CN105400787B - 一种衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用。本发明的一种衰老控制microRNA530成熟体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的一种衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。本发明的一种含有所述的衰老控制microRNA530基因的核苷酸序列的质粒或表达载体或宿主细胞。本发明能够有效延缓植物衰老。

Description

一种衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用。
背景技术
植物衰老是一个复杂的过程，它是在植物内源基因的控制和外界环境的影响下发生的一种自然衰退和死亡的过程。植物的衰老体现在叶片的衰老与凋亡上，在叶片衰老的过程中，植物所储备的营养物质从叶片流向种子或果实，或被存储于植物的根、块茎等器官中，为来年的生长提供足够的物质支持。对于大多数农作物来说，植物的早衰对于其产量和品质都有极大的不利影响。前人调查表明，由生物或非生物胁迫引起的叶片早衰会使作物品质下降，减产50％(Navabpour et al.,2003,J Exp Bot,54(391):2285～2292)。在农业生产实践中，延缓叶片衰老，可使农作物贮存更多的物质和能量，为粮食增产和品质提升提供保障。随着全球人口的持续增长，粮食危机日益加剧。水稻作为世界三大粮食作物之一，是全世界25亿以上的人口的主食。因此，培育具有较高抗性、生育期适当延缓的水稻新品系对解决全球粮食危机具有重要意义。
植物的衰老受到多种环境因素的影响。植物衰老的内源环境因子主要是指叶龄和植物激素。不同类型的植物激素对植物衰老的影响不同。乙烯、茉莉酸、脱落酸和水杨酸能够显著促进植物的衰老，而生长素、细胞分裂素、赤霉素则能够显著抑制植物的衰老。外界环境因子，如干旱、低温、弱光、臭氧、营养缺乏和病原菌侵染等也会引起植物的早衰(Thomas et al.,2013,New Phytol,197(3):696-711；Wu et al.,2012,J Integr PlantBiol,54(12):936-952；Zhang and Zhou,2013,Plant MolBiol,82(6):539-545)。
在已经建立的植物衰老调控网络中，转录因子处于核心位置。它们感受上游衰老信号的诱导，然后作用于下游大量衰老效应基因，从而调控植株的衰老进程(Balazadeh etal.,2008,Plant Biol,10:63-75)。对拟南芥(van der Graff et al.,2006,PlantPhysiol,141:776-792)、水稻(Liu et al.,2008,Plant MolBiol,67:37-55)、小麦(Gregersenet al.,2008,Plant Biol,10:37-49)等植物衰老调控的转录组分析发现许多转录因子的表达在衰老过程 中发生了显著变化。随后对部分转录因子的功能进行分析，结果发现NAC、WRKY家族的转录因子参与了植物衰老的调控(Balazadeh et al.,2008,PlantBiol(Stuttg),10(Suppl 1):63-75；Breeze et al.,2011,Plant Cell,23(3):873-894；Zentgraf et al.,2010,Eur J Cell Biol,89(2-3):133-137；Zhou et al.,2011,MolCells,31(4):303-313)。
表观遗传调控，包括组蛋白修饰和染色质重塑，也被证明参与了植物衰老的调控。组蛋白去乙酰化酶AtHD1和HDA6突变后，将会导致植株早衰、延缓开花(Pandey et al.,2002,Nucleic Acid Res,30:5036-5055；Wu et al.,2008,J Exp Bot,59:225-234)。组蛋白甲基化需要组蛋白甲基化转移酶HMT的参与。一个SU(VAR)3-9(KMTase 1)类型的HMT蛋白SUVH2的过量表达会导致植株叶片发育异常和衰老延缓(Ay et al.,2009,Plant J,58:333-346)，这是由于在过表达植株中，与叶片衰老调控相关基因WRKY53相关位点上形成了H3K27双甲基化及三甲基化的表观遗传标记，导致这些染色质标记与WRKY53无法被诱导表达。对衰老叶片中细胞核染色质的细胞学观察发现，衰老过程中细胞核染色质组织结构发生了显著变化(Kolodziejek et al.,2007,Protoplasma,232:97-108；Damri et al.,2009,Rejuvenation Res,12:435-443)，这暗示了染色质重塑因子参与了植物衰老的调控。SWI/SNF(mating type switching/non fermenting)类染色质重塑因子不同亚基的突变将会导致植株发育的异常(Sarbiwski et al.,2005,Plant Cell,17:2454-2472)。染色质结构调控蛋白ORESARA 7(ORE7)在染色质重塑调控的植物衰老过程中具有重要作用，该基因突变后，将会使植物晚花并且叶片发育异常(Weigel et al.,2000；Plant Physiol,122:1003-1013)，过量表达后，则会使叶片衰老显著延缓(Lim et al.,2007,Plant J,52:1140-1153)。目前虽然没有直接证据表明DNA甲基化也参与了植物衰老的调控，但是对矮牵牛和辐射松发育过程甲基化的研究则表明，随着发育过程的进行，植株个体内甲基化水平逐渐提高(Prakash et al.,2003,J Exp Bot,54:1361-171；Fraga et al.,2002,Planta,215:672-678)。
miRNA是真核生物中一种长约20～24bp的内源非编码RNA，它能通过对特定靶基因的切割降解或翻译抑制从而实现对靶基因的沉默作用。研究表明，多个miRNA参与了植物衰老过程的调控。拟南芥miR164表达被抑制后，植株的衰老进程加快(Kim et al., 2009,Science,323:1053-1057)。与之相反，过量表达miR319则会使植株的衰老大大延缓(Schommer et al.,2008,PlosBiol,6:e230)。miR390能够通过反式激活siRNA TAS3的产生，引起生长素应答因子ARF2/3/4的降解，从而调控了植物的衰老过程(Adenot et al.,2006,CurrBiol,16:927-932；Fahlgren et al.,2006,CurrBiol,16,939-944)。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种有效延缓植物衰老的衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种衰老控制microRNA530成熟体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的一种衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
本发明的一种含有所述的衰老控制microRNA530基因的核苷酸序列的质粒或植株过量表达载体或宿主细胞。
本发明的一种延缓衰老的转基因植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；
(2)用RT-PCR获得衰老控制microRNA530前体基因片段；
(3)构建衰老控制microRNA530前体基因的植株过量表达载体；
(4)将步骤(3)得到的植株过量表达载体转化农杆菌；
(5)将带有转化植株过量表达载体的农杆菌转化目标植物。
进一步地，在步骤(1)中，通过网站找到衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
在步骤(2)中，利用PCR的方法扩增出衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；
所述引物包括上游引物和下游引物；所述带有BamH1酶切位点的上游引物具有SEQID NO：3的核苷酸序列，所述带有Spe1酶切位点的下游引物具有SEQ ID NO：4 的核苷酸序列；
以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用上述引物在Takara Ex Taq的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒，72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟；
将扩增产物回收纯化后，连接到pMD19-T Simple载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需衰老控制microRNA530基因片段；
在步骤(3)中，得到的阳性克隆pMD19-osa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；
并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段；用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5ɑ，通过酶切筛选阳性克隆，获得植株过量表达载体，载体命名为pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530；
在步骤(4)中，将pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530植株过量表达载体转化至根癌农杆菌EHA105菌株中；
在步骤(5)中，通过农杆菌介导的目标植物遗传转化体系将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗，获得延缓衰老的osa-miR530转基因植物。
进一步地，所述的目标植物是水稻品种日本晴。
本发明所述的衰老控制microRNA530基因在培育延缓衰老的转基因水稻中的应用。
本发明的一种miRcute miRNA的荧光定量检测试剂盒的正向引物osa-miR530-RF，所述正向引物osa-miR530-RF具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
本发明的一种水稻5.8s rRNA的荧光定量PCR分析的内参基因，所述内参基因的特异上游引物5.8s-RF具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
有益效果：本发明能够有效延缓植物衰老，通过调控miRNA的表达来延缓水稻衰老的方法。本发明首次分离克隆了osa-miR530及其前体基因，并在水稻中过量表达了osa-miR530。成熟期转基因植株叶片中叶绿素含量显著高于对照，叶片衰老过程显著延迟。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)从水稻日本晴中分离克隆到osa-miR530的前体基因pre-miR530，将该前体基因在水稻中过量表达后，发现和野生型对照相比，过表达株系叶绿素含量显著提高，延 缓衰老能力得到极大提升，叶片保绿期可延缓7～15天。利用本发明的研究内容，水稻叶片延缓衰老可使水稻通过光合作用合成更多的物质储备，从而促进水稻产量和品质的提升。
(2)本发明的miRNA osa-miR530能调控水稻的衰老进程，这有助于明确osa-miR530和靶基因互作在植物衰老过程中的作用机制。由于植物miRNA序列和功能的高度保守性，本发明的结果对于研究其它植物miR530在植物衰老过程中的调控作用具有重要价值。
附图说明
图1为本发明的osa-miR530表达载体的构建示意图；具体为：将克隆在pMD19-T载体上的osa-miR530前体基因利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI之间的DNA片段，这样osa-miR530前体基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即pCAMBIA1390-ubi-miR530植物表达载体。
图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中osa-miR530转录本相对表达水平结果图；其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#a-4、#b-1、#b-2和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因。
图3为osa-miR530过表达转基因植株和野生型植株在成熟期叶片比较图；A图是成熟期植株表型比较图；B图是最上方前5个叶叶片衰老状态比较图；其中osa-miR530-ox表示osa-miR530过表达转基因植株，WT代表野生型水稻植株。
图4为osa-miR530过表达转基因植株和野生型植株在成熟期剑叶叶绿素含量比较图；其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；*表示根据TTEST统计学分析差异显著(P<0.05)；**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的一种衰老控制microRNA530成熟体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的一种衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
本发明的一种含有所述的衰老控制microRNA530基因的核苷酸序列的质粒或植株过量表达载体或宿主细胞。
本发明的一种延缓衰老的转基因植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；通过网站找到衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)用RT-PCR获得衰老控制microRNA530前体基因片段；利用PCR的方法扩增出衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；
所述引物包括上游引物和下游引物；所述带有BamH1酶切位点的上游引物具有SEQID NO：3的核苷酸序列，所述带有Spe1酶切位点的下游引物具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列；
以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用上述引物在Takara Ex Taq的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒，72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟；
将扩增产物回收纯化后，连接到pMD19-T Simple载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需衰老控制microRNA530基因片段。
(3)构建衰老控制microRNA530前体基因的植株过量表达载体；得到的阳性克隆pMD19-osa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；
并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段；用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5ɑ，通过酶切筛选阳性克隆，获得植株过量表达载体，载体命名为pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530；
(4)将pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530植株过量表达载体转化至根癌农杆菌EHA105菌株中；
(5)将带有转化植株过量表达载体的农杆菌转化目标植物。通过农杆菌介导的目标植物遗传转化体系将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗，获得延缓衰老的osa-miR530转基因植物，所述的目标植物是水稻品种日本晴。
本发明所述的衰老控制microRNA530基因在培育延缓衰老的转基因水稻中的应用。
本发明的一种miRcute miRNA的荧光定量检测试剂盒的正向引物osa-miR530-RF，所述正向引物osa-miR530-RF具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
本发明的一种水稻5.8s rRNA的荧光定量PCR分析的内参基因，所述内参基因的特异上游引物5.8s-RF具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
实施例1
osa-miR530前体基因的克隆
利用Takara公司的Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(CodeNo.9767)从100mg水稻品种日本晴幼苗的叶片中提取总RNA，并通过试剂盒中带有的基因组DNA去除离心柱去除基因组DNA的污染。利用Takara公司反转录试剂盒PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis kit(Code No.6110A)，根据试剂盒说明将提取的RNA反转录为cDNA。通过网站http://www.mirbase.org找到osa-miR530的成熟体基因和前体基因的核苷酸序列，具体序列信息如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
根据osa-miR530前体序列，设计带有BamH1酶切位点的上游引物：530-OS(cgggatccgtgatagagctgcatttgca，SEQ ID NO：3)和带有Spe1酶切位点的下游引物530-OAS(ggactagtatgacatagttgcatctgcct，SEQ ID NO：4)。以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用530-OS和530-OAS为引物，在Takara Ex Taq(TaKaRa)的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒，72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟。将扩增产物回收纯化后，连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，将该克隆命名为pMD19-osa-miR530cDNA。
实施例2
osa-miR530前体基因植物表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析osa-miR530的功能，申请人通过过量表达技术使osa-miR530在水稻中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。
osa-miR530前体基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性 克隆pMD19-osa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5ɑ。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530，见图1。pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化载体，如图1所示。将pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530转化至农杆菌菌株EHA105。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei等，1994，Plant J.，6:271-282)。转化共获得16株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下：
(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织(成分见后)，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。
(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分 钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方：
(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin,羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1)YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5NNaOH调PH至7.0。
2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。
3)AB液体培养基：3g/LK2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/L NH4Cl，300mg/L MgSO4·7H2O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl2·2H2O，2.5mg/L FeSO4·7H2O，5g/L葡萄糖，pH7.0。
4)AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/L AS，pH5.2。
5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/L AS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。
6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。
7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧 苄青霉素。
8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH5.8。
(3)主要溶液配方：
1)N6大量元素(10×)
用水定容1L
2)N6微量(1000×)：
用水定容1L
3)N6维生素(1000×)
甘氨酸 200mg
盐酸硫胺素B1 100mg
盐酸吡哆素B6 50mg
烟酸50mg
肌醇10g
用水定容100mL
4)MS大量元素(10×)
用水定容1L
5)MS微量(1000×)：
用水定容1L
6)MS维生素(1000×)
甘氨酸 200mg
盐酸硫胺素B1 10mg
盐酸吡哆素B6 50mg
烟酸50mg
肌醇10g
用水定容100mL
7)铁盐(200×)
FeSO4·7H2O 5.56g
Na2EDTA·2H2O 7.46g
8)AA大量(200×)
9)AA微量(1000×)
用水定容1L
10)2,4-D储存液(2mg/ml)
称取2，4-D 100mg,溶于1ml DMSO,加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。
11)Kinetin储存液(0.2mg/ml)
称取Kinetin 10mg,溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
12)NAA储存液(0.2mg/ml)
称取NAA 10mg,溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
13)乙酰丁香酮(100mg/ml)
称取乙酰丁香酮100mg,溶于1ml DMSO，于-20℃保存。
14)卡那霉素(50mg/ml)
称取卡那霉素500mg,溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22m滤器过滤除菌，于-20℃保存。
试验1
检测转基因水稻植株和野生型水稻中osa-miR530的表达水平
以水稻野生型日本晴和5个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中osa-miR530的转录本水平。具体方法如下：采用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara)试剂盒，从100mg四叶一心期水稻叶片中提取总RNA，并通过试剂盒中带有的基因组DNA去除离心柱去除基因组DNA的污染。
利用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)合成miRNA对应的cDNA第一链。根据PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。
具体步骤如下：在冰预冷RNase free的反应管内加入Total RNA 2μg,E.coliPoly(A)Polymerase 0.4μl,10×Poly(A)Polymerase Buffer 2μl,5×rATP solution 4μl,加入RNase-free ddH2O将总体积补至20μl)。移液器轻轻混匀上述反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟。所得反应液可直接用于下游实验，也可放入-20℃或-80℃冻存。在一新的RNase-free离心管中加入2μl Poly(A)反应液，10×RT Primer 2μl，10×RT Buffer 2μl，超纯dNTP Mixture(2.5mM each)1μl，RNasin(40U/μl)1μl，Quant RTase 0.5μl，RNase-free ddH2O 11.5μl，用移液器将上述反应液轻轻混匀后，短暂离心后在37℃反应60分钟。
以上述cDNA为模板，根据miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)，对四叶一心期野生型和转入pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530的转基因水稻中osa-miR530的表达水平进行鉴定，荧光定量所用反向引物均为试剂盒自带引物。设计合成osa-miR530的正向引物osa-miR530-RF(5’-cgccTGCATTTGCACCTGCACCTAC-3’，SEQ ID NO：5)。osa-miR530的定量PCR具体操作步骤如下：室温融化2×miRcute miRNA Premix和Reverse Primer，使用时将2×miRcute miRNA Premix上下颠倒混匀，避免起泡，并经轻微离心后使用。在灭菌离心管中配置如下组分进行荧光定量PCR分析：2×miRcutemiRNA Premix(含SYBR和ROX)10μl,osa-miR530-RF(10μM)0.4μl,Reverse Primer(10μM)0.4μl，50×ROX Reference Dye 1.6μl，miRNA第一链cDNA不超过2μl，补充ddH2O至20μl。同时用水稻5.8s rRNA作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为5.8s-RF(5’-GAACGACTCTCGGCGGCTA-3’，SEQ ID NO：6)。PCR反应条件是94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，60℃退火延伸34秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明过表达株系中osa-miR530的转录本水平是非转基因水稻植株的3-7倍，从而证明osa-miR530前体基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达，如图2所示。
试验2
osa-miR530转基因水稻植株和野生型植株成熟期叶片衰老程度的比较
本实施例分析了转基因植株和野生型植株成熟期叶片衰老程度。
具体步骤如下：转基因和野生型水稻种子用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至成熟期，测定转基因植株和非转基因野生型植株的衰老程度并进行拍照，如图3A和3B所示，利用叶绿素计(型号：SPAD-502Plus)测量剑叶叶绿素含量，每个样品测量剑叶中间附近5次，取平均值作为该叶片叶绿素相对含量，并通过TTEST进行统计学分析野生型和转基因植株叶绿素含量差异的显著性，如图4所示。同时，以非转基因野生型植株叶绿素含量作为100％，osa-miR530转基因水稻植株叶绿素含量提高了约18-23％。这些结果表明，osa-miR530过量表达能提高植株叶绿素含量，延缓植株衰老。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (3)

1.衰老控制microRNA530前体基因在培育延缓衰老的转基因水稻中的应用，所述衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述延缓衰老的转基因植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；
(2)用RT-PCR获得衰老控制microRNA530前体基因片段；
(3)构建衰老控制microRNA530前体基因的植株过量表达载体；
(4)将步骤(3)得到的植株过量表达载体转化农杆菌；
(5)将带有转化植株过量表达载体的农杆菌转化水稻品种日本晴。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
在步骤(1)中，通过网站找到衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
在步骤(2)中，利用PCR的方法扩增出衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列；
所述引物包括上游引物和下游引物；所述带有BamH1酶切位点的上游引物具有SEQ IDNO：3的核苷酸序列，所述带有Spe1酶切位点的下游引物具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列；
以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用上述引物在Takara Ex Taq的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒，72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟；
将扩增产物回收纯化后，连接到pMDl9-T Simple载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需衰老控制microRNA530基因片段；
在步骤(3)中，得到的阳性克隆pMDl9-osa-miR530cDNA用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段；用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆，获得植株过量表达载体，载体命名为pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530；
在步骤(4)中，将pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530植株过量表达载体转化至根癌农杆菌EHA105菌株中；
在步骤(5)中，通过农杆菌介导的目标植物遗传转化体系将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗，获得延缓衰老的osa-miR530转基因植物。
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