividad biológica del que codifica EYA4.

En una realización preferida del procedimiento, el objetivo de la invención se logra analizando un ácido nucleico que comprende una secuencia de al menos 18 bases de longitud de acuerdo con una de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y las secuencias complementarias a las mismas.

Las secuencias de las SEC ID N.º: 2 a 5 proporcionan versiones modificadas del ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID N.º: 1, donde la conversión de dicha secuencia produce la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y diferente de la de la SEC ID N.º: 1 de la forma siguiente (véase también la siguiente Tabla 1): la SEC ID N.º: 1 es la hebra de ADN codificante del gen EYA4 y su promotor y elementos reguladores; la SEC ID N.º: 2 es la SEC ID N.º: 1 convertida, en la que "C" se ha convertido en "T," pero "cp." sigue siendo "cp." (es decir, corresponde a un caso en el que, para la SEC ID N.º: 1, todos los restos "C" de las secuencias de dinucleótidos cpo están metilados y por lo tanto no se convierten); la SEC ID N.º: 3 es la complementaria de la SEC ID N.º: 1, en la que "C" se ha convertido en "T," pero "cp." sigue siendo "cp." (es decir, corresponde a un caso en el que, para la hebra complementaria (hebra no codificante) de la SEC ID N.º: 1, todos los restos "C" de las secuencias de dinucleótidos cpo están metilados y por ello no se convierten); la SEC ID N.º: 4, es la SEC ID N.º: 1 convertida, en la que "C" se ha eliminado de todos los restos "C", incluidos los de las secuencias de dinucleótidos "cp." (es decir, corresponde a un caso en el que, para la SEC ID N.º: 1, todos los restos "C" de las secuencias de dinucleótidos cpo, no están metilados); la SEC ID N.º: 5 es la complementaria de la SEC ID N.º: 1, en la que "C" se ha eliminado para todos los restos "C", incluidos los de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde a un caso en el que, para la hebra complementaria (hebra no codificante) de la SEC ID N.º: 1, todos los restos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG no están metilados).

TABLA 1 Descripción de las SEC ID N.º: 1 a 5

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De forma significativa, hasta la fecha, las secuencias de ácidos nucleicos y las moléculas de acuerdo con la SEC ID N.º: 1 a la SEC ID N.º: 5 no habían sido implicadas ni se había encontrado conexión con la determinación de trastornos proliferativos de las células de colon.

La invención descrita revela además un oligonucleótido u oligómero para detectar el estado de metilación de las citosinas en el ADN pretratado, de acuerdo con la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5. Dicho oligonucleótido u oligómero comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud al menos nueve (9) nucleótidos que se hibrida, en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas (tal como se definen anteriormente), a una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y/o secuencias complementarias a ellas.

Así, la presente invención incluye moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de oligonucleótidos y de ácido nucleico peptídico (PNA) (oligómeros de PNA)) que se hibridan en condiciones de hibridación moderadamente estrictas y/o estrictas a todas o a parte de las secuencias de las SEC ID N.º: 2 a 5, o a las complementarias de las mismas. La porción que se hibrida de los ácidos nucleicos que se hibridan habitualmente es de al menos 9, 15, 20, 25, 30 ó 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas tienen utilidad inventiva, y por lo tanto están dentro del alcance de la presente invención.

Preferiblemente, la porción que se hibrida de los ácidos nucleicos que se hibridan de la invención es idéntica en al menos un 95%, o al menos un 98%, o un 100% a la secuencia, o a una porción de la misma de las SEC ID N.º: 2 a 5, o a las complementarias de las mismas.

Los ácidos nucleicos que se hibridan del tipo que se describe en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, como cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o cebador de diagnóstico y/o pronóstico. Preferiblemente, la hibridación de la sonda oligonucleotídica a una muestra de ácido nucleico se realiza en condiciones estrictas y la sonda es 100% idéntica a la secuencia diana. La estabilidad de la molécula bicatenaria o híbrido de ácido nucleico se expresa en términos de la temperatura de fusión o Tm, que es la temperatura a la que la sonda se disocia de un ADN diana. Esta temperatura de fusión se usa para definir las condiciones estrictas necesarias.

Para las secuencias diana que están relacionadas y son sustancialmente idénticas a las de la secuencia correspondiente de la SEC ID N.º: 1 (tales como variantes alélicas y SNP de EYA41), en lugar de idénticas, es de utilidad establecer primero la menor temperatura a la que se produce sólo una hibridación homóloga con una concentración particular de sal (por ejemplo, SSC o SSPE). Después, asumiendo que un 1% de emparejamiento incorrecto provoca un descenso de 1ºC de la Tm, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce en consecuencia (por ejemplo, si se buscan secuencias que tengan una identidad > 95% con la sonda, la temperatura del lavado final disminuye en 5ºC). En la práctica, el cambio de la Tm puede estar entre 0,5ºC y 1,5ºC por cada 1% de emparejamiento incorrecto.

Los ejemplos de oligonucleótidos de la invención de longitud X (en nucleótidos), que como indican las posiciones de los polinucleótidos con respecto, por ejemplo, a la SEC ID N.º: 1, incluyen los que corresponden a conjuntos de oligonucleótidos que se superponen consecutivamente de longitud X, en los que los oligonucleótidos de cada conjunto que se superpone consecutivamente (que corresponde a un valor de X dado) se definen como el conjunto finito de oligonucleótidos Z con las posiciones de los nucleótidos:

n a (n + (X-1));

donde n = 1, 2, 3, ... (Y-(X-1));

donde Y es igual a la longitud (nucleótidos o pares de bases) de la SEC ID N.º: 1;

donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido del conjunto (por ejemplo X = 20 para un conjunto de 20-meros que se superponen consecutivamente); y

donde el número (Z) de oligómeros que se superponen consecutivamente de longitud X para una SEC ID N.º dada de longitud Y es igual a Y-(X-1). Por ejemplo Z = 2,785-19 = 2,766 ya sea para conjuntos codificantes o no codificantes de la SEC ID N.º: 1, donde X = 20.

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Preferiblemente, el conjunto se limita a aquellos oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

La presente invención engloba para cada una de las SEC ID N.º: 2 a 5 (codificante y no codificante), múltiples conjuntos de oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados que se superponen consecutivamente de longitud X, donde por ejemplo, X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 ó 35 nucleótidos.

Los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con la presente invención constituyen herramientas eficaces de utilidad para establecer los parámetros genéticos y epigenéticos de la secuencia genómica que corresponde a la SEC ID N.º: 1. Los conjuntos preferidos de dichos oligonucleótidos o de oligonucleótidos modificados de longitud X son los conjuntos de oligómeros que se superponen consecutivamente que corresponden a las SEC ID N.º: 1-5 (y a las complementarias de la misma). Preferiblemente, dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. En esos conjuntos preferidos se incluyen los oligómeros preferidos que corresponden a las SEC ID N.º: 11 a SEC ID N.º: 15.

Los oligonucleótidos u oligómeros particularmente preferidos de acuerdo con la presente invención son aquellos en los que la citosina de las secuencias de dinucleótidos CpG (o de los dinucleótidos TpG o CpA convertidos correspondientes) están en el tercio medio del oligonucleótido; es decir, cuando el oligonucleótido, por ejemplo, tiene 13 bases de longitud, el dinucleótido CpG, TpG o CpA está situado entre los nucleótidos cinco a nueve del extremo 5'.

Los oligonucleótidos de la invención también pueden modificarse enlazando químicamente el oligonucleótido a uno o más restos o conjugados para potenciar la actividad, estabilidad o detección del oligonucleótido. Dichos restos o conjugados incluyen cromóforos, fluoróforos. Los lípidos tales como colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol, (PEG), restos de palmitilo y otros se describen por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos número 5.514.758, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.597.696 y 5.958.773. Las sondas también pueden existir en forma de un PNA (ácido nucleico peptídico) que tiene propiedades de emparejamiento particularmente preferidas. Así, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos, y puede incluir agentes de escisión activados por la hibridación (Krol y cols. BioTechniques 6: 958-976, 1988) o agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988). Con este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un cromóforo, fluoróforo, péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etc.

El oligonucleótido también puede comprender al menos un resto de azúcar y/o base modificados reconocidos en la técnica, o pueden comprender un esqueleto modificado o enlace internucleosídico no natural.

Los oligómeros de acuerdo con la presente invención se usan normalmente en los denominados "conjuntos" que contienen al menos un oligómero para el análisis de cada uno de los dinucleótidos CpG de una secuencia genómica que comprende la SEC ID N.º: 1 y las secuencias complementarias de la misma o su dinucleótido CG, TG o CA correspondiente dentro de los ácidos nucleicos pretratados de acuerdo con la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y las secuencias complementarias a las mismas. Se prefiere un conjunto que contiene al menos un oligómero para cada uno de los dinucleótidos CpG del gen EYA4 y su promotor y elementos reguladores tanto en la versión pretratada como genómica de dicho gen, las SEC ID N.º: 2 a 5 y la SEC ID N.º: 1, respectivamente. Sin embargo, se anticipa que por factores económicos u otros puede ser preferible analizar una selección limitada de los dinucleótidos CpG de dichas secuencias y el contenido del conjunto de oligonucleótidos debería alterarse en consecuencia. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a un conjunto al menos 3 n (oligonucleótidos y/o PNA-oligómeros) que se usan para detectar el estado de metilación de las citosinas en ADN genómico pretratado (SEC ID N.º: 2 a SEC ID N.º: 5 y las secuencias complementarias a las mismas) y ADN genómico (SEC ID N.º: 1 y secuencias complementarias a la misma). Estas sondas posibilitan el diagnóstico y/o el tratamiento de los parámetros genéticos y epigenéticos de trastornos de proliferación celular. El conjunto de oligómeros también puede usarse para detectar polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en ADN genómico pretratado (SEC ID N.º: 2 a SEC ID N.º: 5, y secuencias complementarias a las mismas ) y ADN genómico (SEC ID N.º: 1 y secuencias complementarias a la misma).

Además, la presente invención pone a disposición un conjunto de al menos dos oligonucleótidos que pueden usarse como lo que se denomina "cebadores oligonucleotídicos" para amplificar secuencias de ADN de una de las SEC ID N.º: 1 a SEC ID N.º: 5 y secuencias complementarias a las mismas, o segmentos de las mismas.

En el caso de los conjuntos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, se prefiere que al menos uno y más preferiblemente todos los miembros del conjunto de oligonucleótidos estén unidos a una fase sólida.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que una micromatriz de diferentes oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA (denominada "matriz") puestos a disposición por la presente invención esté presente de forma que estén también unidos a una fase sólida. Esta matriz de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/o oligómeros PNA puede caracterizarse porque su distribución en la fase sólida esté en forma de una retícula rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida preferiblemente está compuesta por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. Sin embargo, también puede usarse nitrocelulosa así como plásticos tales como nylon que pueden existir en forma de glóbulos o también en forma de matrices de resina.

Por lo tanto, un objetivo adicional de la presente invención es un procedimiento para fabricar una matriz fijada sobre un material transportador para el análisis relacionado con trastornos de proliferación celular, procedimiento en el que al menos un oligómero de acuerdo con la presente invención está acoplado a una fase sólida. Los procedimientos para fabricar dichas matrices se conocen, por ejemplo, a partir de la patente de Estados Unidos 5.744.305 mediante reacciones químicas en fase sólida y grupos protectores fotolábiles.

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere a un microchip de ADN para el análisis de trastornos de proliferación celular. Los microchips de ADN son chips que se conocen, por ejemplo, a partir de la patente de Estados Unidos 5.837.832.

La invención que se describe proporciona además una composición de materia de utilidad para detectar, diferenciar y distinguir entre los trastornos proliferativos de las células de colon. Dicha composición que comprende al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico que se describe en las SEC ID N.º: 2 a 5, y una o más sustancias que se toman del grupo que comprende:

cloruro de magnesio 1-5 mM, dNTP 100-500 \muM, 0,5-5 unidades de taq polimerasa, albúmina de suero bovina, un oligómero en particular un oligonucleótido o un oligómero de ácido nucleico peptídico PNA, comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria, o se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas a un ADN genómico pretratado de acuerdo con una de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y secuencias complementarias a las mismas. Se prefiere que dicha composición de materia comprenda una solución tampón apropiada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que permita reacciones basadas en la polimerasa en dicha solución. Los tampones apropiados son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

La presente invención proporciona además un procedimiento para realizar un ensayo para determinar los parámetros genéticos y/o epigenéticos del gen EYA4 y su promotor y elementos reguladores. Lo más preferiblemente, el ensayo de acuerdo con el siguiente procedimiento se usa para detectar la metilación en el gen EYA4 en el que dichos ácidos nucleicos metilados están presentes en una solución que además comprende un exceso de ADN de fondo, en el que el ADN de fondo está presente de 100 a 1000 veces la concentración del ADN a detectar. Dicho procedimiento que comprende poner en contacto una muestra de ácido nucleico obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos, en el que dicho reactivo o series de reactivos, distingue entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados en el ácido nucleico diana.

Preferiblemente, dicho procedimiento comprende las siguientes etapas: en la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, preferiblemente, la fuente de la muestra se selecciona del grupo que consiste en cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, plasma, suero, heces, orina, sangre, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la fuente es biopsias, fluidos corporales, orina, o sangre.

Después se aísla el ADN de la muestra. La extracción puede realizarse por medios que son estándar para una persona de experiencia en la técnica, que incluyen el uso de lisados con detergente, ultrasonidos y agitación en vórtice con perlas de vidrio. Una vez se han extraído los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

En la segunda etapa del procedimiento, la muestra de ADN genómico se trata de tal forma que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Esto se entenderá como "pretratamiento" en el presente documento.

El tratamiento del ADN genómico descrito anteriormente preferiblemente se realiza con bisulfito (hidrogenosulfito, disulfito) y posterior hidrólisis alcalina que provoca una conversión de las nucleobases de citosina no metiladas a uracilo o a otra base que es diferente de citosina en términos de comportamiento de emparejamiento. El ADN a analizar se incluye en una matriz de agarosa, previniendo de ese modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con ADN monocatenario), y se sustituyen todas las etapas de precipitación y purificación por diálisis rápida (Olek A, y cols., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24: 5064-6, 1996). Se prefiere además que el tratamiento con bisulfito se realice en presencia de una trampa de radicales o de un agente desnaturalizador de ADN.

En la tercera etapa del procedimiento, se amplifican los fragmentos del ADN pretratado. Cuando la fuente del ADN es ADN libre proveniente de suero, o ADN que se extrae de parafina se prefiere particularmente que el tamaño del fragmento amplificado esté entre 100 y 200 pares de bases de longitud, y cuando dicha fuente de ADN se extraiga de fuentes celulares (por ejemplo tejidos, biopsias, líneas celulares) se prefiere que el amplificado esté entre 100 y 350 pares de bases de longitud. Se prefiere particularmente que dichos amplificados comprendan al menos una secuencia de 20 pares de bases que comprenda al menos tres dinucleótidos CpG. Dicha amplificación se realiza usando conjuntos de cebadores oligonucleotídicos de acuerdo con la presente invención, y preferiblemente una polimerasa termoestable. La amplificación de varios segmentos de ADN puede realizarse de forma simultánea en un recipiente de reacción único, en una realización del procedimiento preferiblemente se amplifican de forma simultánea seis o más fragmentos. Habitualmente, la amplificación se realiza usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El conjunto de cebadores oligonucleotídicos incluye al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una complementaria inversa, idéntica o se hibrida en condiciones estrictas o muy estrictas a un segmento de al menos 18 pares de bases de longitud de las secuencias de bases de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y las secuencias complementarias a las mismas.

En una realización alternativa del procedimiento, el estado de metilación de las posiciones de CpG preseleccionadas de las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 puede detectarse usando cebadores oligonucleotídicos específicos para la metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la patente de Estados Unidos n.º 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite diferenciar entre los ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que se hibrida a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. Los cebadores de MSP específicos para el ADN no metilado contienen una "T" en la posición 3' de la posición C del CpG. Preferiblemente, por lo tanto, es necesario que la secuencia de bases de dichos cebadores comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 18 nucleótidos que se hibrida a una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y secuencias complementarias a las mismas, en las que la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. En esta realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se prefiere particularmente que los cebadores de MSP comprendan entre 2 y 4 dinucleótidos CpG, TpG o CpA. Se prefiere además que dichos dinucleótidos estén situados en la mitad 3' del cebador por ejemplo cuando un cebador tiene 18 bases de longitud los dinucleótidos especificados están situados en las primeras 9 bases a partir del extremo 3' de la molécula. Además de los dinucleótidos CpG, TpG o CpA se prefiere también que dichos cebadores comprendan además varias bases convertidas mediante bisulfito (es decir citosina convertida en timina, o en la hebra que se hibrida, guanina convertida en adenosina). En una realización preferida adicional dichos cebadores se diseñan de forma que comprendan no más de 2 bases de citosina o guanina.

En una realización del procedimiento, los cebadores pueden seleccionarse a partir del grupo que consiste en las SEC ID N.º: 6 a SEC ID N.º: 10.

Los fragmentos que se obtienen mediante la amplificación pueden portar un marcador detectable de forma directa o indirecta. Se prefieren los marcadores que son marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas escindibles que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores másicos, se prefiere que los amplificados marcados tengan una única carga neta positiva o negativa, que permite una mejor detección en el espectrómetro de masas. La detección puede realizarse y visualizarse mediante, por ejemplo, espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) o usando espectrometría de masas por electrospray (IES).

La espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI- TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas y Hillenkamp, Anal Chem., 60: 2299-301, 1988). Un analito se embebe en una matriz que absorbe la luz. La matriz se evapora mediante un pulso de láser corto transportando así la molécula de analito a la fase de vapor de forma no fragmentada. El analito se ioniza mediante colisiones con las moléculas de la matriz. La aplicación de un voltaje acelera los iones en un tubo de vuelo sin campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a velocidades diferentes. Los iones más pequeños alcanzan el detector más pronto que los más grandes. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1 :147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor que para los péptidos, y disminuye de forma no proporcional al aumentar el tamaño del fragmento. Además, para los ácidos nucleicos que tienen un esqueleto con múltiples cargas negativas, el proceso de ionización mediante la matriz es considerablemente menos eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrado varias matrices que producen una cristalización muy fina. Actualmente existen varias matrices sensibles para el ADN, sin embargo, no se ha reducido la diferencia de sensibilidad entre los péptidos y los ácidos nucleicos. Esta diferencia de sensibilidad puede reducirse, sin embargo, modificando químicamente el ADN de tal modo que se vuelva más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los que los fosfatos habituales del esqueleto se sustituyen por tiofosfatos, pueden convertirse en un ADN con carga neutra usando reacciones de alquilación simples (Gut & Beck, Nucleic Acid Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de un marcador con carga a este ADN modificado provoca un aumento de la sensibilidad de MALDI-TOF al mismo nivel que el que se encuentra para los péptidos. Una ventaja adicional del marcado con cargas es la mayor estabilidad del análisis contra impurezas que hacen la detección de los sustratos no modificados considerablemente más difícil.

En una realización particularmente preferida del procedimiento, la amplificación de la etapa tres se realiza en presencia de al menos una especie de oligonucleótidos bloqueantes. El uso de dichos oligonucleótidos bloqueantes ha sido descrito por Yu y cols., Biotechniques 23: 714-720, 1997. El uso de oligonucleótidos bloqueantes posibilita una mejor especificidad de la amplificación de una subpoblación de ácidos nucleicos. Las sondas bloqueantes hibridadas a un ácido nucleico suprimen, o dificultan la amplificación mediada por polimerasa de dicho ácido nucleico. En una realización del procedimiento, los oligonucleótidos bloqueantes se diseñan para que se hibriden al ADN de fondo. En otra realización del procedimiento, dichos oligonucleótidos se diseñan para que dificulten o supriman la amplificación de ácidos nucleicos no metilados en vez de los ácidos nucleicos metilados o viceversa.

Los oligonucleótidos de las sondas bloqueantes se hibridan al ácido nucleico tratado con bisulfito de forma concurrente a los cebadores de la PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda bloqueante, de tal forma que la amplificación de un ácido nucleico se suprime donde están presentes las secuencias complementarias de la sonda bloqueante. Las sondas pueden diseñarse para hibridarse al ácido nucleico tratado con bisulfito de una forma específica del estado de metilación. Por ejemplo, para la detección de los ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión podría realizarse mediante el uso de sondas bloqueantes que comprenden un "lpG" en la posición en cuestión, en vez de un "CpG": en una realización del procedimiento la secuencia de dichos oligonucleótidos bloqueantes debería ser idéntica o complementaria a una molécula que es complementaria o idéntica a una secuencia de al menos 18 pares de bases de longitud que se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID N.º: 2 a 5, que preferiblemente comprende uno o más dinucleótidos CpG, TpG o CpA. En una realización del procedimiento, la secuencia de dichos oligonucleótidos se selecciona del grupo constituido por la SEC ID N.º: 15 y la SEC ID N.º: 16 y secuencias complementarias a las mismas.

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Para los procedimientos de PCR usando oligonucleótidos bloqueantes, la alteración eficaz de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueantes no sean elongados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se logra usando bloqueantes que son 3'-desoxioligonucleótidos u oligonucleótidos derivatizados en la posición 3' con un grupo distinto de un hidroxilo libre. Por ejemplo, los oligonucleótidos 3'-O-acetilo son representativos de una clase preferida de molécula bloqueante.

Además, debería excluirse la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueantes. Preferiblemente, dicha exclusión comprende o bien el uso de una polimerasa que carece de la actividad de 5' a 3', o el uso de oligonucleótidos bloqueantes modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en los extremos 5' de los mismos que hacen que la molécula de bloqueante sea resistente a nucleasas. Las aplicaciones particulares pueden no requerir dichas modificaciones en 5' del bloqueante. Por ejemplo, si los sitios de unión del bloqueante y cebador se superponen, excluyendo de ese modo la unión del cebador (por ejemplo, con un exceso de bloqueante), la degradación del oligonucleótido bloqueante se excluirá de forma sustancial. Esto es debido a que la polimerasa no extenderá el cebador hacia y a través (en la dirección 5'-3') del bloqueante - un proceso que normalmente provoca la degradación del oligonucleótido bloqueante hibridado.

Una realización particularmente preferida de bloqueante/PCR, para los fines de la presente invención y tal y como se implementa en el presente documento, comprende el uso de oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) como oligonucleótidos bloqueantes. Dichos PNA bloqueantes son perfectamente adecuados, porque ni se descomponen ni son extendidos por la polimerasa.

En una realización del procedimiento, el sitio de unión del oligonucleótido bloqueante es idéntico, o está superpuesto al del cebador y de ese modo impide la hibridación del cebador a su sitio de unión. En una realización del procedimiento preferida adicional, se usan dos o más de dichos oligonucleótidos bloqueantes. En una realización particularmente preferida, la hibridación de uno de los oligonucleótidos bloqueantes impide la hibridación de un cebador directo, y la hibridación de otro de los oligonucleótidos de sonda (bloqueante) impide la hibridación de un cebador inverso que se une al producto amplificado de dicho cebador directo.

En una realización alternativa del procedimiento, el oligonucleótido bloqueante se hibrida a un lugar entre las posiciones de los cebadores inverso y directo del ADN de fondo tratado, dificultando de ese modo la elongación de los cebadores oligonucleotídicos.

Se prefiere particularmente que los oligonucleótidos bloqueantes estén presentes en una concentración de al menos 5 veces la de los cebadores.

En la cuarta etapa del procedimiento, los amplificados obtenidos durante la tercera etapa del procedimiento se analizan para poder establecer el estado de metilación de los dinucleótidos CpG antes del tratamiento.

En realizaciones donde los amplificados se obtienen mediante amplificación por MSP y/u oligonucleótidos bloqueantes, la presencia o ausencia de un amplificado es en sí misma indicativa del estado de metilación de las posiciones CpG que cubren los cebadores y/o el oligonucleótido bloqueante, de acuerdo con las secuencias de bases de los mismos. Para esta detección pueden usarse todos los procedimientos biológicos moleculares conocidos, que incluyen, pero sin limitación, electroforesis en gel, secuenciación, cromatografía de líquidos, hibridaciones, análisis por PCR en tiempo real o combinaciones de los mismos. Esta etapa del procedimiento actúa además como un control cualitativo de las etapas precedentes.

En la cuarta etapa del procedimiento los amplificados obtenidos mediante PCR tanto estándar como específica se analizan adicionalmente para determinar el estado de metilación de CpG del ADN genómico aislado en la primera etapa del procedimiento. Esto puede realizarse mediante procedimientos basados en bases tales como, pero sin limitación, tecnología de matrices y tecnologías basadas en sondas así como mediante técnicas tales como secuenciación y extensión dirigida por plantillas.

En una realización del procedimiento, los amplificados que se sintetizan en la etapa tres se hibridan posteriormente en una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de PNA. En este contexto, la hibridación se produce del siguiente modo: el conjunto de sondas que se usa para la hibridación preferiblemente está compuesto por al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros PNA; en el proceso, los amplificados sirven de sondas que se hibridan a los oligonucleótidos previamente unidos a una fase sólida; los fragmentos no hibridados se eliminan posteriormente; dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases que se especifican en la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5; y el segmento comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

En una realización preferida, dicho dinucleótido está presente en el tercio central del oligómero. Por ejemplo, cuando el oligómero comprende un dinucleótido CpG, dicho dinucleótido es preferiblemente del quinto al noveno nucleótido a partir del extremo 5' de un 13-mero. Existe un oligonucleótido para el análisis de cada dinucleótido CpG dentro de la secuencia de acuerdo con la SEC ID N.º: 1, y las posiciones equivalentes dentro de las SEC ID N.º: 2 a 5. Dichos oligonucleótidos también pueden estar presentes en forma de ácidos nucleicos peptídicos. Los amplificados no hibridados se eliminan después. Los amplificados hibridados se detectan. En este contexto, se prefiere que los marcadores unidos a los amplificados puedan identificarse en cada posición de la fase sólida en la que se localiza una secuencia oligonucleotídica.

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Todavía en una realización adicional del procedimiento, puede determinarse el estado de metilación genómico de las posiciones CpG mediante sondas oligonucleotídicas que se hibridan al ADN tratado con bisulfito de forma concurrente con los cebadores de amplificación de la PCR (donde dichos cebadores pueden ser específicos de metilación o estándar).

Una realización particularmente preferida de este procedimiento es el uso de PCR cuantitativa en tiempo real con base fluorescente (Heid y cols., Genome Res. 6: 986-994, 1996; véase también la patente de Estados Unidos n.º 6.331.393). Hay dos realizaciones preferidas para utilizar este procedimiento. Una realización, que se conoce como el ensayo TaqMan^{TM} emplea una sonda oligonucleotídica fluorescente con marcado dual. La reacción por PCR TaqMan^{TM} emplea el uso de un oligonucleótido no extensible interrogante, que se denomina sonda TaqMan^{TM}, que está diseñada para hibridarse con una secuencia rica en GpC localizada entre los cebadores de amplificación directo e inverso. La sonda TaqMan^{TM} comprende además un "resto testigo" fluorescente y un "resto inactivador" unidos covalentemente a restos de enlace (por ejemplo, fosforamiditas) unidas a los nucleótidos del oligonucleótido TaqMan^{TM}. Las sondas hibridadas son desplazadas y descompuestas por la polimerasa de la reacción de amplificación que produce de ese modo un aumento de la fluorescencia. Para el análisis de la metilación de los ácidos nucleicos posterior al tratamiento con bisulfito, es necesario que la sonda de metilación sea específica, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 6.331.393, también conocida como ensayo MethylLight. La segunda realización preferida de esta tecnología es el uso de tecnología de doble sonda (Light-cycler®), cada una de las cuales porta restos donantes o receptores fluorescentes, donde la hibridación de las dos sondas cerca la una de la otra es indicada por un aumento de los cebadores de amplificación fluorescentes. Ambas técnicas pueden adaptarse de una forma adecuada para usar con ADN tratado con bisulfito, y además para el análisis de la metilación en los dinucleótidos CpG.

En una realización preferida adicional del procedimiento, la cuarta etapa del procedimiento comprende el uso de la extensión de oligonucleótidos dirigida mediante plantillas, tal como MS-SNuPE como describen Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997. En dicha realización se prefiere que el cebador Ms-SNuPE sea idéntico o complementario a una secuencia de al menos nueve pero preferiblemente no más de veinticinco nucleótidos de longitud de una o más de las secuencias que se toman del grupo de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5.

Todavía en una realización adicional del procedimiento, la cuarta etapa del procedimiento comprende la secuenciación y posterior análisis de la secuencia del amplificado generado en la tercera etapa del procedimiento (Sanger F. y cols., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467, 1977).

Realizaciones adicionales de la invención proporcionan un procedimiento para el análisis del estado de metilación de ADN genómico de acuerdo con la invención (SEC ID N.º: 1) sin necesidad de pretratamiento.

En la primera etapa de dichas realizaciones adicionales, la muestra de ADN genómico se aísla de las fuentes de tejidos o células. Preferiblemente, dichas fuentes incluyen líneas celulares, cortes histológicos, fluidos corporales, o tejido embebido en parafina. La extracción puede realizarse por medios que son estándar para una persona de experiencia en la técnica que incluyen, pero sin limitación, el uso de lisados con detergente, ultrasonidos y agitación en vórtice con perlas de vidrio. Una vez se han extraído los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

En una realización preferida, el ADN puede escindirse antes del tratamiento, y esto puede realizarse por cualquier medio estándar en el estado de la técnica, en particular con endonucleasas de restricción sensibles a la metilación.

En la segunda etapa, el ADN después se digiere con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación. La digestión se realiza de tal forma que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción es informativa del estado de metilación de un dinucleótido CpG específico.

En la tercera etapa, que es opcional pero es una realización preferida, los fragmentos de restricción se amplifican. Esto preferiblemente se realiza usando una reacción en cadena de la polimerasa, y dichos amplificados pueden portar marcadores detectables adecuados tal como se describe anteriormente, en concreto marcadores fluoróforos, radionúclidos y marcadores másicos.

En la etapa final se detectan los amplificados. La detección puede realizarse por cualesquiera medios estándar en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, análisis por electroforesis en gel, análisis de hibridación, incorporación de marcadores detectables en los productos de la PCR, análisis mediante matrices de ADN, análisis por MALDI o IES.

La presente invención posibilita el diagnóstico y/o pronóstico de eventos que son desventajosos para pacientes o individuos en los que pueden usarse importantes parámetros genéticos y/o epigenéticos dentro del gen EYA4 y su promotor o elementos reguladores como marcadores. Dichos parámetros obtenidos mediante la presente invención pueden compararse con otro conjunto de parámetros genéticos y/o epigenéticos, sirviendo las diferencias como base para un diagnóstico y/o pronóstico de eventos que son desventajosos para pacientes o individuos.

De forma específica, la presente invención proporciona ensayos de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer basándose en la medición de la metilación diferencial de secuencias de dinucleótidos CpG de EYA4. Las secuencias génicas preferidas de utilidad para medir dicha metilación diferencial se representan en el presente documento mediante las SEC ID N.º: 1 a 5. Habitualmente, dichos ensayos implican obtener una muestra de tejido de un tejido de prueba, realizar un ensayo para medir el estado de metilación de al menos una de las secuencias de dinucleótidos CpG específicas de EYA4 de la invención derivadas de la muestra de tejido comparado con el de una muestra de control y hacer un diagnóstico o pronóstico basándose en él.

En realizaciones preferidas particulares, se usan oligómeros de la invención para evaluar el estado de metilación de los dinucleótidos CpG específicos de EYA4, tales como los que se basan las SEC ID N.º: 1 a 5, que incluyen los oligómeros preferidos representativos que corresponden a las SEC ID N.º: 11 a 15, o matrices de los mismos, así como un kit basado en ellos que es de utilidad para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer y/u otros trastornos de proliferación celular de próstata.

La presente invención además se refiere a un agente de diagnóstico y/o a un agente terapéutico para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos proliferativos de las células de colon, estando caracterizado el agente de diagnóstico y/o el agente terapéutico porque se usa al menos un cebador o sonda basados en las SEC ID N.º: 1 a 5 para prepararlos, posiblemente junto con aditivos y agentes auxiliares adecuados. En una realización, el polipéptido EYA4 o un fragmento o derivado del mismo pueden administrarse a un sujeto para tratar o prevenir los cánceres de colon.

En otra realización, también puede administrarse un vector capaz de expresar EYA4, o un fragmento o derivado del mismo, a un sujeto para tratar o prevenir cánceres de colon.

En otra realización, pueden usarse agonistas que son específicos para EYA4 para estimular o prolongar la actividad de EYA4 y pueden administrarse a un sujeto para tratar o prevenir cánceres de colon.

En otras realizaciones, pueden administrarse cualquiera de las proteínas o vectores terapéuticos descritos anteriormente combinados con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados para usar en politerapia puede realizarla una persona de experiencia ordinaria en la técnica, de acuerdo con principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar de forma sinérgica para lograr el tratamiento o prevención de cáncer de colon. Usando esta estrategia puede ser posible lograr eficacia terapéutica con dosis menores de cada agente, reduciendo así los potenciales efectos secundarios adversos.

Pueden usarse vectores de expresión que se derivan de retrovirus, adenovirus, virus herpes o vaccinia o de diversos plásmidos bacterianos para la administración de las secuencias de nucleótidos al órgano, tejido o población celular dianas.

Una realización adicional de la invención se refiere a la administración de una composición farmacéutica, junto con un vehiculo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas pueden consistir en EYA4 o agonistas de EYA4. Las composiciones pueden administrarse solas o combinadas con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril, biocompatible, que incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones pueden administrarse a un paciente solas, o combinadas con otros agentes, fármacos u hormonas.

Las composiciones farmacéuticas que se utilizan en esta invención pueden administrarse por cualquier número de vías, que incluyen, pero sin limitación, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual o rectal.

Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos dándoles forma de preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Detalles adicionales de las técnicas para la formulación y administración pueden encontrarse en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Además, un aspecto adicional de la presente invención es un kit que comprende, por ejemplo: un reactivo que contiene bisulfito así como al menos un oligonucleótido cuyas secuencias en cada caso corresponden, son complementarias, o se hibridan en condiciones estrictas o muy estrictas a un segmento de 18 bases de longitud de las secuencias de las SEC ID N.º: 1 a 5. Dicho kit puede comprender además instrucciones para realizar y evaluar el procedimiento descrito. En una realización preferida adicional, dicho kit puede comprender además reactivos estándar para realizar un análisis de la metilación específico de la posición de CpG, en la que dicho análisis comprende una o más de las siguientes técnicas: MS-SNuPE, MSP, MethyLight, HeavyMethyl^{TM}, COBRA, y secuenciación de ácidos nucleicos. Sin embargo, un kit al estilo de la presente invención también puede contener solo parte de los componentes mencionados anteriormente.

Los reactivos típicos (por ejemplo, tales como los que pueden encontrarse en un kit basado en el COBRA habitual) para el análisis por COBRA pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o una secuencia de ADN o isla de CpG alteradas por metilación); una enzima de restricción y un tampón apropiado; un oligo de hibridación con el gen; un oligo de hibridación con el control; un kit de marcado de cinasas para una sonda de oligos; y nucleótidos radioactivos. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.

Los reactivos típicos (por ejemplo, tales como los que pueden encontrarse en un kit basado en el MethyLight® habitual) para el análisis por MethyLight® pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o una secuencia de ADN o isla de CpG alteradas por metilación); sondas de TaqMan®; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

Los reactivos típicos (por ejemplo, tales como los que pueden encontrarse en un kit basado en el Ms-SNuPE habitual) para el análisis por Ms-SNuPE pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o una secuencia de ADN o isla de CpG alteradas por metilación); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos radiactivos. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.

Los reactivos típicos (por ejemplo, tales como los que pueden encontrarse en un kit basado en la MSP habitual) para el análisis por MSP pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR metilados y no metilados para un gen específico (o una secuencia de ADN o isla de CpG alteradaa por metilación), tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados y sondas específicas.

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Definiciones

En el contexto de la presente invención, el término "isla de CpG" se refiere a una región contigua de ADN genómico que satisface los criterios de (1) tener una frecuencia de dinucleótidos CpG que corresponde a una "proporción entre la observada y la esperada" >0,6, y (2) que tiene un "contenido en GC" > 0,5. Las islas de CpG son habitualmente, pero no siempre, de entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 kb de longitud.

En el contexto de la presente invención, el término "estado de metilación" o "situación de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN. Los estados de metilación en uno o más sitios de metilación palindrómicos de CpG particulares (cada uno con dos secuencias de dinucleótidos CpG) en una secuencia de ADN incluyen "no metilado," "completamente metilado" y "hemimetilado."

En el contexto de la presente invención, el término "hemimetilación" se refiere al estado de metilación de un sitio de metilación palindrónico de CpG, donde únicamente está metilada una única citosina en una de las dos secuencias de dinucleótidos CpG del sitio de metilación palindrómico de CpG (por ejemplo, 5'-CCMGG-3' (hebra superior): 3'-GGCC-5' (hebra inferior)).

En el contexto de la presente invención, el término "hipermetilación" se refiere al estado de metilación medio que corresponde a una mayor presencia de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, relativo a la cantidad de 5-mCyt que se encuentra en dinucleótidos CpG correspondientes en una muestra de ADN de control normal.

En el contexto de la presente invención, el término "hipometilación" se refiere al estado de metilación medio que corresponde una menor presencia de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, relativa a la cantidad de 5-mCyt que se encuentra en dinucleótidos CpG correspondientes en una muestra de ADN de control normal.

En el contexto de la presente invención, el término "micromatriz" que se refiere de forma amplia tanto a "micromatrices" de ADN como a "microchips de ADN" tal y como se reconoce en la técnica, engloba todos los soportes sólidos reconocidos en la técnica y engloba todos los procedimientos para fijar moléculas de ácidos nucleicos a ellos o la síntesis de ácidos nucleicos sobre ellos.

Los "parámetros genéticos" son las mutaciones y el polimorfismo de genes y las secuencias que se requieren además para su regulación. Se definen como mutaciones, en particular, inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones y polimorfismos y, se prefieren particularmente, los SNP (polimorfismos de nucleótido único).

Los "parámetros epigenéticos" son, en particular, metilaciones de citosinas. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas que, sin embargo, no pueden analizarse directamente usando el procedimiento que se describe pero que, a su vez, se correlaciona con la metilación del ADN.

En el contexto de la presente invención, el término "bisulfito reactivo" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, de utilidad tal como se describe en el presente documento para distinguir entre las secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados.

En el contexto de la presente invención, el término "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN.

En el contexto de la presente invención, el término "MS.AP-PCR", (Reacción en cadena de la polimerasa cebada de forma arbitraria sensible a metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un barrido global del genoma usando cebadores ricos en CG para concentrarse en las regiones que con mayor probabilidad contienen dinucleótidos CpG y que describen Gonzalgo y cols., Cancer Research 57: 594-599, 1997.

En el contexto de la presente invención, el término "MethyLight" se refiere a la técnica de PCR en tiempo real con base fluorescente reconocida en la técnica que describieron Eads y cols., Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999.

En el contexto de la presente invención, el término ensayo "HeavyMethyl^{TM}", en la realización de la misma que se pone en práctica en el presente documento, se refiere a un ensayo de MethylLight HeavyMethyl^{TM}, que es una variación del ensayo MethylLight, en el que el ensayo MethylLight se combina con sondas bloqueantes específicas de metilación que abarcan las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

El término "Ms-SNuPE" (extensión de un cebador nucleotídico único sensible a metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica que describen Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997.

El término "MSP" (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica que describen Herman y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826, 1996, y en la patente de Estados Unidos 5.786.146.

El término "COBRA" (Análisis de restricción combinado con bisulfito) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica que describen Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997.

El término "hibridación" debe entenderse como la unión de un oligonucleótido a una secuencia complementaria al estilo de los emparejamientos de Watson y Crick de la muestra de ADN, formando una estructura bicatenaria.

Las "condiciones de hibridación estrictas" tal como se definen en el presente documento, implican la hibridación a 68ºC en 5 x SSC / 5 x solución de Denhardt / 1,0% de SDS y lavado en 0,2 x SSC / 0,1% de SDS a temperatura ambiente, o equivalentes de los mismos reconocidos en la técnica (por ejemplo, condiciones en las que se realiza una hibridación a 60ºC en 2,5 x tampón SSC, seguido de varias etapas de lavado a 37ºC en una concentración baja de tampón y permanece estable). Condiciones moderadamente estrictas, tal como se definen en el presente documento, implican incluir un lavado en 3 x SSC a 42ºC, o el equivalente del mismo reconocido en la técnica. Los parámetros de concentración salina y temperatura pueden variarse para lograr el nivel de identidad óptimo entre la sonda y el ácido nucleico diana. En la técnica existen directrices sobre dichas condiciones, por ejemplo, de Sambrook y cols., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y cols. (editores), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) en la Unidad 2.10.

"ADN de fondo" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualesquiera ácidos nucleicos que tienen su origen en fuentes distintas de las células de colon. A continuación se describirá la invención en más detalle basándose en los siguientes ejemplos, las SEC ID, y las Figuras, sin estar limitada por los mismos. En el protocolo de las secuencias y en las Figuras,

la SEC ID N.º: 1 muestra la secuencia del gen EYA4 humano,

las SEC ID N.º: 2 a 5 muestran secuencias pretradadas químicamente del gen EYA4,

las SEC ID N.º: 6 a 10 muestran las secuencias de los cebadores que se usan en los ejemplos, y

las SEC ID N.º: 11 a 15 muestran las secuencias de sondas que se usan en los ejemplos.

La Figura 1 muestra el nivel de metilación determinado mediante un ensayo MSP MethyLight y mediante un ensayo MethyLight HeavyMethyl de acuerdo con los ejemplos 1 y 2. El eje Y muestra el grado de metilación en la región del gen EYA4 que se investiga. Las muestras tumorales se representan mediante puntos blancos, y las muestra de tejido de colon normal por puntos blancos y negros. Se observó un grado de metilación significativamente mayor en las muestras tumorales que en las muestras de tejido sano. El nivel de significación medido usando una prueba t era de p = 0,00000312 (MSP-ML, Ejemplo 1) y p = 0,000000326 (HM-ML, Ejemplo 2).

La Figura 2 muestra la curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo MSP-Methyl-Light para los adenocarcinomas de acuerdo con el Ejemplo 1. Una ROC es una gráfica de la tasa positiva verdadera en función de la tasa positiva falsa para los diferentes valores de corte de una prueba diagnóstica. Muestra el equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del valor de corte seleccionado (cualquier aumento de la sensibilidad se acompañará de un descenso en la especificidad). El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor es el área mejor, el óptimo es 1, una prueba aleatoria tendría una curva ROC en diagonal con un área de 0,5). El ABC para el ensayo de MSP-Methyl-Light es de 0,94.

La Figura 3 muestra la curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo HM-Methyl-Light para el adenocarcinoma de acuerdo con el Ejemplo 2. El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico. La ABC para el ensayo por HM-MethylLight es: 0,91.

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La Figura 4 muestra el nivel de metilación determinado mediante un ensayo MethyLight HeavyMethyl de acuerdo con el ejemplo 2, que analiza un conjunto adicional de muestras de colon (25 adenocarcinomas, 33 normales, y 13 adenomas). El eje Y muestra el grado de metilación en la región del gen EYA4 que se investiga. Las muestras de adenocarcinomas se representan mediante cuadros blancos, y las muestra de tejido de colon normal por cuadros blancos y negros. Se observó un grado de metilación significativamente mayor en las muestras tumorales que en las muestras de tejido sano. El nivel de significación medido usando una prueba t era de 0,00424.

La Figura 5 muestra la curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo HM-Methyl-Light para el adenocarcinoma y adenoma de acuerdo con el Ejemplo 2 (conjuntos de muestras adicionales). El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico. La ABC para el ensayo por HM-Methyl-Light es de 0,81.

La Figura 6 muestra la curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo HM-Methyl-Light solo para el adenocarcinoma de acuerdo con el Ejemplo 2 (conjuntos de muestras adicionales). El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico. La ABC para el ensayo por HM-Methyl-Light es: 0,844.

La Figura 7 muestra la curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo HM-Methyl-Light para adenomas de acuerdo con el Ejemplo 2 (conjuntos de muestras adicionales). El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico. La ABC para el ensayo por HM-Methyl-Light es: 0,748.

La Figura 8 muestra el nivel de metilación en diferentes tejidos tumorales y sanos determinado mediante un ensayo MethyLight HeavyMethyl de acuerdo con el ejemplo 3. El eje Y muestra el grado de metilación en la región del gen EYA4 que se investiga. Además de las muestras de cáncer de colon solo uno de los dos tejidos de cáncer de mama estaba metilado.

La Figura 9 muestra el nivel de metilación en diferentes tejidos de cáncer de mama determinado mediante un ensayo MethyLight HeavyMethyl de acuerdo con el ejemplo 3. Solo un tejido estaba metilado.

La Figura 10 muestra el nivel de metilación en muestras de suero determinado mediante un ensayo MethyLight HeavyMethyl de acuerdo con el ejemplo 4. El eje Y muestra el grado de metilación en la región del gen EYA4 que se investiga.

Ejemplo 1 Análisis de la metilación en el cáncer de colon usando un ensayo por MSP-MethyLight

Se extrajo ADN de 33 muestras de adenocarcinoma de colon y 43 tejidos adyacentes normales de colon usando un kit de extracción Qiagen®. El ADN de cada muestra se trató usando una solución de bisulfito (hidrogenosulfito, disulfito) de acuerdo con el procedimiento de perlas de agarosa (Olek y cols. 1996). El tratamiento es de tal forma que todas las citosinas no metiladas en la muestra se convierten en timidina. A la inversa, las citosinas metiladas en 5 en la muestra no sufren cambios.

El estado de metilación se determinó con un ensayo de MSP-MethyLight diseñado para la isla de CpG de interés y un fragmento de control del gen de beta actina (Eads y cols., 2001). El ensayo de la isla de CpG abarca los sitios CpG en ambos cebadores y la sonda de estilo taqman, mientras que el gen de control no. El gen de control se usa para medir la concentración total de ADN, y el ensayo de la isla de CpG (ensayo de metilación) determina los niveles de metilación en ese sitio.

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Métodos: El ensayo de la isla de CpG en el gen EYA4 se realizó usando los siguientes cebadores y sondas:

Cebador directo:	CGGAGGGTACGGAGATTACG	(SEC ID N.º: 6);
Cebador inverso:	CGACGACGCGCGAAA	(SEC ID N.º: 7); y
Sonda:	CGAAACCCTAAATATCCCGAATAACGCCG	(SEC ID N.º: 12).

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El ensayo de control correspondiente se realizó usando los siguientes cebadores y sondas:

Cebador:	TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT	(SEC ID N.º: 8);
Cebador:	ACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA	(SEC ID N.º: 9); y
Sonda:	ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA	(SEC ID N.º: 13)

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Las reacciones se realizaron por triplicado para cada muestra de ADN con las siguientes condiciones de ensayo:

Solución de reacción: (cebadores 900 nM; sonda 300 nM; cloruro de magnesio 3,5 mM; 1 unidad de taq polimerasa; dNTP 200 \muM; 7 de ADN, en un volumen de reacción final de 20 \mul);

Condiciones de los ciclos: (95ºC durante 10 minutos; después 50 ciclos de: 95ºC durante 15 segundos; 60ºC durante 1 minuto). Los datos se analizaron usando el cálculo de PMR descrito anteriormente en la bibliografía (Eads y cols. 2001).

Resultados: La mediana de PMR para las muestras normales fue de 0,15, con una desviación típica de 0,18. La mediana de PMR para las muestras tumorales fue de 17,98, con una desviación típica de 18,18. La diferencia global de los niveles de metilación entre las muestras tumorales y las normales es significativa en una prueba t (p= 0,00000312). Los resultados se muestran en la Figura 1.

También se determinó una curva característica de funcionamiento de los receptores (curva ROC) del ensayo. Una ROC es una gráfica de la tasa positiva verdadera en función de la tasa positiva falsa para los diferentes valores de corte de una prueba diagnóstica. Muestra el equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del valor de corte seleccionado (cualquier aumento de la sensibilidad se acompañará de un descenso en la especificidad). El área bajo una curva (ABC) de una curva ROC mide la exactitud de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor es el área mejor, el óptimo es 1, una prueba aleatoria tendría una curva ROC diagonal con un área de 0,5; para referencias: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York, 1975). La ABC para el ensayo por MSP-MethyLight es: 0,94 (Figura 2).

Ejemplo 2 Se analizó la metilación en el cáncer de colon usando un ensayo HeavyMethyl MethyLight^{TM}

También se usaron las mismas muestras de ADN para analizar la metilación de la isla de CpG con un ensayo HeavyMethyl MethyLight (o HM MethyLight), también denominado ensayo HeavyMethyl. El estado de metilación se determinó con un ensayo de HM-MethyLight diseñado para la isla de CpG de interés y el mismo gen de control que se describe anteriormente. El ensayo de la isla de CpG abarca los sitios CpG en ambos bloqueantes y la sonda de estilo taqman, mientras que el gen de control no.

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Métodos: El ensayo de la isla de CpG (ensayo de metilación) se realizó usando los siguientes cebadores y sondas:

Cebador directo:	GGTGATTGTTTATTGTTATGGTTTG	(SEC ID N.º: 10)
Cebador inverso:	CCCCTCAACCTAAAAACTACAAC	(SEC ID N.º: 11)
Bloqueante directo:	GTTATGGTTTGTGATTTTGTGTGGG	(SEC ID N.º: 15)
Bloqueante inverso:	AAACTACAACCACTCAAATCAACCCA	(SEC ID N.º: 16)
Sonda:	AAAATTACGACGACGCCACCCGAAA	(SEC ID N.º: 14)

Las reacciones se realizaron cada una por triplicado en cada muestra de ADN con las siguientes condiciones de ensayo:

Solución de reacción: (cebadores 400 nM; sonda 400 nM; ambos bloqueantes 1 \muM; cloruro de magnesio 3,5 mM; 1x tampón ABI Taqman; 1 unidad de polimerasa ABI TaqGold; dNTP 200 \muM; y 7 \mul de ADN, en un volumen de reacción final de 20 \mul); Condiciones de ciclado: (95ºC durante 10 minutos); (95ºC durante 15 segundos, 64ºC durante 1 minuto (2 ciclos)); (95ºC durante 15 segundos, 62ºC durante 1 minuto (2 ciclos); (95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 1 minuto (2 ciclos)); y (95ºC durante 15 segundos, 58ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 40 segundos (41 ciclos)).

Resultados: La mediana de PMR para las muestras normales fue de 1,12, con una desviación típica de 1,45. La mediana de PMR para las muestras tumorales fue de 38,23, con una desviación típica de 33,22. La diferencia global de los niveles de metilación entre las muestras tumorales y normales es significativa en una prueba t (p= 0,00000326). Los resultados se muestran en la Figura 1. También se determinó una curva ROC del ensayo. La ABC para el ensayo por MSP-MethyLight es de 0,91 (Figura 3).

El ensayo se analizó en un conjunto adicional de muestras de colon (25 adenocarcinomas, 33 normales, y 13 adenomas). Los resultados mostraron una diferencia significativa de nuevo (Figura 4). Las ROC se muestran en las Figuras 5-7.

Ejemplo 3

El ensayo HeavyMethyl-MethyLight se analizó también con un conjunto de otros tejidos (Figura 8). Además de las muestras de cáncer de colon solo uno de los dos tejidos de cáncer de mama estaba metilado. Sin embargo, en un conjunto de 21 tumores de mama adicionales (de diferentes fases), solo uno estaba metilado (Figura 9). De forma que el marcador es específico para las muestras de tumor de colon. Todos los cebadores, sondas, bloqueantes y condiciones de reacción eran idénticos a las que se usan en el análisis de las muestras de cáncer de colon (Ejemplo 2).

Ejemplo 4

Doce de los tejidos de colon analizados mediante PCR a tiempo real tenían también un suero correspondiente que se extrajo antes de la operación quirúrgica. Los presentes inventores extrajeron ADN de 1 ml de ese suero usando un kit de extracción de ADN Qiagen UltraSens®, el ADN de la muestra se trató con bisulfito y se procesó en el ensayo MethyLight HeavyMethyl en esas muestras. El gen de control no se amplificó en tres de las muestras de suero del cáncer y tres de las muestras de suero normal, de forma que podemos concluir que la preparación de las muestras no funcionó en estos casos. En los otros casos, había indicios de una mayor metilación en las muestras de cáncer que en las muestras normales (Figura 10).

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<110> Epigenomics

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<120> Procedimiento y ácidos nucleicos para al análisis de trastornos de proliferación de células colorrectales

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<160> 15

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<210> 1

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<211> 29993

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

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<210> 2

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<211> 29993

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

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<400> 2

11

12

13

14

15

16

17

18

19

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<210> 3

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<211> 29993

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 29993

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

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<400> 4

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<210> 5

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

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<400> 5

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42

43

44

45

46

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<210> 6

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CEBADOR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggagggtac ggagattacg

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 15

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgacgacgcg cgaaa

\hfill

15

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<210> 8

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CEBADOR

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<400> 8

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tggtgatgga ggaggtttag taagt

\hfill

25

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<210> 9

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgattgtt tattgttatg gtttg

\hfill

25

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<210> 10

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<211> 23

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> CEBADOR

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<400> 10

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cccctcaacc taaaaactac aac

\hfill

23

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<210> 11

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<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SONDA

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgaaacccta aatatcccga ataacgccg

\hfill

29

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<210> 12

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> SONDA

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<400> 12

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accaccaccc aacacacaat aacaaacaca

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SONDA

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<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaattacga cgacgccacc cgaaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> BLOQUEANTE

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gttatggttt gtgattttgt gtggg

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25

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<210> 15

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> BLOQUEANTE

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaactacaac cactcaaatc aaccca

\hfill

26

Claims (21)

1. Un procedimiento in vitro de diagnosticar un trastorno de proliferación de células de colon en un sujeto, que comprende las etapas de:

a) obtener o más muestras de prueba de tejido o suero de colon o ambos, sangre o heces de dicho sujeto; y

b) detectar un descenso de la cantidad o expresión de un polipéptido que se expresa a partir del gen EYA4 o la presencia o ausencia de ARNm que codifica un polipéptido EYA4.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos trastornos proliferativos de las células de colon se eligen del grupo que comprende adenocarcinomas, cánceres de células escamosas, tumores carcinoides, sarcomas y linfomas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha detección es mediante inmunoensayo, en particular mediante un ELISA.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una sonda polinucleotídica que se hibrida de forma específica o es idéntica a un polinucleótido que consiste en la SEC ID N.º: 1,

b) incubar dicha muestra con dicha sonda polinucleotídica en condiciones muy restrictivas formando un complejo de hibridación específico entre un ARNm y dicha sonda; y

c) detectar dicho complejo de hibridación.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha detección comprende el análisis de la metilación del gen EYA4, su promotor y/o elementos reguladores, en particular el análisis de la metilación de una secuencia de ADN genómico de acuerdo con la SEC ID N.º: 1.

6. Un procedimiento para detectar trastornos proliferativos de las células de colon de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende:

a) obtener, de un sujeto, una muestra biológica que tiene el ADN genómico del sujeto;

b) tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas en la posición 5 en uracilo o en otra base que es detectablemente diferente de citosina en términos de propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento del mismo tratado, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 18 nucleótidos de longitud que es complementaria, o se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas, a una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID N.º: 2 a 5, y complementarias de las mismas, en el que el ADN tratado o un fragmento del mismo o bien se amplifica produciendo uno o más amplificados, o no se amplifica;
y

d) determinar, basándose en presencia o ausencia, o en una propiedad de dicho amplificado, del estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de la SEC ID N.º: 1, o una media, o un valor que refleja un estado de metilación medio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la SEC ID N.º: 1.

7. Un procedimiento para detectar trastornos proliferativos de las células de colon de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende las siguientes etapas de

a) obtener, de un sujeto, una muestra biológica que tiene el ADN genómico del sujeto;

b) tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas en la posición 5 en uracilo o en otra base que es detectablemente diferente de citosina en términos de propiedades de hibridación;

c) amplificar uno o más fragmentos del ADN tratado de tal forma que solo se amplifica ADN originario de células de colon o de un trastorno proliferativo de células de colon, y

d) detectar los amplificados o características de los mismos y de ese modo deducir la presencia o ausencia de un trastorno de proliferación de células de colon.

\newpage

8. El procedimiento de una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que en la etapa a) la muestra biológica obtenida del sujeto se selecciona del grupo que consiste en cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, suero, plasma, heces, orina, sangre y combinaciones de los mismos.

9. El procedimiento de una de las reivindicaciones 7 a 8, en el que en la etapa b) tratar el ADN genómico, o el fragmento del mismo, comprende el uso de una solución que se selecciona del grupo que consiste en bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito y combinaciones de los mismos.

10. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, en el que uno o más de dichos cebadores comprenden uno o más dinucleótidos CpG, TpG o CpA.

11. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dichos amplificados obtenidos en la etapa d) comprenden al menos una secuencia de 20 pares de bases que comprende tres o más dinucleótidos CpG, TpG o CpA.

12. Un procedimiento para detectar un trastorno de proliferación de células de colon de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende:

a) obtener, de un sujeto, una muestra biológica que tiene el ADN genómico del sujeto;

b) extraer el ADN genómico;

c) poner en contacto el ADN genómico, o un fragmento del mismo, que comprende la SEC ID N.º: 1 o una secuencia que se hibrida en condiciones restrictivas a la SEC ID N.º: 1, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, en el que el ADN genómico o se digiere produciendo así fragmentos de digestión, o no se digiere de ese modo; y

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia, o en una propiedad de al menos uno de dichos fragmentos, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de la SEC ID N.º: 1, o una media, o un valor que refleja un estado medio de metilación de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la SEC ID N.º:1, mediante lo cual se logra, al menos en parte, la detección del trastorno proliferativo de células de colon.

13. Uso de un polipéptido EYA4 o de un polinucleótido que codifica EYA4 para producir un medicamento para reprimir la transformación en una célula de colon poniendo en contacto dicha célula con dicho polipéptido EYA4 o introduciendo dicho polinucleótido que codifica EYA4 en una cantidad eficaz para inhibir un fenotipo transforma-
do.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha transformación es un trastorno de proliferación de células de colon.

15. Uso de un polipéptido que se expresa a partir del gen EYA4 para detectar trastornos proliferativos de las células de colon.

16. Uso de un oligómero comprendiendo dicho oligómero una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria, o que se hibrida en condiciones restrictivas a un ADN genómico pretratado químicamente de acuerdo con una de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y las secuencias complementarias a las mismas para detectar un trastorno de proliferación de células de colon.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que las secuencias de las bases de dicho oligómero incluyen al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

18. Uso según la reivindicación 16, en el que dicho oligómero se usa como cebador oligonucleotídico para la amplificación de secuencias de ADN de una de la SEC ID N.º: 2 a la SEC ID N.º: 5 y secuencias complementarias a las mismas.

19. Uso de un kit para detectar trastornos proliferativos de las células de colon, en el que dicho kit comprende:

a) un reactivo de bisulfito; y

b) al menos una molécula de ácido nucleico o una molécula de ácido nucleico peptídico que comprende, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria, o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID N.º: 1 a 5, y complementarias de las mismas.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho kit comprende además reactivos estándar para realizar un ensayo de metilación que se selecciona del grupo que consiste en MS-SNuPE, MSP, MethylLight^{TM}, HeavyMethyl^{TM}, COBRA, secuenciación de ácidos nucleicos, y combinaciones de los mismos.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20 para detectar trastornos proliferativos de las células de colon mediante la detección de un descenso de la cantidad o expresión de un polipéptido que se expresa a partir del gen EYA4 o la presencia o ausencia de ARNm que codifica un polipéptido EYA4.