CN103103168B - 一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进植物生长和提早开花相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。该基因也可作为巴西橡胶树高产转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快西橡胶树的生长速度。

Description

一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用

技术领域

本发明涉及一种来源于巴西橡胶树的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物体内的TPS/TPP途径是海藻糖合成的途径，其过程先是由6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸葡萄糖(G-6-P)合成中间产物6-磷酸海藻糖(T-6-P)，接着在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)的催化作用下生成终产物海藻糖。而中间产物6-磷酸海藻糖(T-6-P)在植物体内具有非常重要的地位，起着信号传导和调节植物生长与发育的作用。

Vuorio O.E等(1993)的研究结果表明，中间产物6-磷酸海藻糖(T-6-P)在植物的生长和发育过程中起着决定性的作用，是公认的糖类新陈代谢调节器(Vuorio O.E，Kalkkinen N，Londesborough J.Cloning of two related genes encodingthe 56-kDa and 123-kDa subunits of trehalose synthase from the yeastSaccharomyces cerevisiae.European Journal of Biochemistry，216(3)：849-861)。Dijken A等(2004)的研究证明T-6-P在拟南芥植株的碳水化合物利用和它的生长发育过程中是必不可少的，是通过AtTPS1基因调节T-6-P的生物合成来控制植株的代谢状态(Dijken A，Schluepmann H，Smeekens S.ArabidopsisTrehalose-6-Phosphate Synthase 1 is essential for normal vegetative growth andtransition to flowering.Plant Physiology，135：969-977)。Zhang Y等(2009)的研究表明6-磷酸海藻糖(T-6-P)充当SnRK1基因的抑制剂，是非生物胁迫压力和物质代谢信号的中央处理器，在植物生长组织中具有加快生物合成反应速度的功能(Zhang Y，Primavesi L F，Jhurreea D，et，al.Inhibition of SNF1-related protein kinaselactivity and regulation of metabolic pathways by trehalose-6-phosphate.PlantPhysiology，149(4)，1860-1871)。

以上研究显示，由TPS基因催化合成的6-磷酸海藻糖(T-6-P)在植物的生长和发育过程中起着重要作用，可以促进植物的生长速度。巴西橡胶树通常在定植后6-8年才可割胶，非生产期长。因此，研究巴西橡胶树6-磷酸海藻糖合成酶基因控制6-磷酸海藻糖生物合成的机制有助于了解橡胶树的生长调控。目前，在橡胶树中还未见有关6-磷酸海藻糖合成酶基因的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的促进植物生长和开花的相关蛋白，来源于大戟科橡胶属的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)，名称为HbTPS2，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中序列1由940个氨基酸残基组成。

为了便于序列1编码的HbTPS2纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述HbTPS2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述HbTPS2的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第366-3188位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述促进植物生长和开花的相关蛋白(HbTPS2)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述促进植物生长和开花的相关蛋白(HbTPS2)的编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5′末端第366-3188位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述促进植物生长和开花的相关蛋白的DNA分子；

4)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有促进植物生长和开花的相关功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为3503个核苷酸，包含一个长度为2823个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5′端第366-3188位核苷酸序列)、365nt的5′-UTR(自序列2的5′端第1-365位核苷酸序列)和315nt的3′-UTR(自序列2的5′端第3189-3503位核苷酸序列)，编码一个长度为940个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为106.01KDa的蛋白。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述促进植物生长和开花的相关蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

上述促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因在培育生长速度加快和/或开花期提前的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述生长速度加快为根和叶的生长速度加快；开花期提前为抽苔和/或开花的时间提前。

本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白HbTPS2，在遇到非生物胁迫时，HbTPS2的编码基因在巴西橡胶树幼苗一些组织中的表达量有明显的上升。把该基因的全长cDNA序列导入酵母TPS基因突变株中，发现能够互补酵母突变株的TPS功能。再把该基因转到野生型拟南芥中，得到转基因阳性植株。当种子在MS培养基上培养10天后，观察到转基因拟南芥幼苗根的生长速度比野生型拟南芥快；在移栽到营养土中培养10天后，发现转基因拟南芥的叶片长势明显的比野生型拟南芥旺盛；在营养土中培养一个月后，发现野生型拟南芥还未到抽苔开花期，而转基因拟南芥已经抽出近15cm的茎干，并且到了开花期。因此该基因也可作为巴西橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快巴西橡胶树的生长速度和提早开花，并且在受到胁迫后能够作为信号受体起着信号传递的作用。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在巴西橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用，加快它们的生长速度。

附图说明

图1为HbTPS2基因在低温胁迫下的表达分析。

图2为HbTPS2基因在高温胁迫下的表达分析。

图3为HbTPS2基因在干旱胁迫下的表达分析。

图4为酵母TPS基因突变株的培养性状实验。图4中A为酵母TPS基因突变株在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片，图4中B为酵母TPS基因突变株在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片。

图5为酵母互补实验结果。图5中A为含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基；B为含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基；W303-1A表示野生型酵母W303-1A，tpsΔ+pDR196表示转pDR196的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR-HbTPS2-CDS表示转pDR-HbTPS2-CDS的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR-HbTPS2-全长表示转pDR-HbTPS2-全长的酵母TPS基因突变株。

图6为野生型和转HbTPS2(pCXSN-HbTPS2)基因拟南芥在培养不同时间的生长情况比较。

具体实施方式

下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因的获得

搜索本申请人构建的巴西橡胶树胶乳EST序列数据库，确定一条492bp左右的巴西橡胶树6-磷酸海藻糖合成酶基因EST组装后序列(contig)，设计一对特异性引物扩增得到该cDNA片段，并利用cDNA末端的快速扩增技术(RACE)，最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。

具体方法如下：

<1>cDNA片段克隆

特异性引物设计如下：

SP1(5’端)：5’-GCCTTTTTCTTGGGTCCATTAT-3’；

SP2(3’端)：5’-GCCTCCAGCACTTATCTCCAAA-3’。

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，SP1和SP2为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环；72℃延伸10min。获得一段490bp左右的核苷酸片段，为6-磷酸海藻糖合成酶基因cDNA片段。

<2>5’端RACE

根据6-磷酸海藻糖合成酶基因cDNA片段的测序结果设计5’RACE和3’RACE引物，通用引物QT(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)，Q0(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’)和Q1(5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’)的序列及RACE操作流程参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G S.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京：科学出版社，1998：268～277)。进行5’RACE时，以随机引物进行巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳RNA的cDNA第一链合成，反应产物经乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后，利用末端转移酶TdT催化加polyA尾巴。第一轮扩增以加尾的cDNA为模板，使用引物QT、Q0和第一轮基因特异引物(5’-TCCAGGCATACGCTCACTCTA-3’)，引物终浓度分别为0.04μmol/L、0.4μmol/L和0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：首先，94℃变性5min，50℃退火2min，72℃延伸40min；然后，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30次循环；最后，72℃延伸10min。PCR产物稀释100倍后，取1μl稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Q1和第二轮基因特异引物(5’-CATAATGGACCCAAGAAAAAGG-3’)进行第二轮嵌套扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30次循环；72℃延伸10min。获得一段600bp左右的核苷酸片段。

<3>3’端RACE

进行3’RACE时，以50ng的QT为引物进行巴西橡胶树热研7-33-97叶片RNA的cDNA第一链合成。以cDNA产物为模板，使用终浓度都为0.4μmol/L的Q0和第一轮引物(5’-GATGTGAAAATCAGGATGGCA-3’)进行第一轮PCR扩增，扩增程序与5’RACE的第一轮PCR扩增程序相同。第一轮PCR产物稀释100倍后，取1μl稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Q1和第二轮基因特异引物(5’-TTGGAGATAAGTGCTGGAGGC-3’)进行第二轮嵌套扩增，扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，共30次循环；72℃延伸10min。获得一段2400bp左右的核苷酸片段。

<4>HbTPS2 cDNA全长克隆

根据所得到的巴西橡胶树HbTPS2基因的cDNA片段，5’端和3’端扩增序列，利用DNAMAN软件进行序列拼接，得到HbTPS2基因全长cDNA的拼接序列。根据拼接序列，分别在5’末端和3’末端设计一条引物(2-1F(正义链引物)：5’-AGACTTCTTCTGGGCATTTGTTT-3’，2-3503R(反义链引物)：5’-AAAAGAAAAATAAATATTTATAAGGTACAA-3’)。以巴西橡胶树热研7-33-97胶乳cDNA为模板，进行PCR扩增，引物终浓度均为0.4μmol/L，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸4min，共30次循环；72℃延伸10min。将该PCR获得的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的6-磷酸海藻糖合成酶基因，该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表中序列2全长为3503个核苷酸，包含一个长度为2823个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5’端第366-3188位核苷酸序列)、365nt的5’-UTR(自序列2的5’端第1-365位核苷酸序列)和315nt的3’-UTR(自序列2的5’端第3189-3503位核苷酸序列)，编码一个长度为940个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为106.01KDa的蛋白，即为6-磷酸海藻糖合成酶(本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白)，将该6-磷酸海藻糖合成酶命名为HbTPS2，其编码基因命名为HbTPS2。将上述含有序列2的核苷酸的pMD18-T重组载体命名为pMD18-HbTPS2。

实施例2.巴西橡胶树幼苗HbTPS2基因在非生物胁迫下的表达模式分析

本研究选取生长四个月的巴西橡胶树热研7-33-97组培苗先在营养液中预适应1个月，挑选生长状况相似的幼苗进行三种非生物胁迫处理。

低温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中4℃培养，分别在0h、3h、6h、12h、24h5个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。

高温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中40℃培养，分别在0h、3h、6h、12h、24h5个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。

干旱胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在含有20％PEG6000的营养液中培养，分别在0h、3h、6h、12h、1d、2d、4d、7d8个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。

对上述提取的RNA用DNaseI消化其中的基因组DNA后进行反转录，采用荧光定量技术，分析该基因在不同胁迫中的表达模式。HbTPS2基因荧光定量引物(rTPS2-F：5’-TTATGCCTACCTTAACAGGAACC-3’(正义链引物，对应序列表中序列2的第3352-3374位核苷酸)，rTPS2-R：5’-TACAATTTGTTGATATACTCTAGGGC-3’(反义链引物，对应序列表中序列2的第3453-3478位核苷酸))。

结果显示：在低温胁迫处理后，HbTPS2基因在木质部和根中的表达量呈现递增的趋势，都在处理3h后其表达量达到最大值，约为对照(0h时的表达量)的3倍；处理12h后在树叶中的表达量达到最大值，为对照(0h时的表达量)的1.5倍，其后表达量又降低至对照(0h时的表达量)的0.5倍；而在树皮中有略微下降的趋势(图1)。

在高温胁迫处理后，HbTPS2基因的表达量在根中呈现大幅度上升的趋势，在处理24h后达到最大值，为对照(0h时的表达量)的22倍；在树皮中有略微上升，在处理3h时达到最大值，约为对照(0h时的表达量)的2倍；而在树叶和木质部中变化不明显(图2)。

在干旱胁迫处理后，HbTPS2基因的表达量在树叶中呈现下降的趋势，在处理2天后达到最小值，为对照(0h时的表达量)的1/5；在树皮中的表达量是先略微下降再恢复至原始水平，总体变化趋势不明显；处理2天后在木质部中的表达量达到最大值，接近对照(0h时的表达量)的2倍；而在根中的表达量是先下降再上升，在处理12h后达到最小值，约为对照的1/3，在处理4天后达到最大值，约为对照的1.5倍，在处理7天后恢复到原始水平(图3)。

结果表明巴西橡胶树幼苗在遇到胁迫作用时会调节HbTPS2基因表达量的上升，从而合成更多的6-磷酸海藻糖来传递胁迫处理产生的信号。

实施例3.HbTPS2基因酵母功能互补验证

<1>酵母TPS基因突变株的制备

设计两端分别带有TPS同源臂的Trp标签基因引物(Trp-TPS-F：5’-CGTACACTTTCAAGTGGTTCGGATGGCCTGGGCTAGAGCACACAAAGGCAGCTTGGAG-3’；Trp-TPS-R：5’-ACACTTCCATGGCGTGCAACTTCTGAGGCACACCTTTAGTAATAACCTATTTCTTAGC-3’)，以pGBKT7质粒(Baisheng Zanget al.Analysis of trehalose-6-phosphate synthase(TPS)gene family suggests theformation of TPS complexes in rice.Plant Molecular Biology.2011，76(6)：507-522.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)为模板进行PCR扩增，得到706bp的片段。

把带同源臂的Trp标签基因回收片段通过同源重组技术取代酵母W303-1A(Baisheng Zang et al.Analysis of trehalose-6-phosphate synthase(TPS)gene family suggests the formation of TPS complexes in rice.Plant MolecularBiology.2011，76(6)：507-522.(MATa ade2-1 his3-11，15 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1can1-100 GAL mal SUC2)，中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)的TPS基因部分序列，使野生型酵母失去TPS功能，从而得到酵母TPS基因突变株。具体方法为：(1)酵母野生型菌株在YPD平板上划线，30℃培养至长出单菌落，挑取1个单菌落到YPD液体培养基中，30℃、250rpm摇至OD值为0.8。(2)取2ml的菌液于5000rpm离心2min，去除上清，加入800μl灭菌ddH₂O、100μl10×TE Buffer、100μl10×LiAc，吹打混匀后5000rpm离心2min，去除上清液。(3)把鲑鱼精子DNA放在沸水浴中变性10min后立即放入冰水浴中冷却，待用。(4)加入70μl50％PEG6000、10μl10×TE Buffer、10μl10×LiAc、1μg PCR产物、1μlβ-巯基乙醇、1μl加热变性的鲑鱼精子DNA，吹打混匀后37℃摇床250rpm孵育1h。(5)5000rpm离心2min后去除上清液，用100μl的灭菌水重悬菌体，涂布于含2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基，于30℃培养2-3d。

酵母TPS基因突变株能够利用半乳糖，而不能利用葡萄糖，因此用含有2％半乳糖的Ttp缺陷型SD固体培养基筛选重组菌株，能够在平板上生长的即为酵母TPS基因突变株。酵母TPS基因突变株能够在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上生长(图4中A)，但是不能在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上生长(图4中B)。图4中A为酵母TPS基因突变株在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片，图4中B为酵母TPS基因突变株在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片。

YPD固体培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，腺嘌呤脲硫酸盐2g，葡萄糖20g。液体培养基则不加琼脂即可。

含2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，半乳糖20g，琼脂20g，-Trp单缺氨基酸混合物(-Trp DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630413)0.74g，用KOH调节PH至5.8-6.0。

含2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，葡萄糖20g，琼脂20g，-Trp单缺氨基酸混合物(-Trp DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630413)0.74g，用KOH调节PH至5.8-6.0。

<2>分别含巴西橡胶树HbTPS2基因编码区序列和全长序列酵母互补重组载体的获得

利用pDR196载体(蔡昭艳，欧阳杰，刘滔.水稻寡肽转运基因OsPTR1-10酵母异源表达载体的构建及转化.2009(32)：15730-15733.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)构建HbTPS2基因的酵母互补载体。

分别设计HbTPS2基因编码区序列和全长序列引物(pDR-HbTPS2-CDS-F(正义链引物)：5’-CACCCGGGATGCCTGGAA ACCAGTACA ACG-3’；pDR-HbTPS2-CDS-R(反义链引物)：5’-CCGTCGACTCAAGAAGATGCATTGGCTAGTTT-3’；pDR-HbTPS2-全长-F：5’-CGCCCGGGGTGAGCGTATGCCTGGAAAC-3’；pDR-HbTPS2-全长-R：5’-CCGTCGACGTACAATTTGTTGATATACTCTAGGGC-3’，下划线为添加的酶切位点：上游引物添加SmaI，下游引物添加SalI，下划线之前的是保护碱基)，以pMD18-HbTPS2质粒为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸4min，共30次循环；72℃延伸10min。利用限制性内切酶SmaI和SalI分别对载体pCXSN和HbTPS2基因编码区和全长序列扩增片段进行过夜双酶切。将该线性载体分别与HbTPS2基因编码区和全长序列酶切片段连接，得到重组载体，利用载体引物M13-47(正义链引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13-48(反义链引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)进行PCR鉴定。重组载体送公司测序鉴定，将鉴定表明正确的分别含有序列表中序列2的第366-3188和第1-3503位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pDR-HbTPS2-CDS和pDR-HbTPS2-全长。

<2>本发明的6-磷酸海藻糖合成酶的酵母功能互补验证

将质粒pDR196、pDR-HbTPS2-CDS和pDR-HbTPS2-全长分别导入酵母TPS基因突变株中(导入方法为文献“Dz-Chi Chen et al.One-step transformation ofyeast in stationary phase.Current Genetics.1992，21(1)：83-84”所述)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌株和野生型菌株在含有2％半乳糖的Ura缺陷型SD液体培养基中30℃、250rpm摇动生长2-3d。取菌液点斑于含有2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基上，30℃培养2-3d。

含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基：(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，半乳糖20g，琼脂20g，-Ura单缺氨基酸混合物(-Ura DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630416)0.77g，用KOH调节PH至5.8-6.0。

含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基：(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，葡萄糖20g，琼脂20g，-Ura单缺氨基酸混合物(-Ura DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630416)0.77g，用KOH调节PH至5.8-6.0。液体培养基不加琼脂即可。

结果显示将HbTPS2基因全长序列转入酵母TPS基因突变株中可以使突变株在含有2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基上恢复生长(图5)。图5中A为含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基；B为含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基；W303-1A表示酵母W303-1A，tpsΔ+pDR196表示转pDR196的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR-HbTPS2-CDS表示转pDR-HbTPS2-CDS的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR-HbTPS2-全长表示转pDR-HbTPS2-全长的酵母TPS基因突变株。

实施例4.HbTPS2基因转拟南芥功能验证

利用pCXSN载体(Songbiao Chen et al.A Versatile Zero Background T-VectorSystem for Gene Cloning and Functional Genomics.Plant Physiology.2009(150)，1111-1121.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)构建HbTPS2基因的转拟南芥载体，具体方法如下：

<1>含巴西橡胶树HbTPS2基因编码区重组载体的获得

设计HbTPS2基因编码区引物(pCXSN-HbTPS2-F(正义链引物)：5’-ATGCCTGGAAACCAGTACAACG-3’；pCXSN-HbTPS2-R(反义链引物)5’-TCAAGAAGATGCATTGGCTAGTTT-3’)，以pMD18-HbTPS2为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸3min，共30次循环；72℃延伸10min，扩增片段两端各突出一个核苷酸A。利用限制性内切酶XcmI对载体pCXSN进行过夜酶切，得到两端各突出一个核苷酸T的pCXSN线性载体。将该线性载体与HbTPS2编码区扩增片段连接，得到重组载体，利用载体引物pCXSN-F(正义链引物)5’-GCAATCAAGCATTCTACTTC-3’和特异性引物pCXSN-HbTPS2-R(反义链引物)5’-TCAAGAAGATGCATTGGCTAGTTT-3’)进行PCR鉴定，确保海藻糖合成酶编码片段正向克隆到表达载体。重组载体送公司测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中序列2的第366-3188位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pCXSN-HbTPS2。

<2>本发明的6-磷酸海藻糖合成酶功能验证

将获得的重组载体pCXSN-HbTPS2导入(导入方法见文献“张云峰，邵磊。根癌农杆菌电击转化条件的研究。淮阴师范学院学报：自然科学版。2009，8(3)：243-245，249”)农杆菌EHA105(Feldmann，K.A.and Marks，M.D.Agrobacterium mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana：anon-tissue culture approach.Mol.Gen.Genet.1987，208，1-9.Biovector Co.，LTD订购)中，得到重组表达菌株，将鉴定正确的重组菌株在含利福平(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的YEP液体培养基中培养至OD600为0.8-1.5，收集菌体，用侵染液(MS培养基：1.32g；蔗糖：30g；6-BA(1mg/ml)：60μl；2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水(MES，超级纯)：0.3g；Silwet L-77(84％的聚醚改性七甲基三硅氧烷和16％的烯丙氧基聚乙二醇甲基醚的混合物，“％”为质量百分比)：120μl。KOH调节PH到5.7)重悬至OD600为0.8-1.0，利用喷雾器将农杆菌重悬液喷洒至野生型拟南芥Col-0(购自Arabidopsis Biological Resource Center)的花絮上，直到有液滴滴下。置入培养箱中黑暗培养24h，之后正常培养16h/8h(光照/黑暗)。在拟南芥产生新的花序后再次喷洒一次农杆菌重悬液，继续培养至植物成熟，收集种子(T1代)。

将T1代种子播种到含有50μg/mL的潮霉素B的固体MS培养基平板上，放置4℃冰箱春化3-4天后转移至20℃光照培养箱16h/8h(光照/黑暗)。两周后选择长势正常的拟南芥移植至营养土(蛭石∶营养土＝1∶1)中继续培养，成熟后收集种子(T2代)干燥。挑选能够在含有50μg/mL潮霉素B的固体MS培养基上生长的T2代拟南芥微量提取基因组DNA，分别利用潮霉素基因特异性引物(Hyg-F：5’-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’；Hyg-R：5’-TACTTCTACACAGCCATC-3’)和6-磷酸海藻糖合成酶基因编码区引物(见实施例4<1>)进行PCR检测，分别扩增得到一条1000bp和2800bp左右的特异条带，为潮霉素基因和本发明的促进植物生长和开花的相关基因，即得到转pCXSN-HbTPS2拟南芥阳性株系。

将野生型拟南芥Col-0(购自Arabidopsis Biological Resource Center)和阳性转pCXSN-HbTPS2拟南芥种子播种于MS培养基中，在培养了10天后将拟南芥幼苗移栽到营养土中，每隔一段时间拍照对比植株的生长状态(图6)。

结果如图6所示，转pCXSN-HbTPS2拟南芥种子和野生型拟南芥的种子分别在MS培养基中培养10天后，观察发现转HbTPS2基因拟南芥幼苗根的生长速度显著的快于野生型拟南芥(图6中A)；在移栽到营养土中培养10天后，发现转HbTPS2基因拟南芥叶片的长势明显的比野生型拟南芥旺盛(图6中B)；在营养土中培养1个月后，发现当野生型拟南芥还未达到抽苔开花期时，转HbTPS2基因拟南芥已经抽出近15cm的茎干，而且到了开花期(图6中C)。图6中A为转pCXSN-HbTPS2拟南芥种子和野生型拟南芥的种子分别在MS培养基中培养10天后的照片；图6中B为移栽到营养土中培养10天后的照片；图6中C为在营养土中培养1个月后的照片。

按照上述同样的方法将pCXSN载体转入野生型拟南芥Col-0获得转pCXSN载体拟南芥，培养结果表明，其与野生型拟南芥的长势和开花时间没有明显差别。

4.结论

我们首次克隆了巴西橡胶树6-磷酸海藻糖合成酶HbTPS2基因的全长cDNA，基因表达分析显示巴西橡胶树幼苗在遇到非生物胁迫时，HbTPS2基因在植株一些组织中的表达量有明显的上升。酵母互补实验显示将HbTPS2基因全长序列导入酵母TPS基因突变株中能够互补突变株的TPS功能。而把该基因转入野生型拟南芥中后，发现转HbTPS2基因植株的生长速度明显快于野生型拟南芥，并提早开花时间。

因此该基因也可作为巴西橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快巴西橡胶树的生长速度和提早开花。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在巴西橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用，加快它们的生长速度。

Claims (9)

1.一种具有促进植物生长和开花的功能的蛋白，是由序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白。

2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)或2)所示：

1)序列表中SEQ ID№：2的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID№：2自5′末端第366-3188位核苷酸所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

7.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在培育生长速度加快的转基因植物中的应用；所述植物为拟南芥。

8.一种培育生长速度加快和提早花期的植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，培育得到生长速度加快、花期提前的转基因植物；所述目的植物为拟南芥。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。