KR20060026595A

KR20060026595A - 제한효소와 ｄｎａ 칩을 이용한 프로모터의 메틸화 검출방법

Info

Publication number: KR20060026595A
Application number: KR1020040075395A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 윤치왕; 오태정; 윤대경; 이선우; 김명순; 우숙경
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2004-09-21
Filing date: 2004-09-21
Publication date: 2006-03-24
Also published as: US20060063164A1; US7611841B2

Abstract

본 발명은 메틸화에 민감한 제한효소인 HpaII를 이용하여 프로모터의 메틸화 유무를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 임상 샘플 또는 진단대상 유래의 DNA를 제한효소 HpaII로 절단하고, CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 다음, PCR 증폭물의 존재 유무를 메틸레이션 검출용 DNA 칩으로 확인하는 것을 특징으로 하는 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래의 방법과 달리 간편하고, 경제적으로 유전자 프로모터의 메틸화를 검출할 수 있어, 프로모터 메틸화가 일어나는 암 등의 질병 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

메틸화 검출, CpG 섬, HpaII, 프로모터 메틸화

Description

제한효소와 ＤＮＡ 칩을 이용한 프로모터의 메틸화 검출방법{Method for Detecting Methylaion of Promoter Using Restriction Enzyme and DNA Chip}

도 1은 본 발명의 메틸화 검출방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 메틸화시킨 GAPDH 유전자와 메틸화시키지 않은 β-액틴 유전자를 가각 제한효소 HpaII로 처리한 후, 2% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동하여 유전자 단편의 절단여부를 확인한 것이다. 레인 M은 100bp 레더이고, 레인 1은 HpaII로 처리하지 않은 GAPDH 유전자이며, 레인 2는 메틸레이즈로 처리하지 않은 GAPDH 유전자를 HpaII로 처리한 것이고, 레인 3은 메틸화된 GAPDH 유전자를 HpaII로 처리한 것이며, 레인 4는 HpaII로 처리하지 않은 β-액틴 유전자이고, 레인 5는 β-액틴 유전자를 HpaII로 처리한 것이다.

도 3은 메틸화시킨 GAPDH 유전자와 메틸화시키지 않은 β-액틴 유전자의 PCR 산물을 하이브리제이션시킨 DNA 칩의 스캐닝 사진이다.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터의 메틸화를 측정한 DNA 칩 스캐닝 사진이다.

도 5는 MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터의 메틸화를 확인하기 위하여 바이설파이트 시퀀싱을 수행한 결과이다.

도 6은 본 발명의 방법에 의해 인간의 태반, 편도선 암조직, 대장암 조직 유래 유전자 프로모터의 메틸화를 측정한 DNA 칩 스캐닝 사진이다.

현재 임상에서 암의 진단은 문진과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포수가 10억개, 암의 직경이 1cm 이상이 되어야 진단이 가능하다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양마커가 암 선별검사에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어, 위양성이나 위음성이 자주 나타난다.

따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근 할 필요가 있다. 최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 대표적인 방법은 백혈병의 경우, 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능한 한계가 있다.

또한, 암세포가 발현하는 유전자를 RT-PCR 및 블럿팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 위양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어려우며, 그 유용성에도 한계가 있다(Kopreski, M.S. et al., Clin, Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al., Clin. Chem., 47:505, 2001).

최근에는 혈청이나 혈장 내에 DNA를 사용하는 유전자검사가 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리되어 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5-10배로 증가되며, 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트의 표지와 불안정성 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도 되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).

한편, 혈액 외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999), 대장 및 직장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법(Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법(Goessl, C. et al., Cancer Res., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

이에 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도 움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들 만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자 중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. & Bird, A.P., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).

한편, 정상인의 체세포에서는 이들 중요 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화된 X 염색체 상의 유전자들은 메틸화되어 있다.

발암과정 중에는 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.

흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 프로모터 메틸화가 있다. 아울러 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 프로모터 메틸화를 보인다.

중요한 사실은 이러한 프로모터 메틸화에 의한 유전자외 변화가 곧 유전자의 변화, 즉 코딩서열의 돌연변이를 유발하며, 이들 유전자 및 유전자외의 변화가 결합하여 발암이 진행된다는 것이다.

대부분의 암은 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. & Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K.W., Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(MBD), 및 히스톤 디아세틸라제가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000).

프로모터 메틸화를 이용한 암 진단의 정확도를 극대화하고 발암을 단계별로 분석하며, 암과 고령화에 따른 변화를 감별하기 위해서는 프로모터 CpG 섬의 전체 시토신 염기의 메틸화를 모두 정확하게 분석할 수 있는 검사가 필요하다. 현재 이를 위한 표준적 방법은 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이다. 이는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 다음, 표적 유전자의 검사하고자 하는 CpG 섬 전체 부위를 PCR로 증폭한 후, 그 염기서열을 분석하는 것이다. 그러나 이 검사는 한번에 검사할 수 있는 유전자의 수나 검체의 수에 한계가 있으며, 자동화가 어렵고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.

존스 홉킨스 의대와 MD 엔더슨 암센터, 베를린의대 등에서 암과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이렇게 얻어진 기초자료는 DNA Methylation Society(DMS)에서 교류가 이루어지고 있으며, MethDB (http://www.methdb.de)에 자료가 저장되고 있다. 한편, EpiGenX Pharmaceuticals사는 CpG 섬의 메틸화와 관련된 치료제를 개발하고 있고, Epigenomics사는 DNA칩과 MALDI-TOF 등의 기법으로 프로모터 메틸화를 검사하여 암 진단에 응용하려는 연구를 진행 중이다.

현재까지, 특정 유전자 프로모터의 메틸화 패턴을 측정하기 위한 많은 방법들이 시도되어 왔다. 첫째, 각각의 CpG 부위를 메틸화 특이적 효소로 절단한 후, 써던 블럿을 수행하거나, 인위적인 PCR을 수행하는 방법들이 사용되어 왔다 (Hatanda, I. et al., PNAS, 88:9523,1991; Liang, G. et al., Methods, 27:150, 2002). 또 다른 방법으로, 소듐 바이설파이트 변형방법을 통한 메틸리에션 특이 PCR(MSP) (Herman et al., PNAS, 93:9821, 1996), 메틸라이트(MethylLight) (Eads et al., Nucleic Acid Res., 28:e342, 2000) 그리고 COBRA (Xiong et al., Nucleic Acid Res., 25:2532, 1997) 등이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 기술들은 가격이 비싸거나, 임상 등에 응용이 어렵다는 단점이 있다.

최근에는 대용량 분석기술이 발전하면서 CpG 섬 메틸화를 게놈 수준에서 분석할 수 있는 방법들이 개발되었다. Adorjan 등(Adorjan et al., Nucleic Acid Res., 30:e21, 2002)과 Shi 등(Shi et al., J. Cell Biochem., 88:138, 2003)에 의해 바이설파이트 처리후 PCR 방법을 이용한 올리고뉴클레오티드-기초 메틸화 측정방법이 개발되었고, 이외에도 DMH (Hanug, H.T. et al., Human Mol. Genet., 8:459, 1999), CGI (Yan et al., Clin. Cancer Res., 6:1432, 2000) 그리고 ECISTs (Tsou et al., Oncogene, 21:5450, 2002) 방법 등이 개발되어 있다. DNA 칩을 이용한 메틸화 측정방법으로는, 게놈 DNA의 시토신을 우라실로 변화시켜 증폭하여, 상기 증폭체를 올리고뉴클레오티드나 PNA-올리고머에 중합시킨 중합체를 DNA 칩에 하이브리다이제이션시키는 방법(대한민국 특허공개 10-2004-0015705)이 있다.

이러한 방법들은, 기존 방법에 비해 효율성과 대용량 분석에 있어서 진일보하였으나, 시간이 오래 걸리고, 시료의 준비가 복잡하여 임상적용이 용이하지 않다는 문제점을 내포하고 있다. 그러므로, 대용량으로도 간편하고 저렴하게 메틸화를 검증할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 간편하고, 경제적으로 질병관련 유전자 프로모터의 메틸화를 검증하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, CpG 섬에 존재하는 5'-CCGG-3' 염기서열을 인지하여 절단하면서도, 두번째 시토신이 메틸화되었을 경우 절단하지 못하는 특성을 가지는 메틸화-민감성 제한효소인 HpaII를 이용하여 샘플 DNA를 처리하고, 프로모터의 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 다음, PCR 증폭물의 존재 유무를 메틸레이션 검출용 DNA 칩으로 확인한 결과, 프로모터의 메틸화 여부를 신속·정확하면서도 저비용으로 검출할 수 있다는 것을 확인하고 본 방법을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 임상 샘플 또는 진단대상에서 유래된 유전자 프로모터의 메틸화 여부를 신속·정확하면서도 저비용으로 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 임상 샘플에서 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 샘플 DNA를 HpaII 제한효소로 처리하는 단계; (c) 상기 HpaII로 처리된 DNA와 HpaII로 처리하지 않은 DNA(mock DNA)를 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물을 CpG 섬 내에 HpaII site를 포함하고 있는 프로모터 또는 그 단편이 프로 브로 집적되어 있는 메틸레이션 검출용 DNA 칩과 하이브리다이제이션하는 단계; 및 (e) 상기 하이브리다이제이션 결과, HpaII로 처리된 DNA의 증폭 결과물과 mock DNA의 증폭 결과물에서 모두 양성시그널을 나타내는 경우를 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하는 단계를 포함하는 임상샘플 유래 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 샘플 DNA는 게놈 DNA인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 임상샘플은 암 의심환자 또는 진단대상 유래의 조직, 세포, 가래, 대변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기 또는 혈액인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 PCR인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머는 5'-CCGG-3' 서열을 포함하는 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에 사용하는 상기 PCR 프라이머는 증폭되는 DNA 단편의 내부 염기서열 사이에 1개 이상의 HpaII 절단부위가 존재하도록 디자인하여야 한다. 바람직하게, 상기 프라이머는 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34 및 서열번호 35와 36으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸레이션 검출용 DNA 칩은 정상인의 임상샘플 유래 게놈 DNA를 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34 및 서열번호 35와 36으로 각각 증폭하여 수득된 12개의 프로브가 집적되어 있는 것임을 특징으로 할 수 있으나, 프로브로써 CpG 섬 내에 HpaII site를 포함하고 있는 프로모터 또는 그 단편을 사용하는 한 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 12개의 프로브는 서열번호 37 내지 48의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '임상샘플'은 암 여부를 진단할 대상 유래의 조직, 포뿐만 아니라 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기, 혈액 등을 의미한다. 또 다른 용어 'mock DNA'는 임상샘플로부터 분리된, 아무런 처리를 하지 않은 상태의 샘플 DNA를 의미한다.

본 발명에서 사용한 제한효소인 HpaII 효소는 CpG 섬에 존재하고 있는 5'-CCGG-3' 염기서열을 인지하여 절단하는 효소이다. 그러나 상기 염기서열에서 두 번째 시토신이 메틸화되었을 경우에는 절단하지 못하는 특성이 있다.

그러므로, CpG섬이 메틸화된 유전자 프로모터 부위를 HpaII로 처리하면, 효소가 작용할 수 없어 절단되지 않게 되고, 메틸화되지 않은 유전자 프로모터 부위에 HpaII를 처리하면 CpG 부분이 절단되게 된다. 상기 프로모터 부위들을 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면, HpaII에 의해 절단되지 않은 메틸화된 유전자 프로모터 부위는 정상적으로 PCR이 수행되어 DNA 단편이 증폭되지만, 메틸화되지 않은 유전자 프로모터 부위는 중간에서 절단되어 있기 때문에, PCR에 의한 DNA 단편이 증폭되지 않게 된다.

본 발명에서는 상기와 같은 원리를 이용하여, 상기 PCR 산물을 해당 프로모 터 부위의 프로브가 집적된 DNA 칩과 하이브리다이제이션시켜, 양성 시그날의 여부로 프로모터의 메틸화를 판별하였다. 즉, 양성 시그날이 확인되면 프로모터는 메틸화된 것이고, 양성 시그날이 확인되지 않으면 프로모터는 메틸화 되지 않은 것으로 판별된다 (도 1).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기의 실시예에서는 인간의 태반, 편도선 암 및 대장암 조직 유래 게놈 DNA를 사용하여 프로모터 메틸화를 측정하였으나, 세포막, 혈액, 침, 대변, 소변, 뇌수, 안구, 장기, 신장, 전립선, 폐, 유방, 간, 편도선, 대장 또는 세포조직용 현미경슬라이드에 포장된 조직 등에서 유래된 게놈 DNA를 사용하는 것도 가능하다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 PCR 반응용액에 Cy5-dUTP를 첨가하여 증폭산물이 형광염료로 표지되도록 하였으나, Cy5-dUTP 이외에 PCR 과정에 첨가하여 DNA를 표지할 수 있는 표지물질이라면 제한없이 사용할 수 있다.

실시예 1: 본 발명에 따른 GAPDH 및 β-액틴 cDNA의 메틸화 측정

메틸화 여부에 따른 HpaII 제한효소의 절단능력과 절단상태에 따른 DNA 칩 하이브리다이제이션 결과를 검증하기 위하여, GAPDH와 β-액틴 유전자를 사용하였다. GAPDH 유전자는 중간부분에 1개의 HpaII 절단부위를 포함하고 있고, β-액틴 유전자는 2개의 HpaII 절단부위를 포함하고 있다. 본 실시예에서 사용한 GAPDH(GenBank no. BC026907)와 β-액틴(GenBank no. BC002409)의 cDNA는 TOPOpCR2.1 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝된 상태에서 M13 프라이머(서열번호 1 ~ 서열번호 4)를 사용하여, 각각 PCR로 증폭하였다.

GAPDH-센스(서열번호 1): 5'-tca acg gat ttg gtc gta tt-3'

GAPDH-안티센스(서열번호 2): 5'- tag agg cag gga tga tgt tc-3'

β-액틴-센스(서열번호 3): 5'-ccc aga tca tgt ttg aga cc-3'

β-액틴-안티센스(서열번호 4): 5'-gca gtg atc tcc ttc tgc at-3'

PCR 반응용액의 조성은 표 1과 같으며, 반응용액을 (94℃에서 10분간 반응시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃ 1분)을 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 5분간 반응시켰다.

	GAPDH	β-액틴
주형 DNA(10ng/㎕)	1㎕	1㎕
10×버퍼	5㎕	5㎕
2.5mM dNTP	4㎕	4㎕
프라이머(10pmol/㎕)	2㎕	2㎕
Taq 폴리머레이즈(10U/㎕)	0.5㎕	0.5㎕
증류수	37.5㎕	37.5㎕

GAPDH 유전자의 상기 PCR 산물 1㎍에 10×HpaII 메틸레이즈 버퍼 5㎕, HpaII 메틸레이즈(4U/㎕) 2.5㎕ 및 400×SAM 0.125㎕를 첨가하고, 증류수로 최종부피를 50㎕로 맞춘 다음, 37℃에서 4시간 처리(in vitro methylation)하여 GAPDH 유전자를 인위적으로 메틸화시켰다. 반면, β-액틴 유전자의 PCR 산물은 메틸화시키지 않았다.

상기 메틸화시킨 GAPDH 유전자와 메틸화시키지 않은 β-액틴 유전자를 모두 제한효소 HpaII로 처리한 후, 2% 아가로오즈 겔에 전기영동하여 유전자 단편의 절단여부를 확인하였다 (도 2). 도 2에서, 레인 1은 HpaII로 처리하지 않은 GAPDH 유전자를 나타내고, 레인 2는 메틸레이즈로 처리하지 않은 GAPDH 유전자를 HpaII로 처리한 것으로, HpaII에 의한 절단된 단편이 관찰되었다. 레인 3은 메틸화된 GAPDH 유전자를 HpaII로 처리한 것으로, 절단된 단편이 관찰되지 않았다. 레인 4는 HpaII로 처리하지 않은 β-액틴 유전자이고, 레인 5는 β-액틴 유전자를 HpaII로 처리한 것으로, β-액틴 유전자 상에서 두 개의 HpaII 절단부위가 절단된 3개의 단편을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 메틸화된 GAPDH 유전자는 HpaII에 의해 절단되지 않으며, 메틸화되지 않은 β-액틴 유전자는 HpaII에 의해 절단된다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 메틸화된 GAPDH를 HpaII로 처리한 시료와 메틸화되지 않은 β-액틴 유전자를 HpaII로 처리한 시료를 DNA 칩에 하이브리다이제이션시키기 위하여 프라이머(서열번호 5~8)를 사용하여 각각 nested PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 Cy5-dUTP를 반응용액에 첨가하여 형광표지하였으며, 반응용액의 조성은 표 2와 같다. 반응용액을 94℃에서 10분간 반응시킨 후, (94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃ 1분)을 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 5분간 반응시켰다.

GAPDH nested 센스(서열번호 5):5'-ggg tgt gaa cca tga gaa gta tg-3'

GAPDH nested 안티센스(서열번호 6):5'-ggc agg gat gat gtt ctg gag-3'

β-액틴 nested 센스(서열번호 7):5'-ggc tgt gct atc cct gta cgc-3'

β-액틴 nested 안티센스(서열번호 8):5'-cca ggg cga cgt agc aca gc-3'

Cy5-dUTP 표지용 nested PCR 반응용액의 조성

	GAPDH-IVM	β-액틴
HpaII 처리된 DNA	200pg	200pg
10×Taq 버퍼	2.5㎕	2.5㎕
2.5mM dNTP mix	2㎕	2㎕
Cy5-dUTP(1mM)	0.5㎕	0.5㎕
해당 프라이머	2㎕	2㎕
Taq 폴리머레이즈	0.5㎕	0.5㎕
증류수	최총 부피를 25㎕로 맞춤	최총 부피를 25㎕로 맞춤

상기와 같이 증폭시킨 PCR 산물을 정제하고, 100㎕의 증류수로 용출시킨 다음, GAPDH와 β-액틴의 cDNA 프로브가 집적되어 있는 DNA 칩에 하이브리다이제이션시켰다. 하이브리다이제이션을 위한 반응용액의 조성은 표 3과 같다.

	GAPDH-IVM	β-액틴
용출 DNA	20㎕	20㎕
20×SSC	17.5㎕	17.5㎕
10% SDS	3㎕	3㎕
salmon sperm DNA(5mg/ml)	1㎕	1㎕
증류수	최종 100㎕로 맞춤	최종 100㎕로 맞춤

GAPDH의 cDNA 프로브가 집적되어 있는 DNA 칩은 다음과 같이 제작하였다. 사 람 태반으로부터 total RNA를 분리하고, 5㎍의 total RNA를 200ng의 서열번호 2 프라이머를 15.4㎕의 부피에서 혼합하여 65℃에서 10분간 처리한 다음, 역전사(reverse transcription) 반응을 통해 cDNA를 제작하였다. 역전사 반응은 SuperscriptII(Invitrogen)를 이용하여 총 30㎕의 부피로 수행하였다. 상기 반응용액에 5X first strand buffer 6㎕, 0.1 M DTT 3.0㎕, dNTP (each 10mM) 1.0㎕ 및 SuperscriptII(Invitrogen, 200 units) 1.0㎕를 첨가하여 최종부피가 30㎕가 되도록 만든 후, 42℃에서 2시간 동안 방치하여 single stranded cDNA를 합성하였다. 상기 reverse transcription mixture의 1/10을 취하여 GAPDH cDNA를 증폭하기 위한 PCR에 사용하였다. PCR을 위한 조성은 single stranded cDNA 3㎕, 10×버퍼 2.5㎕, 2.5mM dNTP 2㎕, Taq polymerase(5units, Solgent), 1㎕, 서열번호 1과 2의 프라이머(10pmole/㎕) 각 1㎕을 첨가하고, 증류수로 최종부피 25㎕를 맞춘다음, 다음과 같은 조건에서 수행하였다: [(94℃, 10 min --> 94℃, 1min, 55℃, 1 min, 72℃, 1min) 30 cycles --> 72℃, 10 min]. 상기한 PCR 산물을 TOPOpCR2.1 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 클로닝 한 후, 서열번호 5와 6을 이용하여 다시 GAPDH cDNA를 증폭하였다. PCR 조건은 상기한 조건과 동일하게 수행하였다.

β-actin의 cDNA 프로브가 집적되어 있는 DNA 칩은 다음과 같이 제작하였다. β-actin을 서열번호 4를 프라이머로 하여 GAPDH와 동일한 조건에서 reverse transcription한 후, 서열번호 3과 4를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이들 PCR산물을 TOPOpCR2.1 플라스미드 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. GAPDH와 동일한 방법으로 서열번호 7과 8을 이용하여 β-actin cDNA를 증폭하였다.

이들 증폭산물을 50% DMSO 용액에 200-250ng/㎕가 되게 현탁한 후 Corning UltraGAPS 유리슬라이드(Corning)에 집적한 후, 16시간 동안 실온에 방치후 350mJ의 자외선을 조사하여 cross-linking시켰다.

상기 하이브리다이제이션 종료후 반응용액을 100℃에서 3분간 끓인 후, GAPDH와 β-액틴의 프로브가 집적되어 있는 DNA 칩에 스팟팅한 후, 65℃에서 2시간 동안 반응시켜 하이브리다이제이션을 수행하였다. 반응이 끝난 DNA 칩을 세척한 후, Axon scanner 400B(Axon Instrument, CA, USA)로 스캐닝하였다 (도 3).

그 결과, 메틸화된 GAPDH는 HpaII로 처리하더라도 절단이 되지 않기 때문에 정상적인 PCR 산물이 생성되어 하이브리다이제이션 시그널이 관찰되었으나(도 3의 좌측 패널), 메틸화되지 않은 β-액틴은 HpaII 처리에 의해 절단되어 PCR 산물이 생성되지 않아, 하이브리다이제이션 시그널이 관찰되지 않았다 (도 3의 우측 패널). 이로부터, 본 발명의 방법에 의해 유전자의 메틸화를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 암세포주의 메틸화 검출

본 실시예에서는 사람의 암세포주를 대상으로 프로모터의 메틸화 여부를 검출하였다. 메틸화 여부를 측정할 프로모터는 대장암 조직에서 메틸화되어 있는 것으로 알려진 MAGEA2 유전자(Melanoma associated antigen 2, GenBank No. NM_153488) 및 RAR-β 유전자(Retinoic acid receptor-β, GenBenk No. NM_000965)의 프로모터를 사용하였다(Virmani et al., J. Natl. Cancer Institut., 92:1303, 2000; De Smet, C. et al., Mol. Cell. Bio., 19;:7327, 1999).

본 실시예에서는 Caco-2 세포주(ATCC HTB37)의 게놈 DNA를 이용하여, 상기 유전자의 메틸화 상태를 측정하였다. 먼저 Caco-2 세포주의 게놈 DNA를 분리하여 CpG 부위를 절단하는 제한효소인 HpaII로 처리하였다. 상기 제한효소 처리시의 반응용액 조성은 다음과 같다: Caco-2 세포주 게놈 DNA 2㎕, 10×HpaII 버퍼 5㎕, HpaII(10U/㎕) 2㎕ 및 증류수로 최종부피를 50㎕로 조정.

상기 HpaII로 처리된 Caco-2 세포주 게놈 DNA를 정제하고, MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터 부위를 증폭하기 위하여 하기 프라이머(서열번호 9~12)를 이용하여 각각 PCR 증폭을 수행하였으며, 증폭반응은 실시예 1의 방법과 동일한 조건에서 Cy5-dUTP를 첨가하여 수행하였다.

MAGEA2 센스(서열번호 9): 5'-gca gag aga gag tct tgg ctt tc-3'

MAGEA2 안티센스(서열번호 10): 5'-ctt gac tgc cga cca gtc ctg-3'

RAR-β 센스(서열번호 11): 5'-gtg aca gaa gta gta gga agt ga-3'

RAR-β 안티센스(서열번호 12): 5'-gat ctc cct tgc act gaa tgt c-3'

증폭된 각각의 PCR 산물을 MAGEA2 및 RAR-β 프로브로 직접된 DNA 칩 과, 실시예 1에 기재된 방법으로, 하이브리다이제이션시켰다. 본 실시예에서 사용된 MAGEA2 및 RAR-β 프로브로 직접된 DNA 칩은 다음과 같이 제작하였다. MAGEA2와 RAR-β 메틸화 프로모터 부분의 프로브를 제작하기 위하여, 사람 태반 genomic DNA를 분리한 다음, 서열번호 9와 10의 프라이머를 사용하여 MAGEA2 프로모터 프로브를 증폭하고, 서열번호 11과 12의 프라이머를 사용하여 RAR-β 프로모터 프로브 증 폭한 다음, 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 DNA chip을 제작하였다.

상기 하이브리다이제이션 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대장암 세포주인 Caco-2 세포주 게놈 DNA를 HpaII로 처리한 경우, MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터 프로브에 대하여 HpaII로 처리한 시료와 처리하지 않은 시료에서 모두 양성시그널이 나타나, MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터가 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 두 프로모터 부위가 메틸화되어 있다는 것을 다른 방법으로 증명하기 위하여 바이설파이트 시퀀싱을 수행하였다. DNA에 바이설파이트를 처리하면 메틸화되지 않은 씨토신은 우라실로 변하고, 메틸화된 씨토신은 변하지 않는다. 상기에서 분리한 Caco-2 게놈 DNA 1㎍을 MSP 바이설파이트 변형키트(In2Gen, Inc., 한국)를 사용하여 바이설파이트 변형(Sato, N. et al., Cancer Research, 63:3735, 2003)을 실시하였다. 바이설파이트 처리된 Caco-2 게놈 DNA를 하기의 프라이머(서열번호 13~16)를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후, Topo 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

MAGE BF 센스(서열번호 13): 5'-ggg ggt att gtt tgg agg ttg g-3'

MAGE BF 안티센스(서열번호 14): 5'-aaa aat tca ccc cta act aac caa ac-3'

RAR-β BF 센스(서열번호 15): 5'-ggt agg agg gtt tat ttt ttg tta-3'

RAR-β BF 안티센스(서열번호 16): 5'-ccc aaa aaa atc cca aat tct cc-3'

각 시료의 염기서열을 분석한 결과, MAGEA2 유전자 프로모터 및 RAR-β 유전자 프로모터의 염기서열 중 CpG 섬을 포함하는 부분에서 모두 씨토신이 검출되어, 두 유전자 프로모터가 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 3: 임상시료를 이용한 메틸화 검출

본 발명의 메틸화 검출방법이 임상시료에 적용가능한지 알아보기 위하여, 실제 암 환자의 암조직 게놈 DNA를 사용하여 메틸화를 검출하였다. 본 실시예에서는 사람 암조직에서 프로모터의 CpG 섬이 메틸화되어 있다고 알려진 12개 유전자(표 4)의 프로모터를 대상으로 메틸화 여부를 검출하였다.

유전자 명	GenBank accession no.
MAGEA2	U93163
APC	U02059
CDH13	AB001090
MTHFR	AF105977
CALCA	X15943
AR	M58158
S100A2	Y07755
SRBC	AF08198
RAR-beta	X56849
EDN1	J05008
CFTR	M58478
BLT1	AB008193

사람의 정상 태반조직, 편도선 암 조직 및 대장암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리하여, 상기 유전자의 프로모터 부위중 CpG 섬 내에 1개 이상의 HpaII 절단부위를 포함하는 부위를 PCR로 증폭하였으며, 상기 증폭에 사용된 프라이머는 표 5와 같다. 또한, 표 5의 프라이머를 이용하여 사람의 정상 태반조직의 게놈 DNA를 증폭하여 12개의 프로브(서열번호 37 ~ 서열번호 48)를 수득한 다음, 이를 유리슬라이드(Corning UltraGAPS, Corning)에 집적하여 DNA 칩을 제작하였다.

제한효소 HpaII로 처리하지 않은 태반조직, 편도선 암 조직 및 대장암 조직의 게놈 DNA군과 HpaII로 처리한 각각의 게놈 DNA군에 각각 표 5의 PCR 프라이머를 첨가하고 Cy5-dUTP 존재하에서 동시에 증폭하였다. 각 시료의 PCR 반응용액의 조성은 표 6과 같다.

유전자 명	센스 프라이머 안티센스 프라이머	PCR 산물의 크기(bp)
MAGEA2	(서열번호 9): 5'-gca gag aga gag tct tgg ctt tc-3' (서열번호 10): 5'-ctt gac tgc cga cca gtc ctg-3'	501
APC	(서열번호 17): 5'-cag gca acc cag acg tcc aga g-3' (서열번호 18): 5'-cag tgc cac cct ggc ggg ct-3'	576
CDH13	(서열번호 19): 5'-ccg tgc aat tcc att ctc tgg a-3' (서열번호 20): 5'-cgc aca gaa cga gcg gag ttc-3'	409
MTHFR	(서열번호 21): 5'-gct gcc tgc ccc ctg atg c-3' (서열번호 22): 5'-ccc cag gca cca cca ctc c-3'	346
CALCA	(서열번호 23): 5'-gga tca gag ttg gaa gag tcc c-3' (서열번호 24): 5'-cct ccc agc gcc agc gac t-3'	382
AR	(서열번호 25): 5'-gga ccc gac tcg caa act gt-3' (서열번호 26): 5'-gct ggc gtg gtg cgt ccc t-3'	195
S100A2	(서열번호 27): 5'-cca cag ttc tct cat tcc agc-3' (서열번호 28): 5'-ctc agg att ctt ttt gca gca ac-3'	578
SRBC	(서열번호 29): 5'-gct acc caa gag gac gaa ata aa-3' (서열번호 30): 5'-ctg gct gca cta cgg tca gg-3'	629
RAR-β	(서열번호 11): 5'-gtg aca gaa gta gta gga agt ga-3' (서열번호 12): 5'-gat ctc cct tgc act gaa tgt c-3'	473
EDN1	(서열번호 31): 5'-ggt aca cag gcc ata tag gaa c-3' (서열번호 32): 5'-ccg aat ccc tgg gca tca gg-3'	620
CFTR	(서열번호 33): 5'-cct cca gcg ttg cca act gg-3' (서열번호 34): 5'-cgt ctg ggc tca agc tcc ta-3'	443
BLT1	(서열번호 35): 5'-gtg agc gcc atc gtg ctt gc-3' (서열번호 36): 5'-cac cac ttt cag ctg agg gg-3'	332

	태반	태반/HpaII	편도선	편도선/HpaII	대장	대장/HpaII
게놈 DNA	200ng	200ng	200ng	200ng	200ng	200ng
10×버퍼	2.5㎕	2.5㎕	2.5㎕	2.5㎕	2.5㎕	2.5㎕
2.5mM dNTP	2㎕	2㎕	2㎕	2㎕	2㎕	2㎕
Cy5-dUTP	0.5㎕	0.5㎕	0.5㎕	0.5㎕	0.5㎕	0.5㎕
12쌍 프라이머 (각 10pmol)	12㎕	12㎕	12㎕	12㎕	12㎕	12㎕
Taq polymerase (5 units)	1㎕	1㎕	1㎕	1㎕	1㎕	1㎕
증류수	최종 25㎕

상기 PCR 증폭물을 상기 12개의 프로브가 집적되어 있는 DNA 칩과 하이브리다이제이션을 수행한 다음, 스캐닝하여 메틸화 여부를 검출하였다. 그 결과, 도 6에서 나타난 것과 같이, 정상조직인 태반조직의 게놈 DNA에서는 HpaII로 처리하지 않은 군에서만 양성 시그널이 나타나고, HpaII로 처리한 군에서는 시그널이 나타나지 않아, 12개의 모든 유전자 프로모터의 CpG 섬에 메틸화가 일어나지 않았다는 것을 알 수 있었다. 반면, 편도선 암과 대장암 조직의 게놈 DNA의 경우에는 HpaII로 처리하지 않은 군과 HpaII로 처리한 군에서 모두 양성 시그널이 나타나, 해당 유전자 프로모터의 CpG 섬이 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 편도선 암조직의 게놈 DNA의 경우에는 MAGEA2, APC, CDH13,CALCA, AR, S100A2, SRBC, RAR-β 및 CFTR 유전자 프로모터의 CpG섬이 메틸화되어 있는 것을 나타났고, 대장암 조직의 게놈 DNA의 경우에는 MAGEA2, CALCA, AR, S100A2, SRBC, CFTR 및 BLT1 유전자 프로모터의 CpG섬이 메틸화되어 있는 것으로 나타났다.

이 결과로부터, 본 발명의 메틸화 검출방법을 이용할 경우, 암관련 유전자 프로모터의 메틸화 여부를 신속·정확하면서도 간편하게 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 임상 샘플 또는 진단대상 유래의 DNA를 제한효소 HpaII로 절단하고, CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 다음, PCR 증폭물의 존재 유무를 메틸레이션 검출용 DNA chip을 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 프로모터의 메틸화 여부를 신속·정확하면서도 저비용으로 검출하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GenomicTree Inc. <120> Method for Detecting Methylaion of Promoter Using Restriction Enzyme and DNA Chip <130> P04-371 <160> 48 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcaacggatt tggtcgtatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tagaggcagg gatgatgttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cccagatcat gtttgagacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcagtgatct ccttctgcat 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gggtgtgaac catgagaagt atg 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcagggatg atgttctgga g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggctgtgcta tccctgtacg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccagggcgac gtagcacagc 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcagagagag agtcttggct ttc 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cttgactgcc gaccagtcct g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtgacagaag tagtaggaag tga 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatctccctt gcactgaatg tc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gggggtattg tttggaggtt gg 22 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aaaaattcac ccctaactaa ccaaac 26 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggtaggaggg tttatttttt gtta 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccaaaaaaa tcccaaattc tcc 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caggcaaccc agacgtccag ag 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cagtgccacc ctggcgggct 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccgtgcaatt ccattctctg ga 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcacagaac gagcggagtt c 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gctgcctgcc ccctgatgc 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccccaggcac caccactcc 19 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggatcagagt tggaagagtc cc 22 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cctcccagcg ccagcgact 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggacccgact cgcaaactgt 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gctggcgtgg tgcgtccct 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ccacagttct ctcattccag c 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ctcaggattc tttttgcagc aac 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gctacccaag aggacgaaat aaa 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ctggctgcac tacggtcagg 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ggtacacagg ccatatagga ac 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ccgaatccct gggcatcagg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cctccagcgt tgccaactgg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgtctgggct caagctccta 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gtgagcgcca tcgtgcttgc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 caccactttc agctgagggg 20 <210> 37 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gcagagagag agtcttggct ttcacgggaa tcaaggtgag gactctgagg gcggatgaga 60 agacctctcc ccaaaaaagg cacattcaca gagccctgcc gctgctgtca ggcctgtgag 120 gccaggcagg ggtggcctgt ttggcacgct tagatttcca cagtgggggc tgagggaggt 180 gggggtattg tttggaggct ggcggatttg ggtcagcacg catattcgtc ccaggctgct 240 agatactgag gtgaggaccc tagtggagac gaagggacca gcaacgctag aacagtgacg 300 tccggtagcg tccagccgtc agcccctcag acgccacggg ctgccggatg tgagtcatcc 360 tgacttccgc tttgaaaaaa aagacccgag cggatgtggc tcatcctgac ttccgctttg 420 gaggcgagga cccgagcgag tgtagggggt gcggcgtctg gtcagccagg ggtgaattct 480 caggactggt cggcagtcaa g 501 <210> 38 <211> 575 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 caggcaaccc agacttccag agttctgatc tccactacta agctgctagc atagcttttc 60 tggtaactat ttttaattca aatataattc gagtgatcta tctaacaagt catcactctg 120 acaactcagt gacttgtaat gtaaaattat tcattgtaat tcatttaata ttattgtttc 180 tctgtgctgc aaaaatcata gcaatcgaga tgtaatttat tactctccct cccacctccg 240 gcatcttgtg ctaatccttc tgccctgcgg acctcccccg actctttact atgcgtgtca 300 actgccatca acttccttgc ttgctgggga ctggggccgc gagggcatac ccccgagggg 360 tacggggcta gggctaggca ggctgtgcgg ttgggcgggg ccctgtgccc cactgcggag 420 tgcgggtcgg gaagcggaga gagaagcagc tgtgtaatcc gctggatgcg gaccagggcg 480 ctccccattc ccgtcgggag cccgccgatt ggctgggtgt gggcgcacgt gaccgacatg 540 tggctgtatt ggtgcagccc gccagggtgt cactg 575 <210> 39 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccgtgcaatt ccattctctg gaaaagtgga atcagctggc attgcccagc gtgatttgtg 60 aggctgagcc ccaacagtcc aaagaagcaa atgggatgcc acctccgcgg ggctcgctcc 120 tcgcgaggtg ctcaccccgt atctgccatg caaaacgagg gagcgttagg aaggaatccg 180 tcttgtaaag ccattggtcc tggtcatcag cctctaccca atgctttcgt gatgctgctg 240 ctgatctatt tgggaagttg gctggctggc gaggcagagc ctctcctcaa agcctggctc 300 ccacggaaaa tatgctcagt gcagccgcgt gcatgaatga aaacgccgcc gggcgcttct 360 agtcggacaa aatgcagccg agaactccgc tcgttctgtg cg 402 <210> 40 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gctgcctgcc ccctgatgct ccctgcccca ccctgtgcag taggaaccca gccatggtga 60 acgaagccag aggaaacagc agcctcaacc cctgcttgga gggcagtgcc agcagtggca 120 gtgagagctc caaagatagt tcgagatgtt ccaccccggg cctggaccct gagcggcatg 180 agagactccg ggagaagatg aggcggcgat tggaatctgg tgacaagtgg ttctccctgg 240 aattcttccc tcctcgaact gctgagggag ctgtcaatct catctcaagg taaactcatg 300 caaggttaag gtgggaggcg ggagtggtgg tgcctgggg 339 <210> 41 <211> 374 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ggatcagagt tggaagagtc cctacaatcc tggacccttt ccgccaaatc gtgaaaccag 60 gggtggagtg gggcgagggt tcaaaaccag gccggactga gaggtgaaat tcaccatgac 120 gtcaaactgc cctcaaattc ccgctcactt taagggcgtt acttgttggt gcccccacca 180 tcccccacca tttccatcaa tgacctcaat gcaaatacaa gtgggacggt cctgctggat 240 cctccaggtt ctggaagcat gagggtgacg caacccaggg gcaaaggacc cctccgccca 300 ttggttgctg tgcactggcg gaactttccc gacccacagc ggcgggaata agagcagtcg 360 ctggcgctgg gagg 374 <210> 42 <211> 192 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggacccgact cgcaaactgt tgcatttgct ctccacctcc cagcgccccc tccgagatcc 60 cggggagcca gcttgctggg agagcgggac ggtccggagc aagcccagag gcagaggagg 120 cgacagaggg aaaaagggcc gagctagccg ctccagtgct gtacaggagc cgaagggacg 180 caccacgcca gc 192 <210> 43 <211> 571 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ccacagttct ctcattccag cttccctggt gggatcaacc tgggcctctc tgggccttcc 60 cccttggaag aactctctgt gaagtgctga agtgttgact gaagggtttt tttttttttt 120 tttttttttt gagatggagt ctcgctctgt cgcccaggct ggagtacagt ggtgtgatct 180 cagctcactg caaactcccc ctcccaggtt cacgccattt ccctgcctca gcctcccgag 240 tagctgggac tgcaggcgcc caccaccatg cccggctaat ttttttgtat ttttagtaga 300 gatggggttt caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgatctcgt gatccaccca 360 tctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gagtaagcca ccgcgcccgg ccgactgaag 420 ggtttttctc caggttcctc tgtgaggtct cagtgcaggg gttgctctga ggccctcccc 480 tggatatctc agtctagggg cccttctttg ggggtctagg cctaggagca ggaggtgtgc 540 atgtgggcgt tgctgcaaaa agaatcctga g 571 <210> 44 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gctacccaag aggacgaaat 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caggtccccg tttcctcacg 240 cggctcttcg aaggctctgg ggaggcccga gggggcggcc gctctaggga agggaccatg 300 gagctccgaa ctacccctca gctgaaagtg gtg 333

Claims

다음의 단계를 포함하는 임상샘플 유래 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법:

(a) 임상 샘플에서 샘플 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 샘플 DNA를 HpaII 제한효소로 처리하는 단계;

(c) 상기 HpaII로 처리된 DNA와 HpaII로 처리하지 않은 DNA(mock DNA)를 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물을 CpG 섬 내에 HpaII site를 포함하고 있는 프로모터 또는 그 단편이 프로브로 집적되어 있는 메틸레이션 검출용 DNA 칩과 하이브리다이제이션하는 단계; 및

(e) 상기 하이브리다이제이션 결과, HpaII로 처리된 DNA의 증폭 결과물과 mock DNA의 증폭 결과물에서 모두 양성시그널을 나타내는 경우를 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하는 단계.
제1항에 있어서, 샘플 DNA는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심환자 또는 진단대상 유래의 조직, 세포, 가래, 대변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머는 5'-CCGG-3' 서열을 포함하는 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 프라이머는 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34 및 서열번호 35와 36으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 메틸레이션 검출용 DNA 칩은 정상인의 임상샘플 유래 게놈 DNA를 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34 및 서열번호 35와 36으로 각각 증폭하여 수득된 12개의 프로브가 집적되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 12개의 프로브는 서열번호 37 내지 48의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.