CN101215569A

CN101215569A - 一个与耐逆相关的水稻海藻糖合酶基因的克隆及应用

Info

Publication number: CN101215569A
Application number: CNA2008100560417A
Authority: CN
Inventors: 王喜萍
Original assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: CN101215569B

Abstract

本发明公开了一个来源于水稻的与耐逆性相关的TPS基因，编码下述蛋白质：1)具有序列表中的SEQ ID NO：1或其N－端缺失1至130个氨基酸残基的氨基酸序列；2)将1)所述氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且编码具有调控植物耐逆性功能的衍生蛋白质。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一个与耐逆相关的水稻海藻糖合酶基因的克隆及应用

技术领域

本发明涉及植物与耐逆性相关的基因与应用，特别涉及来源于水稻的与耐逆相关的海藻糖合酶及其编码基因与其在培育耐逆性植物中的应用。

背景技术

海藻糖(trehalose：α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside)，是由两个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的一种非常稳定的非还原性双糖，广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和低等动植物中。近年来也发现存在于高等植物中。

海藻糖最初被认为是一种贮藏性糖类，作为生物体代谢的碳源，但后来人们发现它更重要的作用是一种应激反应的重要产物。许多生物体处于不良生长环境如高温、干燥、高渗透压、重金属、有毒试剂时，体内合成并积累海藻糖。海藻糖可能是采取以下两种方式来抵抗逆境的胁迫：一、作为小分子物质，调节渗透压；二、稳定膜结构和保护生物大分子以免变性。而稳定膜结构和保护生物大分子可能是其最主要的功能。由于海藻糖的非还原特性，使它比其它双糖，包括非还原性蔗糖更为惰性，因而能最有效地保护生物活性物质。

海藻糖对生物大分子活性的保护机理，目前主要有两种假说：一是“水替代”假说，即生物体中的蛋白质、糖、脂类和其它大分子物质周围均包围着一层水膜，这层水膜对维持生物大分子的结构和功能是必不可少的，当干燥时这层水膜被逐步去除，生物大分子的结构和功能则发生不可逆转的改变。当溶液中存在海藻糖时，它可通过羟基和生物大分子形成氢键而取代了原来由水分子形成的氢键，同时还形成一层新水膜以保护生物大分子，使其在缺水条件下仍能保持原有结构，而不丧失活性，1984年Crowe等以海藻糖对人生长素的保护性研究支持此假说(Crowe JH，Crowe LM，Chapman D，(1984)Preservation of membranesin anhydrobiotic organisms：The role of trehalose.Science，223：701～703)。

另一种是“玻璃体”假说〔Colaco c，Sen S，Thangavelu M，et al.(1992)Extraordinarystability of enzymes dried in trehalose：simplified molecular biology.BiotechnologyNY，10(9)：1007～1011〕，1992年，Colaco等发现海藻糖可以紧密地包住相邻的分子，并与生物大分子形成一种类似水晶状的玻璃体结构，使生物大分子位于玻璃体内而维持原来的空间结构，从而在干燥及冷冻时可得到有效保护。以上两种假说都可说明对某些生物大分子的保护作用，但直到目前仍未有更全面进一步阐明海藻糖对生物大分子的保护机理，这需要作深入的研究工作。

目前研究表明在生物体内至少存在五种海藻糖合成代谢途径(Avonce N，Mendoza-Vargas A，Morett E，Iturriaga G(2006)Insights on the evolution of trehalosebiosynthesis.BMC Evol Biol 6：109)，除了少数几种细菌或古细菌外，绝大多数生物都是通过以下途径来合成海藻糖的。首先在海藻糖-6-磷酸合酶(TPS：trehalose-6-phosphate(T6P)synthase)的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸，然后通过海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP：trehalose-6-phosphate(T6P)phosphatase)作用脱去磷酸形成海藻糖。在大肠杆菌中这两个酶独立存在，并且构成一个操纵子otsBA(otsA编码海藻糖-6-磷酸合酶，otsB编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶)。而在酿酒酵母中由4个基因(TPS1、TPS2、TSL、TPS3)编码蛋白构成复合物来执行来高效合成海藻糖，同时也存在少量的TPS1单体来合成必须的T6P。其中TPS1基因编码海藻糖-6-磷酸合酶；TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶；TSL基因具有初级调控功能，如若该基因被阻断，导致酶活性降低；TPS3基因编码的蛋白有利于复合体的聚集(Walter Bell，Weining Sun，et al.1998Composition and Functional Analysis of the Saccharomyces cerevisiae Trehalose SynthaseComplex THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.273，No.50，pp.33311-33319)。

人们很早就认识到体内大量积累海藻糖是沙膜旱生植物膜叶卷柏抵御环境胁迫的重要手段。在1913年，O.Anselmino等人就从蕨类植物Selaginella lepidophylla中纯化得到海藻糖。Joachim Müller等用气相色谱仪分析得出，在干旱完全脱水的情况下，卷柏中的海藻糖含量约占干重的10％-12％，经过复水后，海藻糖的含量约占干重1％左右。但在此后的很长时间里人们却在高等植物体内却检测不到内源海藻糖的存在，所以很久以来认为在许多高等植物中不存在的海藻糖的生物合成途径。直到1969年，在甘蔗中发现很高的海藻糖酶的活性，间接说明在高等植物中可能存在海藻糖的合成和分解途径。1978年，从生长在非洲的悬崖峭壁上一种被子植物Myrothamnus flabellifolius的叶子中发现了海藻糖存在，其含量约占叶子干重的3％(Joachim Müller，Thomas Boller，et al.1995，Trehalose and trehalase inplants：recent developments Plant Science 112：1-9)。此后也从其他植物的一些组织和器官中检测到海藻糖的存在，但含量都很低。1998年，从拟南芥中分离到编码有生物活性的海藻糖-6-磷酸合酶基因AtTPS1(Miguel A.Blázquez，Elisa Santos，et al.(1998)Isolation andmolecular characterization of the Arabidopsis TPS1 gene encoding trehalose-6-phosphatesynthase The Plant Journal 13(5)，685-689)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因AtTPPA、AtTPPB(Guido Vogel，Roger A.Aeschbacher，et al.1998 Trehalose-6-phosphate phosphatases fromArabidopsis thaliana identification by functional complementation of the yeast tps2 mutant ThePlant Journal 13(5)，673-683)。这表明在高等植物体内仍然存在海藻糖合成和分解的途径。从此，人们对植物体内海藻糖合成与分解代谢的研究揭开了新的篇章，并成为当前研究的一个热点。

在酵母海藻糖-6-磷酸合酶基因(ScTPS1)缺失突变体中，由于不能合成海藻糖-6-磷酸，不能调控葡萄糖代谢，进而导致不能够在含有葡萄糖的培养基上生长(Blazquez，M.A.Lagunas，R.Gancedo，C.and Gancedo，J.M.(1993)Trehalose-6-phosphate，a new regulator ofyeast glycolysis that inhibits hexokinases.FEBS Lett.329，51-54.)。过表达植物海藻糖-6-磷酸合酶基因(如拟南芥的AtTPS1基因和Selaginella lepidophylla的SlTPS1基因)可以弥补这一缺陷，但是其形成的海藻糖-6-磷酸合酶催化活性很低，海藻糖积累量也很少。与酵母的ScTPS1基因和E.coli的EcOtsA基因不同，AtTPS1和SlTPS1基因在其N端都存在一段大约100氨基酸左右的延长区(如图1)，当在酵母ScTPS1基因缺失突变体中过表达去除这一区域的基因时，海藻糖-6-磷酸合酶的催化活性可以增加大约10-40倍，海藻糖的积累量也增加了大约20-40倍，这表明这两个植物海藻糖合酶基因N端的这一延长区会抑制其合成海藻糖-6-磷酸的活性，去除这一区域可以增强酶的活性(Van Dijck，P.Mascorro-Gallardo，J.O.etal.2002 Truncation of Arabidopsis thaliana and Selaginella lepidophylla trehalose-6-phosphatesynthase unlocks high catalytic activity and supports high trehalose levels on expression in yeastBiochem.J.366，63-71)。

由于大多数植物体内不能像还魂植物那样产生很高的海藻糖浓度来执行胁迫保护的作用，因此科学家们很早就开始了应用生物工程手段将海藻糖合成基因引入植物体，提高植物的抗干旱、盐碱能力，培育优良农作物品种。目前已经在烟草、马铃薯、水稻中进行了尝试，并且都提高了作物抵抗干旱和盐碱的能力，但其中也仍然存在一些问题(SuprasannaPenna(2003)Building stress tolerance through over-producing trehalose in transgenic plantsTRENDS in Plant Science 8(8)：355-357)。1997年，Carlos Romero等人将酵母TPS1基因转入烟草中发现，在提高转基因烟草的抗旱性的同时也引发了一系列多效性反应，植物生长迟钝、矮小，而且形成刀形叶(Carlos Romero，Jose M.et al.(1997)Expression of the yeasttrehalose-6-phosphate synthase gene in transgenic tobacco plants：pleiotropic phenotypes includedrought tolerance.Planta 201：293-297)。此后Goddijn等人将E.coli的otsA或同时将otsA和otsB基因转化烟草，也发现具有类似现象(Goddijn，O.J.et al.(1997)Inhibition of trehalaseactivity enhances trehalose accumulation in transgenic plants.PlantPhysiol.113，181-190.)。2002年，康乃尔大学吴瑞教授的课题组成功将E.coli的otsA和otsB基因融合起来形成TPSP基因转化水稻，在转基因水稻中TPSP分别受组织特异性启动子(rbcS)或ABA诱导启动子的调控，转基因水稻株系中海藻糖含量相对于未转基因的对照植株提高了大约3到10倍，尽管转基因水稻每克鲜重中海藻糖含量仍然不到1mg，但是转基因植物在高盐、干旱以及低温等恶劣条件下呈现正常的生长状态，并且有效地减少了光氧化损伤(photo-oxidative damage)，维持体内的矿质平衡(Ajay K.Garg，Ju-Kon Kim 2002 Trehalose accumulation in rice plantsconfers high tolerance levels to different abiotic stresses.PNAS vol.99 no.25：15898-15903)。2003年，In-Cheol Jang等人同样将E.coli的otsA和otsB基因融合起来形成TPSP基因，然后连接上玉米的ubiquitin启动子，转化水稻，提高了转基因水稻的抗旱抗盐能力。这一方法也没有引起水稻产生表型变化，但是转基因水稻种子的萌发却要比野生型种子延迟3天左右(In-Cheol Jang，Se-Jun Oh，et al.2003 Expression of a Bifunctional Fusion of the Escherichiacoli Genes for Trehalose-6-Phosphate Synthase and Trehalose 6-Phosphate Phosphatase inTransgenic Rice Plants Increases Trehalose Accumulation and Abiotic Stress Tolerancewithout Stunting Growth Plant Physiology，131：516-524)，2004，Nelson等人在拟南芥中过表达自身基因AtTPS1，提高了拟南芥脱水耐受的能力。而在表型上并没有明显变化，除了开花稍微有些延迟(Nelson Avonce，Barbara Leyman，et al.2004，The ArabidopsisTrehalose-6-P Synthase AtTPS1 Gene Is a Regulator of Glucose，Abscisic Acid，and StressSignaling1 Plant Physiology，Vol.136，pp.3649-3659.)。以上结果表明提高作物体内海藻糖含量仍然可以增强作物抵抗多种不良环境的能力，但是海藻糖含量也应受到精确的调控。

另外，水稻中确切的海藻糖合酶基因目前还没有报道，不同数据库中有关该海藻糖合酶基因的预测模型也各有不同，且没有完整的cDNA或EST序列作为实验支持。

发明内容

本发明的目的是提供一个与耐逆性相关的海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)基因。本发明利用同源克隆的方法在水稻中克隆了多个海藻糖合酶的候选基因，并证明其中的一个基因及其N-端缺失的片段具有增强植物抗逆性的功能。

本发明所提供的与耐逆性相关的TPS基因，来源于水稻，编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)具有序列表中SEQ ID NO：1或其N-端缺失1至130个氨基酸残基的氨基酸序列；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加1至10个氨基酸残基且具有调控植物耐逆性功能的由(i)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸序列由985个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第133-600位氨基酸残基为保守的海藻糖-6-磷酸合酶结构域，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsTPS1。本发明发现该蛋白的N-端缺失1-130个氨基酸残基后，其功能不受影响。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

编码本发明来源于水稻的与耐逆性相关的TPS的全长基因，可以具有下述核苷酸序列：序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。编码本发明N端部分缺失的TPS的基因可以是序列表中SEQ ID NO：2的N端缺失3-390个核苷酸残基且具有相同阅读框架的DNA序列。

序列表中的SEQ ID NO：2由2958个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-2958位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第397-1800位碱基编码海藻糖-6-磷酸合酶结构域，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsTPS1。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsTPS1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的TPS基因(如OsTPS1或其N端部分缺失的基因，或者是与这些基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列)导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。

在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的TPS基因(OsTPS1)或其N端部分缺失的基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐逆性相关的TPS基因(OsTPS1)或其同源序列可通过含有ZmCBL1或其同源序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明中水稻与耐逆性相关的TPS基因(OsTPS1)或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM 118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，以pH2GW7(Invitrogen公司的Gateway^TW vector载体)为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的TPS基因的植物表达载体为pH2GW7-OsTPS1。携带有本发明水稻与耐逆性相关的TPS基因(OsTPS1)或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的TPS基因(OsTPS1)或其N端部分缺失的基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了一个与耐逆性相关的TPS及其编码基因。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为不同生物中海藻糖-6-磷酸合酶(TPS1)结构比较图；

图2为OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因T0代植株中潮霉素磷酸转移酶基因PCR检测结果的电泳图；

图3为OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因T0代植株中海藻糖-6磷酸合酶基因PCR检测结果的电泳图；

图4为经干旱胁迫后OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因T1代植株与野生型植株的对比照；

图5为经1％NaCl盐溶液胁迫后OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因T1代植株与野生型植株的对比照；

图6为经低温胁迫后OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因T1代植株与野生型植株的对比照；

图7a为OsTPS1Δ(1-40)转基因水稻不同株系中耐旱、耐盐和耐冷植株百分比柱形图；

图7b为OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻不同株系中耐旱、耐盐和耐冷植株百分比柱形图。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.Russell，David W.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例1、水稻与耐逆性相关的海藻糖合酶基因OsTPS1(OsTPS1Δ(1-40)及OsTPS1Δ(1-130))的获得

1、OsTPS1的分离及功能研究

检索TIGR数据库、华大德BGI数据库、以及NCBI等一些其它综合数据库，获得TPS1的推测编码序列，根据预测其N端延长区大约有128个氨基酸，在这一区域有三个甲硫氨酸(Met)，我们分别以这三个甲硫氨酸为起始设计5’端引物：

f001：5′＞CACCATGCCGACCCCCGCGCC＞3′

f121：5′＞CACCATGCTCCGCGGGGAGTG＞3′

f393：5′＞CACCATGGGGATGAAGCAGCGCCTC＞3′

3’端引物序列为r2958：5′＞GTCGACCTGCCTATCCAAGAACATG＞3′

提取灌浆期的广陆矮4号水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA，RT-PCR方法，以引物对f001、r2958扩增得到全长OsTPS1基因，基因大小为2958bp，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别提供的就是此全长基因的氨基酸序列及序列。以引物对f121、r2958扩增得到OsTPS1基因去除N端40个氨基酸的基因片段OsTPS1Δ(1-40)，以引物对f393、r2958扩增得到去除N端130个氨基酸的OsTPS1Δ(1-130)。

具体反应为：取约2μg的总RNA，加入2μl Oligo(dT)₁₈ primer(0.1μg/μl)，小心混匀，65℃保温5分钟。室温放置10分钟，然后分别加入4μl 5×First-strand buffer，0.5μlRibonuclease inhibitor(40U/μl)，2μl 100mM DTT，2μl 4×dNTP(各10mM)，1μl MMLV ReverseTranscriptase(200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后90℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取1μl作为PCR反应的模板，上、下游引物(10μM)各1μl，LATaq酶(5U/μl)0.5μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，2×GC buffer(Mg²⁺)25μl，H₂O 20.5μl。PCR反应条件为预热95℃ 5min，变性94℃ 1min，退火56℃ 1min，延伸72℃ 3min，35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小分别为2838bp和2566bp的DNA片段，与预期结果相符。回收并纯化上述片段，将其分别连接入载体pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，通过CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)TOP10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，分别命名为pENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-40)和pENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-130)。对上述质粒进行测序，测序结果表明获得了序列正确的OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)基因。

实施例2、水稻与耐逆性相关海藻糖合酶基因OsTPS1(OsTPS1Δ(1-40)及OsTPS1Δ(1-130))转基因水稻的获得

我们选择N-端分别缺失40个和130个氨基酸残基的基因构建OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转化水稻，以检测不同缺失的基因片段对水稻耐逆性能的影响。用农杆菌介导法转化水稻，具体方法如下：

1)转化农杆菌

通过LR反应将实施例2中构建的重组质粒pENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-40)和pENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-130)分别导入植物表达载体pH2GW7(Invitrogen公司的Gateway^TW vector载体)中，LR反应体系为0.5μl Gateway^LR Clonase^TM Enzyme Mix(Gateway^LR Clonase^TM Enzyme Mix试剂盒中提供，Invitrogen)，1μl 5×buffer，2μlpENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-40)(150ng/μl)或pENTER-TOPO-OsTPS1Δ(1-130)(150ng/μl)，1.5μl pH2GW7(150ng/μl)，补水5μl。LR反应条件为25℃水浴1到3个小时。然后通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)TOP10。以5′＞CACCATGGGGATGAAGCAGCGCCTC＞3′为正向引物，5′＞GTCGACCTGCCTATCCAAGAACATG＞3′为反向引物，PCR筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养12-16小时，提取质粒，用限制性内切酶EcorRV进行酶切鉴定，经酶切获得了约3kb的酶切产物，与预期结果相符，鉴定结果表明获得了含有OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)的重组植物表达载体，命名为pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)，随后将上述重组载体pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)分别转化农杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)。以5′＞CACCATGGGGATGAAGCAGCGCCTC＞3′为正向引物，5′＞GTCGACCTGCCTATCCAAGAACATG＞3′为反向引物PCR进行阳性重组农杆菌的鉴定，获得AGL0(pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130))重组农杆菌株。

2)侵染水稻愈伤组织，

挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(Co(NO₃)₂·6H₂O 0.15mg/L，CaCl₂ 110mg/L，MgSO₄ 122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH₂PO₄·H₂O150mg/L，Na₂-EDTA 0.01mM，FeSO₄·7H₂O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO₄·4H₂O 84.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.25mg/L，H₃BO₃ 5mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO₄ 0.005mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O1.25mg/L，盐酸硫胺素VB₁ 5mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB₆ 5mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln 87.6mg/L，L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至OD₆₀₀＝0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织分别浸入上述转化有pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N₆共培养基(N₆培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L)上培养，其中N₆基本培养基的配方为(NH₄)₂SO₄ 0.46g/L，KNO₃ 2.83g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 0.092g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂-EDTA 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.11g/L，MnSO₄·4H₂O 0.44g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.17g/L，H₃BO₃0.14g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0005g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g/L，盐酸硫胺素VB₁ 0.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB₆ 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直到水中不见丝状菌体，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上凉干，最后转入筛选培养基(N₆基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。

3)阳性转基因水稻的获得

将侵染后的水稻愈伤组织于N₆共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素的N₆固体培养基(N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的N₆固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2 MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’和反向引物5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得约1100bp大小DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果如图2所示，其中M为分子量标记；WT为未转基因水稻中花11对照；右边1-10道为不同转基因株系：1-5道分别为编号是1、2、3、6、8的OsTPS1Δ(1-40)转基因株系，6-10道分别为编号是7U、9U、29U、46U、51U的OsTPS1Δ(1-130)转基因株系。表明用上述方法获得了分别转化有pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)的转基因水稻。

另外以5′＞TTGAAGTTCGGTCTGTCG＞ 3′为正向引物，以5′＞GTCGACCTGCCTATCCAAGAA CATG＞3′为反向引物扩增OsTPS1基因3′端DNA片段，由于在未转基因中花11对照基因组该区域中含有1050bp大小的内含子和561bp大小的编码序列，所以可扩增得到1611bp大小DNA片段，而在转化有OsTPS1Δ(1-40)或OsTPS1Δ(1-130)的转基因水稻中，除了这一条带外还含有转入的OsTPS1Δ(1-40)或OsTPS1Δ(1-130)的去除了内含子的编码序列即561bp大小的条带。检测结果如图3所示，WT为未转基因中花11阴性对照，右边1-10道所代表的不同转基因株系同图2。以上结果又一次证明获得了转化有pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)的转基因水稻植株。

实施例3、OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株的耐旱性鉴定

收获pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因株系，并进行Southern印记分析，进一步鉴定外源插入基因的拷贝数。每个基因选择5个不同的单拷贝转基因株系，继续培养10天后对其转基因阳性苗进行干旱处理，同时设未转基因的水稻中花11植株作对照。将水稻幼苗种入装箱的土壤中，采用蛭石∶营养土比例为3∶1的混合土，土壤的含水量限定为55-65％之间(采用烘干法测量土壤含水量，根据土壤烘干前后土壤重量的差值计算土壤的含水量)。从处理即日起不再浇水，采用重复干旱法，即当同一培养箱中约50％的幼苗表现出萎蔫时结束第一次干旱，复水约7天，使苗恢复生长，再进行第二次干旱处理，直至绝大多数的未转基因水稻苗的叶片干枯、茎杆脱水弯曲、死亡，而各转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立，停止筛选，复水培养。此过程大约需要20-30天。在正常的复水培养条件下恢复生长2周后统计各转基因株系的成活苗数，计算耐旱苗比例。pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代经耐旱处理后的植株与经耐旱处理后的未转基因对照植株如图4所示，每张照片中WT为未转基因对照植株，另一盆为转基因植株。与野生型(WT)对照植株相比，pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株对干旱胁迫的耐受性均明显提高。筛选出的转基因耐旱苗在大田中继续生长获得T2代种子。

实施例4、OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株的耐盐性鉴定

收获pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因株系，并进行Southern印记分析，进一步鉴定外源插入基因的拷贝数。每个基因选择5个不同的单拷贝转基因株系，继续培养10天后，将苗转移到大试管中，加入含有1％NaCl的盐溶液，进行盐胁迫处理7天(温度：28℃，光强：2500Lux，光照时间：光15h/暗9h)，期间每天更换盐溶液，以保持盐浓度的稳定，筛选7天后除去盐溶液，统计成活苗数，计算耐盐苗比例。实验结果如图5所示，每张照片中最左边的是未经盐胁迫处理的未转基因中花11对照(WT-H₂O)，中间的是经盐胁迫处理的未转基因中花11对照(WT)，最右边的是经盐胁迫处理后的T1代转基因植株(OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130))。T1代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡。

实施例5、OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株的耐冷性鉴定

收获pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因株系，并进行Southern印记分析，进一步鉴定外源插入基因的拷贝数。每个基因选择5个不同的单拷贝转基因株系，继续培养10天后，将苗转移到三角瓶中，加入营养液，然后放入4℃(光强：2500Lux，光照时间：光15h/暗9h)培养条件下进行低温处理10天，然后恢复室温继续培养，同时以未转基因的中花11为对照，分别统计成活苗数，计算耐低温苗比例。耐低温处理后的转基因T1代植株和对照植株如图6所示，4℃处理第7天后，阳性转基因株系的T1代植株(OsTPS1Δ(1-40)和OsTPS1Δ(1-130))仅叶尖部分稍有卷曲，室温培养后能够继续恢复生长，而未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，室温培养后不能恢复生长，并很快死亡，表明转基因植株对低温的耐受抵抗能力明显高于未转基因植株。

以上耐旱、耐盐和耐冷筛选中选取的转基因株系为相同的五个株系，统计各株系的耐旱苗比例、耐盐苗比例以及耐冷苗比例，计算结果如图7a和图7b所示，pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)和pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株对干旱胁迫、盐溶液胁迫以及低温胁迫的耐受性较未转基因对照(WT)均有明显提高，由图中也可看出，与未转基因对照比较，pH2GW7-OsTPS1Δ(1-130)转基因水稻T1代植株对干旱胁迫、盐溶液胁迫以及低温胁迫的耐受性要好于pH2GW7-OsTPS1Δ(1-40)转基因水稻T1代植。

尽管为说明目的公开了本发明的具体实施例和附图，其目的在于帮助理解本发明的内容并据以实施，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司

<120>一个与耐逆相关的水稻海藻糖合酶基因的克隆及应用

<130>JSP070309

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>985

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

Met Pro Thr Pro Ala Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Cys

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ser Tyr Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Pro Asp Asp Arg Met Leu Arg Gly Glu Cys Gly Arg

35 40 45

Arg His Pro Phe Ala Ser Ser Ala Ala Val Gly Ala Gly Ser Pro Asp

50 55 60

Ala Met Asp Thr Asp Ser Ala Glu Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ser Val

65 70 75 80

Ala Asp Phe Gly Ala Arg Ser Pro Phe Ser Pro Gly Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Ala Asn Met Asp Asp Ala Gly Gly Ala Ser Ala Ala Gly His Ala Ala

100 105 110

Arg Pro Pro Leu Ala Gly Pro Arg Ser Gly Phe Arg Arg Leu Gly Leu

115 120 125

Arg Gly Met Lys Gln Arg Leu Leu Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val

130 135 140

Ser Ala Asn Arg Arg Gly Glu Asp Gln Trp Ser Leu Glu Ile Ser Ala

145 150 155 160

Gly Gly Leu Val Ser Ala Leu Leu Gly Val Lys Asp Val Asp Ala Lys

165 170 175

Trp Ile Gly Trp Ala Gly Val Asn Val Pro Asp Glu Val Gly Gln Arg

180 185 190

Ala Leu Thr Arg Ala Leu Ala Glu Lys Arg Cys Ile Pro Val Phe Leu

195 200 205

Asp Glu Glu Ile Val His Gln Tyr Tyr Asn Gly Tyr Cys Asn Asn Ile

210 215 220

Leu Trp Pro Leu Phe His Tyr Leu Gly Leu Pro Gln Glu Asp Arg Leu

225 230 235 240

Ala Thr Thr Arg Asn Phe Glu Ser Gln Phe Asn Ala Tyr Lys Arg Ala

245 250 255

Asn Gln Met Phe Ala Asp Val Val Tyr Gln His Tyr Lys Glu Gly Asp

260 265 270

Val Ile Trp Cys His Asp Tyr His Leu Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu

275 280 285

Lys Asp His Asp Ile Asn Met Lys Val Gly Trp Phe Leu His Thr Pro

290 295 300

Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Ser Arg Ser Glu Leu

305 310 315 320

Leu Arg Ser Val Leu Cys Ala Asp Leu Val Gly Phe His Thr Tyr Asp

325 330 335

Tyr Ala Arg His Phe Val Ser Ala Cys Thr Arg Ile Leu Gly Leu Glu

340 345 350

Gly Thr Pro Glu Gly Val Glu Asp Gln Gly Arg Leu Thr Arg Val Ala

355 360 365

Ala Phe Pro Ile Gly Ile Asp Ser Glu Arg Phe Lys Arg Ala Leu Glu

370 375 380

Leu Pro Ala Val Lys Arg His Ile Thr Glu Leu Thr Gln Arg Phe Asp

385 390 395 400

Gly Arg Lys Val Met Leu Gly Val Asp Arg Leu Asp Met Ile Lys Gly

405 410 415

Ile Pro Gln Lys Ile Leu Ala Phe Glu Lys Phe Leu Glu Glu Asn His

420 425 430

Glu Trp Asn Asp Lys Val Val Leu Leu Gln Ile Ala Val Pro Thr Arg

435 440 445

Thr Asp Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu Ile

450 455 460

Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Thr Leu Thr Ala Val Pro Ile

465 470 475 480

His His Leu Asp Arg Ser Leu Asp Phe His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr

485 490 495

Ala Val Thr Asp Val Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn

500 505 510

Leu Val Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser Lys Lys Gly Val

515 520 525

Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu Gly Ala Gly

530 535 540

Ala Ile Leu Val Asn Pro Trp Asn Ile Thr Glu Val Ala Asp Ser Ile

545 550 555 560

Lys His Ala Leu Thr Met Ser Ser Asp Glu Arg Glu Lys Arg His Arg

565 570 575

His Asn Tyr Ala His Val Thr Thr His Thr Ala Gln Asp Trp Ala Glu

580 585 590

Thr Phe Val Cys Glu Leu Asn Glu Thr Val Ala Glu Ala Gln Leu Arg

595 600 605

Thr Arg Gln Val Pro Pro Asp Leu Pro Ser Gln Ala Ala Ile Gln Gln

610 615 620

Tyr Leu His Ser Lys Asn Arg Leu Leu Ile Leu Gly Phe Asn Ser Thr

625 630 635 640

Leu Thr Glu Pro Val Glu Ser Ser Gly Arg Arg Gly Gly Asp Gln Ile

645 650 655

Lys Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro Glu Leu Lys Gly Pro Leu Arg

660 665 670

Ala Leu Cys Glu Asp Glu His Thr Thr Val Ile Val Leu Ser Gly Ser

675 680 685

Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe Gly Glu Phe Asn Met Trp Leu

690 695 700

Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg Pro Thr Asn Gly Glu Trp Met

705 710 715 720

Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Asp Trp Val Asp Ser Val Lys

725 730 735

Asn Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg Thr Pro Arg Ser His Phe Glu

740 745 750

His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn Tyr Lys Tyr Ala Asp Val Glu

755 760 765

Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met Leu Gln His Leu Trp Thr Gly

770 775 780

Pro Ile Ser Asn Ala Ala Val Asp Val Val Gln Gly Ser Arg Ser Val

785 790 795 800

Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys Gly Ala Ala Ile Asp Arg Ile

805 810 815

Leu Gly Glu Ile Val His Ser Lys Ser Met Ile Thr Pro Ile Asp Tyr

820 825 830

Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly Lys Asp Glu Asp Ile Tyr Val

835 840 845

Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu Ser Lys Val Lys Pro Asp Ser

850 855 860

Ser Gly Ser Val Ser Leu Asp Arg Arg Pro Asn Gly Arg Pro Ser Asn

865 870 875 880

Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Ser Gln Ser Arg Thr Pro Lys Ala Gln

885 890 895

Ala Ala Pro Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Gly Thr

900 905 910

Pro Asn Ser His His Asp Trp Arg Glu Gly Ser Ser Val Leu Asp Leu

915 920 925

Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Arg Lys Arg Ser Asn

930 935 940

Ala Arg Tyr Leu Leu Asn Ser Ser Glu Glu Val Val Ser Phe Leu Lys

945 950 955 960

Glu Met Ala Asp Ala Thr Ala Ala His Asn Gly Phe Gln Ser Thr Thr

965 970 975

Ala Asp Tyr Met Phe Leu Asp Arg Gln

980 985

<210>2

<211>2958

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

atgccgaccc ccgcgccgtc ggcatcgtcc tcctcctcct tctcctgcgg cggcggtggc 60

ggtggcgccg gggccgcgtc gtcctactcc tcctcctcct cctcctcccc ggacgaccgc 120

atgctccgcg gggagtgcgg ccgccgccac cccttcgcgt cgtcggcggc ggtgggggcc 180

ggttccccgg acgccatgga cacggactcc gcggagcctt cctccgcggc gacctccgtc 240

gcggacttcg gggcccggtc gccgttctcg ccgggggccg cctcgcccgc caacatggac 300

gacgcgggcg gcgcgtcggc ggcggggcac gcggcgcggc cgccgctcgc cgggccgcgc 360

agcgggttcc gccgcctcgg cctccgcggg atgaagcagc gcctcctcgt cgtcgccaac 420

cgcctccccg tctccgccaa tcgccgcggc gaggaccagt ggtccctgga gatcagcgcc 480

ggcggcctcg tcagcgccct cctcggcgtc aaggacgtgg acgcgaagtg gatcggatgg 540

gcgggcgtca acgtccccga cgaggtcggc cagcgagctc tcacacgagc gctcgccgag 600

aagagatgta taccagtgtt cctggatgag gaaatcgtgc accaatacta caacggatac 660

tgcaacaaca tactctggcc tctgtttcac tacctgggat tgccacagga ggacaggttg 720

gcgacgacga ggaatttcga gtcacagttc aacgcgtaca agcgagcaaa ccagatgttc 780

gctgatgttg tgtaccagca ctacaaggaa ggggatgtga tctggtgcca tgattaccac 840

ctcatgttcc tgcccaagtg cctcaaggat catgacatca acatgaaggt cgggtggttc 900

ctgcacacgc cattcccttc ttcggagatt taccggacgc tgccctcccg gtcggagctg 960

cttcgctccg tgctctgtgc tgatttagtc ggatttcata catatgatta tgcaagacat 1020

tttgtgagcg catgtacaag aatacttgga ctggagggca ctcctgaggg tgtggaagac 1080

caaggaaggc taaccagagt tgctgcgttt cctattggga tagactctga acgtttcaag 1140

cgagcattgg agcttccagc agttaaaaga cacatcactg aattaacaca acgttttgat 1200

ggtcgaaagg taatgcttgg tgttgaccga cttgacatga tcaaaggaat tccgcaaaag 1260

attttggcct ttgaaaagtt tctcgaagaa aaccatgaat ggaatgataa agtggttcta 1320

cttcaaattg ctgtgccgac aagaactgat gtccctgagt atcaaaagct tacaagtcag 1380

gtgcatgaaa ttgttgggcg cataaatggc cgatttggaa cactgactgc tgttcctatt 1440

catcatctgg accgatctct tgatttccat gccttgtgtg ccctttatgc agtcactgat 1500

gtggcccttg taacatcgct gagagatgga atgaatcttg taagctatga atatgttgca 1560

tgccaaggat caaaaaaagg agtgttgata ttgagtgagt ttgctggggc agcacagtct 1620

cttggagccg gtgctatttt agtaaacccc tggaatatta ccgaagtcgc agactcaatc 1680

aagcatgctt tgacaatgtc atctgatgag agagaaaagc gacataggca taactatgct 1740

catgtgacaa ctcacactgc acaagattgg gccgaaactt ttgtatgtga gttaaatgag 1800

acagttgctg aagctcagct gagaacaaga caagttccac ctgatctccc tagtcaagca 1860

gcaattcaac aatatctgca ttccaaaaat cggttgctca tattggggtt caattcaaca 1920

ttgactgagc cagttgaatc ctctgggaga aggggtggtg accaaatcaa ggaaatggag 1980

ctcaagttgc atcctgagtt gaagggccct ttgagagccc tctgtgagga tgagcatact 2040

acagttattg ttcttagtgg aagtgacagg agcgtccttg atgaaaattt cggagaattc 2100

aatatgtggt tagcagcaga gcatggcatg tttttacgtc caactaatgg agagtggatg 2160

acaacaatgc ctgagcatct gaacatggat tgggtagaca gtgtaaagaa tgtttttgaa 2220

tactttacag aaagaacccc aaggtctcat tttgaacacc gtgagacatc atttgtatgg 2280

aattacaagt atgctgatgt tgagtttgga cggctccaag caagagatat gctgcagcac 2340

ttgtggacag gtccaatctc aaatgcagca gtcgatgttg ttcaaggaag ccgatcagtt 2400

gaagttcggt ctgtcggagt tacaaagggt gctgcaattg atcgtattct aggagagata 2460

gttcatagca aaagcatgat tactccaatt gattatgttc tatgcattgg gcacttccta 2520

ggaaaggatg aggacatcta tgtctttttc gatcccgagt acccttctga atcaaaagta 2580

aaaccagata gcagcggctc ggtatctctt gacaggaggc caaatggacg accatcaaac 2640

ggcaggagca attccagaaa ctcgcagtca aggacaccca aggcacaggc tgctccggag 2700

aggtcatcgt catcatcttc atcaagccag ggcaccccaa acagccacca tgactggcgc 2760

gaagggtcct cggtccttga cctcaagggc gagaattatt tctcctgcgc tgttggaagg 2820

aagcggtcca acgcccgcta cctgcttaac tcgtcagagg aggtcgtctc cttcctcaag 2880

gagatggcag atgcaacggc ggctcacaat gggttccagt ccacaactgc ggattacatg 2940

ttcttggata ggcagtag 2958

Claims

1.来源于水稻的海藻糖-6-磷酸合酶基因及其编码的蛋白质在培育耐逆性植物中的应用，所述海藻糖-6-磷酸合酶基因编码下述蛋白质(i)或(ii)：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述海藻糖-6-磷酸合酶基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐逆性提高的转基因植物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述海藻糖-6-磷酸合酶基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：2或其N端缺失3-390个核苷酸残基且具有相同阅读框架的DNA序列；

2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述海藻糖-6-磷酸合酶基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体为pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway^TW系列载体、pCAMBIA系列载体、per8或pX6；所述可在原核生物中复制的载体为pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述出发载体是pH2GW7载体。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用所述海藻糖-6-磷酸合酶基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用所述海藻糖-6-磷酸合酶基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因包括但不限于：可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物和抗化学试剂标记基因。