ES2534765T3 - Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares de la próstata - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, donde la expresión disminuida de y/o metilación de CpG en el gen RASSF22 es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

Description

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DESCRIPCIÓN

Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares de la próstata

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados de enfermedad en relación a normales y proporciona métodos, usos de ácidos nucleicos y usos de kits para detectar, o para diagnosticar carcinoma de próstata.

Antecedentes

Incidencia y diagnóstico del cáncer

15 El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Las tasas de mortalidad pueden mejorarse significativamente si se mejorasen los métodos de exploración actuales en cuanto al cumplimiento por parte del paciente, la sensibilidad y la facilidad de la exploración. Los métodos recomendados actuales para el diagnóstico del cáncer son a menudo invasivos, caros o de otro modo no son adecuados para su aplicación con pruebas de exploración en toda la población.

Incidencia y diagnóstico del cáncer de próstata. El cáncer de próstata es la neoplasia más común entre los hombres en los Estados Unidos (~200.000 nuevos casos por año), y la sexta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en hombres en todo el mundo (~204.000 por año). El cáncer de próstata es principalmente una enfermedad de los ancianos, teniendo la enfermedad aproximadamente un 16 % de los hombres con edades entre 60 y 79. De

25 acuerdo con algunas estimaciones en el momento de la autopsia, el 80 % de todos los hombres mayores de 80 años de edad tienen alguna forma de enfermedad de próstata (por ejemplo, cáncer, HBP, prostatitis, etc.). La hipertrofia benigna de próstata está presente en aproximadamente un 50 % de 50 años o más, y en el 95 % de los hombres de 75 o más. Resulta evidente a partir de estos informes que el cáncer de próstata no es a menudo una enfermedad de la que fallezcan los hombres, pero sí con la que lo hacen. Pruebas recientes sugieren que la incidencia del cáncer de próstata puede estar de hecho en descenso, probablemente como resultado de un mejor tratamiento, una mejor cirugía, y una detección más temprana.

Las guías actuales para la exploración del cáncer de próstata se han sugerido por la American Cancer Society y son las siguientes: A los 50 años de edad, los profesionales de la salud deben ofrecer una prueba en sangre para el 35 antígeno específico de próstata (PSA) y efectuar un examen rectal digital (ERD). Se recomienda que las poblaciones de alto riesgo, tales como los afroamericanos y aquellos con historial familiar de enfermedad de la próstata, deben comenzar a explorarse a los 45 años de edad. Los hombres sin patología prostática anormal tienen generalmente un nivel de PSA en sangre por debajo de 4 ng/ml. Los niveles de PSA entre 4 ng/ml y 10 ng/ml (denominados la "zona gris") tienen un 25 % de probabilidades de tener cáncer de próstata. El resultado es que el 75 % de las veces, los hombres con un ERD y una PSA en esta zona negra tienen una biopsia negativa, o aparentemente innecesaria. Por encima de la zona gris, la probabilidad de tener cáncer de próstata es significativa (> 67 %) y aumenta incluso más a medida que aumentan los niveles de PSA. Existen numerosos métodos para medir la PSA (PSA libre porcentual, velocidad de PSA, densidad de PSA, etc.), y cada uno tiene una precisión asociada para detectar la presencia del cáncer. Sin embargo, incluso con las mejoras menores en la detección, y los descensos comunicados en la

45 mortalidad asociados con la exploración, la frecuencia de falsos positivos sigue siendo alta. La especificidad reducida es el resultado, en parte, de la PSA aumentada en sangre asociada a la HBP, y la prostatitis. También se ha estimado que hasta un 45 % de las biopsias de próstata con las orientaciones actuales son falsos negativos, dando como resultado una sensibilidad reducida incluso con biopsia.

La biopsia guiada TRUS se considera el patrón de oro para el diagnóstico del cáncer. Las recomendaciones para la biopsia están basadas en niveles anormales de PSA y/o ERD anormal. Para la PSA, hay una zona gris donde un gran porcentaje de biopsias quizá no son necesarias. Sin embargo, la capacidad para detectar el cáncer en esta zona gris (niveles de PSA de 4,0 a 10 ng/ml) es difícil sin biopsia. Debido a esta falta de especificidad, el 75 % de los hombres que se someten a biopsia no tienen cáncer. Sin embargo, sin biopsia, no se detectarían aquellos con

55 cáncer, dando como resultado una morbilidad y mortalidad aumentadas. Sin embargo, los riesgos asociados con una biopsia innecesaria también son elevados.

Está claro que hay necesidad de una prueba temprana y específica para el cáncer para una detección y control del tratamiento más precisos, para mejorar las tasas de morbilidad y mortalidad. Sin embargo, usando un examen histológico rutinario, a menudo es difícil distinguir entre hiperplasia de la próstata de las etapas tempranas del carcinoma de próstata, incluso si se obtiene una biopsia adecuada (McNeal J. E. et al., Hum. Pathol. 2001, 32:4416). Además, las muestras de biopsia pequeñas o de otro modo insuficientes a menudo impiden el análisis.

Incidencia y diagnóstico del cáncer de colon. En los Estados Unidos, la incidencia anual de cáncer colorrectal es de

65 aproximadamente 150.000, muriendo 56.600 individuos de cáncer colorrectal cada año. El riesgo de cáncer colorrectal a lo largo de la vida en la población general de aproximadamente un 5 a un 6 porciento. A pesar de los esfuerzos intensivos en los últimos años en la exploración y detección temprana del cáncer de colon, a día de hoy la mayoría de los casos se diagnostican en un estado avanzado con metástasis regional o distal. Mientras que las opciones terapéuticas incluyen cirugía y adyuvante o quimioterapia paliativa, la mayoría de los pacientes fallecen a causa de la progresión de su cáncer en unos pocos meses. Identificar los cambios moleculares que subyacen al

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5 desarrollo del cáncer de colon pueden ayudar a desarrollar nuevas opciones de control, exploración, diagnósticas y terapéuticas que puedan mejorar el pronóstico pobre general de estos pacientes.

Las orientaciones actuales para exploración colorrectal de acuerdo con la American Cancer Society utilizan una de cinco opciones diferentes para la exploración en los individuos de riesgo medio de 50 años de edad o mayores. Estas opciones incluyen 1) pruebas de sangre oculta en heces (FOBT) anualmente, 2) sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 4) enema de bario con doble contraste (EBDC) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. Aunque estos procedimientos de ensayo están bien aceptados por la comunidad médica, la implementación de exploración extensiva del cáncer colorrectal no se ha llevado a cabo aún. El cumplimiento por parte del paciente es un factor principal para el uso limitado debido a la 15 incomodidad o a los inconvenientes asociados con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque es un procedimiento no invasivo, necesita restricciones de tipo dietético y otras durante 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad para esta prueba también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal, con amplia variabilidad dependiendo de la prueba. Las medidas de sensibilidad para la detección de adenomas son incluso menor ya que la mayoría de los adenomas no sangran. Por el contrario, la sensibilidad para procedimientos más invasivos, tales como la sigmoidoscopia y la colonoscopia es bastante elevada debido a la visualización directa del lumen del colon. Estudios no aleatorizados han evaluado la eficacia de estas técnicas, sin embargo, usando datos de estudios de control de caso y datos del National Polyp Study (EE.UU.) se ha demostrado que la extirpación de pólipos adenomatosos da como resultado una reducción del 76-90 % en la incidencia de CCR. La sigmoidoscopia tiene la limitación de solo visualizar el lado izquierdo del colon, dejando las lesiones en el colon derecho sin detectar.

25 Ambos procedimientos de determinación del alcance son caros, necesitan de una preparación catártica y tienen un riesgo aumentado de morbilidad y mortalidad. Las pruebas mejoradas con una sensibilidad aumentada, especificidad, facilidad de uso y costes disminuidos se necesitan claramente antes de que la exploración general en la población para cáncer colorrectal sea rutinaria.

La detección temprana del cáncer colorrectal se basa generalmente en la prueba de sangre fecal oculta (FOBT) efectuada anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales adaptadas por varias organizaciones del cuidado de la salud, incluyendo la American Cancer Society, indican el comienzo de la prueba de sangre fecal oculta a la edad de 50 años, repitiéndose anualmente hasta el momento en que el paciente no se beneficiará más de la exploración. Una FOBT positiva da lugar a un examen colonoscópico del intestino; un 35 procedimiento caro e invasivo, con una tasa de complicaciones graves de uno por cada 5.000 exámenes. Solo el 12 % de los pacientes con heces positivas en sangre son diagnosticados con cáncer o grandes pólipos en el momento de la colonoscopia. Una variedad de estudios muestran que la exploración FOBT no mejora la mortalidad asociada con el cáncer o la supervivencia general. El cumplimiento con la prueba de sangre oculta ha sido escaso; a menos del 20 por ciento de la población se le ofrece o se somete a la FOBT según las recomendaciones. Si se efectúa la FOBT de manera adecuada, el paciente recoge una muestra fecal de tres movimientos consecutivos del intestino. Las muestras se obtienen mientras el paciente se adhiere a orientaciones dietéticas y evita medicaciones que se sabe que inducen sangrado gastrointestinal oculto. En realidad, los médicos no dan instrucciones adecuadas a los pacientes, los pacientes no se adhieren frecuentemente al protocolo, y algunos pacientes encuentran la tarea de recoger muestras fecales difícil o desagradable, por lo que el cumplimiento con la prueba de sangre oculta anual

45 es escaso. Si se pudiesen mejorar la sensibilidad y especificidad de las pruebas frente a los métodos actuales, podría reducirse la frecuencia de las pruebas, podría eliminarse la recogida de muestras consecutivas, y podrían eliminarse las modificaciones dietéticas y de medicación, y se potenciaría el cumplimiento por parte de los pacientes. Además del problema del cumplimiento, la sensibilidad y especificidad de la FOBT para detectar el cáncer de colon son escasas. La escasa especificidad de la prueba da lugar a colonoscopias innecesarias, lo que añade un gasto considerable a la exploración del cáncer de colon.

La especificidad de la FOBT se ha calculado en un máximo del 96 %, con una sensibilidad del 43 % (adenomas) y del 50 % (carcinoma colorrectal). La sensibilidad puede mejorarse usando un inmunoensayo FOBT, tal como el que se produce con el nombre comercial "InSure™", con una sensibilidad mejorada del 77 % (adenomas) y del 88,9 %

55 (carcinoma colorrectal).

Marcadores moleculares de enfermedad. Los marcadores moleculares de enfermedad ofrecen varias ventajas frente a otros tipos de marcadores, siendo una ventaja que incluso muestras de pequeño tamaño y/o muestras cuya arquitectura tisular no se ha mantenido puedan analizarse de manera bastante eficiente. En la última década, se ha demostrado que una variedad de genes se expresan de manera diferencial entre normal y carcinomas de colon. Sin embargo, no se ha demostrado que un marcador individual o una combinación de estos sean suficientes para el diagnóstico de carcinomas de colon. Se ha demostrado recientemente que los enfoques basados en ARNm de alta dimensión son capaces de proporcionar mejores medios para distinguir entre diferentes tipos de tumor y entre lesiones benignas y malignas. sin embargo, su aplicación como herramienta diagnóstica rutinaria en un ambiente 65 clínico se ve impedida por la extrema inestabilidad del ARNm, los rápidos cambios en la expresión después de determinados estímulos (por ejemplo, recolección de la muestra), y, de manera más importante, la gran cantidad de

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ARNm necesaria para el análisis (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21:20-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21:25-32, 1999), que a menudo no pueden obtenerse de una biopsia rutinaria.

Se ha sugerido el uso de marcadores biológicos para mejorar adicionalmente la sensibilidad y especificidad de la

5 FOBT, los ejemplos de dichas pruebas incluyen el ensayo de análisis de heces PreGen-Plus™ disponible a través de EXACT Sciences, que tiene una sensibilidad del 20 % (adenoma) y del 52 % (carcinoma colorrectal) y una especificidad del 95 % en ambos casos. Esta prueba detecta la presencia de 23 mutaciones de ADN asociadas con el desarrollo de neoplasias de colon.

Metilación de islas CpG. Aparte de las mutaciones, se ha demostrado que la metilación aberrante de islas de CpG da lugar al silenciamiento transcripcional de determinados genes que se han implicado anteriormente con la patogénesis de varios cánceres. Las islas de CpG son secuencias cortas que son ricas en dinucleótidos de CpG y pueden encontrarse normalmente en la región 5' de aproximadamente el 50 % de todos los genes humanos. La metilación de las citosinas en estas islas da lugar a la pérdida de expresión genética, y se ha comunicado en la

15 inactivación del cromosoma X y en la impronta genética.

El gen RASSF2 está localizado en la ubicación cromosómica 20p13, y codifica múltiples isoformas de transcritos de ARNm. Los miembros de la familia de proteínas Ras están asociados con el cáncer, RASSF2 se une a K-Ras, y la expresión de RASSF2 está asociada con el crecimiento celular controlado. La pérdida de expresión da como resultado proliferación celular no inhibida, y por consiguiente, RASSF2 es un gen supresor de tumores (Vos et. al. J. Biol. Chem., Vol. 278, Edición 30, 28045-28051, 25 de julio de 2003).

Enfoque multifactorial. El diagnóstico del cáncer se ha basado tradicionalmente en la detección de marcadores moleculares individuales (por ejemplo, mutaciones génicas, niveles elevados de PSA). Desafortunadamente, el

25 cáncer es una enfermedad en la que típicamente los marcadores individuales han fallado en detectar o diferenciar muchas formas de la enfermedad. Por lo tanto, se ha demostrado que los ensayos que reconocen un solo marcador tienen un valor predictivo limitado. Una divulgación fundamental en el presente documento es que los diagnósticos del cáncer basados en la metilación y la exploración, diagnóstico, y control terapéutico de dichas enfermedades proporcionará mejoras significativas frente al estado de la técnica que usa análisis de un solo marcador mediante el uso de una selección de múltiples marcadores. El enfoque analítico multiplexado es particularmente adecuado para el diagnóstico del cáncer ya que el cáncer no es una enfermedad simple, este enfoque de "panel" multifactorial es consistente con la naturaleza heterogénea del cáncer, tanto citológica como clínicamente.

La clave para la implementación exitosa de un enfoque de panel para pruebas diagnósticas basadas en la metilación

35 es el diseño y desarrollo de paneles de marcadores optimizados que puedan caracterizar y distinguir estados de enfermedad. La presente divulgación describe una variedad de panales de genes únicos y particularmente eficaces, el análisis de metilación de uno o de una combinación de miembros del panel que permiten la detección de trastornos proliferativos de las células del colon con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados.

Desarrollo de pruebas médicas. Dos medidas de evaluación clave de cualquier prueba diagnóstica o exploratoria médica son su sensibilidad y su especificidad, que miden lo bien que rinde la prueba para detectar de manera precisa a todos los individuos afectados, sin excepción, y sin incluir falsamente individuos que no tienen la enfermedad diana (valor predictivo). Históricamente, se han criticado muchas pruebas diagnósticas debido a la

45 escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado auténtico positivo (AP) es cuando la prueba es positiva y la afección está presente. Un resultado falso positivo (FP) es cuando la prueba es positiva pero la afección no está presente. Un resultado auténtico negativo (AN) es cuando la prueba es negativa y la afección no está presente. Un resultado falso negativo (FN) es cuando la prueba es negativa pero la afección está presente. En este contexto, Sensibilidad = AP/(AP+FN); Especificidad = AN/(FP+AN); y Valor predictivo = AP/(TP+FP).

La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad diana en un individuo al que se le practica la prueba. Una prueba que tiene una escasa sensibilidad produce una tasa elevada 55 de falsos negativos, es decir, individuos que tienen la enfermedad pero se identifican erróneamente como libres de esa enfermedad particular. El peligro potencial de un falso negativo es que el individuo con la enfermedad seguirá no diagnosticado y sin tratar durante un determinado periodo de tiempo, durante el cual la enfermedad puede progresar a un estadio posterior donde los tratamientos, en caso de haberlos, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba que tiene una baja sensibilidad es una prueba de sangre para el VIH basada en proteínas. Este tipo de prueba muestra una baja sensibilidad debido a que no logra detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está bien establecida y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en números sustanciales. Por el contrario, un ejemplo de una prueba que tiene una elevada sensibilidad es la detección de carga viral usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La elevada sensibilidad se logra debido a que este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas del virus. La elevada sensibilidad es particularmente importante cuando las

65 consecuencias de fallar en el diagnóstico son graves.

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La especificidad, por otro lado, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar de manera precisa a los pacientes que están libres de la enfermedad. Una prueba que tiene una baja especificidad produce una tasa elevada de falsos positivos, es decir, individuos en los que se identifica erróneamente que tienen la enfermedad. Un inconveniente de los falsos positivos es que fuerzan a los pacientes a someterse a procedimientos médicos

5 innecesarios con sus inherentes riesgos, esfuerzos emocionales y financieros, y que pueden tener efectos adversos sobre la salud del paciente. Una característica de las enfermedades que hacen difícil desarrollar pruebas diagnósticas con elevada especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, particularmente en el cáncer, implican a menudo una variedad de genes y proteínas. Además, determinadas proteínas pueden estar elevadas debido a razones no relacionadas con una enfermedad. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociado con procedimientos diagnósticos adicionales o con una intervención médica adicional son muy elevados.

Origen del gen RASSF2. El gen RASSF2 comprende una región densa de CpG en el promotor del gen, que se extiende a los 2 primeros exones no codificantes. Se ha caracterizado que esta región está co-metilada, y además, la metilación de la misma se ha asociado con el desarrollo de carcinomas gástricos y de colon. Hesson et al.

15 (Oncogene. 2005 Jun 2;24(24):3987-94.) caracterizaron la isla de CpG como co-metilada, mediante análisis COBRA y secuenciación de bisulfito de líneas celulares de cáncer de colon. Además, confirmaron mediante análisis MSP que 21/30 (70 %) de las líneas celulares de cáncer de colon analizadas estaban metiladas en la región promotora de RASSF2. La investigación adicional ha indicado que la metilación de RASSF2 puede estar asociada al cáncer gástrico (Endoh et al., Br J Cancer. 12 de diciembre de 2005; 93(12):1395-9) y al cáncer nasofaríngeo (Zhang et al., Int J Cancer. 1 de enero de 2007; 120(1):32-8).

La base de la presente invención es que la presente divulgación demuestra por primera vez que la metilación de RASSF2 es un marcador de cáncer de próstata y que puede detectarse en una amplia variedad de fluidos corporales.

25 El efecto técnico de analizar fluidos corporales en oposición a tejidos es permitir el diagnóstico del cáncer sin necesidad de biopsia, u otros procedimientos invasivos. Actualmente no hay pruebas basadas en tejidos corporales que sean adecuadas para el diagnóstico rutinario del cáncer. Las pruebas de fluidos corporales, tales como la PSA (cáncer de próstata) y FOBT (cáncer de colon) se llevan a cabo de manera rutinaria, pero se consideran como indicadores de cáncer a seguir con, por ejemplo, pruebas invasivas o de obtención de imágenes tras cuyos resultados los médicos proporcionarán un diagnóstico.

El desarrollo de una prueba diagnóstica para el cáncer basada en fluidos podría aumentar el cumplimiento por parte del paciente a un nivel en que podría ser posible explorar poblaciones asintomáticas, es decir, posibilitaría una

35 exploración general para el cáncer de colon. Esto aumentaría en gran medida la detección temprana del cáncer, y por consiguiente, mejoraría las tasas de supervivencia de los pacientes. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica por una prueba de exploración/diagnóstica para el cáncer de colon basada en fluidos.

Por consiguiente, el problema a resolver es cómo diagnosticar de manera no invasiva el cáncer. A partir de las enseñanzas citadas anteriormente, el experto en la materia se habrá percatado de que RASSF2 es un marcador de metilación adecuado para diferenciar entre tejido neoplásico de colon y tejido sano de colon, y puede por lo tanto haber pensado investigarlo adicionalmente como marcador diagnóstico. Sin embargo, no hay enseñanza en la materia que pueda motivar a dicha persona a investigar dicho marcador como un marcador de cáncer en fluidos corporales en oposición a una prueba de análisis de biopsia más tradicional, ya que no habría tenido una expectativa

45 de éxito razonable.

Los marcadores que están metilados en un tipo de cáncer específico rara vez son detectables en fluidos corporales, debido a la presencia de un fondo de metilación general resultante de los muchos tipos de tejido diferentes que pueden estar presente, y también debido a las pequeñas cantidades de ADN tumoral presente en los fluidos corporales. Por ejemplo, aunque el gen RASSF2 no está metilado en los tejidos sanos del colon, puede estar metilado en otros tejidos que pueden estar presentes en fluidos corporales. No hay enseñanzas en la técnica acerca de que RASSF2 no está metilado en fluidos corporales. Por consiguiente, el experto en la materia no habría tenido ninguna motivación para investigar su rendimiento en fluidos corporales.

55 Las Figuras 1 a 10 proporcionan una visión general de la metilación media logarítmica medida mediante el ensayo HM de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en tres gráficas, las gráficas superior e inferior izquierda proporcionan el análisis binario y multi-clase, respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilación de ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X. En cada figura, la gráfica de la derecha proporciona un ROC donde la sensibilidad se muestra en el eje y 1especificidad se muestra en el eje X.

La Figura 1 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el

Ejemplo 2, en todas las muestras.

65 La Figura 2 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

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La Figura 3 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 4 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el 5 Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 5 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 6 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 7 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

15 La Figura 8 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 9 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 10 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

25 La Figura 11 proporciona una visión general del poder predictivo del modelo de regresión logística de combinaciones de marcadores. Se es sensibilidad, sp es especificidad, ABC es área bajo la curva.

Las Figuras 12 a 21 proporcionan una visión general de la metilación media mayoritaria logarítmica medida mediante el ensayo HM de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en tres gráficas, las gráficas superior e inferior izquierda proporcionan el análisis binario y multi-clase, respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilación de ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X. En cada figura, la gráfica de la derecha proporciona un ROC donde la sensibilidad se muestra en el eje y 1-especificidad se muestra en el eje X.

La Figura 12 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el 35 Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 13 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 14 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 15 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

45 La Figura 16 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 17 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 18 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

55 La Figura 19 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 20 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Figura 21 proporciona una visión general del rendimiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

Las Figuras 22 a 26 proporcionan una visión general de la metilación media logarítmica medida mediante

65 combinaciones de ensayos HM (paneles de genes) de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en dos gráficas, la gráfica superior representa todas las muestras (Normales, sin enfermedad colorrectal, sin cáncer colorrectal y todos los estadíos de CCR), la gráfica inferior solo representa muestras normales y de CCR. La sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilación de ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X.

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La Figura 22 proporciona una visión general de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3+SND1. 5 La Figura 23 proporciona una visión general de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3.

La Figura 24 proporciona una visión general de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2.

La Figura 25 proporciona una visión general de los ensayos de Septina 9+TFAP2E.

La Figura 26 proporciona una visión general de los ensayos de Septina 9+RASSF2.

Las Figuras 27 a 31 proporcionan cada una, una visión general del rendimiento de los ensayos de acuerdo con el

15 Ejemplo 3 en varias poblaciones de pacientes. Cada figura consiste en cuatro gráficas, (una para cada ensayo), donde el eje Y proporciona la sensibilidad y el eje X la concentración de ADN en log 10 ng/ml.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos y usos de kits para detectar trastornos proliferativos de próstata, tal como se define en las reivindicaciones, en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, donde la expresión disminuida y/o metilación de CpG es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

25 En una realización, dicho nivel de expresión se determina detectando la ausencia o nivel de ARNm transcrito de dicho gen. En una realización adicional, dicho nivel de expresión se determina detectando la ausencia o nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia del mismo.

En una realización adicional preferida, dicha expresión se determina detectando la presencia o ausencia de metilación de CpG en dicho gen, donde la presencia de metilación indica la presencia de carcinoma de próstata.

Dicho método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferentemente seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre) obtenida del sujeto con al

35 menos un reactivo, o series de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la secuencia nucleotídica de dicha región diana comprende al menos una secuencia de dinucleótidos de CpG del gen RASSF2; y ii) detectar el carcinoma, al menos en parte. Preferentemente, la región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas, con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1.

Preferentemente, la sensibilidad de dicha detección es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %,

o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 85 %. Preferentemente, la especificidad es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un

45 85%.

Dicho uso del gen puede posibilitarse mediante cualquier análisis de la expresión del gen, mediante análisis de la expresión de ARNm o análisis de expresión proteica. Sin embargo, en la realización más preferida de la invención, la detección de trastornos proliferativos celulares, (preferentemente trastornos cancerosos o pre-cancerosos, y aún más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas), se posibilita mediante el análisis del estado de metilación del gen RASSF2, y/o sus elementos promotores o reguladores.

Se divulga un método para el análisis de muestras biológicas para características asociadas con el desarrollo del

55 cáncer, caracterizándose el método en que el ácido nucleico, o un fragmento del mismo de SEC ID Nº: 1 se pone en contacto con un reactivo o una serie de reactivos capaces de distinguir entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de la secuencia genómica.

Además se divulga un método para determinar parámetros epigenéticos de ADN genómico asociado con el desarrollo del cáncer de próstata. El método tiene utilidad para la detección y el diagnóstico mejorados de dicha enfermedad.

Preferentemente, la fuente de la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculación, eyaculación, 65 orina, sangre, y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, la fuente se selecciona del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células

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aisladas de la sangre obtenidas del sujeto.

Específicamente, la presente invención proporciona un método, tal como se define en las reivindicaciones, para detectar el cáncer de próstata adecuado para su uso en una herramienta diagnóstica, que comprende: obtener una 5 muestra biológica que comprende ácido(s) nucleico(s) genómico(s); poner en contacto el(los) ácido(s) nucleico(s), o un fragmento de los mismos, con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficientes para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metilados o no metilados dentro de una secuencia diana del ácido nucleico objeto, donde la secuencia diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas a, una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos al menos una

10 secuencia de dinucleótidos de CpG; y determinar, basándose al menos en parte en dicha distinción, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótido de CpG diana, o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido de CpG diana.

Preferentemente, distinguir entre secuencias de dinucleótido de CpG metiladas o no metiladas dentro de la

15 secuencia diana comprende conversión o no conversión dependiente del estado de metilación de al menos una de dichas secuencias de dinucleótidos de CpG a la correspondiente secuencia de dinucleótidos convertida o no convertida con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17, y regiones contiguas de las mismas que corresponden a la secuencia diana.

20 Las realizaciones adicionales proporcionan un método para la detección de cáncer de próstata, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende:

obtener una muestra biológica que tenga el ADN genómico objetivo; extraer el ADN genómico; tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas 25 en posición 5 a uracilo u otra base que sea detectablemente distinta a citosina en cuanto a propiedades de hibridación; poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17, y complementos de las

30 mismas, donde el ADN tratado o el fragmento del mismo bien se amplifica para producir un amplificado, o no se amplifica; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilación o un promedio, o un valor que refleje un promedio del nivel de metilación de al menos uno, pero más preferentemente una pluralidad de dinucleótidos de CpG de SEC ID Nº: 1.

35 Preferentemente, la determinación comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: i) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17, y complementos de las mismas; ii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico, unida a una fase sólida, que comprende una

40 secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17, y complementos de las mismas; iii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6,

45 7, 16 y 17, y complementos de las mismas, y extender al menos una de dichas moléculas de ácido nucleico en al menos una base nucleotídica; y iv) secuenciar el amplificado.

Además se divulga un método para el análisis (es decir, detección o clasificación) del carcinoma, que comprende obtener una muestra biológica que tenga el ADN genómico objetivo; extraer el ADN genómico; poner en contacto el 50 ADN genómico, o un fragmento del mismo, que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 o una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con este, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, donde el ADN genómico se digiere de este modo para producir fragmentos de digestión, o no se digiere de este modo; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o sobre una propiedad de al menos uno de dichos fragmentos, el estado de metilación de al menos una secuencia de

55 dinucleótidos de CpG de SEC ID Nº: 1 o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido de CpG de los mismos. Preferentemente, el ADN genómico digerido o no digerido se amplifica antes de dicha determinación.

Además también se divulgan nuevas secuencias de ácido nucleico genómico y químicamente modificadas, así como

60 oligonucleótidos y/o oligómeros de APN para el análisis de patrones de metilación de citosina dentro de SEC ID Nº: 1.

Descripción detallada de la invención

65 Definiciones: La expresión "proporción observada/esperada" ("proporción O/E") se refiere a la frecuencia de dinucleótidos de CpG dentro de una secuencia de ADN particular, y corresponde al [número de sitios de CpG / (número de bases de C x número de bases de G)] / longitud de banda para cada fragmento.

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5 La expresión "isla de CpG" se refiere a una región contigua de ADN genómico que satisface el criterio de (1) tener una frecuencia de dinucleótidos de CpG correspondiente a una "proporción observada/esperada" > 0,6, y (2) tener un "contenido de GC" > 0,5. Las islas de CpG tienen típicamente, pero no siempre, entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 KB, o hasta aproximadamente 2 KB de longitud.

10 La expresión "estado de metilación" o "estatus de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos de CpG en una secuencia de ADN. Los estados de metilación en uno o más sitios de metilación de CpG (teniendo cada uno dos secuencias de dinucleótido de CpG) en una secuencia de ADN incluyen "no metilado", "completamente metilado" y "semi-metilado".

15 La expresión "semi-metilación" o "semimetilación" se refiere al estado de metilación de una doble hebra de ADN donde solo una hebra de la misma está metilada.

El término "ABC", tal como se usa en el presente documento, es una abreviatura para el área bajo la curva. En particular, se refiere al área bajo una curva de Característica Operativa del Receptor (ROC). La curva ROC es una 20 gráfica de la proporción de verdaderos positivos frente a la proporción de falsos positivos para los posibles puntos de corte distintos de una prueba diagnóstica. Muestra la compensación entre sensibilidad y especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (cualquier aumento en la sensibilidad estará acompañado de una disminución en la especificidad). El área bajo una curva ROC (ABC) es una medida para la precisión de una prueba diagnóstica (cuanto mayor sea el área, mejor, el valor óptimo es 1, una prueba al azar puede tener una curva ROC que se

25 encuentre en la diagonal, con un área de 0,5; para referencias: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York, 1975).

El término "micromatriz" se refiere ampliamente tanto a "micromatrices de ADN" como a "microplacas de ADN" tal como se reconoce en la técnica, abarca todos los soportes sólidos reconocidos en la materia, y abarca todos los 30 métodos para fijar moléculas de ácido nucleico a estos o para sintetizar ácidos nucleicos sobre estos.

Los "parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos de genes y secuencias que se necesitan adicionalmente para su regulación. Se denominan mutaciones, en particular, las inserciones, eliminaciones, mutaciones puntuales, inversiones y eliminaciones y, de manera particularmente preferida, los SNP (polimorfismos

35 de un solo nucleótido).

Los "parámetros epigenéticos" son, en particular, la metilación de citosina. Los parámetros epigenéticos adicionales incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas que, sin embargo, no puede analizarse directamente usando el método descrito pero que a su vez, se correlaciona con la metilación del ADN.

40 La expresión "reactivo de bisulfito" se refiere aun reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles tal como se divulga en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metiladas o no metiladas.

45 La expresión "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos de CpG en una secuencia de ADN.

La expresión "MS.AP-PCR" (Reacción en Cadena de la Polimerasa Cebada de manera Arbitraria Sensible a la Metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite una exploración global del genoma 50 usando cebadores ricos en GG para centrarse en las regiones que es más probable que contengan dinucleótidos de CpG, y se describe por Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997.

El término "MethyLight™" se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999.

55 El término ensayo "HeavyMethyl™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo, donde sondas de bloqueo específicas de metilación (también citadas como bloqueantes) que cubren posiciones de CpG entre, o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

60 El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, donde se combina el ensayo MethyLight™ con sondas de bloque específicas de metilación que abarcan posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

65 El término "Ms-SNuPE" (Extensión de Cebador de Un solo Nucleótido sensible a Metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.

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El término "MSP" (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito 5 por Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, y por la patente de los Estados Unidos Nº

5.786.146.

El término "COBRA" (Análisis de restricción de bisulfito combinado) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997.

El término "MCA" (Amplificación de Islas de CpG metiladas) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999, y en el documento WO 00/26401 A1.

El término "hibridación" debe entenderse como un enlace de un oligonucleótido a una secuencia complementaria

15 siguiendo los emparejamientos de base de Watson-Crick en el ADN de muestra, formando una estructura bicatenaria.

Las "condiciones rigurosas de hibridación", tal como se definen en el presente documento, implican hibridar a 68 °C en SSC 5x/ solución de Denhardt 5x/SDS al 1,0 %, y lavar en SSC 0,2x/SDS al 0,1 % a temperatura ambiente, o implican el equivalente de las mismas reconocido en la técnica (por ejemplo, condiciones en las que se lleva a cabo una hibridación a 60 °C en tampón SSC 2,5x, seguida de varias etapas de lavado a 37 °C en una baja concentración de tampón, y permanezca estable). Las condiciones moderadamente rigurosas, tal como se definen en el presente documento, implican incluir lavado en SSC 3x a 42 °C, o el equivalente de las mismas reconocido en la técnica. Los parámetros de concentración de sal y temperatura pueden variarse para lograr el nivel óptimo de identidad entre la

25 sonda y el ácido nucleico diana. Hay disponible orientación referente a dichas condiciones en la técnica, por ejemplo, por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, N.Y.) en la Unidad 2.10.

Las expresiones "enzimas de restricción específicas de metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la metilación" deben entenderse como una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiente del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de dichas enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o está semi-metilado, el corte no tendrá lugar, o con una eficacia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de dichas enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de restricción está metilado, el corte no tendrá lugar, o con una

35 eficacia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no está metilado. Se prefieren las enzimas de restricción específicas de metilación, cuya secuencia de reconocimiento contiene un dinucleótido de Cg (por ejemplo, cgg o cccggg). Además se prefieren para algunas realizaciones enzimas de restricción que no cortan si la citosina en este dinucleótido está metilada en el átomo de carbono C5.

Las "enzimas de restricción específicas de no metilación" o las "enzimas de restricción sensibles a no metilación" son enzimas de restricción que cortan una secuencia de ácido nucleico independientemente del estado de metilación con aproximadamente la misma eficacia. También se llaman "enzimas de restricción inespecíficas de metilación".

En referencia a secuencias de matriz compuesta, la expresión "nucleótidos contiguos" se refiere a una región de

45 secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual de la matriz compuesta, pero no incluye una región de la secuencia de matriz compuesta que incluya un "nodo", tal como se define anteriormente en el presente documento.

El término "RASSF2" debe entenderse como inclusivo de todas las variantes del mismo y todos los elementos promotores y reguladores del mismo. Además, como se conocen una variedad de SNP dentro de dicho gen, el término debe entenderse como inclusivo de todas las variantes de secuencia del mismo.

El término "precanceroso" debe entenderse como cualquier trastorno proliferativo celular que esté sufriendo transformación maligna.

55 Se divulga un método para detectar carcinoma en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en la que la expresión disminuida y/o la metilación de CpG es indicativo de la presencia o clase de dicho trastorno. Dichos marcadores pueden usarse para el diagnóstico de cánceres, tales como cáncer de próstata o de colon, incluyendo la detección temprana durante las etapas precancerosas de la enfermedad.

Los marcadores divulgados son particularmente eficaces para detectar trastornos proliferativos celulares malignos, (preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas), de este

65 modo proporcionando medios mejorados para la detección temprana, clasificación y tratamiento de dichos trastornos.

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Además de las realizaciones anteriores en las que se analiza el análisis de metilación del gen RASSF2, la divulgación presenta paneles adicionales de genes que comprenden a RASSF2 con nueva utilidad para la detección de cánceres, en particular, cáncer de próstata y/o colorrectal. El cáncer de próstata puede detectarse y/o diferenciarse de trastornos benignos de próstata determinando la expresión de una pluralidad de genes que comprenden RASSF2A. En una realización, dicha pluralidad de genes consiste adicionalmente en 1, 2 o 3 genes seleccionados del grupo que consisten en GSTP1, HIST1H4J y TFAP2E. Se prefiere particularmente el análisis combinado de RASSF2A y TFAP2E.

El cáncer colorrectal (incluyendo afecciones colorrectales precancerosas) puede detectarse determinando la expresión de una pluralidad de genes que comprende RASSF2A. En una realización, dicha pluralidad de genes consiste adicionalmente en 1, 2 o 3 genes seleccionados del grupo que consisten en Septina 9, PCDHGC3, SND1 y TFAP2E. Se prefiere particularmente el análisis combinado de RASSF2A y Septina 9. Otras combinaciones preferidas incluyen:

Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3+SND1

Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3

Septina 9+TFAP2E+RASSF2

Se prefiere particularmente que se analicen las posiciones de CpG de dichos genes comprendidos en las secuencias de acuerdo con la Tabla 1.

La modificación de bisulfito de ADN es una herramienta reconocida en la técnica usada para evaluar el estado de metilación de CpG. La 5-metilcitosina es la modificación de base covalente más frecuente en el ADN de células eucariotas. Juega un papel, por ejemplo, en la regulación de la transcripción, en la impronta genética, y en la tumorigénesis. Por lo tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de información genética tiene un interés considerable. Sin embargo, las posiciones de 5-metilcitosina no pueden identificarse mediante secuenciación, debido a que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de emparejamiento de bases que la citosina. Además, la información epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde por completo durante, por ejemplo, la amplificación PCR.

El método usado más frecuentemente para analizar ADN en busca de la presencia de 5-metilcitosina está basado en la reacción específica de bisulfito con citosina mediante la cual, tras la posterior hidrólisis alcalina, la citosina se convierte a uracilo, lo que corresponde a timina en su comportamiento de emparejamiento de bases. De manera significativa, sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin modificar en estas condiciones. En consecuencia, el ADN original se convierte de tal modo que la metilcitosina, que originariamente no podía distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, puede detectarse ahora como la única citosina restante usando técnicas biológicas moleculares convencionales reconocidas en la técnica, por ejemplo, mediante amplificación e hibridación, o mediante secuenciación. Todas estas técnicas están basadas en las propiedades diferenciales de emparejamiento de bases, que ahora pueden explotarse por completo.

La técnica anterior, en cuanto a la sensibilidad, se define mediante un método que comprende atrapar el ADN a analizar en una matriz de agarosa, evitando de este modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con ADN monocatenario), y reemplazando todas las etapas de precipitación y purificación con una diálisis rápida (Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996). Por lo tanto, es posible analizar el estado de metilación de células individuales, lo que ilustra la utilidad y sensibilidad del método. Se proporciona una revisión de métodos reconocidos en la técnica para detectar 5-metilcitosina por Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998.

La técnica de bisulfito, salvo algunas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997), solo se usa actualmente en investigación. En todos los casos, se amplifican fragmentos cortos específicos de un gen conocido después del tratamiento de bisulfito, y o bien se secuencian completamente (Olek y Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997), se someten a una o más reacciones de extensión de cebador (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997; documento WO 95/00669; Patente de los Estados Unidos Nº 6.251.594) para analizar las posiciones individuales de citosina, o se tratan mediante digestión enzimática (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997). También se ha descrito en la técnica la detección mediante hibridación (Olek et al., documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de metilación respecto a genes individuales (Grigg y Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; documentos WO 97/46705 y WO 95/15373).

La presente invención proporciona el uso, tal como se define en las reivindicaciones, de la técnica de bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos de CpG en SEC ID Nº: 1. Los dinucleótidos de CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (como alternativa, conocidos como sobre-y bajo-metilados, respectivamente). Sin embargo, los métodos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras biológicas de una naturaleza heterogénea, por ejemplo, una baja concentración de células tumorales en un origen de sangre o eyaculación. Por consiguiente,

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cuando se analiza el estado de metilación de una posición de CpG en dicha muestra, el experto en la materia puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fracción, relación, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG particular en oposición a un estado de metilación. Por consiguiente, la expresión estado de metilación o estatus de metilación también debe entenderse como un valor que refleja el grado de metilación en una posición de CpG. A menos que se indique específicamente, los términos "hipermetilado" o "sobremetilado" deben entenderse como un nivel de metilación por encima de el de un punto de corte especificado, donde dicho punto de corte puede ser un valor que representa el nivel de metilación media o mediana para una población dada, o es preferentemente un nivel de corte optimizado. El "valor de corte" también se cita en el presente documento como un "umbral". En el contexto de la presente invención, los términos "metilado", "hipermetilado" o "sobremetilado" deben entenderse como inclusivos de un nivel de metilación por encima del valor de corte de metilación de cero (0) % (o equivalentes del mismo) para todas las posiciones de CpG en y asociadas con (por ejemplo, en regiones promotoras o reguladoras) el gen RASSF2.

De acuerdo con la presente invención, la determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos de CpG en SEC ID Nº: 1 tiene utilidad en el diagnóstico y detección del cáncer de próstata.

Procedimientos de ensayo de metilación. Se conocen en la técnica varios procedimientos de ensayo de metilación, y pueden usarse conjuntamente con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o de una pluralidad de dinucleótidos de CpG (por ejemplo, islas de CpG) en una secuencia de ADN. Dichos ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ADN de ADN tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia de Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles a metilación.

Por ejemplo, se ha simplificado la secuenciación genómica para el análisis de patrones de metilación de ADN de distribución de 5-metilcitosina usando tratamiento de bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18271831, 1992). Además, se usa digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri y Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996), o COBRA (Análisis de restricción de bisulfito combinado) (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997).

COBRA. El análisis COBRA™ es un ensayo cuantitativo de metilación útil para determinar los niveles de metilación de ADN en locus génicos específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, se usa digestión con enzimas de restricción para revelar diferencias de secuencia dependientes de metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de metilación se introducen primeramente en el ADN genómico mediante tratamiento convencional con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Se lleva a cabo entonces la amplificación PCR del ARN convertido con bisulfito usando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección usando sondas de hibridación específicas marcadas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de manera linealmente cuantitativa a lo largo de un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica puede aplicarse de manera fiable a ADN obtenido a partir de muestras de tejido incluidas en parafina microdiseccionadas.

Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); enzimas de restricción y tampón adecuado; oligonucleótido de hibridación al gen; oligonucleótido de control de hibridación; kit de marcado de cinasas para sonda oligonucleotídica; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

Preferentemente, se usan ensayos tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), reacciones Ms-SNuPE™ (Extensión de Cebador de Un solo Nucleótido sensible a Metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; Patente de los Estados Unidos Nº 5.786.146), y amplificación de islas de CpG metiladas ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999) solos o en combinación con otros de estos métodos.

El ensayo "HeavyMethyl™", es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación basándose en la amplificación específica de metilación de ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (también citadas como bloqueantes) que cubren posiciones de CpG entre, o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™,

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donde se combina el ensayo MethyLight™ con sondas de bloque específicas de metilación que abarcan posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también puede usarse en combinación con cebadores de amplificación específicos de metilación.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); oligonucleótidos de bloqueo; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

MSP. La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios de CpG en una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a metilación (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente de los Estados Unidos Nº 5.786.146). En resumen, se modifica el ADN mediante bisulfito de sodio convirtiendo todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, a uracilo, y posteriormente amplificarlas con cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. La MSP solo requiere pequeñas cantidades de ADN, es sensible para alelos metilados al 0,1 % de un locus de isla de CpG dado, y puede efectuarse en ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en MSP) para el análisis MSP pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR metilados o no metilados para genes específicos (o secuencias de ADN tratadas con bisulfito o isla de CpG), tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados, y sondas específicas.

MethyLight™. El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqMan™) tecnología que no necesita manipulaciones adicionales después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). En resumen, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mezclada de ADN que se convierte, en una solución de bisulfito de sodio, en un conjunto de diferencias de secuencia dependientes de metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los restos de citosina no metilada a uracilo). Entonces se lleva a cabo la PCR basada en fluorescencia en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que solapan a dinucleótidos de CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede suceder tanto a nivel del proceso de amplificación y al nivel del proceso de detección de fluorescencia.

El ensayo MetyLight™ puede usarse como prueba cuantitativa para patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en la que la discriminación de secuencia sucede a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de la PCR proporciona amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que solapa a un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN introducido mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda solapan a ningún dinucleótido de CpG. Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para metilación genómica sondando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios potenciales de metilación.

El proceso MethyLight™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo, "TaqMan™", Lightcycler™ etc. Por ejemplo, se trata al ADN genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan™; por ejemplo, con cebadores de MSP y/o oligonucleótidos bloqueantes de HeayMethyl y sonda TaqMan™. La sonda TaqMan™ está marcada dualmente con moléculas fluorescentes "indicadoras" e "inactivadoras", y está diseñada para ser específica para una región de relativamente alto contenido en GC de tal forma que se funden a una temperatura aproximadamente 10 °C mayor en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan™ se mantenga completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, finalmente alcanzará la sonda TaqMan™ hibridada. La actividad de endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará entonces a la sonda TaqMan™ digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no desactivada usando un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); sondas TaqMan™ o Lightcycler™; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en la que la discriminación de secuencia sucede a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de la PCR proporciona amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa a un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN introducido mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda solapan a ningún dinucleótido de CpG. Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para metilación genómica sondando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada

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en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios potenciales de metilación.

El proceso QM™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo, "TaqMan™", Lightcycler™ etc. en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y la sonda TaqMan™. La sonda TaqMan™ está marcada dualmente con moléculas fluorescentes "indicadoras" e "inactivadoras", y está diseñada para ser específica para una región de relativamente alto contenido en GC de tal forma que se funden a una temperatura aproximadamente 10 °C mayor en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan™ se mantenga completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, finalmente alcanzará la sonda TaqMan™ hibridada. La actividad de endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará entonces a la sonda TaqMan™ digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no desactivada usando un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en QM™) para el análisis QM™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); sondas TaqMan™ o Lightcycler™; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios de CpG específicos basada en el tratamiento del ADN con bisulfito, seguida de extensión de cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, se hace reaccionar el ADN genómico con bisulfito de sodio para convertir citosina no metilada en uracilo a la vez que se deja la 5-metilcitosina sin cambiar. La amplificación de la secuencia diana deseada se lleva a cabo entonces usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y usa como patrón para el análisis de metilación en el sitio (o sitios) de CpG de interés. Pueden analizarse pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdiseccionadas), y evita el uso de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en sitios de CpG.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE™) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para gen específico; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

Se determinó que la secuencia genómica de acuerdo con SEC ID Nº: 1, y las variantes tratadas de origen no natural de la misma de acuerdo con las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17, tienen una utilidad nueva para la detección temprana del cáncer, en particular del cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas.

Se divulga un método que comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto ADN genómico (preferentemente aislado de fluidos corporales) obtenido de un sujeto con al menos un reactivo, o series de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados en el gen RASSF2 (incluyendo sus regiones promotoras y reguladoras); y ii) detectar trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas, producido con una sensibilidad mayor o igual al 80 % y una especificidad mayor o igual al 80 %.

Preferentemente, la sensibilidad es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 85 %. Preferentemente, la especificidad es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 85 %.

El ADN genómico puede aislarse mediante cualquier método convencional en la materia, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. En resumen, donde el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica tiene que romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN entonces puede limpiarse de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico entonces se recupera de la solución. Esto tiene que llevarse a cabo mediante una variedad de métodos incluyendo extracción con sal, extracción orgánica o uniendo el ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método estará afectada por varios factores incluyendo el tiempo, el gasto y la cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que contienen material neoplásico o preneoplásico son adecuados para su uso en el presente método; se prefieren líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente de ADN preferida; se prefieren particularmente eyaculación, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas y células aisladas de la sangre.

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5 La muestra de ADN genómico entonces se trata con al menos un reactivo, o series de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas, con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la secuencia de acuerdo con SEC ID Nº: 1 respectivamente, donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido de CpG.

Se prefiere particularmente que dicho reactivo convierta las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' a uracilo, timina, u otra base que es diferente de citosina en cuanto a su comportamiento de hibridación. Sin embargo, en una realización alternativa, dicho reactivo puede ser una enzima de restricción sensible a metilación.

15 Donde la muestra de ADN genómico se trata de un modo tal que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten a uracilo, timina, u otra base que sea diferente de citosina en cuanto a su comportamiento de hibridación, se prefiere que este tratamiento se lleve a cabo con bisulfito (sulfito de hidrógeno, disulfito) y posterior hidrólisis alcalina. Dicho tratamiento da como resultado la conversión de SEC ID Nº: 1 a las SEC ID Nº: 6, y 7 (respectivamente) donde dichos dinucleótidos de CpG están metilados o en las SEC ID Nº: 16, y 17 donde dichos dinucleótidos de CpG no están metilados.

Entonces se analiza el ADN tratado para determinar el estado de metilación de RASSF2 antes del tratamiento. Se prefiere particularmente que la región diana comprenda, o hibride en condiciones rigurosas con al menos 16

25 nucleótidos contiguos de RASSF2. Se prefiere que la secuencia de dicho gen de acuerdo con SEC ID Nº: 1 se analice. El método de análisis puede seleccionarse entre los conocidos en la técnica, incluyendo aquellos listados en el presente documento. Se prefieren particularmente MethyLight™, MSP y el uso de oligonucleótidos bloqueantes (HeavyMethyl™) tal como se describe en el presente documento. Se prefiere además que cualquier oligonucleótido usado en dichos análisis (incluyendo cebadores, oligonucleótidos bloqueantes y sondas de detección) deben ser inversamente complementarios, idénticos, o hibridar en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 16 pares de bases de longitud de las secuencias de bases de uno o más de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas.

La metilación aberrante, más específicamente la hipermetilación de RASSF2 (así como de las regiones promotoras

35 y/o reguladoras del mismo) está asociada con la presencia de cáncer de próstata. Por consiguiente, donde una muestra biológica presenta cualquier grado de metilación, dicha muestra debe determinarse como neoplásica.

El análisis del gen RASSF2 permite por primera vez detectar trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas, producido con una sensibilidad mayor o igual al 80 % y una especificidad mayor o igual al 80 %. La sensibilidad se calcula como: (neoplasia detectada/toda neoplasia) por ejemplo: (carcinoma de próstata detectado/todos los carcinomas de próstata); y la especificidad se calcula como (negativos no detectados/total de negativos).

45 Preferentemente, la sensibilidad es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 85 %. Preferentemente, la especificidad es de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 96 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 85 %.

Dicho método puede estar posibilitado mediante cualquier análisis de la expresión de un ARN transcrito a partir de esto o de un polipéptido o proteína traducido a partir de dicho ARN, preferentemente mediante análisis de la expresión de ARN o análisis de la expresión de polipéptidos. Por consiguiente, la presente invención también proporciona ensayos y métodos diagnósticos, tanto cuantitativos como cualitativos para detectar la expresión del gen

55 RASSF2 en un sujeto y determinar a partir de este la presencia o ausencia del cáncer en dicho sujeto.

La expresión aberrante de ARNm transcrito del gen RASSF2 está asociada con la presencia de cáncer de próstata y colorrectal en un sujeto. De acuerdo con la presente invención, la expresión disminuida (y/o presencia de metilación) está asociada con la presencia de cáncer, y al revés, la sobreexpresión (y/o ausencia de metilación) está asociada con la ausencia de cáncer.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica un gen o secuencia genómica, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que comprende materia celular del tumor. Los tipos de muestra adecuados incluyen líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos

65 corporales, eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y todas las posibles combinaciones de los mismos. Se prefiere que dichos tipos de

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muestra sean eyaculación o fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre.

La muestra puede tratarse para extraer el ARN contenido en esta. Entonces se analiza el ácido nucleico resultante de la muestra. Se conocen muchas técnicas en el estado de la técnica para determinar los niveles absolutos y relativos de la expresión génica, las técnicas usadas de manera común adecuadas para su uso en la presente invención incluyen hibridación in situ (por ejemplo, FISH), análisis de Northern, ensayos de protección de RNasa (RPA), micromatrices y técnicas basadas en la PCR, tales como PCR cuantitativa y PCR de visualización diferencial

o cualquier otro método de detección de ácidos nucleicos.

Se prefiere particularmente el uso de la técnica de la reacción en cadena de transcripción/polimerización inversa (RT-PCR). El método de la RT-PCR se conoce bien en la técnica (por ejemplo, véase Watson y Fleming, citado anteriormente).

El método de la RT-PCR puede llevarse a cabo como sigue. El ARN celular total se aísla, por ejemplo, mediante el método de isotiocianato de guanidinio convencional y se transcribe inversamente el ARN total. El método de transcripción inversa implica la síntesis de ADN sobre una plantilla de ARN usando una enzima transcriptasa inversa y un cebador dT de oligonucleótido de extremo 3' y/o cebadores hexaméricos al azar. El ADNc producido de este modo se amplifica entonces mediante la PCR. (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, págs. 316-325, 1987).

Se prefiere además la variante en "tiempo real" de la RT-PCR, donde el producto de la PCR se detecta mediante sondas de hibridación (por ejemplo, TaqMan, Lightcycler, Molecular Beacons y Scorpion) o verde SYBR. La señal detectada de las sondas o de verde SYBR se cuantifica entonces bien mediante referencia a una curva patrón o comparando los valores de Ct con los de un patrón de calibración. El análisis de genes constitutivos se usa a menudo para normalizar los resultados.

En el análisis de transferencia de Northern se hace correr el ARNm total o poli(A)+ARNm en un gen de agarosa desnaturalizante y se detecta mediante hibridación a una sonda marcada sobre el mismo gen seco o sobre una membrana. La señal resultante es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN.

La comparación de las señales de dos o más poblaciones de células o tejidos revela diferencias relativas en los niveles de expresión génica. La cuantificación absoluta puede efectuarse comparando la señal con una curva patrón generada usando cantidades conocidas de un transcrito in vitro correspondiente al ARN diana. El análisis de genes constitutivos, genes en los que se espera que sus niveles de expresión se mantengan relativamente constantes independientemente de las condiciones, se usa normalmente para normalizar los resultados, eliminando cualquier diferencia aparente causada por la transferencia desigual de ARN a la membrana o la carga desigual de ARN sobre el gel.

La primera etapa en el análisis de Northern es aislar ARN puro intacto de las células o tejido de interés. Debido a que las transferencias de Northern distinguen al ARN por tamaño, la integridad de la muestra influencia el grado con el que se localiza una señal en una sola banda. Las muestras de ARN parcialmente degradadas darán como resultado que la señal esté alterada o distribuida a lo largo de varias bandas con una pérdida general de sensibilidad y posiblemente una interpretación errónea de los datos. En el análisis de la transferencia de Northern, el ADN, el ARN y las sondas oligonucleotídicas pueden usarse y estas sondas están preferentemente marcadas (por ejemplo, marcadores radiactivos, marcadores de masa o marcadores fluorescentes). El tamaño del ARN diana, no la sonda, determinará el tamaño de la banda detectada, por lo que métodos tales como el marcado de cebado aleatorio, que genera sondas de longitudes variables, son adecuados para la síntesis de la sonda. La actividad específica de la sonda determinará el nivel de sensibilidad, por lo que se prefiere el uso de sondas con elevadas actividades específicas.

En un ensayo de protección de RNasa, se hibridan en solución el ARN diana y una sonda de ARN de una longitud definida. Después de la hibridación, se digiere el ARN con RNasas específicas para ácidos nucleicos monocatenarios para eliminar cualquier ARN diana y sonda no hibridado monocatenario.

Las RNasas se inactivan, y se separa el ARN, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacta es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN. Puede usarse RPA para la cuantificación relativa y absoluta de la expresión génica y también para mapear la estructura del ARN, tales como los límites de intrón/exón y los sitios de inicio de la transcripción. El ensayo de protección de RNasa es preferible al análisis de transferencia de Northern ya que tiene generalmente un límite de detección más bajo.

Las sondas de ARN antisentido usadas en RPA se generan mediante la transcripción in vitro de un molde de ADN con un punto de terminación definido y están típicamente en el intervalo de 50-600 nucleótidos. El uso de sondas de ARN que incluye secuencias adicionales no homólogas al ARN diana permite que el fragmento protegido se distinga de la sonda de longitud completa. Las sondas de ARN se usan típicamente en vez de sondas de ADN debido a la

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facilidad de generar sondas de ARN monocatenario y a la reproducibilidad y fiabilidad de la digestión del dúplex de ARN:ARN con RNasas (Ausubel et al., 2003), se prefieren particularmente sondas con actividades específicas elevadas.

Se prefiere particularmente el uso de micromatrices. El proceso de análisis de micromatrices puede dividirse en dos partes principales. Primeramente está la inmovilización de secuencias génicas conocidas sobre portaobjetos de vidrio u otro soporte sólido seguido de la hibridación del ADNc marcado fluorescentemente (que comprende las secuencias a interrogar) a los genes conocidos inmovilizados sobre el portaobjetos de vidrio (u otra fase sólida). Después de la hibridación, las matrices se exploran usando un escáner de micromatrices fluorescente. El análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de diferentes genes proporciona una medida de las diferencias en la expresión génica.

Las matrices de ADN pueden generarse inmovilizando oligonucleótidos pre-sintetizados sobre portaobjetos de vidrio preparados u otras superficies sólidas. En este caso, las secuencias representativas de genes se fabrican y preparan usando métodos convencionales de síntesis de oligonucleótidos y de purificación. Estas secuencias de genes sintetizadas son complementarias con los transcritos de ARN del gen RASSF2 y tienen a ser secuencias más cortas en el intervalo de 25-70 nucleótidos. Como alternativa, los oligonucleótidos inmovilizados pueden sintetizarse químicamente in situ sobre la superficie del portaobjetos. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos adecuados a los puntos de la micromatriz; los puntos que no reciben un nucleótido se protegen durante cada etapa del proceso usando máscaras físicas o virtuales. Preferentemente, dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos bloqueados.

En experimentos de micromatriz de perfil de expresión, los moldes de ARN usados son representativos del perfil de transcripción de las células o tejidos que se estén estudiando. El ARN se aísla primeramente de la población de células o tejidos a comparar. Cada muestra de ARN se usa entonces como molde para generar ADNc marcado fluorescentemente mediante una reacción de transcripción inversa. El marcado fluorescente del ADNc puede lograrse mediante métodos de marcaje directo o de marcaje indirecto. Durante el marcaje directo, los nucleótidos modificados fluorescentemente (por ejemplo, Cy®3-o Cy®5-dCTP) se incorporan directamente en el ADNc durante la transcripción inversa. Como alternativa, el marcaje indirecto puede lograrse incorporando nucleótidos modificados con aminoalilo durante la síntesis de ADNc y después conjugando un tinte de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) al ADNc modificado con aminoalilo después de completar la reacción de transcripción inversa. Como alternativa, la sonda puede no estar marcada, pero puede ser detectable mediante unión específica con un ligando que esté marcado, de forma directa o indirecta. Los marcadores y métodos adecuados para marcar ligandos (y sondas) se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos que pueden incorporarse mediante métodos conocidos (por ejemplo, traducción de muescas o tratamiento con cinasas). Otros marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.

Para efectuar el análisis de expresión génica diferencial, el ADNc generado a partir de diferentes muestras de ARN se marca con Cy®3. El ADNc marcado resultante se purifica para eliminar nucleótidos no incorporados, tinte suelto y ARN residual. Después de la purificación, las muestras de ADNc marcadas se hibridan a la micromatriz. La rigurosidad de la hibridación se determina mediante una variedad de factures durante el procedimiento de hibridación y de lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, el tiempo de duración y la concentración de formamida. Estos factores se indican de manera general en, por ejemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989). La micromatriz se explora después de la hibridación usando un escáner de micromatriz fluorescente. La intensidad de fluorescencia de cada punto indica el nivel de expresión del gen analizado; los puntos brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras que los puntos tenues indican una expresión débil.

Una vez se han obtenido las imágenes, tienen que analizarse los datos primarios. Primeramente, tiene que restarse la fluorescencia de fondo de la fluorescencia de cada punto. Los datos se normalizan entonces con una secuencia de control, tal como ácidos nucleicos exógenos añadidos (preferentemente ARN o ADN), o un panel de genes constitutivos para tener en cuenta cualquier hibridación no específica, imperfecciones de la matriz o variabilidad en la configuración de la matriz, marcaje de ADNc, hibridación o lavado. La normalización de datos permite que se comparen los resultados de múltiples matrices.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de kits en el diagnóstico de cáncer de próstata en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, comprendiendo dicho kit: un medio para medir el nivel de transcripción del gen RASSF2. En una realización preferida, los medios para medir el nivel de transcripción comprenden oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción de RASSF2. En una realización más preferida, el nivel de transcripción se determina mediante técnicas seleccionadas del grupo de análisis de transferencia de Northern, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, protección de RNasa, y micromatriz. En otra realización de la invención el kit además comprende medios para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que además comprende un envase que es lo más preferentemente adecuado para contener los medios para medir el nivel de transcripción y la muestra biológica del paciente, y más preferentemente comprende además instrucciones para su uso e interpretación de los resultados del kit.

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En una realización preferida, el kit comprende (a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción del gen RASSF2;

5 (b) un recipiente, preferentemente adecuado para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprende los productos de transcripción donde los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y opcionalmente, (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes, tales como tampón de hibridación (donde los oligonucleótidos son para su uso como sonda) envasados en un recipiente separado. Como alternativa, en los casos donde los oligonucleótidos se van a usar para amplificar una región diana, el kit puede contener, envasado en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de cebadores mediada por la

15 polimerasa, tal como PCR. Preferentemente, dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Se prefiere además que dicho kit contenga además un reactivo de RNasa.

De acuerdo con la presente invención, la expresión disminuida de dichos polipéptidos de RASSF2 está asociada con la presencia de cáncer de próstata.

Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para detectar polipéptidos. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, espectrometría de masas, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, métodos inmunoquímicos, ensayos de aglutinante-ligando, técnicas inmunohistoquímicas, aglutinación y ensayos de complemento (por ejemplo, véase Basic and Clinical Immunology, Sites y Terr, eds., Appleton y Lange, Norwalk, Conn. págs 217-262, 1991, que se

25 incorpora por referencia). Se prefieren métodos de aglutinante-ligando que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con un epítopo o epítopos y desplazar de manera competitiva un polipéptido marcado o derivado del mismo.

Pueden usarse anticuerpos específicos para el(los) polipéptido(s) sintetizado(s) por el gen RASSF2. Dichos anticuerpos son útiles para el diagnóstico del cáncer. Puede inducirse la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales mediante el uso de un epítopo codificado por un polipéptido del gen RASSF2 como antígeno. Dichos anticuerpos pueden a su vez usarse para detectar polipéptidos expresados como marcadores para el diagnóstico del cáncer. Los niveles de dichos polipéptidos presentes pueden cuantificarse mediante métodos convencionales. La unión anticuerpo-polipéptido puede detectarse y cuantificarse mediante una variedad de medios conocidos en la técnica, tales como marcaje con ligandos fluorescentes o radiactivos. La invención además comprende el uso de kits

35 para llevar a cabo los procedimientos anteriormente mencionados, donde dichos kits contienen anticuerpos específicos para los polipéptidos investigados.

Se conocen bien numerosos inmunoensayos de unión de polipéptido competitivos y no competitivos en la técnica. Los anticuerpos empleados en dichos ensayos pueden estar no marcados, por ejemplo, tal como se usan en pruebas de aglutinación, o marcados para su uso en una variedad de métodos de ensayo. Los marcadores que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, fluoróforos, quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, tintes y similares. Los ensayos preferidos incluyen, pero sin limitación, radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares. Pueden producirse anticuerpos policlonales o

45 monoclonales o epítopos de los mismos para su uso en los inmunoensayos mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

En una realización alternativa del método, las proteínas pueden detectarse mediante análisis de transferencia de Western. Dicho análisis es convencional en la técnica. En resumen, las proteínas se separan mediante electroforesis, por ejemplo SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfieren entonces a una membrana adecuada (o papel) por ejemplo, nitrocelulosa, manteniendo la separación espacial lograda por la electroforesis. Después se incuba la membrana con un agente de bloqueo para unir los sitios adherentes restantes sobre la membrana, los agentes usados de manera común incluyen proteína genérica (por ejemplo, proteína láctea). Entonces se añade un anticuerpo específico para la proteína de interés, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, por

55 ejemplo, mediante tintes o medios enzimáticos (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante). Entonces se detecta la localización del anticuerpo sobre la membrana.

En una realización alternativa del método, las proteínas pueden detectarse mediante inmunohistoquímica (el uso de anticuerpos para sondar antígenos específicos en una muestra). Dicho análisis es convencional en la técnica, donde la detección de antígenos en tejidos se conoce como inmunohistoquímica, mientras que la detección en células cultivadas se denomina generalmente inmunocitoquímica. En resumen, el anticuerpo primario se detecta uniéndolo a su antígeno específico. Entonces se une el complejo antígeno-anticuerpo mediante un anticuerpo secundario conjugado a una enzima. En presencia del sustrato y cromógeno necesarios, la enzima unida se detecta de acuerdo con depósitos coloreados en los sitios de unión de antígeno-anticuerpo. Hay una amplia variedad de tipos de 65 muestra adecuados, afinidad de antígeno-anticuerpo, tipos de anticuerpo, y métodos para potenciar la detección. Por lo tanto, las condiciones óptimas para la detección inmunohistoquímica o inmunocitoquímica tienen que

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determinarse por el experto en la materia para cada caso individual.

Un enfoque para preparar anticuerpos para un polipéptido es la selección y preparación de una secuencia de aminoácidos de la totalidad o parte del polipéptido, sintetizando químicamente la secuencia de aminoácidos e inyectándola en un animal adecuado, normalmente un conejo o un ratón (Milstein y Kohler, Nature 256:495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981).

Los métodos para la preparación de los polipéptidos o epítopos de los mismos incluyen, pero sin limitación, síntesis química, técnicas de ADN recombinante o aislamiento a partir de muestras biológicas.

En la etapa final del método, se determina el diagnóstico del paciente, por el cual la expresión disminuida (de ARNm

o polipéptidos de RASSF2) es indicativa de la presencia del cáncer. La expresión "expresión disminuida" debe como expresión al nivel detectado menor que un valor de corte predeterminado que puede seleccionarse del grupo que consiste en la media, mediana o un valor umbral optimizado.

Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un kit en el diagnóstico del cáncer en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende: un medio para detectar polipéptidos de RASSF2.

Los medios para detectar los polipéptidos comprenden preferentemente anticuerpos, derivados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos. Los polipéptidos se detectan lo más preferentemente mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo marcado. El kit puede comprender además medios para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende además un envase adecuado para contener los medios para detectar los polipéptidos en la muestra biológica del paciente, y más preferentemente comprende además instrucciones para su uso e interpretación de los resultados del kit-En una realización preferida el kit comprende: (a) un medio para detectar polipéptidos de RASSF2; (b) un envase adecuado para contener el dicho medio y la muestra biológica del paciente que comprende los polipéptidos donde los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b); y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes, tales como tampones o soluciones adecuadas para bloquear, lavar o recubrir, envasadas en un envase separado.

Se pone un énfasis particular en una nueva aplicación del análisis de los niveles y/o patrones de metilación en dichas secuencias que permite una detección, caracterización y/o tratamiento preciso del cáncer. La detección temprana del cáncer está directamente relacionada con el pronóstico de la enfermedad, y el método divulgado por lo tanto permite al médico y al permite tomar decisiones de tratamiento mejores y más informadas.

MEJORAS ADICIONALES

Se divulgan nuevos usos para la secuencia genómica de SEC ID Nº: 1 y variantes modificadas de SEC ID Nº: 1, así como oligonucleótidos y/o oligómeros de APN para el análisis de patrones de metilación de citosina dentro de SEC ID Nº: 1.

Se divulga el análisis adicional del estado de metilación de uno o más dinucleótidos de CpG en SEC ID Nº: y 1 y secuencias complementarias a esta.

También se divulgan ácidos nucleicos, derivados de la SEC ID Nº: 1 genómica, donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico a uracilo u otra base que es diferente de manera detectable a citosina en cuanto a su hibridación. La secuencia genómica en cuestión puede comprender una o más posiciones de CpG metiladas consecutivas. Dicho tratamiento comprende preferentemente el uso de un reactivo seleccionado del grupo que consiste en bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de los mismos. Además se divulga un ácido nucleico modificado de origen no natural que comprende una secuencia de al menos 16 bases nucleotídicas contiguas de longitud de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17. Dicho ácido nucleico puede tener al menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico que no es idéntica o complementaria a la totalidad o una porción de las secuencias de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 pero no SEQ ID NO: 1 u otro ADN de origen natural.

Se prefiere que dicha secuencia comprenda al menos un dinucleótido de CpG, TpA o CpA y secuencias complementarias a esta. Las secuencias de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 proporcionan versiones modificadas de origen no natural del ácido nucleico de acuerdo con SEC ID Nº: 1, donde la modificación de cada secuencia genómica da como resultado la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y distinta de dicha secuencia genómica del modo a continuación. Para cada hebra sentido de ADN genómico, por ejemplo, SEC

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ID Nº: 1, se divulgan cuatro versiones convertidas. Una primera versión donde "C" se convierte a "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para la secuencia genómica, todos los restos de "C" de las secuencias de dinucleótido de CpG están metiladas y por lo tanto no se convierten); una segunda versión divulga el complemento de la secuencia de ADN genómico divulgada (es decir, hebra antisentido), donde "C" se convierte a "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para todos los restos de "C" de las secuencias de dinucleótido de CpG están metiladas y por lo tanto no se convierten). Las secuencias "sobremetiladas" convertidas de SEC ID Nº: 1 corresponden a SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7. Se proporciona una tercera versión químicamente convertida de cada secuencia genómica, donde "C" se convierte a "T" para todos los restos de "C", incluyendo aquellos de secuencias de dinucleótidos de "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para las secuencias genómicas, todos los restos de "C" de secuencias de dinucleótidos de CpG no están metilados); una versión químicamente convertida final de cada secuencia divulga el complemento de la secuencia de ADN genómico divulgada (es decir, hebra antisentido), donde "C" se convierte a "T" para todos los restos de "C", incluyendo aquellos de secuencias de dinucleótidos de "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para el complemento (hebra antisentido) de cada secuencia genómica, todos los restos de "C" de secuencias de dinucleótidos de CpG no están metilados). Las secuencias "bajo-reguladas" convertidas de SEC ID Nº: 1 corresponden a SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5.

De manera significativa, hasta ahora, las secuencias y moléculas de ácido nucleico de acuerdo con las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 no estaban implicadas o conectadas con la detección, clasificación o tratamiento del cáncer.

Además, se divulgan oligonucleótidos u oligómeros adecuados para su uso en los métodos de la invención para detectar el estado de metilación de la citosina en ADN genómico o tratado (químicamente modificado), de acuerdo con las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16 y 17. Dichos oligonucleótidos u oligómeros proporcionan nuevos medios diagnósticos. Dicho u oligómero comprende una secuencia de ácido nucleico que tienen una longitud de al menos nueve (9) nucleótidos que es idéntica a, hibrida, en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas (tal como se definen anteriormente en el presente documento), una secuencia de ácido nucleico tratada de acuerdo con las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 y/o secuencias complementarias a estas, o con una secuencia genómica de acuerdo con SEC ID Nº: 1 y/o secuencias complementarias a esta.

Por lo tanto, se divulgan moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos y moléculas de ácidos peptidonucleicos (PNA) (oligómeros de PNA) que hibridan en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o rigurosas con la totalidad o parte de las secuencias de las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16 y 17 o con los complementos de las mismas. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico que hibride en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o rigurosas con la totalidad o una porción de las secuencias de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 pero no SEQ ID NO: 1 u otro ADN genómico humano.

La porción idéntica o que hibrida de los ácidos nucleicos que hibridan es típicamente de al menos 9, 16, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, moléculas más largas tienen utilidad inventiva.

Preferentemente, la porción que hibrida de los ácidos nucleicos que hibridan de la invención es al menos un 95 %, o al menos un 98 %, o un 100 % idéntica a la secuencia, o a una porción de la misma de las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16 y 17, o a los complementos de las mismas.

Pueden usarse ácidos nucleicos hibridantes del tipo descrito en el presente documento, por ejemplo, como cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o como un cebador o sonda diagnóstica y/o pronóstica. Preferentemente, la hibridación de la sonda de oligonucleótido a una muestra de ácido nucleico se efectúa en condiciones rigurosas y la sonda es 100 % idéntica a la secuencia diana. La estabilidad del dúplex o hibrido del ácido nucleico se expresa como la temperatura de fusión o Tm, que es la temperatura a la que una sonda se disocia de un ADN diana. Esta temperatura de fusión se usa para definir la rigurosidad de las condiciones necesaria.

Para las secuencias diana que están relacionadas y son sustancialmente idénticas a la secuencia correspondiente de SEC ID Nº: 1 (tales como variantes alélicas de SNP), en lugar de idénticas, es útil establecer primero la temperatura más baja a la que solo sucede hibridación de homólogos con una concentración de sal determinada (por ejemplo, SSC o SSPE). Por tanto, asumir una discordancia del 1 % da como resultado una reducción de 1 °C en la Tm, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce en la misma proporción (por ejemplo, si se buscan secuencias que tienen > 95 % de identidad con la sonda, la temperatura del lavado final se reduce en 5 °C). En la práctica, el cambio en la Tm puede estar entre 0,5 °C y 1,5 °C por cada 1 % de discordancia.

Los ejemplos de oligonucleótidos de la invención de longitud X (en nucleótidos), se indica por las posiciones de polinucleótidos con referencia a, por ejemplo, SEC ID Nº: 1, incluye aquellos correspondientes a conjuntos (conjuntos sentido y antisentido) de oligonucleótidos consecutivamente solapantes de longitud X, donde los oligonucleótidos en cada conjunto consecutivamente solapante (correspondiente a un valor de X dado) se definen como el conjunto finito de X oligonucleótidos de las posiciones de nucleótidos:

n a (n + (X-1)); donde n = 1, 2, 3,...(Y-(X-1));

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donde Y es igual a la longitud (de nucleótidos o pares de bases) de SEC ID Nº: 1 (1920); donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido en el conjunto (por ejemplo, X = 20 para un conjunto de 20-meros consecutivamente solapantes); y

5 donde el número (Z) de oligómeros consecutivamente solapantes de longitud X para una SEC ID Nº: 1 dada de longitud Y es igual a Y-(X-1). Por ejemplo, Z = 1920-19 = 1901 para los conjuntos sentido o antisentido de SEC ID Nº: 1, donde X = 20.

Preferentemente, el conjunto está limitado a aquellos oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido de CpG, TpG o CPA.

Los ejemplos de oligonucleótidos 20-meros de la invención incluyen el conjunto siguiente de 2.261 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario a estos), indicado por las posiciones de polinucleótidos con referencia a SEC ID Nº: 1: 1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, ........ y 1896-1920.

15 Preferentemente, el conjunto está limitado a aquellos oligómeros que comprenden al menos un CpG, TpG o CPA.

Del mismo modo, los ejemplos de oligonucleótidos 25-meros de la invención incluyen el conjunto siguiente de 2.256 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario a estos), indicado por las posiciones de polinucleótidos con referencia a SEC ID Nº: 1: 1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29,... y 6072-6096.

Preferentemente, el conjunto está limitado a aquellos oligómeros que comprenden al menos un CpG, TpG o CPA.

Se divulgan para cada una de las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16 y 17 (sentido y antisentido), múltiples conjuntos

25 consecutivamente solapantes de oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X, donde, por ejemplo, X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 o 35 nucleótidos.

Los oligonucleótidos u oligómeros constituyen herramientas eficaces útiles para determinar parámetros genéticos y epigenéticos de la secuencia genómica correspondiente a SEC ID Nº: 1. Los conjuntos preferidos de dichos oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X son aquellos conjuntos consecutivamente solapantes de oligómeros correspondientes a las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16 y 17 (y a los complementos de las mismas). Preferentemente, dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido de CpG, TpG o CPA.

Los oligonucleótidos u oligómeros particularmente preferidos son aquellos en los que la citosina de las secuencias

35 de dinucleótido de CpG (o del correspondiente dinucleótido convertido de TpG o CpA) se encuentra en el tercio medio del oligonucleótido; es decir, en los casos donde el oligonucleótido es, por ejemplo, de 13 bases de longitud, el dinucleótido de CpG, TpG o CpA está posicionado entre el quinto al noveno nucleótido desde el extremo 5'.

También pueden modificarse los oligonucleótidos uniendo químicamente los oligonucleótidos a uno o más restos o conjugados para potenciar la actividad, estabilidad o detección del oligonucleótido. Dichos restos o conjugados incluyen cromóforos, fluoróforos, lípidos, tales como colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol (PEG), restos palmitilo, y otros tal como se divulga en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nº. 5.514.758, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.597.696 y 5.958.773. Las sondas también pueden existir en forma de APN (ácido peptidonucleico) que tiene propiedades de emparejamiento

45 particularmente preferidas. Por lo tanto, los oligonucleótidos pueden incluir otros grupos anexos tales como péptidos, y pueden incluir agentes de escisión activados por hibridación (Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988) o agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988). Para ello, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, por ejemplo, un cromóforo, fluoróforos, péptido, agente reticulante activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etc.

El oligonucleótido también puede comprender al menos un resto de azúcar y/o base reconocido en la técnica, o puede comprender una estructura modificada o enlaces internucleósidos no naturales.

Los oligonucleótidos u oligómeros se usan típicamente en "conjuntos", que contienen al menos un oligómero para el

55 análisis de cada uno de los dinucleótidos de CpG de una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 y secuencias complementarias a esta, o con el correspondiente dinucleótido de CpG, TpG o CpA en una secuencia de los ácidos nucleicos tratados de acuerdo con las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 y secuencias complementarias a estas. Sin embargo, se anticipa que por factores económicos o de otro tipo puede ser preferible analizar una selección limitada de los dinucleótidos de CpG en dichas secuencias, y el contenido del conjunto de oligonucleótidos se altera de manera correspondiente.

Por lo tanto, la divulgación abarca un conjunto de al menos dos (2) (oligonucleótidos y/o oligómeros de APN) útiles para detectar el estado de metilación de la citosina en ADN genómico tratado (SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17), o en ADN genómico (SEQ ID NO: y 1 y secuencias complementarias a esta). Estas sondas permiten el diagnóstico y la 65 detección de trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y

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afecciones colorrectales pre-cancerosas. El conjunto de oligómeros también puede usarse para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en ADN genómico tratado (SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17), o en ADN genómico (SEQ ID NO: y 1 y secuencias complementarias a esta).

5 Al menos uno, y más preferentemente todos los miembros de un conjunto de oligonucleótidos están unidos a una fase sólida.

Se divulga además un conjunto de al menos dos (2) oligonucleótidos que se usan como oligonucleótidos "cebadores" para amplificar secuencias de ADN de una de las SEC ID Nº: 1, 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas, o segmentos de las mismas.

Se anticipa que los oligonucleótidos pueden constituir la totalidad o parte de una "matriz" o "microlplaca de ADN" (es decir, una ordenación de diferentes oligonucleótidos y/o oligómeros de APN unidos a una fase sólida). Dicha matriz de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/o oligómeros de APN pueden caracterizarse, por ejemplo, en que

15 están dispuestas sobre la fase sólida en forma de un enrejado rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata, u oro. También pueden usarse nitrocelulosa así como plásticos como el nailon que pueden existir en forma de gránulos o también como matrices de resina. Puede obtenerse una revisión de la técnica anterior de fabricación de matrices de oligómeros de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999, y de la bibliografía citada en el presente documento). Las sondas marcadas fluorescentemente se usan a menudo para la exploración de matrices de ADN inmovilizadas. La unión simple de los tintes Cy3 y Cy5 al 5'-OH de la sonda específica son particularmente adecuados para marcadores de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un microscopio confocal. Los tintes Cy3 y Cy5, entre otros muchos, están disponibles comercialmente.

25 También se anticipa que los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, pueden constituir la totalidad

o parte de una "matriz virtual" donde los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, se usan, por ejemplo, como "especificadores" como parte de, o en combinación con una población diversa de sondas únicas marcadas para analizar una mezcla compleja de analitos. Dicho método, por ejemplo, se describe en el documento US 2003/0013091 (número de serie de los Estados Unidos 09/898.743, publicado el 16 de enero de 2003). En dichos métodos, se generan sondas suficientes de tal forma que cada ácido nucleico en la mezcla compleja (es decir, cada analito) puede unirse de manera única por un marcador único y por tanto detectarse (se cuenta directamente cada marcador, dando como resultado una lectura digital de cada especie molecular en la mezcla).

35 Se prefiere particularmente que los oligómeros se usen para detectar, o para diagnosticar trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas.

La presencia o ausencia de cáncer de próstata o cáncer colorrectal se determina mediante el análisis del estado de metilación de al menos una secuencia diana que comprende al menos una posición de CpG, comprendiendo dicha secuencia, o hibridando en condiciones rigurosas con al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: y complementos de la misma. Además se divulga un método para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos de la secuencia genómica de acuerdo con SEC ID Nº: 1 en un sujeto analizando la metilación de citosina y polimorfismos de nucleótidos individuales. Dicho método comprende

45 poner en contacto un ácido nucleico que comprende a SEC ID Nº: 1 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos, donde dicho reactivo o serie de reactivos, distingue entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados en el ácido nucleico diana. Dicho método puede comprender las siguientes etapas: En la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, tal como líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y todas las posibles combinaciones de los mismos. Se prefiere que dichas fuentes de ADN sean eyaculación o fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre.

55 El ADN genómico se aísla entonces a partir de la muestra. El ADN genómico puede aislarse mediante cualquier método convencional en la materia, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. En resumen, donde el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica tiene que romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. Después pueden eliminarse las proteínas de la solución de ADN y otros contaminantes, por ejemplo, mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera entonces de la solución. Esto tiene que llevarse a cabo mediante una variedad de métodos incluyendo extracción con sal, extracción orgánica o uniendo el ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método estará afectada por varios factores incluyendo el tiempo, el gasto y la cantidad necesaria de ADN.

Donde el ADN de la muestra no está encerrado en una membrana (por ejemplo, ADN circulante de una muestra de

65 sangre) pueden emplearse métodos convencionales en la materia para el aislamiento y/o purificación de ADN. Dichos métodos incluyen el uso de reactivo degenerante de proteínas, por ejemplo, sal caotrópica, por ejemplo

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clorhidrato de guanidina o urea; o un detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio(SDS), bromuro de cianógeno. Los métodos alternativos incluyen, pero sin limitación precipitación de etanol o precipitación de propanol, y concentración al vacío, entre otros mediante una centrífuga.

El experto en la materia también puede hacer uso de dispositivos tales como dispositivos de filtro, por ejemplo, ultrafiltración, superficies de sílice o membranas, partículas magnéticas, partículas de poliestireno, superficies de poliestireno, superficies cargadas positivamente, y membranas cargadas positivamente, membranas cargadas, superficies cargadas, membranas de intercambio cargadas, superficies de intercambio cargadas.

Una vez se han extraído los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

En la segunda etapa del método, la muestra de ADN genómico se trata de un modo tal que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten a uracilo, timina, u otra base que es diferente de citosina en cuanto a su comportamiento de hibridación. Esto se entenderá como "pretratamiento" o "tratamiento" en el presente documento.

Esto se logra preferentemente mediante tratamiento con un reactivo de bisulfito. La expresión "reactivo de bisulfito" se refiere aun reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles tal como se divulga en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metiladas o no metiladas. Los métodos de dicho tratamiento se conocen en la técnica (por ejemplo, el documento WO 2005/038051). Se prefiere que el tratamiento de bisulfito se lleve a cabo en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitación, n-alquilenglicol, particularmente dimetiléter de dietilenglicol (DME),

o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. En una realización preferida, los disolventes desnaturalizantes se usan en concentraciones entre el 1 % y el 35 % (v/v). También se prefiere que la reacción de bisulfito se lleve a cabo en presencia de secuestrantes, tales como, pero sin limitación, derivados de cromano, por ejemplo, ácido 6-hidroxi2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico o ácido trihidroxibenzoico y derivados de los mismos, por ejemplo, ácido gálico (véase: el documento WO2005/038051). La conversión de bisulfito se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de reacción entre 30 °C y 70 °C, en la que la temperatura se aumenta a más de 85 °C durante cortos periodos de tiempo durante la reacción. En ADN tratado con bisulfito se purifica preferentemente antes de la cuantificación. Esto puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido en la técnica, tale como, pero sin limitación, ultrafiltración, preferentemente llevado a cabo mediante columnas Microcon™ (fabricadas por Millipore™). La purificación se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo modificado del fabricante.

En la tercera etapa del método, se amplifican los fragmentos del ADN tratado, usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN puede llevarse a cabo de manera simultánea en uno y el mismo vaso de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Preferentemente, dichos amplificados son de 100 a 2.000 pares de bases de longitud. El conjunto de oligonucleótidos cebadores incluye al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una inversamente complementarias, idénticas, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 16 pares de bases de longitud de las secuencias de bases de una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas.

Como alternativa, puede detectarse el estado de metilación de posiciones de CpG preseleccionadas en una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEC ID Nº: 1 mediante el uso de oliconucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos de estado de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que hibrida con un dinucleótido de CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido de CpG. Los cebadores específicos de MSP para ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición C en el CpG. Preferentemente, por tanto, es necesario que la secuencia de bases de dichos cebadores comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas, donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido de CpG. El método puede comprender el uso de oligonucleótidos bloqueantes (el ensayo HeavyMethyl™). El uso de dichos oligonucleótidos bloqueantes se ha descrito por Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997. Los oligonucleótidos de sonda bloqueantes se hibridan al ácido nucleico tratado con bisulfito de manera concurrente con los cebadores de PCR. La amplificación PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda bloqueante, de tal forma que la amplificación de un ácido nucleico se suprime donde la secuencia complementaria a la sonda bloqueante está presente. Las sondas pueden diseñarse para hibridar con el ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica del estado de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados en una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión puede llevarse a cabo mediante el uso de sondas bloqueantes que comprenden un "CpA" o "TpA" en la posición en cuestión, en oposición a un "CpG" si se desea la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos metilados.

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Para los métodos PCR que usan oligonucleótidos bloqueantes, la interrupción eficaz de la amplificación mediada por polimerasa necesita que los oligonucleótidos bloqueantes no se elongen por la polimerasa. Preferentemente, esto se logra mediante el uso de bloqueantes que sean 3'-desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos derivados en la posición 3' con un grupo distinto de hidroxilo "libre". Por ejemplo, Los 3'-O-acetil oligonucleótidos son representativos

5 de una clase preferida de molécula bloqueante.

Además, debe excluirse la descomposición mediada por la polimerasa de los oligonucleótidos bloqueantes. Preferentemente, dicha exclusión comprende bien el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3' exonucleasa, o el uso de oligonucleótidos bloqueantes modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en el extremo 5' de los mismos que hacen que la molécula bloqueante sea resistente a nucleasas. Las aplicaciones particulares pueden no necesitar dichas modificaciones 5' del bloqueante. Por ejemplo, si se solapan los sitios de unión de bloqueante y cebador, excluyendo de este modo la unión del cebador (por ejemplo, con bloqueante en exceso), se excluirá la degradación del oligonucleótido bloqueante de manera sustancial. Esto se debe a que la polimerasa no extenderá el cebador hacia, y a lo largo (en la dirección 5'-3') del bloqueante, un proceso que

15 normalmente da como resultado la degradación del oligonucleótido bloqueante hibridado. Un bloqueante/PCR particularmente preferido implementado en el presente documento comprende el uso de oligómeros de ácido peptidonucleico (APN) como oligonucleótidos bloqueantes. Dichos oligómeros bloqueantes de APN son idealmente adecuados, ya que ni se descomponen ni se extienden por la polimerasa.

Preferentemente, por tanto, es necesario que la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos bloqueantes comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas, donde la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido de CpG, TpG o CPA.

25 Los fragmentos obtenidos mediante la amplificación pueden portar un marcador detectable directa o indirectamente. Se prefieren marcadores en forma de marcadores fluorescentes, radionúclidos, o fragmentos de moléculas detectables que tengan una masa típica que pueda detectarse en un espectrómetro de masas. En los casos donde dichos marcadores sean marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, permitiendo que se puedan detectar mejor en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse mediante, por ejemplo, espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) o usando espectrometría de masas por electropulverización (ESI).

La espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas y Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). Se incluye un analito 35 en una matriz absorbente de luz. La matriz se evapora mediante un pulso corto de láser, transportando de este modo la molécula del analito en la fase de vapor de manera no fragmentada. El analito se ioniza mediante colisiones con las moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los mayores. La espectrometría MALDI-TOF es adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es en cierto modo más difícil (Gut y Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:14757, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor que para péptidos, y disminuye de manera desproporcionada a medida que aumenta el tamaño del fragmento. Además, para ácidos nucleicos que tienen una estructura cargada negativamente de manera múltiple, el proceso de ionización mediante la matriz es considerablemente menos eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de

45 la matriz juega un papel extremadamente importante. Para la desorción de péptidos, se han descubierto varias matrices muy eficientes que producen una cristalización muy fina. Actualmente hay varias matrices que responden para ADN, sin embargo, la diferencia en sensibilidad entre péptidos y ácidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia en sensibilidad puede reducirse, sin embargo, modificando químicamente al ADN de tal modo que se haga más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los que los fosfatos habituales de la estructura se sustituyen por tiofosfatos, pueden convertirse en un ADN de carga neutra usando química de alquilación simple (Gut y Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de un indicador de carga a este ADN modificado da como resultado un aumento en la sensibilidad del MALDI-TOF al mismo nivel que el encontrado para péptidos. Una ventaja adicional del marcaje de cargas es la estabilidad aumentada del análisis frente a impurezas, lo que la detección de sustratos no modificados sea considerablemente más difícil.

55 En la cuarta etapa del método, los amplificados obtenidos durante la tercera etapa del método se analizan para determinar el estado de metilación de los dinucleótidos de CpG antes del tratamiento.

En los casos donde los amplificados se obtuvieron mediante amplificación MSP, la presencia o ausencia de un amplificado es en sí misma indicativa del estado de metilación de las posiciones de CpG cubiertas por el cebador, de acuerdo con las secuencias básicas de dicho cebador.

Los amplificados obtenidos mediante PCR tanto estándar como específica de metilación pueden analizarse adicionalmente mediante métodos basados en bases tales como, pero sin limitación, tecnología de matriz y

65 tecnologías basadas en sondas así como mediante técnicas tales como secuenciación y extensión dirigida por molde.

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Los amplificados sintetizados en la etapa tres se hibridan posteriormente a una matriz o a un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de APN. En este contexto, la hibridación tiene lugar del modo siguiente: el conjunto de sondas usadas durante la hibridación está compuesto preferentemente de al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros de APN; en el proceso, los amplificados sirven como sondas que hibridan con oligonucleótidos unidos previamente a una fase sólida; los fragmentos no hibridados se eliminan posteriormente; dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es inversamente complementaria o idéntica a un segmento de las secuencias básicas especificadas en el presente Listado de Secuencias; y el segmento comprende la menos un dinucleótido de CpG, TpG o CPA. La que hibrida de los ácidos nucleicos que hibridan es típicamente de al menos 9, 15, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, moléculas más largas tienen utilidad inventiva.

Dicho dinucleótido está presente en el tercio central del oligómero. Por ejemplo, done el oligómero comprende un dinucleótido de CpG, dicho dinucleótido es preferentemente del quinto al noveno nucleótido desde el extremo 5' de un 13-mero. Existe un oligonucleótido para el análisis de cada dinucleótido de CpG en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, y las posiciones equivalente en las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17. Dichos oligonucleótidos también pueden estar presentes en forma de ácidos peptidonucleicos. Posteriormente se retiran los amplificados no hibridados. Después se detectan los amplificados hibridados. En este contexto, se prefiere que los marcadores unidos a los amplificados sean identificables en cada posición de la fase sólida en la que se localiza una secuencia de oligonucleótido.

El estado de metilación genómica de las posiciones de CpG puede determinarse mediante sondas de oligonucleótido (tal como se detalla anteriormente) que están hibridadas al ADN tratado con bisulfito de manera concurrente con los cebadores de amplificación PCR (donde dichos cebadores pueden ser específicos de metilación

o convencionales).

Un método particularmente preferido es el uso de PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; véase también la Patente de Estados Unidos Nº 6.331.393) que emplea una sonda de oligonucleótido fluorescente con marcaje dual (TaqMan™ PCR, usando un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). La reacción PCR TaqMan™ emplea el uso de un oligonucleótido interrogante no extendible, llamado una sonda TaqMan™, que se diseña para hibridar con una secuencia rica en CpG localizada entre los cebadores de amplificación directos e inversos. La sonda TaqMan™ comprende además un "resto indicador" fluorescente y un "resto inactivante" unidos covalentemente a restos enlazantes (por ejemplo, fosforamiditas) unidas a os nucleótidos del oligonucleótido TaqMan™. Para el análisis de metilación en ácidos nucleicos posterior al tratamiento con bisulfito, se requiere que la sonda sea específica de metilación, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.331.393, también conocido con el ensayo MethyLight™. Las variaciones de la metodología de detección TaqMan™ que también son adecuadas para su uso con la invención descrita incluyen el uso de tecnología de sonda dual (Lightcycler™) o cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas técnicas pueden adaptarse de manera adecuada para su uso con ADN tratado con bisulfito, y además para análisis de metilación en dinucleótidos de CpG.

La cuarta etapa del método puede comprender el uso de extensión de oligonucleótidos dirigida por molde, tal como MS-SNuPE, tal como se describe por Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.

Como alternativa, la cuarta etapa del método comprende secuenciar y el posterior análisis de secuencia del amplificado generado en la tercera etapa del método (Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977).

En un método preferido, se aíslan los ácidos nucleicos genómicos y se tratan de acuerdo con las primeras tres etapas del método indicado anteriormente, es decir:

a) obtener, de un sujeto, una muestra biológica que tiene ADN genómico objetivo;

b) extraer o de otro modo aislar el ADN genómico;

c) tratar el ADN genómico de b) o un fragmento de los mismos, con uno o más reactivos para convertir las

bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' de las mismas a uracilo u otra base que sea diferente

de manera detectable en cuanto propiedades de hibridación; y donde

d) amplificar después del tratamiento en c) se lleva a cabo de manera específica de metilación, es decir,

mediante el uso de cebadores específicos de metilación u oligonucleótidos bloqueantes, y además donde,

e) detectar los amplificados se lleva a cabo mediante una sonda de detección en tiempo real, tal como se

describe anteriormente.

Preferentemente, en los casos donde la posterior amplificación de d) se lleva a cabo mediante cebadores específicos de metilación, como se ha descrito anteriormente, dichos cebadores específicos de metilación comprenden una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratada de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 y secuencias complementarias a estas, donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido de CpG.

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La etapa e) del método, es decir, la detección de los amplificados específicos indicativos del estado de metilación de una o más posiciones de CpG de acuerdo con SEC ID Nº: 1 se lleva a cabo mediante métodos de detección en tiempo real tal como se describe anteriormente.

5 Además se divulga un método para el análisis del estado de metilación de ADN genómico (SEC ID Nº: 1, y complementos de la misma) sin necesidad de conversión de bisulfito. Se conocen métodos en la técnica donde se utiliza un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación, o una serie de reactivos de enzima de restricción que comprenden reactivos de enzima de restricción sensibles a metilación que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados en una región diana para determinar la metilación, por ejemplo, pero sin limitación, DMH.

En la primera etapa de dichos métodos, la muestra de ADN genómico se aísla de tejidos o fuentes celulares. El ADN genómico puede aislarse mediante cualquier método convencional en la materia, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. En resumen, donde el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la 15 muestra biológica tiene que romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN entonces puede limpiarse de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico entonces se recupera de la solución. Esto tiene que llevarse a cabo mediante una variedad de métodos incluyendo extracción con sal, extracción orgánica o uniendo el ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método estará afectada por varios factores incluyendo el tiempo, el gasto y la cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que comprenden materia neoplásica o potencialmente neoplásica son adecuados para su uso en el presente método, se prefieren líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente de ADN preferida; se prefieren particularmente plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa,

25 células sanguíneas aisladas y células aisladas de la sangre.

Una vez se han extraído los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

El ADN puede escindirse antes del tratamiento con enzimas de restricción sensibles a metilación. Dichos métodos se conocen en la técnica y pueden incluir medios tanto físicos como enzimáticos. Se prefiere particularmente el uso de una o una pluralidad de enzimas de restricción que no sean sensibles a metilación, y cuyos sitios de reconocimiento sean ricos en AT y no comprendan dinucleótidos de CG. El uso de dichas enzimas permite la conservación de islas de CpG y regiones ricas en CpG en el ADN fragmentado. Las enzimas de restricción no específicas de metilación se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en Msel, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI y XspI.

35 Se prefiere particularmente el uso de dos o tres de dichas enzimas. Se prefiere particularmente el uso de una combinación de Msel, BfaI y Csp6I.

Después puede ligarse el ADN fragmentado a oligonucleótidos adaptadores para facilitar la posterior amplificación enzimática. El ligamiento de los oligonucleótidos a fragmentos de ADN de extremos romos y adherentes se conocen en la técnica, y se lleva a cabo mediante desfosforilación de los extremos (por ejemplo, usando fosfatasa alcalina de ternero o de gamba) y posteriormente ligando usando enzimas de ligasa (por ejemplo, ADN ligasa T4) en presencia de dATP. Los oligonucleótidos adaptadores tienen típicamente 18 pares de bases de longitud.

En la tercera etapa, el ADN (o fragmentos del mismo) se digiere entonces con una o más enzimas de restricción

45 sensibles a metilación. La digestión se lleva a cabo de tal modo que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción es informativa del estado de metilación de un dinucleótido de CpG específico del gen RASSF2.

Preferentemente, la enzima de restricción específica de metilación se selecciona del grupo que consiste en Bsi EI, Hga I, HinPl, Hpy99I, Ava I, Bce AI, Bsa HI, BisI, BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, McrBC, GlaI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinPII, HpyCH4IV, EagI y mezclas de dos o más de las enzimas anteriores. Se prefiere una mezcla que contenga las enzimas de restricción BstUI HpaII, HpyCH4IV y HinP1I.

En la cuarta etapa, que es opcional, se amplifican los fragmentos de restricción. Esto se lleva a cabo preferentemente usando una reacción en cadena de la polimerasa, y dichos amplificados pueden portar marcadores

55 detectables adecuados tal como se ha discutido anteriormente, es decir, marcadores de fluoróforo, radionúclidos y marcadores de masa. Se prefiere particularmente la amplificación mediante una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso, una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, y complementos de la misma. Preferentemente, dicha secuencia contigua es de al menos 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud. Como alternativa, dichos cebadores pueden ser complementarios a cualquier adaptador unido a los fragmentos.

En la quinta etapa, se detectan los amplificados. La detección puede ser mediante cualquier medio convencional en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, análisis por electroforesis en gel, análisis de hibridación, incorporación de 65 marcadores detectables en los productos de la PCR, análisis de matrices de ADN, análisis MALDI o ESI. Preferentemente, dicha detección se lleva a cabo mediante hibridación a al menos un ácido nucleico o ácido

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peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, y complementos de la misma. Preferentemente, dicha secuencia contigua es de al menos 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud.

5 Después de la determinación del estado o nivel de metilación de los ácidos nucleicos se deduce la presencia, ausencia de trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos (y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas), basándose en el estado o nivel de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos de CpG de SEC ID Nº: 1, o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido de CpG de SEC ID Nº: 1 donde la metilación se asocia con la presencia de cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales pre-cancerosas. En los casos donde dicha metilación se determina mediante medios cuantitativos, el punto de corte para determinar dicha presencia de metilación es preferentemente cero (es decir, donde una muestra muestra cualquier grado de metilación se

15 determina que tiene un estado metilado en la posición de CpG analizada). Sin embargo, se prevé que el experto en la materia pueda desear ajustar dicho valor de corte para proporcionar un ensayo de una sensibilidad o especificidad particularmente preferidas. Por consiguiente, dicho valor de corte puede aumentarse (de este modo aumentando la especificidad), dicho valor de corte puede encontrarse en un intervalo seleccionado del grupo que consiste en 0 %5 %, 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-30 % y 30 %-50 %. Se prefieren valores de corte del 10 %, 15 %, 25%, y 30%.

Kits

Además, un aspecto adicional de la invención es el uso de un kit, tal como se define en las reivindicaciones, que

25 comprende: un medio para determinar la metilación de RASSF2. El medio para determinar la metilación de RASSF2 comprende preferentemente un reactivo que contiene bisulfito; uno o una pluralidad de oligonucleótidos cuya secuencia es en cada caso idéntica, complementaria, o hibrida en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de 9 o preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método descrito de análisis de metilación. En una realización, la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido de CpG, CpA o TpG.

En una realización adicional, dicho kit puede comprender además reactivos estándar para llevar a cabo un análisis de metilación específico de posiciones de CpG, donde dicho análisis comprende una o más de las siguientes

35 técnicas: MS-SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl, COBRA, y secuenciación del ácido nucleico. Sin embargo, un kit de este tipo también puede contener solo una parte de los componentes anteriormente mencionados.

En una realización preferida, el kit puede comprender reactivos de conversión de bisulfito adicionales seleccionados del grupo que consiste en: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

El kit puede contener, envasado en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de cebadores mediada por la polimerasa, tal como PCR. El kit puede comprender además medios para 45 obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende además un envase adecuado para contener los medios para determinar la metilación del gen RASSF2 en la muestra biológica del paciente, y más preferentemente comprende además instrucciones para su uso e interpretación de los resultados del kit-Preferentemente, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, complementarias, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de 9 o preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un

55 oligonucleótido y/o oligómero de APN que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleótidos que es idéntica a o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 y secuencias complementarias a estas; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, complementaria, o hibrida en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de 9 o preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17; (d) al menos un oligonucleótido y/o oligómero de APN 65 que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleótidos que es idéntica a o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16 y 17 y secuencias complementarias a estas; y

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opcionalmente (e) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes, tales como tampones o soluciones adecuadas para bloquear, lavar o recubrir, envasadas en un envase separado.

5 Se divulga un kit para su uso en la determinación de la presencia de y/o diagnosticar trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos (y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales precancerosas), comprendiendo dicho kit: un medio para medir el nivel de transcripción del gen RASSF2 y un medio para determinar la metilación de RASSF2.

Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para RASSF2; enzimas de restricción y tampón adecuado; oligo de hibridación al gen; oligo de control de hibridación; kit de marcado de cinasas para sonda oligo; y

15 nucleótidos marcados. Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en MetyLight™) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para la secuencia convertida con bisulfito del gen RASSF2; sondas específicas de bisulfito (por ejemplo, TaqMan™ o Ligthcycler™); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE™) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores de MsSNuPE™ para la secuencia convertida con bisulfito del gen RASSF2; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados.

25 Los reactivos típicos (por ejemplo, como los que pueden encontrarse en un kit típico basado en MSP) para el análisis MSP pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR metilados y no metilados para la secuencia convertida de bisulfito del gen RASSF2, tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y sondas específicas.

Además, un kit alternativo comprende un medio para determinar la metilación de RASSF2, donde dicho medio comprende preferentemente al menos una enzima de restricción específica de metilación; uno o una pluralidad de oligonucleótidos cebadores (preferentemente uno o una pluralidad de pares de cebadores) adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido de CpG de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método descrito de análisis de

35 metilación. La secuencia de bases de dichos oligonucleótidos puede ser idéntica, complementaria, o hibridar en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 18 bases de longitud o de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1.

Dicho kit puede comprender una o una pluralidad de sondas de oligonucleótidos para el análisis de fragmentos digeridos, preferentemente, dichos oligonucleótidos son idénticos, complementarios, o hibridar en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 16 bases de longitud o de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1.

El kit puede comprender reactivos adicionales seleccionados del grupo que consiste en: tampón (por ejemplo,

45 tampones de enzima de restricción, PCR, almacenamiento o lavado); reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad) y componentes de recuperación de ADN.

Como alternativa, el kit puede contener, envasado en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de cebadores mediada por la polimerasa, tal como PCR. Como alternativa, el kit puede comprender además medios para obtener una muestra biológica del paciente. Preferentemente, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que sean idénticos, complementarios, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 9 bases de longitud o de una secuencia

55 seleccionada de SEC ID Nº: 1; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido de CpG de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un envase

65 adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido de CpG de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1; (d) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que sean idénticos, complementaria, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 9 bases de longitud o de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1 y opcionalmente (e) instrucciones para el uso e interpretación de los

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5 resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes, tales como tampones o soluciones adecuadas para bloquear, lavar o recubrir, envasadas en un envase separado.

Además se divulga un kit para su uso en proporcionar un diagnóstico de la presencia de trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos (y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales precancerosas), en un sujeto mediante análisis de enzimas de restricción sensibles a metilación. Dicho kit comprende un envase y un componente de micromatriz de ADN. Siendo dicho componente de micromatriz de ADN una

15 superficie sobre la que se inmovilizan una pluralidad de oligonucleótidos en posiciones específicas y donde el oligonucleótido comprende al menos un sitio de metilación de CpG. Al menos uno de dichos oligonucleótidos es específico para el gen RASSF2 y comprende una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud pero de no más de 200 pb de una secuencia de acuerdo con una de SEC ID Nº: 1. Preferentemente, dicha secuencia es de al menos 15 pares de bases de longitud pero no más de 80 pb de una secuencia de acuerdo con una de SEC ID Nº: 1. Se prefiere adicionalmente que dicha secuencia sea de al menos 20 pares de bases de longitud pero no más de 30 pb de una secuencia de acuerdo con una de SEC ID Nº: 1.

Dicho kit de ensayo comprende preferentemente además un componente de enzima de restricción que comprende una o una pluralidad de enzimas de restricción sensibles a metilación.

25 Además, dicho kit de ensayo está caracterizado por que comprende al menos una enzima de restricción específica de metilación, y donde los oligonucleótidos comprenden un sitio de restricción de dicha al menos una enzima de restricción específica de metilación.

El kit puede comprender además uno o más de los siguientes componentes, que se conocen en la técnica de enriquecimiento de ADN: un componente de proteína, uniéndose dicha proteína a ADN metilado; un componente de ácido nucleico formador de triplete, uno o una pluralidad de enlazantes, opcionalmente en una solución adecuada; sustancias o soluciones para llevar a cabo un ligamiento, por ejemplo, ligasas, tampones; sustancias o soluciones para llevar a cabo una cromatografía en columna; sustancias o soluciones para llevar a cabo un enriquecimiento

35 basado en inmunología (por ejemplo, inmunoprecipitación); sustancias o soluciones para llevar a cabo amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, PCR; un tinte o varios tintes, si son necesarios, con un reactivo de acoplamiento, si es necesario, en una solución; sustancias o soluciones para llevar a cabo una hibridación; y/o sustancias o soluciones para llevar a cabo una etapa de lavado.

La divulgación proporciona además una composición de materia útil para detectar, o para diagnosticar trastornos proliferativos celulares, preferentemente trastornos cancerosos o precancerosos y más preferentemente un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal y afecciones colorrectales precancerosas. Dicha composición comprende al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17, y una o más sustancias

45 tomadas del grupo que comprende: cloruro de magnesio 1-5 mM, dNTP 100-500 μM, 0,5-5 unidades de polimerasa taq, albúmina de suero bovino, un oligómero, en particular un oligonucleótido u oligómero de ácido peptidonucleico (APN), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con un ADN genómico pretratado de acuerdo con una de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17 y secuencias complementarias a estas. Se prefiere que dicha composición de materia comprenda una solución tamponadora adecuada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que permita las reacciones basadas en la polimerasa en dicha solución. Los tampones adecuados se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente.

55 Dicho al menos un ácido nucleico tiene al menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en las SEC ID Nº: 6, 7, 16, y 17.

Ejemplos

Ejemplo 1

En el siguiente ejemplo, se diseñó un ensayo de MSP adecuado para el análisis de metilación del gen RASSF2, para validad la adecuación de dicho marcador para la detección de carcinoma de colon. El ensayo se diseñó para llevarse a cabo en una plataforma LightCycler (Roche Diagnostics), pero también son adecuados otros instrumentos

65 similares usados de manera común en la técnica. Se diseñó el amplificado para detectarse mediante sondas de detección marcadas fluorescentemente del estilo TaqMan.

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Muestras

Se analizaron 314 muestras en total: 198 de carcinoma colorrectal en los siguientes estadíos:

5 -Estadío 0: 4 muestras -Estadío 1: 19 muestras -Estadío 2: 84 muestras -Estadío 3: 57 muestras -Estadío 4: 20 muestras

10 -Estadío desconocido: 14 muestras

22 de tejido normal o adyacente normal 26 muestras de sangre completa 40 de otros cánceres (hígado, mama y próstata)

15 28 de otros tejidos normales o adyacentes normales (hígado, mama y próstata)

Extracción de ADN y tratamiento con bisulfito

El ADN se aisló de todas las muestras de acuerdo con un protocolo modificado basado en el divulgado en el Qiagen

20 Genomic DNA Handbook (Agosto de 2001) (págs. 28-31, 44-47). El eluido resultante de la purificación se convirtió entonces de acuerdo con la siguiente reacción de bisulfito. El eluido se mezcló con 354 μl de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 μl de dioxano que contenía un secuestrante de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman 2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99 °C y posteriormente se incubó con el siguiente programa de temperatura durante un total de 7 h min 50 °C; un pico

25 térmico (99,9 °C) durante 3 min; 1,5 h 50 °C; un pico térmico (99 °C) durante 3 min; 3 h 50 °C. La mezcla de reacción se purificó posteriormente mediante ultrafiltración usando una columna Millipore Microcon™. La purificación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con este fin, la mezcla de reacción se mezcló en 300 μl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y posteriormente se lavó con tampón TE 1 x. El ADN permanece en la membrana en este tratamiento. Se lleva a cabo la

30 desulfonación. Con este fin, se añaden 0,2 mol/l de NaOH y se incuba durante 10 min. Se lleva a cabo entonces una centrifugación (10 min), seguida de una etapa de lavado con tampón TE 1 x. Después de esto, se eluyó el ADN. Con este fin, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 μl de tampón TE 1x templado (50 °C). Se dio la vuelta a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación repetida, con la que el ADN se retiró de la membrana. Se utilizaron 10 μl del eluido para el ensayo de PCR en

35 tiempo real LightCycler.

Secuencias componentes del ensayo PCR:

Cebador: gaagtagtcggggtcgtttacg SEC ID Nº: 26

40 Cebador: Gcaaaatacgcgaaaaccgt SEC ID Nº: 27 Oligonucleótido de detección: acgtcttctctcgccccgaacga SEC ID Nº: 28

Condiciones de termociclado:

Activación

grados C

tiempo

95

10 min

Activación

grados C

tiempo

Ciclado (50x)

grados C

tiempo

95

15 s

60

60 s

Ensayo de control El diseño del ensayo GSTP1-C3 lo hace adecuado para cuantificar ADN de diferentes fuentes, incluyendo muestras frescas/congeladas, muestras remotas, tales como plasma o suero, y ADN obtenido de especímenes de archivo,

imagen20

tales como material incluido en parafina. Se usaron los siguientes oligonucleótidos en la reacción para amplificar el amplificado de control: Cebador 1 de control: GGAGTGGAGGAAATTGAGAT (SEC ID Nº: 29) Cebador 2 de control: CCACACAACAAATACTCAAAAC (SEC ID Nº: 30)

5 Sonda de control: FAM-TGGGTGTTTGTAATTTTTGTTTTGTGTTAGGTT-TAMRA (SEC ID Nº: 31)

Programa de ciclado (40 95 °C, 10 min

ciclos): 95 °C, 15 s 58 °C, 1min

Interpretación de los datos

10 Cálculo de la concentración de ADN. Se usaron los Cp (valores de punto de corte) calculados por el programa informático del instrumento LigthCycler para determinar la concentración de ADN. La concentración de ADN se calculó mediante referencia del valor de CP de cada pocillo a una curva patrón tanto para los ensayos de metilación como para el ensayo de C3.

15 Porcentaje de metilación. Para cada muestra se calculó el porcentaje de metilación como la concentración medida de ADN cuantificada usando los ensayos de metilación frente a la concentración de ADN en la muestra cuantificada mediante el ensayo C3.

La detección de la metilación se determinó a múltiples niveles de umbral diferentes, (ver las tablas) así como en 20 todos los niveles de metilación (es decir, cualquier muestra donde se detectó metilación se consideró positiva).

La sensibilidad del ensayo se determinó a partir de la tasa de detección de positivos de muestras de carcinoma colorrectal, donde la sensibilidad se determinó como el % de muestras donde se detectó positivamente la metilación (es decir, verdaderos positivos). La especificidad del ensayo se determinó a partir de la tasa de detección de

25 negativos de muestras de sangre completa (es decir, tasa de detección de verdaderos negativos) donde los falsos positivos se descontaron del número total de muestras analizadas.

Resultados

30 El término "ABC" es una abreviatura para el área bajo la curva. En particular, se refiere al área bajo una curva de Característica Operativa del Receptor (ROC). La curva ROC es una gráfica de la proporción de verdaderos positivos frente a la proporción de falsos positivos para los posibles puntos de corte distintos de una prueba diagnóstica. Muestra la compensación entre sensibilidad y especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (cualquier aumento en la sensibilidad estará acompañado de una disminución en la especificidad). El área bajo una curva ROC

35 (ABC) es una medida para la precisión de una prueba diagnóstica (cuanto mayor sea el área, mejor, el valor óptimo es 1, una prueba al azar puede tener una curva ROC que se encuentre en la diagonal, con un área de 0,5; para referencias: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975).

A un valor de corte de metilación del 0 % (es decir, cualquier metilación detectada se considera "hipermetilado") el

40 ABC fue de 0,86 para la detección de carcinoma colorrectal y 0,00 en sangre. A un valor de corte del 10 %, 20 % y 30 % la metilación (es decir, cualquier metilación detectada se considera "hipermetilado") las ABC fueron 0,73, 0,54 y 0,33 respectivamente para la detección de carcinoma colorrectal.

Ejemplo 2

45 En la siguiente investigación, se seleccionó el rendimiento de marcadores seleccionados de acuerdo con la Tabla 2 para análisis posterior mediante el ensayo HM (HeavyMethyl). Las regiones diana de cada gen se convirtieron con bisulfito y se amplificaron mediante cebadores no de MSP, en presencia de oligonucleótidos bloqueantes diseñados para suprimir amplificados que no se hubiesen metilado antes del tratamiento con bisulfito. Los amplificados se

50 detectaron después mediante sondas LightCycler (duales).

Se analizaron muestras de plasma de las siguientes clases de pacientes:

-Carcinoma colorrectal (131 en total)

55 Estadío 0 = 1 Estadío I = 13 Estadío II = 32 Estadío III = 27 Estadío IV = 8

60 No clasificadas = 50 -Colorrectal sano (verificado mediante colonoscopia) = 169

imagen21

-Enfermedades no cancerosas (ENC) = 29 -Cánceres de origen no colorrectal (CNC) = 31

Se analizaron 360 muestras en total. 5 Extracción de ADN y tratamiento con bisulfito

El ADN se aisló de todas las muestras mediante el método Magna Pure (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El eluido resultante de la purificación se convirtió entonces de acuerdo con la siguiente reacción de 10 bisulfito.

El eluido se mezcló con 354 μl de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 μl de dioxano que contenía un secuestrante de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman 2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99 °C y posteriormente se incubó con el siguiente programa de 15 temperatura durante un total de 7 h min 50 °C; un pico térmico (99,9 °C) durante 3 min; 1,5 h 50 °C; un pico térmico (99 °C) durante 3 min; 3 h 50 °C. La mezcla de reacción se purificó posteriormente mediante ultrafiltración usando una columna Millipore Microcon™. La purificación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con este fin, la mezcla de reacción se mezcló en 300 μl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y posteriormente se lavó con tampón TE 1 x. El ADN permanece en la 20 membrana en este tratamiento. Se lleva a cabo la desulfonación. Con este fin, se añaden 0,2 mol/l de NaOH y se incuba durante 10 min. Se lleva a cabo entonces una centrifugación (10 min), seguida de una etapa de lavado con tampón TE 1 x. Después de esto, se eluyó el ADN. Con este fin, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 μl de tampón TE 1x templado (50 °C). Se dio la vuelta a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación repetida, con la que el ADN se retiró de la membrana.

25 Se utilizaron 10 μl del eluido para el ensayo de PCR en tiempo real LightCycler.

Soluciones de reacción y condiciones de ciclado térmico

Las secuencias componentes del ensayo PCR se proporcionan en la Tabla 3. Cada ensayo se efectuó dos veces 30 (independientemente) en cada muestra.

Las condiciones de termociclado fueron:

PCDHGC3 activación: 95 °C10 min

50 ciclos 95 °C10 s (20 °C/s) 56 °C30 s (20 °C/s) 60 °C3 s (20 °C/s) detección 72 °C10 s (20 °C/s)

curva de fusión: 95 °C10 s (20 °C/s) 40 °C10 s (20 °C/s) 95 °C0 s (0,1 °C/s)

Enfriado continuo: 40 °C5 s

Todos los demás ensayos: activación: 95 °C10 min

55 ciclos 95 °C10 s (20 °C/s) 56 °C30 s (20 °C/s) detección 72 °C10 s (20 °C/s)

curva de fusión: 95 °C10 s (20 °C/s) 40 °C10 s (20 °C/s) 95 °C0 s (0,1 °C/s)

Enfriado continuo: 40 °C5 s

35 Resultados:

Para predecir la presencia de ADN de tumor CCR en las muestras de plasma medidas se usó un modelo de regresión logística. El modelo de regresión logística se construye del modo siguiente. Primeramente los datos medidos para cada ensayo de marcador se codifican de manera cuantitativa mediante los siguientes 3 niveles:

40

imagen22

-Nivel 0 -Ambas reacciones de PCR replicadas no mostraron amplificación -Nivel 1 -Exactamente uno de los dos replicados de PCR mostró una curva de amplificación -Nivel 2 -Ambos replicados de PCR mostraron curvas de amplificación

5 Si cualquiera de los dos replicados de PCR no se pudo medir satisfactoriamente la medida del marcador respectivo se consideró inválida. Los cinco marcadores de metilación de ADN distintos se usaron como factores independientes con 3 niveles en un modelo de regresión logística. Se incluyó un factor de intercepción adicional pero no se incluyeron interacciones de factor en el modelo. El modelo de regresión logística se probó y se determinaron ponderaciones óptimas para todos los niveles de factores usando el procedimiento de máxima probabilidad.

10 Las Figuras 1 a 10 proporcionan las gráficas de la metilación media log medida de los ensayos individuales. Cada figura consiste en tres gráficas, las gráficas superior e inferior izquierda proporcionan el análisis binario y multi-clase, respectivamente, la gráfica de la derecha proporciona un ROC donde la sensibilidad se muestra en el eje y 1especificidad se muestra en el eje X. La Tabla 4 y las Figuras 1 a 5 proporcionan una visión general de los

15 rendimientos de los marcadores en todos los grupos de muestra. La Tabla 5 y las Figuras 6 a 10 proporcionan una visión general de los rendimientos de marcadores en los grupos de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

Las Figuras 12 a 21 proporcionan las gráficas de la metilación media mayoritaria logarítmica (la muestra analizada solo se cuenta como positiva si ambos replicados son positivos, la media de las dos medidas se toma como la 20 medida de metilación cuantitativa) de los ensayos individuales. Cada figura consiste en tres gráficas, las gráficas superior e inferior izquierda proporcionan el análisis binario y multi-clase, respectivamente, la gráfica de la derecha proporciona un ROC donde la sensibilidad se muestra en el eje y 1-especificidad se muestra en el eje X. La Tabla 6 y las Figuras 12 a 16 proporcionan una visión general de los rendimientos de los marcadores en todos los grupos de muestra. La Tabla 7 y las Figuras 18 a 21 proporcionan una visión general de los rendimientos de marcadores en los

25 grupos de carcinoma colorrectal y colorrectal normal.

La Tabla 8 proporciona una visión general de las ABC y sensibilidades de los ensayos individuales a una especificidad del 95 % (todos los valores de p fueron menores de 0,00001). Donde dichas clases son:

30 Todos: Normal + NCD +NCC frente a CCR estadíos I a IV I-IV: Normal frente a CCR estadíos I a IV I-III: Normal frente a CCR estadíos I a III

A partir de la distribución multiclase de la Figura 6 (gráfica inferior izquierda) y la Tabla 11 puede determinarse que el

35 gen RASSF2 es particularmente eficaz en detectar carcinomas colorrectales en Estadío 1 y tempranos. Por consiguiente, la expresión, más preferentemente la metilación de CpG, de dicho gen es además de un marcador diagnóstico preferido particularmente preferida para la exploración de poblaciones generales (individuos que no muestren indicadores o síntomas de carcinoma colorrectal) para la detección temprana de carcinomas colorrectales.

40 Combinaciones de marcadores (paneles)

Para identificar el subconjunto de marcadores de metilación de ADN que predicen de manera óptima la presencia de CCR, los inventores usaron el procedimiento de eliminación hacia atrás. En cada etapa de eliminación, el marcador de metilación de ADN con los niveles de factor más bajos se eliminó del modelo. Los inventores compararon el 45 poder predictivo del modelo reducido con el modelo completo usando la prueba de razón de verosimilitud. Para identificar el subconjunto de marcadores de metilación de ADN que predicen de manera óptima la presencia de CCR, los inventores usaron el procedimiento de eliminación hacia atrás. En cada etapa de eliminación, el marcador de metilación de ADN con los niveles de factor más bajos se eliminó del modelo. Los inventores compararon el poder predictivo del modelo reducido con el modelo completo usando la prueba de razón de verosimilitud. La Figura 50 11 muestra que (en la comparación de Normal frente a CCR estadíos I a IV) en cada etapa de eliminación el poder predictivo del modelo de regresión logística se reducía significativamente. Los inventores concluyen que todos los modelos de marcador de metilación de ADN proporcionan un rendimiento superior de la predicción en comparación con un solo marcador o con los respectivos paneles de marcadores más simples. Los inventores concluyen que los siguientes modelos de marcadores de ADN proporcionan un rendimiento superior de la predicción en comparación

55 con un solo marcador o con los respectivos paneles de marcadores más simples.

Las Figuras 22 a 26 proporcionan una visión general del rendimiento de las siguientes combinaciones de marcadores:

Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3+SND1 (Figura 22) Todos ABC 80 Sens./Espec. 57/95 Todos los CCR ABC 80 Sens./Espec. 58/96 CCR I-III ABC 76 Sens./Espec. 50/96

imagen23

Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3 (Figura 23) Todos ABC 80 Sens./Espec. 53/95 Todos los CCR ABC 80 Sens./Espec. 55/96 CCR I-III ABC 77

Sens./Espec. 48/96 Septina 9+TFAP2E+RASSF2 (Figura 24) Todos ABC 77

Sens./Espec. 48/96 Todos los CCR ABC 79 Sens./Espec. 52/96 CCR I-III ABC 75

Sens./Espec. 42/96 Septina 9+TFAP2E (Figura 25) Todos ABC 77

Sens./Espec. 45/96 Todos los CCR ABC 79 Sens./Espec. 51/96 CCR I-III ABC 75

Sens./Espec. 41/96 Septina 9+RASSF2 (Figura 26) Todos ABC 77

Sens./Espec. 43/96 Todos los CCR ABC 79 Sens./Espec. 56/95 CCR I-III ABC 74 Sens./Espec. 46/95

En cada caso, la gráfica superior representa todas las muestras (Normales, sin enfermedad colorrectal, sin cáncer colorrectal y todos los estadíos de CCR), la gráfica inferior solo representa muestras normales y de CCR.

5 Ejemplo 3: Rendimiento de marcador en el diagnóstico de cáncer de próstata

En la siguiente investigación, se determinó el rendimiento de marcadores seleccionados para detectar carcinoma de próstata mediante el ensayo HM (HeavyMetyl). Las regiones diana de cada gen se convirtieron con bisulfito y se amplificaron mediante cebadores no de MSP, en presencia de un oligonucleótido bloqueante diseñado para suprimir

10 amplificados que no se hubiesen metilado antes del tratamiento con bisulfito. Los amplificados se detectaron entonces mediante sondas LightCycler (duales) y se determinó el nivel de metilación mediante referencia a ensayos de control.

Muestras

15 Para este experimento, se recogieron plasma y orina emparejadas de un total de 191 hombres, incluyendo 91 varones con cáncer de próstata confirmado mediante biopsia, 51 varones sin cáncer detectado mediante biopsia (posteriormente diagnosticados con HBP), y 50 varones jóvenes sanos. En todos los análisis, la clase positiva está compuesta de las muestras de cáncer de próstata.

20 En el diseño del presente estudio clínico, la dificultad principal estaba en la definición de la clase negativa, ya que no hay método de detección que excluya la presencia de cáncer de próstata con una seguridad de 100 %. La biopsia tiene una tasa de diagnósticos falsos positivos del 10 % mientras que la medida de la PSA es propensa tanto a falsos negativos como a falsos negativos. Debido a que el objetivo principal del presente estudio era demostrar la

25 viabilidad de medir marcadores metilados de cáncer de próstata en un fluido corporal remoto, los inventores se centraron en una clase negativa que minimizase la probabilidad de falsos positivos. En consecuencia, se seleccionaron los varones jóvenes sanos como la clase "auténticamente" negativa. Se razonó que los varones jóvenes sanos sin antecedentes familiares de cáncer de próstata deben ser auténticamente negativos para cáncer de próstata.

30 Para investigar los marcadores como seguimiento diagnóstico a la PSA, también se incluyó una segunda clase negativa de biopsia negativa, muestras de HBP. Un factor que potencialmente puede dar lugar a confusión es la presencia probable de biopsias falsas negativas.

35 En cinco casos de cáncer de próstata, solo se recogió una muestra de plasma y en diez casos adicionales solo se recogió una muestra de orina. Las muestras se recogieron en múltiples sitios. La orina se recogió después de masaje prostático. Las muestras tanto de plasma como de orina se obtuvieron antes de cualquier tratamiento para el cáncer de próstata. Los criterios de inclusión y exclusión se diseñaron para asegurar que los pacientes analizados reflejasen a los pacientes potenciales que podrían usar pruebas de exploración de cáncer de próstata.

imagen24

Los siguientes criterios de inclusión y exclusión se aplicaron a los pacientes que se sometían a biopsia:

5 Criterios de inclusión:

Indicación para biopsia (PSA elevada y/o ERD sospechoso) Biopsia programada para 1 semana después de la recolección de la muestra Edad 40-80

Criterios de exclusión:

Cualquier tratamiento anterior para el cáncer de próstata Antecedentes de cáncer o enfermedad grave en los últimos 5 años

15 Síntomas de infección del tracto urinario

Los siguientes criterios se aplicaron a los varones adultos del grupo de control:

Criterios de inclusión:

Varón

Edad 18-30

25 Criterios de exclusión:

Cualquier tratamiento anterior para o síntomas de cáncer de próstata o enfermedad prostática Historial de cáncer o enfermedad grave en los últimos 5 años Síntomas de infección del tracto urinario

Extracción de ADN

El ADN se extrajo y aisló usando protocolos estándar y kits comercialmente disponibles.

35 Tratamiento de bisulfito

El eluido se mezcló con 354 μl de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 μl de dioxano que contenía un secuestrante de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman 2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99 °C y posteriormente se incubó con el siguiente programa de temperatura durante un total de 7 h min 50 °C; un pico térmico (99,9 °C) durante 3 min; 1,5 h 50 °C; un pico térmico (99 °C) durante 3 min; 3 h 50 °C. La mezcla de reacción se purificó posteriormente mediante ultrafiltración usando una columna Millipore Microcon™. La purificación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con este fin, la mezcla de reacción se mezcló en 300 μl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y posteriormente se lavó con tampón TE 1 x. El ADN permanece en la

45 membrana en este tratamiento. Se lleva a cabo la desulfonación. Con este fin, se añaden 0,2 mol/l de NaOH y se incuba durante 10 min. Se lleva a cabo entonces una centrifugación (10 min), seguida de una etapa de lavado con tampón TE 1 x. Después de esto, se eluyó el ADN. Con este fin, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 μl de tampón TE 1x templado (50 °C). Se dio la vuelta a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación repetida, con la que el ADN se retiró de la membrana.

Ensayo de PCR en tiempo real LigthCycler

En cada ensayo, se corrió 1,5 ml de equivalente de analito en duplicado, la metilación se determinó mediante los componentes del ensayo de acuerdo con la Tabla 9. Los ensayos de control para el gen de beta actina y regiones

55 "CFF" se usaron para determinar la concentración de ADN total, para cuantificar la cantidad de ADN metilado determinada por el ensayo HeavyMethyl.

Resultados

Uno de los objetivos era desarrollar marcadores dirigidos como un seguimiento diagnóstico a las pruebas de PSA de 4,0 ng/ml o más para hombres de más de 50 años de edad para discriminar cáncer de próstata de afecciones no cancerosas. Posteriormente los inventores se centraron en dos indicaciones: una aplicación exploratoria para identificar hombres de más de 50 años con un riesgo elevado de cáncer de próstata y un seguimiento diagnóstico a la PSA para informar de la decisión de volver a biopsiar la próstata en hombres con al menos una biopsia de

65 próstata negativa y PSA elevada de manera persistente. Los inventores analizaron los datos de dos modos distintos:

(i) los inventores usaron muestras de cáncer y de biopsia negativa para evaluar el rendimiento de los marcadores en el seguimiento a la prueba de PSA (aplicación diagnóstica) y (ii) los inventores usaron muestras de cáncer de próstata y todas aquellas sin cáncer (biopsia negativa y sanos) para medir el rendimiento de los marcadores en la prueba de exploración (aplicación exploratoria). Los inventores comunican el rendimiento de marcadores para plasma y orina por separado, también proporcionan análisis de datos para marcadores individuales y paneles de

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5 marcadores. Todos los datos comunicados son valores me metilación media logarítmica en bruto.

Rendimiento de marcadores en aplicación exploratoria

Como prueba de exploración primaria, el marcador necesitaría identificar el cáncer de próstata en hombres de más de 50 años de edad con una especificidad mejorada en relación a la PSA. Todos los análisis de aplicación exploratoria usan las muestras de cáncer de próstata como clase positiva. Para los fines del presente estudio clínico, los inventores analizaron datos su aplicación exploratoria con dos clases negativas alternativas. La primera clase negativa analizó los 50 varones jóvenes sanos con mínima probabilidad de cáncer de próstata no detectado. Mientras que esta clase negativa representa un "verdadero" negativo en la prueba, no está emparejada con la edad

15 de la población diana de la exploración de cáncer de próstata y no incluye cualquier clase de posibles falsos positivos, por ejemplo, HBP. Por lo tanto, se efectuó un segundo análisis en el que todos los controles de 50 jóvenes sanos y todos los controles de 51 biopsias negativas se analizaron como una clase negativa con un tamaño de muestra de 101.

De media, se efectúan 20.000.000 de pruebas de PSA cada año en los Estados Unidos, procediéndose con la biopsia en solo aproximadamente 1.000.000 de los casos (de los cuales aproximadamente 750.000 biopsias son innecesarias). Por lo tanto, menos del 5 % de los individuos a los que se les practica una exploración para PSA se encuentran en la clase negativa que está representada por PSA elevada-HBP positiva mientras que la gran mayoría de la población de exploración se encuentran en la clase negativa de baja PSA. Aunque la clase negativa de solo

25 varones jóvenes sanos puede representar una sobreestimación de la capacidad discriminante de los marcadores, la clase negativa combinada de varones jóvenes sanos más varones con biopsia negativa de edad emparejada puede representar una subestimación de la capacidad discriminante de los marcadores.

Rendimiento de marcador único en orina

La sensibilidad y especificidad de los marcadores ensayados mediante PCR en tiempo real en orina después de masaje prostático de pacientes con cáncer de próstata, pacientes con biopsia negativa e individuos sanos de control se muestra en la Tabla 10, y el rendimiento del ensayo en orina después de masaje prostático en comparación con la clase negativa I (individuos sanos) se muestra en la Figura 27. El rendimiento del ensayo en orina después de

35 masaje prostático en comparación con clase negativa II (individuos sanos más biopsia negativa) se muestra en la Figura 28.

La sensibilidad y especificidad de los marcadores ensayados mediante PCR en tiempo real en plasma de pacientes con cáncer de próstata, pacientes con biopsia negativa e individuos sanos de control se muestra en la Tabla 11, y el rendimiento del ensayo en plasma en comparación con la clase negativa I (individuos sanos) se muestra en la Figura

29. El rendimiento del ensayo en plasma en comparación con clase negativa II (individuos sanos más biopsia negativa) se muestra en la Figura 30.

En todas las comparaciones con la clase negativa y para todos los marcadores, la orina fue el analito más sensible,

45 tal como se ilustra en la Tabla 12. Las cantidades mayores de ADN marcador metilado se correlacionaron con una puntuación de Gleason mayor para todos los marcadores en plasma. Esto fue cierto para muestras con elevadas cantidades de ADN marcador metilado en orina (especialmente los marcadores TFAP2E y RASSF2A), esto fue así especialmente en ADN de plasma. La PSA como marcador de cáncer de próstata en pacientes con PSA elevada (> 4 ng/ml) también se correlacionó con una mayor puntuación de Gleason.

La Tabla 13 muestra el rendimiento de los paneles de marcadores de exploración para distinguir cáncer de próstata de la clase negativa I (varones sanos) en orina. La Tabla 14 muestra el rendimiento de los paneles de marcadores de exploración para distinguir cáncer de próstata de la clase negativa II (varones sanos más biopsia negativa) en orina. La Tabla 15 muestra el rendimiento de los paneles de marcadores de exploración para distinguir cáncer de

55 próstata de la clase negativa I (varones sanos) en plasma. La Tabla 16 muestra el rendimiento de los paneles de marcadores de exploración para distinguir cáncer de próstata de la clase negativa II (varones sanos más biopsia negativa) en plasma.

Rendimiento de marcadores en aplicación diagnóstica: Seguimiento a PSA

Como aplicación diagnóstica, los marcadores deben identificar el cáncer de próstata en varones de más de 50 años de edad con PSA elevada de manera persistente (> 4,0 ng/ml) que se han sometido a al menos una biopsia de próstata negativa. Esta es una aplicación y un análisis distinto y requiere una discriminación aumentada en comparación con la prueba de exploración. Los falsos positivos en esta aplicación surgen de la PSA elevada, clase 65 de HBP de biopsia negativa. De nuevo, las muestras de cáncer de próstata representan la clase positiva. Para los fines de una aplicación diagnóstica, se analizaron los datos usando una sola clase negativa compuesta de las 51

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muestras de biopsia negativa.

Rendimiento de marcador único en orina

5 La Tabla 17 muestra la sensibilidad y especificidad de marcadores ensayados mediante PCR en tiempo real en orina después de masaje prostático de pacientes con cáncer de próstata y pacientes con biopsia negativa.

La Figura 31 representa el rendimiento de ensayo individual para ensayos PCR en tiempo real de HM en orina después de masaje prostático.

10 Tal como se muestra en la Tabla 18, para todos los marcadores de metilación analizados, la orina fue el analito más sensible. Por consiguiente, se prefiere particularmente para el diagnóstico de cáncer de próstata que el analito sea orina, ya sea espontánea o después de masaje prostático.

15 La Tabla 19 proporciona el rendimiento de paneles de marcadores diagnósticos para detectar cáncer de próstata en pacientes con biopsia negativa en orina.

Tabla 1: Secuencias de acuerdo con la presente invención,

SEC ID Nº genómica

Gen Secuencia convertida con bisulfito metilada (sentido) Secuencia convertida con bisulfito metilada (antisentido) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (sentido) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (antisentido)

1

RASSF2A 6 7 16 17

2

SCND1 8 9 18 19

3

PCDHGC3 10 11 20 21

4

TFAP2E 12 13 22 23

5

SEPTIN9 14 15 24 25

57

GSTP1 59 60 63 64

58

HIST1H4J 61 62 65 66

Tabla 2: Genes usados en los ejemplos

SEC ID Nº genómica

Gen Abreviatura Secuencias convertidas con bisulfito

Proteína 1 que contiene dominio de nucleasa estafilocócica (coactivador p100) (coactivador de 100 kDa) (coactivador p100 de EBNA2)

SND1

Precursor de protocadherina gamma C5 (PCDH-gamma-C5)

PCDHGC3

factor de transcripción AP-2 épsilon (proteína de unión a potenciador de activación 2 épsilon)

TFAP2E

Septina-9 (MLL proteína de fusión similar a septina) (MLL proteína de fusión similar a septina MSF-A) (septina ovárica/de mama) (Ov/Br septina) (Septina D1)

Septina 9

Familia de dominio de asociación a Ras 2

RASSF2

* A menos que se indique lo contrario, todas las localizaciones se refieren a Ensembl database v39 (junio de 2006) ** Ensembl database v31.35d (8 de julio de 2005)

Tabla 3: Secuencias de cebador, bloqueante y sonda de acuerdo con el Ejemplo 2. Tabla 4: Ensayo HM (Ejemplo 2) rendimiento en todas las muestras de tejido.

Septina 9

RASSF2 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

Cebador directo SEC ID Nº:

32 37 42 47 52

Cebador inverso SEC ID Nº:

33 38 43 48 53

Bloqueante SEQ ID NO:

34 39 44 49 54

imagen27

Septina 9

RASSF2 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

Sonda SEQ ID NO:

35 40 45 50 55

Sonda SEQ ID NO:

36 41 46 51 56

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

ABC (intervalo de confianza del 95 %)

0,72 (0,67, 0,77) 0,75 (0,7, 0,79) 0,66 (0,6, 0,71) 0,66 (0,61, 0,72) 0,69 (0,63, 0,74)

Sens./Espec.

0,4/0,95 0,47/0,95 0,25/0,95 0,32/0,95 0,29/0,95

Corte de Sens./Espec.

-3,029 -2,706 -3,089 -2,378 -2,692

Wilcoxon P

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma -(pos)

131 131 118 119 119

Normal+enfermedades no cancerosas (ENC)+carcinoma distinto de colorrectal (CNC) -(neg)

228 228 205 206 206

Tabla 5: Ensayo HM (Ejemplo 2) rendimiento en muestras de carcinoma colorrectal y de tejido colorrectal normal.

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

ABC (intervalo de confianza del 95 %)

0,73 (0,67, 0,78) 0,76 (0,7, 0,8) 0,67 (0,61, 0,73) 0,68 (0,62, 0,73) 0,71 (0,65, 0,76)

Sens./Espec.

0,47/0,95 0,48/0,95 0,39/0,95 0,32/0,95 0,39/0,95

Corte de Sens./Espec.

-3,272 -2,858 -3,473 -2,417 -3,446

Wilcoxon P

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma (pos)

131 131 118 119 119

Normal (neg)

168 169 148 148 148

Tabla 6: Ensayo HM (Ejemplo 2) rendimiento en todas las muestras de tejido. Tabla 7: Ensayo HM (Ejemplo 2) rendimiento en muestras de carcinoma colorrectal y de tejido colorrectal normal.

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

ABC (intervalo de confianza del 95 %)

0,67 (0,62, 0,72) 0,74 (0,69, 0,79) 0,63 (0,57, 0,68) 0,65 (0,6, 0,7) 0,65 (0,6, 0,7)

Sens./Espec.

0,37 (0,96) 0,51 0,28/0,95 0,34/0,95 0,34/0,96

Corte de Sens./Espec.

-4 -4 -3,45 -2,523 -4

Wilcoxon P

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma -(pos)

121 127 113 127 120

Normal+enfermedades no cancerosas (ENC)+carcinoma distinto de colorrectal (CNC) (neg)

206 220 194 224 203

imagen28

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

ABC (intervalo de confianza del 95 %)

0,67 (0,61, 0,73) 0,74 (0,69, 0,79) 0,64 (0,58, 0,7) 0,66 (0,6, 0,71) 0,66 (0,6, 0,72)

Sens./Espec.

0,37/0,97 0,51/0,97 0,3/0,97 0,35/0,95 0,34/0,98

Corte de Sens./Espec.

-4 -4 -4 -2,599 -4

Wilcoxon P

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma (pos)

121 121 113 127 120

Normal (neg)

154 164 146 167 154

Tabla 8: ABC y sensibilidad (a una especificidad del 95 %) para ensayos individuales de marcadores de acuerdo con la clase.*

ABC

Sensibilidad

Todos

I-IV I-II Todos I-IV I-II

Septina 9 (Media mayoritaria)

73 73 67 49 49 37

RASSF2 (Media log)

72 73 70 45 48 41

TFAP2E (Media log)

68 71 67 32 38 30

SND1 (Media log)

64 65 62 25 35 29

PCDHGC3 (Media log)

65 66 64 30 32 29

*todos los valores de p fueron menores de 0,00001

Tabla 9: Ensayos de acuerdo con el Ejemplo 2.

Gen

Cebador directo SEC ID Nº: Cebador inverso SEC ID Nº: Bloqueante SEQ ID NO: Sonda SEQ ID NO: Sonda SEQ ID NO:

Actina B

67 68 69

Fragmento libre de citosina

70 71 72

GSTP

73 74 75 76 77

Histona H4 HIST1H4K

78 79 80 81 82

RASSF2

83 84 85 86 87

TFAP2E

88 89 90 91 92

Tabla 10 Tabla 11

Marcador

Clase negativa I: Sano Clase negativa II: Sano + Biopsia (-)

ABC

Sens./Espec. Valor de p de Wilcoxon ABC Sens./Espec. Valor de p de Wilcoxon

GSTP1

0,89 0,63 / 0,96 0 0,79 0,31 / 0,96 0

RASSF 2A

0,90 0,74 / 0,96 0 0,79 0,24 / 0,96 0

HIST1H 4J

0,91 0,69 / 0,96 0 0,78 0,36 / 0,96 0

TFAP2 E

0,86 0,47 / 0,96 0 0,76 0,27 / 0,96 0

imagen29

Marcador

Clase negativa I: Sano Clase negativa II: Sano + Biopsia (-)

ABC

Sens./Espec. Valor de p de Wilcoxon ABC Sens./Espec. Valor de p de Wilcoxon

GSTP1

0,61 0,17 / 0,96 0,0063 0,58 0,17 / 0,95 0,0183

RASSF2A

0,68 0,37 / 1,00 0 0,64 0,20/0,95 0

HIST1H4 J

0,64 0,26/0,96 5e-04 0,56 0,16 / 0,95 0,0572

TFAP2E

0,61 0,22/1,00 4e-04 0,56 0,09/0,95 0,0128

Tabla 12

Marcador

Clase negativa I: Sano Clase negativa II: Sano + Biopsia (-)

ABC orina

ABC plasma ABC orina ABC plasma

GSTP1

0,89 0,61 0,79 0,58

RASSF2A

0,90 0,68 0,79 0,64

HIST1H4 J

0,91 0,64 0,78 0,56

TFAP2E

0,86 0,61 0,76 0,56

Tabla 13

Panel de marcadores

% de Sens. de cáncer de próstata % de Espec. sanos

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

74 96

HIST1H4J

69 96

GSTP1

63 96

TFAP2E

46 100

Paneles cualitativos:

GSTP1+HIST1H4J

79 98

RASSF2A+HIST1H4J

94 88

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+HIST1H4J

94 88

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

79 98

Tabla 14 Tabla 15

Panel de marcadores

% de Sens. de cáncer de próstata % de Espec. Sano + Biopsia (-)

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

74 76

HIST1H4J

69 68

GSTP1

63 80

TFAP2E

46 88

Paneles cualitativos:

imagen30

Panel de marcadores

% de Sens. de cáncer de próstata % de Espec. Sano + Biopsia (-)

GSTP1+HIST1H4J

79 72

RASSF2A+HIST1H4J

94 54

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+HIST1H4J

94 58

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

79 76

Panel de marcadores

% de Sens. de cáncer de próstata % de Espec. sanos

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

37 100

HIST1H4J

26 96

GSTP1

17 94

TFAP2E

22 100

Paneles cualitativos:

RASSF2A+HIST1H4J

41 98

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)

32 100

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

39 96

Tabla 16

Panel de marcadores

% de Sens. de cáncer de próstata % de Espec. Sano + Biopsia (-)

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

37 91

HIST1H4J

26 88

GSTP1

17 95

TFAP2E

22 92

Paneles cualitativos:

RASSF2A+HIST1H4J

41 88

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)

32 92

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

39 94

Tabla 17

Marcador

Cáncer de próstata frente a biopsia (-)

ABC

Sens./Espec. Valor de p de Wilcoxon

GSTP1

0,69 0,23/0,95 6e-04

RASSF2A

0,66 0,18/0,95 0,0043

HIST1H4J

0,64 0,28/0,95 0,0126

TFAP2E

0,65 0,21/0,95 0,0062

Claims (14)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, donde la expresión disminuida de y/o metilación de CpG en el gen RASSF22 es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

2. 2.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito a partir de dicho gen, o donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia del mismo, o donde dicha expresión se determina detectando la presencia o ausencia de metilación de CpG en dicho gen, donde la presencia de metilación indica la presencia de un carcinoma.

3. 3.

   El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polipéptido se detecta mediante uno o más medios seleccionados del grupo que comprende análisis de transferencia de Western, cromatografía, inmunoensayo, inmunoensayo ELISA, radioinmunoensayo, anticuerpo y combinación de los mismos.

4. 4.

   Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto, que comprende poner en contacto ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, con al menos un reactivo, o series de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la al menos una región diana es una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1, donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido de CpG, y mediante el cual la detección del carcinoma, al menos en parte, se posibilita y donde ma metilación de CpG en la SEC ID Nº: 1 es indicativa de dicho trastorno.

5. 5.

   Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata, que comprende:

   a) extraer o de otro modo aislar ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas; b) tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' de las mismas a uracilo u otra base que sea diferente de manera detectable en cuanto a propiedades de hibridación; c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas, donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo bien se amplifica para producir al menos un amplificado, o no se amplifica; y d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID Nº: 1, o un promedio, o un valor que refleje un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad dinucleótidos de CpG de SEC ID Nº: 1, mediante el cual al menos uno de detectar y diagnosticar cáncer, al menos en parte, se posibilita y donde la metilación de CpG es indicativa de cáncer de próstata.

6. 6.

   El método de reivindicación 5, donde poner en contacto o amplificar en c) comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que comprende: el uso de una ADN polimerasa resistente al calor como enzima de amplificación; el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3' exonucleasa; el uso de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la generación de una molécula de ácido nucleico amplificada que porta un marcador detectable.

7. 7.

   El método de reivindicación 5, que además comprende en la etapa d) el uso de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico que comprenden en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas, donde dicha molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico suprime la amplificación del ácido nucleico al que está hibridada, y/o donde determinar en d) comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico en cada caso comprendiendo una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas.

8. 8.

   El método de reivindicación 7, que además comprende extender al menos una de dichas moléculas de ácido nucleico en al menos una base nucleotídica.

9. 9.

   El método de reivindicación 7, donde poner en contacto o amplificar en c), comprende el uso de cebadores específicos de metilación.

10. 10.

    Un método para detectar el cáncer de próstata, que comprende:

    a) extraer o de otro modo aislar ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas; b) digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación; poner en contacto el ADN digerido con enzima de restricción de b), con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID Nº: 1; y c) determinar, basándose en la presencia o ausencia de un amplificado el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID Nº: 1, mediante el cual al menos uno de detectar y clasificar el cáncer, al menos en parte, se posibilita y donde ma metilación de CpG en la SEC ID Nº: 1 es indicativa de cáncer de próstata.

11. 11.

    El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la presencia o ausencia de un amplificado se determina mediante hibridación a al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que es idéntico, complementario, o hibrida en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 16 bases de longitud de SEC ID Nº: 1.

12. 12.

    Uso de un ácido nucleico tratado derivado de la SEC ID Nº: 1 genómica en la detección del cáncer de próstata, donde se convierte al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico a uracilo u otra base que es diferente de manera detectable a citosina en cuanto a su hibridación, o uso de un ácido nucleico en la detección del cáncer de próstata, comprendiendo dicho ácido nucleico al menos 16 nucleótidos contiguos, comprendiendo preferentemente al menos 50 nucleótidos contiguos, de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 7, 16, 17, y secuencias complementarias a estas, donde dicho ácido nucleico comprende al menos una base que se ha convertido de una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico a uracilo u otra base que es diferente de manera detectable a citosina en cuanto a su hibridación, donde la secuencia de bases contiguas comprende al menos una secuencia de dinucleótido de CpG, TpG o CpA y donde la metilación de CpG de SEC ID Nº: 1 es indicativa de cáncer de próstata.

13. 13.

    Uso de un kit en el diagnóstico y/o detección de cáncer de próstata, donde la expresión disminuida de RASSF2A es indicativa de cáncer de próstata, siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 2 y que comprende a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripción del gen RASSF2; (b) un envase adecuado para contener a los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprende los productos de transcripción donde los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y opcionalmente, (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit, o siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 3 y que comprende (a) un medio para detectar polipéptidos de RASSF2; (b) un envase adecuado para contener dicho medio y la muestra biológica del paciente que comprende los polipéptidos donde los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b).

14. 14.

    Uso de un kit en el diagnóstico y/o detección de cáncer de próstata, donde la metilación de CpG es indicativa de cáncer de próstata. siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 5 y que comprende (a) reactivo de bisulfito; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, complementarias, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de 9 o preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID Nº: 6, 7, 16, 17, o siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 10 y que comprende (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que sean idénticos, complementarios, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de SEC ID Nº: 1; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

    90 91

    imagen2