CN106148399A - 与水稻粒长相关的蛋白ZmGL及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
发明公开了蛋白ZmGL编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。蛋白ZmGL在制备水稻粒长调控制剂中的应用。本发明还公开了一种与水稻粒长相关的蛋白ZmGL的表达载体。过量表达玉米ZmGL基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比,转基因水稻粒长增长10.6%,千粒重增重8.4%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及与水稻粒长相关的蛋白ZmGL及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一,全球约有一半的人口以稻米为主食。世界稻米的供求矛盾越来越突出,提高产量是当今水稻育种的首要目标。粒重、每穗粒数和每株穗数是决定水稻产量的三个组成部分,其中粒重又由粒长、粒宽和粒厚度决定。粒长不仅作为重要的产量性状成为育种目标,它还影响稻谷整精米率、烹煮特性和适口性等品质和外观,成为品质育种中的主要选择指标之一。如在增加产量的同时,又能提高稻米质量,则是我们生物学家、农学家最为追求的目标。
发明内容
ZmGL基因(GenBank登陆号KT626002)是玉米中功能未知基因,定位于玉米第4号染色体上,无内含子,编码序列(CDS)大小为810bp,编码包含269个氨基酸残基的蛋白(GenBank登陆号AME17989.1),蛋白质分子量为27.61KD,等电点为9.68。在该蛋白质序列中,带电荷氨基酸70个,酸性氨基酸21个,碱性氨基酸30个,极性氨基酸58个,疏水氨基酸89个。GenBank数据库比对分析发现,ZmGL蛋白序列具有推定的DUF1645保守结构域,预测该蛋白为富含脯氨酸的类受体蛋白激酶PERK7。ZmGL蛋白序列与玉米(XP_008680000.1)、玉米(NP_001145342.1)、玉米(NP_001142435.1)、高粱(XP_002453267.1)、小米(XP_004951972.1)和水稻(NP_001045810.1)蛋白序列的一致性分别达到94%、88%、85%、57%、56%和48%。ZmGL蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示,ZmGL蛋白的编码基因序列如SEQID NO.3所示。本发明构建出蛋白ZmGL的表达载体,其序列如SEQ ID NO.1所示,命名为载体pCAMBIA1300+163+ZmGL,将其转化到水稻中表达,发现过量表达玉米ZmGL基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比,转基因水稻粒长增长10.6%,千粒重增重8.4%。因此,蛋白ZmGL编码基因可用于制备与水稻粒长相关的表达载体。蛋白ZmGL可用于制备水稻粒长调控制剂。
附图说明
图1玉米ZmGL基因的PCR扩增产物;M,Marker;1,PCR产物;
图2 ZmGL的pMD18-T质粒酶切分析;M,Marker;C,未酶切质粒作为对照;1、2、3分别代表不同质粒酶切产物;
图3表达载体pCAMBIA1300+163的结构示意图;
图4表达载体pCAMBIA1300+163+ZmGL酶切鉴定。M,Marker;1、2分别代表不同质粒酶切产物;
图5农杆菌介导水稻遗传转化;A,水稻成熟胚愈伤组织的诱导;B,抗性愈伤筛选;C,愈伤分化;D,生根培养;
图6特异潮霉素引物鉴定转ZmGL基因水稻;M,DNA分子量标准;1,无模板对照;2、3,野生型对照;4、5,阳性对照;6-19,转基因植株;
图7野生型与转ZmGL基因水稻农艺性状的比较;Control,水稻野生型;OE,过表达株系;*P<0.05,**P<0.01,Student’s t test。
具体实施方式
基因克隆
PCR克隆引物,PCR等反应实验条件,克隆载体,来源及可能用到的內切酶,cDNA阳性克隆分析
人工合成一对引物,并在其5’端分别加上NcoI和BamHI酶切位点。引物如下:
ZmGLF:5'CCATGG CACTCTACCCCATGTCCG 3'(24)(NcoI)(SEQ ID NO.4);
ZmGLR:5'GGATCC CGCAATTCTTCAGAATTTGC 3'(26)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。
利用此对引物,以玉米的总DNA为模板进行PCR。PCR条件为:热盖温度105℃,预变性95℃5min,95℃变性45s,61℃退火45s,72℃延伸2min,进行34个循环,72℃延伸10min。PCR体系表1:
表1
使用TAE电泳缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳,得到了大约1000bp的片段(图1),命名为ZmGL。
将上述ZmGL扩增产物用TIANGEN的试剂盒进行胶回收,然后将回收片段连入PMD18-T载体(TAKARA)。连接体系如表2:
表2
连接2个小时,转化E.coli DH5α的感受态细胞,涂板,用氨苄霉素筛选。挑选单克隆,提取质粒后用NcoI和BamHI双酶切鉴定,结果如图所示,均有大约1000bp的目的条带(图2)。送1、2、3号对应的菌液测序,三个测序序列均与ZmGL基因序列一致。
基因功能验证详细过程
表达原载体及来源,表达原载体构建可能用到的內切酶
克隆得到ZmGL基因,将其构建到表达载体,具体步骤如下:将连接有ZmGL基因的克隆载体pMD18-T和表达载体pCAMBIA1300+163(图3)都用BamHI和NcoI进行双酶切并分别回收纯化,然后用T4连接酶连接后转化E.coli DH5α,挑取单菌落扩大培养后抽提质粒,BamHI和NcoI双酶切鉴定,最终获得连接有目的基因的过量表达载体pCAMBIA1300+163+ZmGL(图4)。利用热激法将构建的表达载体转化到农杆菌EHA105菌株中。
基因转化方法,基因转化物种
采用农杆菌介导法将构建的表达载体转化到水稻SR59中,获得过量表达ZmGL基因的水稻转基因株系。该实验过程如下:以SR59成熟种子诱导而来的愈伤组织为受体,经过农杆菌浸染、共培养、2次抗性愈伤组织潮霉素连续筛选(每次2周)、抗性愈伤组织分化、生根、炼苗等步骤获得潮霉素抗性植株(图5)。
转基因植物分子分析
利用潮霉素特异引物,对潮霉素抗性再生植株进行PCR检测(图6)。检测出含潮霉素基因的阳性株系14株。引物如下:
hptF:5'TTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGC 3'(SEQ ID NO.6)
hptR:5'CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG 3'(SEQ ID NO.7)
转基因植物功能表型(图7)
对野生型和T1代转ZmGL基因水稻的农艺性状进行对比观察和统计分析。与野生型的株高相比,OE-1株系显著低于野生型,OE-2和OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的分蘖数相比,OE-2株系极显著高于野生型,OE-1和OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶长和宽相比,三个株系无显著性差异。与野生型的穗长相比,三个株系无显著性差异。与野生型的每穗粒数相比,三个株系均显著小于野生型。
与野生型的千粒重相比,OE-2株系无显著差异,OE-1和OE-3株系均极显著增重。OE-1株系增重8.4%,OE-2株系增重1.0%,OE-3株系增重8.4%。与野生型的粒长相比,三个株系均极显著增长。OE-1株系增长10.0%,OE-2株系增长8.2%,OE-3株系增长10.6%。与野生型粒宽相比,三个株系无显著性差异。与野生型的粒长宽比相比,三个株系均极显著变大。与野生型的粒厚相比,OE-2株系显著降低3.6%,OE-1和OE-3株系均无显著性差异。
Claims (4)
1.蛋白ZmGL编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。
2.蛋白ZmGL在制备水稻粒长调控制剂中的应用。
3.一种与水稻粒长相关的蛋白ZmGL的表达载体,其特征在于,所述表达载体中含有权利要求1所述的蛋白ZmGL编码基因。
4.如权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体序列如SEQ ID NO.1所示,命名为载体pCAMBIA1300+163+ZmGL。
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