CN105349571B - 水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用 - Google Patents

水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻小分子RNA osa‑miR530在降低水稻株高方面的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻小分子RNA osa‑miR530的前体序列，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390‑ubi上；再进行遗传转化至水稻中，得到水稻小分子RNA osa‑miR530表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，营养生长阶段及成熟期阳性转基因水稻植株的株高明显低于非转基因植株：在营养生长阶段，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的78‑83％；在成熟期，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的80％。

Description

水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及小分子RNA(microRNA)osa-miR530在降低水稻株高方面的应用。
背景技术
水稻是世界上主要粮食作物之一，水稻产量由多个性状决定，株高是水稻品种最重要的农艺性状之一，中国水稻单产在经历矮化育种和杂交稻育种两次飞跃后，单产一直停滞不前。为了打破这一局面，以理想株型为模式的超级稻育种提供了重要途径，其主要策略就是理想株型和杂种优势相结合(Chen et al.,Acta Agronomica Sinica,2001,27:665-673)。由此可见，株型改良是水稻育种的一条主线，而株高是株型改良的关键性状。水稻株高相关基因的发掘利用和遗传机理研究一直是水稻育种家和分子生物学家研究的热点之一。
植物激素在水稻株高发育中具有重要调控作用，迄今为止，大多数已克隆株高基因与赤霉素(Gibberellin,GA)、油菜素内酯(Brassinosteriod,BR)和独脚金内酯(strigolactone,SL)等激素的代谢或信号转导有关。此外，其他开花相关转录因子、细胞壁形成基因也会影响植物的株高。
拟南芥GAs生物合成途径上的相关基因缺失突变均能够导致植株出现严重矮化或者半矮化表型(Sakamoto et al.,Plant Physiol,2004,134:1642-1653)。在水稻中发现的3个GA缺陷型半矮化突变体d35、sd1和d18分别是由OsKO2、OsGA20ox2和OsGA3ox2位点变异引起的(Itoh et al.,Plant Cell,2002,14:57-70；Sasaki et al.,Nature,2002,416:701-702；Itoh et al.,Plant Mol Biol,2004,533-547)。水稻GA去活性酶EUI的过量表达转基因水稻株高显著降低(Zhu et al.,Plant Cell,2006,18:442-456)，eui是一个水稻高秆突变体(Zhu et al.,Plant Cell,2006,18:442-456)。对水稻OsGA2ox6被增强表达后表现显性矮秆，内源活性GA显著降低(Huang et al.,J Genet Genomic,2010,37:23-36)。此外，水稻中发现的最早的赤霉素不敏感突变体d1，其植株显著矮化，对外源施加的GA不敏感(Ueguchi-Tanaka et al.,Nature,2005,437:693-698)。研究表明油菜素内酯也是决定株高的重要激素。BR缺陷型突变体brd1、d2和d11均表现出矮化表型(Hong et al.,Plant J,2002,32:495-508；Hong et al.,Plant Cell,2003,15:2900-2910；Tanabe et al.,PlantCell,2005,17:776-790)。水稻DLT基因是水BR信号转导负调控因子GSK2激酶的直接下游靶标，dlt突变体表现为矮化少分蘖。此外，独角金内酯和生长素也参与调解水稻株高和分蘖。如独角金内酯信号途径相关的多蘖矮秆突变体d10、htd1/sd-t、htd2/d88/d14、d27等(张云辉等，中国农学通报，2014，30:1-7)。生长素响应因子OsIAA1过表达转基因植株表现株高矮化、株型松散等特点(Song et al.,Plant Mol Biol,2009,70:297-309)。
除了植物激素途径，一些调节水稻株高的基因也已被报道。GHD7基因是一个能同时控制水稻穗粒数、株高和抽穗期3个性状的主效QTL。野生型GHD7等位基因可使抽穗期大大延迟，株高和每穗粒数显著增加(Xue et al.,Nat Genet,2008,40:761-767)。DTH8和GHD8，能够同时调控水稻花期、株高和产量这3种农艺性状。DTH8基因自然突变会导致光周期敏感性减弱和株高降低(Wei et al.,Plant Physiol,2010,153:1747-1758；Yan etal.,Mol Plant,2011,4:319-330)，氨基酸序列分析结果表明，GHD8与DTH8是同一个基因。BUI1基因编码一个植物特异的ClassⅡformin蛋白，调控细胞微丝骨架的装配和动态变化。BUI1的缺失突变使水稻的节间发育异常，表现为最上节间严重缩短，呈弯曲生长(Yang etal.,Plant Cell,2011,23:661-680)。
MicroRNA是一类长度约22个核苷酸的内源单链RNA，是植物生长发育过程中的关键调节因子。研究表明，microRNA与植物的生长发育有着密切的关系，植物体内microRNA及其靶基因表达的改变可以影响多种遗传性状。因此，对水稻microRNA的功能研究能为水稻农艺性状改良提供新的理论依据和研究方法。本发明从水稻日本晴中分离克隆到一个小分子RNA osa-miR530，Liu等已经在水稻中预测了该microRNA的序列(Liu B et al.,2005,Plant Physiol,139:296-305)，但目前还没有任何相关功能研究的报道。
发明内容
本发明从水稻日本晴中分离克隆到microRNA osa-miR530，该microRNA在水稻中过量表达后，转基因阳性植株的株高明显低于非转基因植株。因此，在水稻中过量表达osa-miR530对于降低株高，提高耐倒伏能力具有重要意义，这为水稻高产分子设计育种提供新的资源和研究方法。
本发明申请人以水稻的一个microRNA osa-miR530为研究对象，通过过量表达小分子RNA osa-miR530，使正常的水稻植株变矮。osa-miR530的成熟序列是20个碱基(5’-TGCATTTGCACCTGCACCTA-3’；SEQ ID NO：1)。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴microRNA osa-miR530的前体序列(SEQ ID NO：2)，包含157个碱基，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上，得到植物表达载体pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530；再进行遗传转化至水稻中，提高osa-miR530的表达，得到osa-miR530表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，营养生长阶段及成熟期阳性转基因水稻植株的株高明显低于非转基因植株：在营养生长阶段，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的78-83％；在成熟期，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的80％。
本发明用于构建过量表达osa-miR530的前体植物表达载体、增强osa-miR530表达的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明利用水稻品种日本晴的osa-miR530作为应用microRNA，将该microRNA的前体序列正向转入水稻中，提高osa-miR530的表达水平，转基因水稻植株表现出株高降低。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种通过降低株高而提高水稻抗倒伏能力的水稻microRNAosa-miR530的应用。申请人在水稻中过量表达osa-miR530后，转基因阳性植株的株高降低。
(2)本发明首次分离克隆了水稻osa-miR530，并首次在水稻中过量表达了osa-miR530。为培育高抗倒伏水稻品种提供了新的思路，也有助于进一步研究osa-miR530和靶基因互作在调控植物株高过程中的作用机制。
(3)本发明中应用的microRNA可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗倒伏研究提供支持。
附图说明
图1为本发明的osa-miR530表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体上的osa-miR530利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI之间的DNA片段，这样osa-miR530正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530植物表达载体。
图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中osa-miR530转录本相对表达水平结果图。其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#a-4、#b-1、#b-2和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因。
图3为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在四叶一心期和孕穗期株高比较图。A图是四叶一心期表型图；B图是孕穗期株高表型；C图是孕穗期株高比较图。其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。
图4为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期期株高比较图。A图是成熟期表型图；B图是成熟期株高比较图。其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。
图5为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期植株不同节间长度比较图。A图是成熟期植株不同节间长度表型图；B图是第一节间至第五节间的节间长度比较图。其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。*表示根据TTEST统计学分析差异显著(P<0.05)；**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆osa-miR530、构建表达载体以及验证功能的方法。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。
实施例1：osa-miR530前体基因DNA片段的克隆
采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴幼苗叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水(一般为60μl)溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
利用反转录酶SuperScript II(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl 500μg/ml oligo(dT)12-18、2μg总RNA、1μl 10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT(40U/μl)，42℃，2分钟。然后加入1μlSuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。通过网站http://www.mirbase.org找到osa-miR530的成熟体和前体序列，具体序列信息如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。根据osa-miR530前体序列，设计带有BamH1酶切位点的上游引物：530-OS(CGGGATCCGTGATAGAGCTGCATTTGCA，SEQ ID NO：3)和带有Spe1酶切位点的下游引物530-OAS(GGACTAGTATGACATAGTTGCATCTGCCT，SEQ ID NO：4)。以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用530-OS和530-OAS为引物，在Takara Ex Taq(TaKaRa)的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是：94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒，72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟。将扩增产物回收纯化后，连接到pMD18-T Simple载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO：2所示)，将该克隆命名为pMD18-osa-miR530cDNA。
实施例2：osa-miR530前体基因植物表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析osa-miR530的功能，申请人通过过量表达技术使osa-miR530在水稻中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。
osa-miR530前体基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD18-osa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5ɑ。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530(见图1)。pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化载体(见图1)。将pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530转化至农杆菌菌株EHA105。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei等，1994，Plant J.，6:271-282)。转化共获得16株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下：
(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织(成分见后)，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。
(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方：
(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin,羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1)YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5NNaOH调PH至7.0。
2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
3)AB液体培养基：3g/L K2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/L NH4Cl，300mg/L MgSO4·7H2O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl2·2H2O，2.5mg/L FeSO4·7H2O，5g/L葡萄糖，pH 7.0。
4)AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/L AS，pH 5.2。
5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/L AS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。
7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH 5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。
8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH 5.8.
(3)主要溶液配方：
1)N6大量元素(10×)
用水定容1L；
2)N6微量(1000×)：
用水定容1L；
3)N6维生素(1000×)
用水定容100mL；
3)MS大量元素(10×)
用水定容1L；
4)MS微量(1000×)：
用水定容1L；
5)MS维生素(1000×)
用水定容100mL；
6)铁盐(200×)
FeSO4.7H2O 5.56g
Na2EDTA.2H2O 7.46g；
7)AA大量(200×)
8)AA微量(1000×)
用水定容1L。
9)2,4-D储存液(2mg/ml)
称取2，4-D 100mg，溶于1ml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。
10)Kinetin储存液(0.2mg/ml)
称取Kinetin 10mg，溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
11)NAA储存液(0.2mg/ml)
称取NAA 10mg，溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
12)乙酰丁香酮(100mg/ml)
称取乙酰丁香酮100mg，溶于1ml DMSO，于-20℃保存。
13)卡那霉素(50mg/ml)
称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。
实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻中osa-miR530的表达水平
以水稻野生型日本晴和5个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中osa-miR530的转录本水平。具体方法如下：采用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara)试剂盒，从100mg四叶一心期水稻叶片中提取总RNA，并通过试剂盒中带有的基因组DNA去除离心柱去除基因组DNA的污染。具体步骤如实施例1的描述。
利用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)合成miRNA对应的cDNA第一链。根据PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。具体步骤如下：在冰预冷RNase free的反应管内加入Total RNA 2μg，E.coli Poly(A)Polymerase 0.4μl，10×Poly(A)Polymerase Buffer 2μl，5×rATP solution 4μl，加入RNase-free ddH2O将总体积补至20μl)。移液器轻轻混匀上述反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟。所得反应液可直接用于下游实验，也可放入-20℃或-80℃冻存。在一新的RNase-free离心管中加入2μl Poly(A)反应液，10×RT Primer 2μl，10×RT Buffer 2μl，超纯dNTP Mixture(2.5mM each)1μl，RNasin(40U/μl)1μl，Quant RTase 0.5μl，RNase-free ddH2O 11.5μl，用移液器将上述反应液轻轻混匀后，短暂离心后在37℃反应60分钟。
以上述cDNA为模板，根据miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)，对四叶一心期野生型和转入pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530的转基因水稻中osa-miR530的表达水平进行鉴定，荧光定量所用反向引物均为试剂盒自带引物。设计合成osa-miR530的正向引物osa-miR530-RF(5’-cgccTGCATTTGCACCTGCACCTAC-3’，SEQ ID NO：5)。osa-miR530的定量PCR具体操作步骤如下：室温融化2×miRcute miRNA Premix和Reverse Primer，使用时将2×miRcute miRNA Premix上下颠倒混匀，避免起泡，并经轻微离心后使用。在灭菌离心管中配置如下组分进行荧光定量PCR分析：2×miRcute miRNA Premix(含SYBR和ROX)10μl，osa-miR530-RF(10μM)0.4μl，Reverse Primer(10μM)0.4μl，50×ROX Reference Dye1.6μl，miRNA第一链cDNA不超过2μl，补充ddH2O至20μl。同时用水稻5.8s rRNA作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为5.8s-RF(5’-GAACGACTCTCGGCGGCTA-3’，SEQ ID NO：6)。PCR反应条件是94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，60℃退火延伸34秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明过表达株系中osa-miR530的转录本水平是非转基因水稻植株的3-7倍，从而证明osa-miR530前体基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。
实施例4：osa-miR530转基因水稻在营养生长期不同发育阶段的株高降低
本实施例分析了转基因水稻植株和野生型水稻植株苗期的营养生长期不同发育阶段的株高。具体步骤如下：将转基因植株(#a-1、#b-1和#c-1)和非转基因野生型植株的种子用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟，然后无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至成熟期，分别于四叶一心期、孕穗期和成熟期测定转基因植株和野生型植株的株高、拍照，并通过TTEST进行统计学分析野生型和转基因植株株高差异的显著性。以非转基因野生型植株的株高作为100％，在四叶一心期(图3A)和孕穗期(图3B和3C)osa-miR530转基因水稻植株的株高降低了约17-22％，成熟期osa-miR530转基因水稻植株的株高降低了约20％(图4A和4B)。
上述结果表明，osa-miR530过量表达导致水稻营养生长期株高降低。
实施例5：osa-miR530转基因水稻植株和野生型植株成熟期株高和节间长度比较
本实施例分析了转基因植株和野生型植株成熟期株高及节间长度。具体步骤如下：转基因和野生型水稻种子用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至成熟期，测定转基因植株和非转基因野生型植株的株高、拍照，并利用TTEST进行统计学分析野生型和转基因植株株高差异的显著性(图3和图4)。结果表明，osa-miR530过量表达能够导致成熟期水稻植株株高降低。同时我们测定了成熟期水稻植株不同节间长度，结果显示转基因水稻的第一节间至第五节间长度均小于非转基因水稻(图5A和5B)。这些结果表明，osa-miR530过量表达能够抑制水稻各节间的延伸。

Claims (2)

1.水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用，所述水稻小分子RNA osa-miRNA530的成熟体序列为5’-UGCAUUUGCACCUGCACCUA-3。
2.水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用方法，其特征是，通过PCR方法，扩增出水稻小分子RNA osa-miR530的前体序列，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上，得到植物表达载体pCAMBIA1390-ubi-Osa- miR530；再进行遗传转化至水稻中，得到水稻小分子RNA osa-miR530表达增强的转基因水稻植株，所述水稻小分子RNA osa-miRNA530的成熟体序列为5’-UGCAUUUGCACCUGCACCUA-3。
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