JP4762636B2 - Ｄｎａ中のメチル化状態を判定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ中のメチル化状態を判定する方法に関する。

ゲノムＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化は、生物の発生過程においてゲノム配列の変化を伴わずに遺伝子の転写活性を抑制する機構の一つとして知られている。近年、癌等の疾病においても遺伝子制御領域のＤＮＡのメチル化が検出されており、ＤＮＡ修復系遺伝子等の活性低下に深く関わっていることが報告されている（非特許文献１）。また、ゲノムＤＮＡのメチル化又は脱メチル化は、老化や感染、生活習慣に相関することが示唆されている（非特許文献２）。したがって、病態に関与する遺伝子、および遺伝子制御領域のＤＮＡのメチル化状態を把握することは、癌や生活習慣病などの疾病の早期発見に繋がる可能性があると考えられる。

ＤＮＡのメチル化は、形質が均一と考えられる培養細胞においても、個々の細胞のＤＮＡのメチル化状態が同一でないことが知られている。したがって、ある遺伝子制御の特定領域と疾病との関連を模索するためには、個々の細胞のＤＮＡのメチル化状態を知るだけでは不十分であり、細胞集団のＤＮＡのメチル化状態を知ることが重要である。

これまで、幾つかＤＮＡのメチル化を測定する方法が報告されてきた。ＭＳＰ法（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）は、ＤＮＡを重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理することにより、メチル化シトシンに変化を与えずに、非メチル化シトシンをウラシルに変換した後、メチル化検出用プライマーと非メチル化検出用プライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、遺伝子増幅の有無によってメチル化を検出するものである（非特許文献３）。この方法は検出感度が高いものの、ＤＮＡ上の特定の１箇所のメチル化しか検出することができない。

また、ｄｄＣＴＰ（ジデオキシシチジン−５’−三リン酸）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるメチル化の測定方法（非特許文献４）も報告されているが、この方法はメチル化シトシンの量のみしかを測定することができないため、メチル化の位置に関する情報を得ることができない。

さらに、メチル化の位置情報が得られる方法として、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（非特許文献５）が報告されている。この方法は、ＤＮＡを重亜硫酸塩で処理した後、大腸菌へクローニングし、それぞれのクローンをシークエンシングにより測定する方法である。この方法は、他の方法に比べて最も詳細なＤＮＡメチル化情報を得られることができるが、クローニングが必要なため多大な労力を要するゆえ、ハイスループットな測定を行うことができない。

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したがって、本発明は、上記の従来技術の問題点を解決すべく、細胞集団などから得る異なるメチル化状態を有するＤＮＡのある特定領域におけるメチル化状態を、クローニングすることなく簡便にかつ一度の操作で判定する方法を提供することを課題とする。

本発明の発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡ中の特定領域におけるメチル化状態を、化学処理、ＰＣＲ法による特定領域に相当する２本鎖ＤＮＡ断片の増幅、２本鎖ＤＮＡ断片をテンプレートとするＰＣＲ法による１本鎖ＤＮＡ断片の合成、及びキャピラリー電気泳動による１本鎖ＤＮＡ断片の検出結果によって、判定する方法を見出した。この方法は、クローニングすることなく簡便に一度の操作で細胞集団などから得る異なるメチル化状態を有するＤＮＡ中のメチル化を検出することができ、さらにマルチプレックスＰＣＲ法及び複数の蛍光標識されたプライマーの使用により、複数の領域のメチル化状態を判定することができることを見出して、本発明を完成することに至った。

すなわち、本発明は、ＤＮＡを化学処理し、非メチル化シトシンをウラシルに変換する第１のステップと、
特定領域を増幅できるプライマー対及びｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸）を含む反応液を用いたＰＣＲ法により特定領域に相当する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する第２のステップと、
増幅した２本鎖ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１個のプライマー、ｄＮＴＰ及びｄｄＣＴＰ（ジデオキシシチジン−５’−三リン酸）を含む反応液を用いたＰＣＲ法により１本鎖ＤＮＡ断片を合成する第３のステップと、
合成した１本鎖ＤＮＡ断片をキャピラリー電気泳動により分離し、検出する第４のステップと、
検出されたピークの位置に相当するシトシンがメチル化シトシンであると判定する第５のステップと
を備える、ＤＮＡ中の特定領域におけるメチル化状態を判定する方法を提供する。

第１のステップにおいて、メチル化シトシンに変化を与えずに、非メチル化シトシンを特異的にウラシルに変換する。第２のステップにおいて、検出の目標領域（特定領域）に相当する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅することで、ウラシルをチミンに、そしてメチル化シトシンを非メチル化シトシンに変換する。第３のステップにおいて、第２のステップで増幅された２本鎖ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１本鎖ＤＮＡを伸長させるが、反応液中にｄｄＣＴＰが含まれるため、伸長中のＤＮＡはランダムにｄｄＣＴＰを取り込み、そして１本鎖ＤＮＡの伸長が停止する。すなわち、第３のステップで、特定領域の全長を伸長した１本鎖ＤＮＡ断片以外に、テンプレート中の各シトシンの位置まで伸長した、様々な長さの１本鎖ＤＮＡ断片が合成される。第４のステップにおいて、キャピラリー電気泳動により第３のステップで得た様々な長さの１本鎖ＤＮＡ断片をそのサイズ（長さ）によって分離し、検出する。キャピラリー電気泳動は微量なサンプルでも１塩基単位で感度よくＤＮＡを分離することができる。そして、第５のステップにおいて、検出された１本鎖ＤＮＡ断片の長さに相当する位置が元々のＤＮＡ中のメチル化シトシンが存在する位置であると判定することができる。したがって、本発明の方法により、クローニングすることなく、一度の操作でＤＮＡの特定領域にわたってメチル化の状態を判定することが可能である。

上記第１のステップの化学処理は、重亜硫酸塩を用いて行われることが好ましい。重亜硫酸塩を用いることにより、簡便に効率よくシトシンをシトシンスルホン酸及びウラシルスルホン酸を経て、ウラシルに変換することができる。また、メチル化シトシンではこの反応が著しく遅いため、メチル化シトシンのまま残ることとなる。

上記第３のステップのプライマーが、蛍光標識したプライマーであることが好ましい。蛍光標識したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、合成された１本鎖ＤＮＡ断片が５’側に蛍光標識プライマーを含むこととなるため、後のステップで高感度かつ簡便に検出されることが可能である。また、複数の異なる蛍光物質によって標識された複数のプライマーを用いることにより、複数のＤＮＡ領域のメチル化状態をも一度の操作で判定することが可能である。

上記第３のステップのｄｄＣＴＰは、蛍光標識したｄｄＣＴＰであることも好ましい。蛍光標識プライマーの代わりに、蛍光標識されたｄｄＣＴＰを用いてＰＣＲを行うことで、合成された１本鎖ＤＮＡが３’側に蛍光標識ｄｄＣＴＰを含むこととなるため、後のステップで高感度かつ簡便に検出されることが可能である。

上記第３のステップの反応液中、ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰ（デオキシシチジン−５’−三リン酸）との混合比は、用いるポリメラーゼの種類に依存するが、１００〜１／５０であることが好ましい。例えば、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率に優れたポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（アマシャム）を用いる場合、混合比は１／５〜１／５０であることが好ましい。この場合には、特定領域中のメチル化シトシンの個数にもよるが、約５００ｂｐまでのＤＮＡ１本鎖を伸長することが可能である。ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰとの混合比が、１／５０よりも小さい場合には、ｄｄＣＴＰが取り込まれる確率が著しく低いため、１本鎖ＤＮＡ断片中のシトシンの検出感度が低減する傾向があり、逆に１／５よりも大きい場合には、ｄｄＣＴＰが取り込まれる確率が著しく高いため、１本鎖ＤＮＡ断片が伸長しにくくなり、特定領域の全長にわたって検出できなくなる傾向がある。また、例えばＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ）を用いる場合は、反応液中のｄｄＣＴＰとｄＣＴＰとの混合比が１〜５００であることが好ましい。この場合には、特定領域中のメチル化シトシンの個数にもよるが、約５００乃至１０００ｂｐまでのＤＮＡ１本鎖を伸長することが可能である。したがって、ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰとの混合比は、用いるポリメラーゼに応じて最適化する必要がある。

上記特定領域の長さが、５０ｂｐ〜５００ｂｐまでであることが好ましい。用いるポリメラーゼを選択すること、ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰとの混合比を調節すること及び検出感度の良いキャピラリー電気泳動装置の使用などで、５００ｂｐまでの特定領域にわたってメチル化の状態を判定することも可能である。５０ｂｐよりも短い場合には、遺伝子制御領域の長さよりも短い場合が多く、制御領域の全域のメチル化状態を判定することができない可能性があり、逆に５００ｂｐよりも長い場合には、全長の伸長が著しく難しくなる可能性がある。

本発明の方法によれば、細胞集団などから得る異なるメチル化状態を有するＤＮＡの特定領域、特に５０ｂｐ〜５００ｂｐまでの特定領域におけるメチル化状態を、クローニングすることなく簡便にかつ一度の操作で判定することができる。

以下、本発明の好適な実施形態について詳しく説明する。

本発明の方法によってメチル化状態が判定できるＤＮＡは、メチル化が存在する又は存在することが予想されるＤＮＡである。例えば、株化細胞系、初代培養細胞系、若しくは生体組織から採取した細胞集団由来のゲノムＤＮＡ、或いは涙などの体液、又は痰、尿若しくは糞便などの排泄物に含まれるＤＮＡ断片のいずれでもよい。また、ヒト由来のＤＮＡのメチル化状態の判定は、病態との関連の解析や病気の早期診断などに繋がるため、特に好ましい。

本発明の方法によってメチル化状態が判定できる特定領域は、ＤＮＡ（遺伝子）の一部であって目的によって適宜に選択することができる。癌又は生活習慣病などの疾病に関連する遺伝子の発現制御領域（プロモータ領域など）を選択する場合には、病態との関連の解析や病気の早期診断などに繋がるため特に好ましい。特定領域の長さは、全長におけるメチル化の状態を判定するために、５０ｂｐ〜５００ｂｐまでの長さが好ましく、１００ｂｐ〜３００ｂｐまでの場合には、最も検出感度がよいためより好ましい。

また、細胞集団由来、又は体液若しくは排泄物に含まれるＤＮＡを判定するために、本発明の方法に適用する前に、細胞集団や排泄物よりＤＮＡを抽出し、精製することが好ましい。抽出・精製方法としては、一般的に行われる方法であればよい。市販されている各種組織、代謝物からＤＮＡを効率的に抽出するためのキット、例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などの抽出キットを用いることで効率的に抽出できるため特に好ましい。

本発明の方法の第１のステップの化学処理では、化学反応によってメチル化シトシンに変化を与えずに、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。重亜硫酸塩を用いる化学処理は、簡便で効率よく非メチル化シトシンをウラシルに変換できるため、特に好ましい。そのうち、重亜硫酸ナトリウムがよく使用される。化学処理方法としては、例えば、重亜硫酸塩の水溶液を用いて、非特許文献３又は５などで開示されている方法に従って行うことが好ましい。

本発明の方法の第２のステップで使用されるプライマー対は、特定領域の全長を増幅できる、特定領域の５’末端側のセンスプライマーと３’末端側のアンチセンスプライマーとの１対のプライマーを含む。プライマーの設計について、特定領域を特異的に増幅できるプライマー対であればよいが、一般的にＴｍ値やＣＧの含有量を考慮することが好ましく、市販又は公開されているソフトを使用して設計することもできる。また、クローニングをする場合を考慮すれば、制限酵素サイトを含むことができる。プライマーの長さは、１５ｂｐ〜５０ｂｐであることが好ましく、２０ｂｐ〜３０ｂｐであることがより好ましい。

本発明の方法の第２のステップで行われるＰＣＲ法は、一般的な２本鎖ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ法であればよい。反応液には、テンプレートとしてのＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片など）、ポリメラーゼ、プライマー対、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び緩衝液などが含まれ、各成分の使用量は一般的なＰＣＲ法に準ずる。ポリメラーゼの種類を特にプライマーのＴｍ値などによって適宜に選択することができるが、そのうちＴａｑポリメラーゼがよく使用される。ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）は、市販されている予め混合されているものを使用すればよく、その使用量はポリメラーゼなどによって適宜に選択することができる。また、温度、時間若しくは反応サイクルなどの反応条件を、プライマー対及びポリメラーゼの種類、特にプライマーのＴｍ値によって適宜に設定すればよいが、条件設定のための予備実験を行うことが好ましい。

ＰＣＲ産物をそのまま用いて次のステップを行うこともよいが、予めＰＣＲ産物を精製することがより好適である。精製方法としては、一般的なＤＮＡの精製方法であればよい。例えば、市販のＰＣＲ産物より過剰のプライマーやｄＮＴＰを除去するためのキットや、アガロースゲル電気泳動によって分離した後、市販のゲルからＤＮＡを回収するキットによって精製する方法である。

本発明の方法の第３のステップで使用されるプライマーは、特定領域の５’末端側のセンスプライマー又は３’末端側のアンチセンスプライマーのいずれか１つである。このプライマーは、一般的なＰＣＲ反応に使用できるプライマーであればよく、第２のステップで使用されたプライマー対のいずれか一方を援用することもできる。プライマーの設計について、一般的なにＴｍ値やＣＧの含有量を考慮することが好ましく、市販又は公開されているソフトを使用して設計することもできる。プライマーの長さは、１５ｂｐ〜５０ｂｐであることが好ましく、２０ｂｐ〜３０ｂｐであることがより好ましい。また、合成されたＤＮＡ１本鎖が後のステップにおいて検出されやすいように、プライマーを蛍光標識することが好ましい。蛍光標識の方法としては、一般的に用いられる蛍光色素を用いて行えばよいが、例えば、６−ＦＡＭ（6-carboxyfluoresein）、ＴＥＴ（6-carboxy-2’,4,7,7’-tetrachlorofluorescein）、ＨＥＸ（6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein）、ＲＯＸ（6-carboxy-x-rhodamine）、ＴＡＭＲＡ（6-carboxytetramethylrhodamine）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ、又はＰＥＴなどの５’末端蛍光標識オリゴフクレオチドを用いる蛍光標識が可能である。

本発明の方法の第３のステップで使用されるｄｄＣＴＰは、市販されているものであればよい。合成されたＤＮＡ１本鎖が後のステップにおいて検出されやすいように、プライマーの代わりにｄｄＣＴＰを蛍光標識することが好ましい。蛍光標識の方法としては、一般的に用いられる蛍光色素を用いて行えばよいが、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、fluorescein、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどを用いた蛍光標識が可能である。また、ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰとの混合比が、特定領域の長さやポリメラーゼの種類によって１００〜１／５０の範囲内で適宜に選択することができ、例えば、特定領域の長さが５０ｂｐ〜５００ｂｐであり、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャム・ファルマシア）を用いる場合には、その比が好ましくは１／５〜１／５０であり、また、Ｔａｑポリメラーゼなどの通常のポリメラーゼを用いる場合には、その比が好ましくは１〜１００である。

本発明の方法の第３のステップで行われるＰＣＲ法の反応液には、テンプレートとしてのＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片など）、ポリメラーゼ、１個のプライマー、ｄＮＴＰ、ｄｄＣＴＰ及び緩衝液などが含まれ、各成分の使用量は一般的なＰＣＲ法に準ずる。ポリメラーゼの種類を特にプライマーのＴｍ値などによって適宜に選択することができるが、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャム・ファルマシア）やＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ（パーキンエルマー）のようなジデオキシヌクレオチドの取り込み効率に優れたポリメラーゼを用いることが好ましい。ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）は、市販されている予め混合されているものを使用すればよく、その使用量はポリメラーゼなどによって適宜に選択することができる。また、温度、時間又は反応サイクルなどの反応条件をプライマー及びポリメラーゼ、特にプライマーのＴｍ値によって適宜に設定すればよいが、条件設定のための予備実験を行うことが好ましい。

本発明の方法の第４のステップで行われる１本鎖ＤＮＡの分離及び検出は、検出器が付いて、データ解析ソフトウェアが搭載されているキャピラリー電気泳動装置を用いて行われることが好ましい。微量なサンプルで感度よく分離できるキャピラリー電気泳動装置であればよいが、ＤＮＡの分析に適しているものがより好ましい。

本発明の方法の第５のステップでは、第４のステップにおいて検出される１本鎖ＤＮＡの長さに相当する位置には、元々のＤＮＡにおいてメチル化シトシンが存在すると判定する。複数のメチル化シトシンが検出された場合には、それが単一細胞（クローン）に存在するかそれとも個別の細胞に存在するかは判定できないが、ある目的領域のＤＮＡ配列上に存在するメチル化状態が判定できる。特に、ヒト細胞集団由来のＤＮＡについてある目的領域の数百ｂｐに渡って存在するメチル化状態判定は、疾病や健康度との関連で意義がある。

以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１ 培養細胞由来ＤＮＡのメチル化の測定）
Ｃａｃｏ−２培養細胞より、ゲノムＤＮＡ抽出キットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し精製した。得られたゲノムＤＮＡを非特許文献５に開示された方法に従って重亜硫酸ナトリウムで処理した。具体的には、１μgのゲノムＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｈｔｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、添付の処理手順にしたがって重亜硫酸処理し、洗浄・精製を行った。この処理により、メチル化シトシンに変化を与えずに、非メチル化シトシンをウラシルに塩基変換させた。

次に、ＡＰＣプロモータ領域を、プライマー対（5’-GTTATTAATTTTTTTGTTTGTTGGG-3’（配列番号１）、及び5’-ACACCTCCATTCTATCTCCAATAAC-3’（配列番号２））を用いたＰＣＲ法によりＡＰＣプロモータ領域のＤＮＡ断片（２９０ｂｐ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＴＡベクターであるｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ）に導入し、さらに大腸菌にトランスフォームし、ＴＡクローニングを行った。得られた単一コロニーよりプラスミドを抽出・精製し、単一ＤＮＡクローンとした。

次に、得られた単一ＤＮＡクローン（プラスミド）に対して、５’末端が蛍光標識されたプライマー（5’―FAM-GTTATTAATTTTTTTGTTTGTTGGG-3’）（配列番号３）を用いてＰＣＲ反応を行った。そのＰＣＲの反応液には、単一ＤＮＡクローン１００ｎｇ、Ｏ．４ｍＭずつのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を、０．０４ｍＭのｄｄＣＴＰ、１ｐｍｏｌの蛍光標識プライマー、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９．３）、５ｍＭのＭｇＣ１_２、０．０３ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０１５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０１５％のＮＰ−４０、及び５ｕｎｉｔのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）が含まれていた。ＰＣＲ反応は、最初に９５℃２分で変性を行い、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分の処理を２０サイクル繰り返し、最後に４℃で保存した。

得られたＰＣＲ産物１μＬに、０．５μＬのサイズスタンダードＧＳ−５００（アプライドバイオシステムズ）、及び１０μＬのホルムアミドを加えて、９５℃で３分間熱処理し、急冷した後、ジェネティックアナライザー３１０（アプライドバイオシステムズ）でＤＮＡ断片を分離し検出した。単一クローンＣ−９及びＣ−１９の結果を図１及び図２に示す。

図１に示したように、クローンＣ−９のＡＰＣプロモータ領域には、３５、３７、５１、６０、８５、９３、１１３、１２０、１２５、１３２、１５７、１６６、１７６、１８９、１９２、２００、２０３、２２１、２２５、２３１、及び２５７ｂｐの計２１のピークが存在し、また、図２に示したように、クローンＣ−１９のＡＰＣプロモータ領域には、３５及び１８７ｂｐに２つのピークが存在することが分かった。これらのピークの個数と位置が、塩基配列解析によって決定されたメチル化シトシンの個数及び位置と一致していることが分かった。したがって、本発明の方法により、単一クローンのメチル化状態を判定できることを判明した。

さらに、上記と同様な方法により５つの単一クローンを混合したサンプルを測定し、その結果を図３に示す。また、各単一クローンのＡＰＣプロモータ領域について、シークエンシングによって塩基配列決定を行った。その結果及びＡＰＣ遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を図４に示す。

図３に示したように、５つのクローンのＡＰＣプロモータ領域には、３５、３７、５１、６０、８５、９３、１１３、１２０、１２５、１３２、１５７、１６６、１７６、１８２、１８７、１８９、１９２、２００、２０３、２２１、２２５、２３１、及び２５７の計２３のピークが存在していることが分かった。これらのピークは、図４に示しているそれぞれのクローンのＡＰＣプロモータ領域のメチル化シトシンの合計の位置と一致している。以上の結果より、本発明の方法は複数のクローンのメチル化シトシンの位置、すなわち、細胞集団のメチル化状態をクローニングせずに簡便にかつ一度の操作で検出することができることを判明した。

（実施例２ ヒト細胞集団由来ＤＮＡのメチル化の測定）
健康人の血液より遠心分離して取得した白血球から、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、精製した。得られたゲノムＤＮＡを、実施例１で示した方法と同様に、重亜硫酸ナトリウムで処理した後、配列番号１及び配列番号２からなるプライマー対を用いたＰＣＲ法によりＡＰＣプロモータ領域のＤＮＡ断片を増幅した。これらの操作により、ゲノムＤＮＡのＡＰＣプロモータ領域中のメチル化シトシン及び非メチル化シトシンは、それぞれ非メチル化シトシン及びチミンに塩基変換された。

次に、得られたＤＮＡ断片に対して、クローニングせず、実施例１に記載の方法と同様に、５’末端が蛍光標識されたプライマー（配列番号３）を用いてＰＣＲ反応を行い、ジェネティックアナライザー３１０（アプライドバイオシステムズ）でＤＮＡ断片を分離し検出した。その結果を図５に示す。ポジティブコントロールとして実施例１で得られたクローンＣ−９を同様に測定し、その結果を図６に示す。

図５に示したように、健康人のＡＰＣ遺伝子のプロモータ領域に、２９０ｂｐに１つだけピークが存在し、それはｄｄＣＴＰを取り込まずに伸長したＤＮＡ断片の全長に相当するため、健康人の該当領域にメチル化が存在しないことが分かった。これに対して、図６に示したように、クローンＣ−９の分析結果には、全長の２９０ｂｐピーク他に、２１のピークが存在した。それぞれの位置に相当するシトシンは、塩基配列決定によって得られたメチル化シトシンの位置と一致していることが分かった。以上の結果から、本発明の方法によりヒト由来の細胞集団のメチル化をクローニングせずに一度の操作で検出することができることを判明した。これにより、ＤＮＡのメチル化と疾病との関連を模索する手法として用いられることが可能であると判明した。

（実施例３ 複数の領域のＤＮＡのメチル化の測定）
培養細胞ＨＣＴ−１１６のＤＮＡ修復酵素であるＭＧＭＴのプロモータ領域について実施例２と同様な測定を行った。具体的には、ＭＧＭＴのプロモータ領域にメチル化が存在する培養細胞ＨＣＴ−１１６よりゲノムＤＮＡを抽出し、重亜硫酸塩処理した後、当該領域をプライマー対（5’-ATTATTTTTGTGATAGGAAAAGGTA-3’（配列番号４）、及び5’-AAAACCTAAAAAAAACAAAAAAAC-3’（配列番号５））を用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、反応酵素としてＡｃｃｕｍｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）を用いて、最初に９５℃２分で変性を行い、その後９５℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分間の処理を３５サイクル繰り返した。ＰＣＲ反応終了後ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で余剰プライマーを除去した。

次に、精製した増幅産物をテンプレートＤＮＡとし、蛍光標識された1個のプライマー（5’-FAM-ATTATTTTTGTGATAGGAAAAGGTA-3’）（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片のメチル化を測定した。その結果を図７に示す。さらに、テンプレートとして、ＭＧＭＴのプロモータ領域の増幅産物の他に、ＡＰＣ及びｈＭＬＨ１のプロモータ領域の増幅産物も存在したサンプルについて、同様な蛍光標識プライマーを用いて測定し、その結果を図８に示す。

図７に示したように、それぞれのピークの位置が当該領域に存在するメチル化シトシンの位置と一致していることが分かった。また、図８に示したように、複数のＤＮＡ領域のテンプレートが混在するサンプルについても、プライマーの特異性のため、単一のＤＮＡ領域のテンプレートの場合と同様なピークのパターンが得られた。

以上の結果より、マルチプレックスＰＣＲにより複数の領域を増幅することにより得られるサンプルについても、特定の領域のメチル化位置を検出することが可能であると判明した。この結果は、異なった蛍光色素でラベルされたプライマーを利用することにより、一度の操作で複数ＤＮＡ領域のメチル化位置を検出できることを示唆した。

（比較例 ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法）
培養細胞ＨＣＴ−１１６より抽出されたゲノムＤＮＡは、実施例３に記載の方法と同様に重亜硫酸ナトリウム溶液で処理した後、ＭＧＭＴのプロモータ領域をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応終了後ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で余剰プライマーを除去した。この段階でのＰＣＲ増幅後のサンプル中には、同一のＭＧＭＴのプロモータ領域ではあるが、メチル化パターンの異なっているＤＮＡ断片が存在している。このＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターにクローニングし、単一クローンを調製した。そのうちの一つのクローンを選択し、プラスミドＤＮＡを抽出後、そのプラスミドに対して塩基配列決定した。その結果を図９に示す。一方、クローニングせずに種々のメチル化パターンを持つＤＮＡ断片を一度に直接塩基配列決定した結果を図１０に示す。

図９に示したように、クローニングによって単一クローンにした場合には、塩基配列を決定できることが分かった。この場合は、元々のＤＮＡ中のメチル化シトシンはシトシンとなり、非メチル化シトシンはチミンとなっている。一方、図１０に示したように、クローニングしない複数のクローンの場合、一度の操作で塩基配列を決定することができないことがわかった。これは、同一の位置にメチル化シトシンのクローンと非メチル化シトシンのクローンが混在するため、同一の位置にシトシンとチミンが混在するからである。以上の結果より、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法は複数のメチル化パターンが存在するサンプル（例えば、細胞集団由来のゲノムＤＮＡ）のメチル化の測定に適さないことを判明した。

ＤＮＡ（遺伝子）上に存在するメチル化の位置は病態により様々であるだけでなく、個々の細胞によっても異なっている。当然ながら、個々のヒトによっても異なったメチル化状態を示す。したがって、ある特定の遺伝子制御領域（ＤＮＡ修復遺伝子や癌関連遺伝子等）のメチル化位置を迅速に知ることは、疾病に関する様々な態様を知る上で極めて有効であり、疾病診断や健康状態の把握に貢献し得るものと考えられる。本発明の方法によれば、従来多大な労力を必要とする細胞集団などの複数のメチル化パターンが存在するサンプルの５０ｂｐ〜５００ｂｐにわたるメチル化状態の判定が可能となり、新たな診断マーカーの発見や健康度の診断に貢献することが可能である。

クローンＣ−９のＡＰＣプロモータ領域の測定結果を示す。 クローンＣ−１９のＡＰＣプロモータ領域の測定結果を示す。 ５つのクローン（Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−９、Ｃ−１９及びＣ−２２）のＡＰＣプロモータ領域の測定結果を示す。 ＡＰＣ遺伝子のプロモータ領域の塩基配列及び５つのクローンの塩基配列の測定結果を示す。 健康人の白血球由来のＤＮＡサンプルのＡＰＣプロモータ領域の測定結果を示す。 クローンＣ−９のＡＰＣプロモータ領域の測定結果を示す。 増幅されたＭＧＭＴプロモータ領域ＤＮＡをテンプレートとしたＨＣＴ−１１６細胞のＭＧＭＴプロモータ領域の測定結果を示す。 増幅されたＭＧＭＴ、ＡＰＣ及びｈＭＬＨ１プロモータ領域ＤＮＡをテンプレートとしたＨＣＴ−１１６細胞のＭＧＭＴプロモータ領域の測定結果を示す。 クローニングした場合のシークエンシングの結果を示す。 クローニングしない場合のシークエンシングの結果を示す。

Claims (5)

1. ＤＮＡ中の特定領域におけるメチル化状態を判定する方法であって、
   ＤＮＡを重亜硫酸塩で処理し、非メチル化シトシンをウラシルに変換する第１のステップと、
   特定領域を増幅できるプライマー対及びｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸）を含む反応液を用いたＰＣＲ法により特定領域に相当する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する第２のステップと、
   増幅した２本鎖ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１個のプライマー、ｄＮＴＰ及びｄｄＣＴＰ（ジデオキシシチジン−５’−三リン酸）を含む反応液を用いたＰＣＲ法により１本鎖ＤＮＡ断片を合成する第３のステップと、
   合成した１本鎖ＤＮＡ断片をキャピラリー電気泳動により分離し、検出する第４のステップと、
   検出されたピークの位置に相当するシトシンがメチル化シトシンであると判定する第５のステップと
   を備える方法。
2. 第３のステップのプライマーが蛍光標識したプライマーである、請求項１に記載の方法。
3. 第３のステップのｄｄＣＴＰが蛍光標識したｄｄＣＴＰである、請求項１に記載の方法。
4. 第３のステップの反応液中、ｄｄＣＴＰとｄＣＴＰ（デオキシシチジン−５’−三リン酸）との混合比が１００〜１／５０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 特定領域の長さが５０ｂｐ〜５００ｂｐである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
   

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