JP2005198533A - 哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 哺乳動物の染色体DNA上の、プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子からなる群より選ばれる1種又は2種以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定し、該メチル化頻度に基いて神経芽細胞腫の予後を判定する。
【選択図】 図3
Description
(1) 哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法であって、該哺乳動物の染色体DNA上の、プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子からなる群より選ばれる1種又は2種以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定し、該メチル化頻度に基いて神経芽細胞腫の予後を判定することを特徴とする方法。
(2) 前記遺伝子が、プロトカドヘリンβ16をコードする遺伝子である、(1)の方法。
(3) さらに、プロトカドヘリンβ16以外のプロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする1種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、(2)の方法。
(4) 前記遺伝子が、プロトカドヘリンα1をコードする遺伝子である、(1)の方法。
(5) さらに、プロトカドヘリンα1以外のプロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする1種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、(4)の方法。
(6) メチル化特異的PCR法によってメチル化頻度を測定することを特徴とする、(1)〜(5)のいずれかの方法。
(7) プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを1つ以上含む配列を有するプライマー。
(8) プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを1つ以上含む配列を有するプローブ。
(9) (7)又は(8)のプライマー又はプローブを含む、神経芽細胞腫の予後判定用キット。
ードする遺伝子を挙げることができるが、プロトカドヘリンβ16(PCDHB16)をコードする遺伝子(PCDHB16遺伝子)が特に好ましい。本発明においては、PCDHBファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子は、タンパク質コード領域、プロモーター領域、及び3’非翻訳領域を含む遺伝子を意味する。この中で、PCDHB16遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NG_000017の149533〜154349で示される遺伝子を挙げることができる。PCDHB16遺伝子に含まれるCGIとしては、上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、NG_000017の152547〜152659(配列番号1)及び151812〜152302の配列中に存在するCGIを挙げることができる。具体的には、例えば、NG_000017で登録されている塩基配列において、152552、152559、152564、152644、152651、152656番目(配列番号1の6,13,18,94,98,105,110)で示されるシトシンなどを挙げることができる。
ク質をコードする遺伝子、すなわち、PCDHA2〜14をコードする遺伝子においても、PCDHA1遺伝子のCGIのシトシンに相当するシトシンが存在する場合が多い。これらの遺伝子もPCDHA1遺伝子同様、Accession No. NG_000016で登録されている。例えば、PCDHA2遺伝子の場合、上記のPCDHA1のシトシン(配列番号6の11,13,20,101,106のシトシン)に対応するシトシンとして、NG_000016の62370、62372、62379、62460、62465番目のシトシンが挙げられる。したがって、PCDHA2〜14遺伝子のうちの1種類以上の遺伝子に含まれるCGIのシトシンと、PCDHA1遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定してもよい。配列番号7〜10のプライマーはPCDHA1〜14遺伝子に共通する領域に設定されたプライマーであるため、これらのプライマーを用いることで、PCDHA1遺伝子のCGIのメチル化頻度と、PCDHA2〜14遺伝子のCGIのメチル化頻度とを組み合わせて測定することができる。なお、各遺伝子のシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定する場合、上記のように各遺伝子のメチル化頻度を同時に測定してもよいし、別々に測定してそれぞれのメチル化頻度の平均値をとるなどしてもよい。
No. AC026779の90988〜91084(配列番号16)に存在するCGIを挙げることができる。また、GenBank Accession No. AC026779の91325〜91745に存在するCGIであってもよい。具体的には、例えば、AC026779で登録されている塩基配列において、91000、91006、91078番目(配列番号16の13,19,91)で示されるシトシンなどを挙げることができる。DKFZp451I127遺伝子に含まれるCGIのシトシン残基は神経芽細胞腫において高メチル化されているため、哺乳動物のDNAのDKFZp451I127遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。
とができる。具体的には、例えば、AL358613で登録されている塩基配列において、11646、11648、11663,11666番目(配列番号21の1,3,18,21,99)で示されるシトシンなどを挙げることができる。CYP26C1遺伝子に含まれるCGIのシトシンは神経芽細胞腫において高メチル化されているため、哺乳動物の染色体DNAのCYP26C1遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。
5〜65℃、60秒さらに72℃、45秒のサイクルを40サイクル行う条件で行うことができる。ただし、各遺伝子について最適条件を検討することがより好ましい。上記PCRにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合には、解析対象とするシトシンがメチル化されているDNAが増幅される。一方、非メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないDNAが増幅される。したがって、これらの増幅産物の量を検出し、その量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化頻度を調べることができる。検出は、例えば、増幅産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動行い、泳動後のゲルをエチジウムブロミドなどで染色することにより行うことができる。また、DNA染色の代わりに予め蛍光物質などで標識されたプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の量を標識物質由来の蛍光強度などにより検出することもできる。
<メチル化特異的プライマー>
M1:5'- aatggcgagg tgcgtatc -3'(配列番号2)
M2:5'-aacgtaacga taaccgaacg -3'(配列番号3)
<非メチル化特異的プライマー>
UM1:5'- tataatggtg aggtgtgtat t -3'(配列番号4)
UM2:5'-caacataaca ataaccaaac a -3'(配列番号5)
挙げられる。当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」(以下、メチル化感受性制限酵素と記すこともある。)とは、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該DNAは切断されず、一方、認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該DNAは切断される。この違いを利用してメチル化を検出することができる。メチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII(ccgg)、BstUI(cgcg)等を挙げることができる。
配列は、亜硫酸水素ナトリウム等によりメチル化されていないシトシンがチミン(ウラシル)に変換されることを考慮して決定する。プローブは検出のための標識物質が結合したものであってもよい。さらに、プローブは担体上に固定化された検出用チップであってもよい。本発明のキットをメチル化特異的PCR用とする場合は、プライマーのほかにポリメラーゼ等、PCR用試薬を含んでいてもよい。また、ハイブリダイゼーションキットとする場合は、プローブのほかに検出用の基質や酵素を含むものであってもよい。
MS-RDA法(特開平11-146788号公報)を用いて、神経芽細胞腫の予後不良群でメチル化頻度の高いシトシンを含むフラグメントの取得を試みた。予後良好群の検体として、予後の良好な神経芽細胞腫5例から調製したプライマリー細胞を用いた。一方、予後不良群の検体としては、予後不良の神経芽細胞腫由来の5種類のセルライン(CHP134、IMR32、GAMB、NGP、TGW)を用いた。なお、これらの5種類のセルラインはJapanses Collection of Bioresources (Tokyo, Japan)又はAmerican Type Culture Collection (ATCC: Manassas, VA,米国)から入手した。
上記遺伝子のうち、PCDHB16、PCDHA1、HLP、DKFZp451I127、CYP26C1の5種類の遺伝子について、メチル化特異的PCRを行い、メチル化頻度と神経芽細胞腫の予後との相関を調べた。まず、上記MS-RDAによる解析に用いた5種類のプライマリー細胞及び5種類のセルラインから、染色体DNAを抽出した。次に、得られたDNAを、TEバッファー中で、亜硫酸水素ナトリウム(溶液中の濃度3M)を用いて一晩、55℃で処理した。
臨床ステージの異なる非再発性の神経芽細胞腫の102種類の組織サンプルについて、PCDHB16遺伝子(PCDHB2〜15,17,18も含む)、PCDHA1遺伝子(PCDHA2〜18も含む)、HLP遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、及びCYP26C1遺伝子のメチル化頻度を調べるために、それぞれ定量MS-PCRを行った。まず上記各組織サンプルから、染色体DNAを単離し、該DNAの亜硫酸水素ナトリウム処理を行った。
r Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories)によって行い、SYBR Green PCR Core Reagents(PE Biosystems)を用いて検出した。被験サンプル中のメチル化CGIを含むDNA及び非メチル化CGIを含むDNAの分子数は、メチル化プライマー又は非メチル化プライマーによって得られた増幅産物の量を、それぞれメチル化用コントロール又は非メチル化用コントロールを鋳型にして得られた増幅産物の量と比較することにより算出した。メチル化DNAの増幅量/(メチル化DNAの増幅量+非メチル化DNAの増幅量)の値を各遺伝子のメチル化頻度とした。
Claims (9)
- 哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法であって、該哺乳動物の染色体DNA上の、プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子からなる群より選ばれる1種又は2種以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定し、該メチル化頻度に基いて神経芽細胞腫の予後を判定することを特徴とする方法。
- 前記遺伝子が、プロトカドヘリンβ16をコードする遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- さらに、プロトカドヘリンβ16以外のプロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする1種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、請求項2に記載の方法。
- 前記遺伝子が、プロトカドヘリンα1をコードする遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- さらに、プロトカドヘリンα1以外のプロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする1種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、請求項4に記載の方法。
- メチル化特異的PCR法によってメチル化頻度を測定することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを1つ以上含む配列を有するPCR用プライマー。
- プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを1つ以上含む配列を有するハイブリダイゼーション用プローブ。
- 請求項7又は8に記載のプライマー又はプローブを含む、神経芽細胞腫の予後判定用キット。
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