WO2015039272A1 - 一种棉花海藻糖合成酶tps-2及其编码基因与应用 - Google Patents
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
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- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
Definitions
- the present invention relates to plant proteins and coding genes thereof and applications thereof, and in particular to a cotton-derived trehalose synthase TPS-2 and a gene encoding the same, And its use in cultivating transgenic plants with improved drought tolerance.
- the present inventors cloned a cotton trehalose synthase using a combination of SSH (suppression subtractive hybridization) and RACE (rapid amplification of cDNA ends) (the coding gene designated herein, and the DNA thereof was determined). sequence. It was also found that after introduction into plants, the drought tolerance of transgenic plants was significantly improved, and these traits were stably inherited.
- the first aspect of the present invention provides a gene encoding a trehalose synthase GhTPS-2 of cotton (designated herein as GhTPS-2) having the sequence of SEQ ID NO: 2.
- a second aspect of the invention provides a recombinant expression vector comprising the gene of the first aspect of the invention, and the nucleotide sequence of the gene is operably linked to an expression control sequence of the expression vector; preferably, The vector is -GhTPS-2-2, a vector shown in Figure 2.
- the third aspect of the invention provides a recombinant cell comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention; preferably, the recombinant cell is a recombinant Agrobacterium cell.
- a fourth aspect of the present invention provides a method for improving drought tolerance of a plant, comprising: introducing the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention into a plant or plant tissue and causing the gene Expression;
- the plant is Arabidopsis thaliana.
- a fifth aspect of the invention provides a method for producing a transgenic plant, comprising: cultivating a plant or a plant comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention under conditions effective to produce a plant Tissue;
- the plant is Arabidopsis thaliana.
- a sixth aspect of the present invention provides the gene according to the first aspect of the present invention, the recombinant expression vector of the second aspect of the present invention or the recombinant cell of the third aspect of the present invention for improving drought tolerance of a plant and for use in plant breeding Use;
- the plant is Arabidopsis thaliana.
- the seventh aspect of the present invention provides the gene-encoded protein according to the first aspect of the present invention, which has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.
- BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure I is the construction procedure (a-b) of the plant expression vector pSS-G/zr ⁇ SOO) of GhTPS-2.
- Figure 2 is a plasmid map of the plant expression vector (SSS-G/zr ⁇ SOO) of GhTPS-2.
- FIG 3 shows the results of drought tolerance simulation experiments of T1 transgenic Arabidopsis plants (T1H2) and non-transgenic Arabidopsis plants (CK) as controls.
- T1H2 transgenic Arabidopsis plants
- CK non-transgenic Arabidopsis plants
- FIG. 4 is a graph showing the results of protein expression verification at the transcriptional level of transgenic T1 Arabidopsis plants and non-transgenic control plants.
- M is DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa)
- 1-4 is a non-transgenic Arabidopsis control
- 5-11 is a drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T 1 plant (in order: T 1H1 , T 1H2 , T 1H3 , T1H4 , T 1H5, T1H6, T1H7)
- 12-15 are drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plants.
- a subtractive library was constructed by the method of inhibition subtractive hybridization using the method shown by Clontech's PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit.
- the mRNA of the leaves of the drought-treated cotton seedlings was used as a sample during the experiment, and the mRNA of the leaves of the untreated cotton seedlings was used as a control.
- the specific steps are as follows:
- the above test seedlings were divided into two groups, each with 4 pots and 1 pot per pot.
- the first group was a control group, which was cultured at 25 ° C, photoperiod of 16 hours light / 8 hours dark, and was normally watered.
- the second group was the drought treatment group, cultured at 25 °C, photoperiod of 16 hours light/8 hours darkness, stopped watering, and treated for 10 days. After the treatment, the leaves of the top two groups of the seedlings were cut in time. After the nitrogen was rapidly frozen, it was stored in a -70 ° C refrigerator.
- the cotton leaves of the control and drought-treated groups were each 0.1 g, and the total RNA of cotton leaves was extracted with a plant RNA extraction kit (purchased from Invitrogen).
- the absorbance values of total RNA at 260 nm and 280 nm were measured by HITACHI's UV spectrophotometer U-2001, and the OD 260 /OD 280 ratio was 1.8-2.0, indicating The total RNA was of higher purity; the integrity of total RNA was detected by 1.0% agarose gel electrophoresis, and the brightness of the 28S band was about twice that of the 18S band, indicating good RNA integrity.
- mRNA was isolated using Qiagen's purification of poly A+ RNA from total RNA.
- this experiment simultaneously uses the endonuclease Haelll to tester cDNA according to the above steps.
- the P Driver cDNA was digested and subjected to two forward subtractive hybridizations and two inhibitory PCR amplifications, and finally the second inhibitory PCR products of the two sets of forward subtractive hybridization cDNA fragments were combined.
- the second PCR product of the above combined positive subtractive hybridization cDNA fragment purified using QIAquick PCR Purification Kit, purchased from Qiagen
- pGEM-T Easy kit purchased from Promega
- the specific steps are as follows: The following components are sequentially added to a 200 ⁇ PCR tube: the second inhibitory PCR product of the purified combined positive subtractive hybridization cDNA fragment 3 ⁇ 1, 2 ⁇ 4 DNA ligase buffer 5 ⁇ l of liquid, pGEM-T Easy vector 1 ⁇ l, ⁇ 4 DNA ligase 1 ⁇ l, and ligated overnight at 4 °C.
- SEQ ID No: 3 is the 3 end sequence of the coding gene TPS-2.
- GH-129GSP1 SEQ ID NO: 4:
- CGAGGGAGCCTTTTTCTCAG GH-129GSP2 SEQ ID NO: 5:
- the kit comes with universal primers:
- AAP SEQ ID NO: 7:
- the GGCCACGCGTCGACTAGTAC experimental procedure was performed according to the kit instructions (5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit purchased from Invitrogen).
- GH-129GSP1 (SEQ ID NO: 4;) was used as a reverse transcription primer, reverse transcription was performed using cotton mRNA as a template to obtain a cDNA template, and then Poly C tail was added according to the procedure in the above 5' RACE kit instructions. The tailed product was subjected to the first round of PCR amplification using the primer.
- the primer used was SEQ ID NO: 4 and the universal primer SEQ ID NO: 7 (the kit is self-contained, and I is hypoxanthine modified a, c, g). Or t), the specific steps are as follows:
- PCR reaction system 5 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 each of 2.0 ⁇ 1, and 35 ⁇ 1 of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 ° C, annealing for 45 seconds at 58 ° C, extension of 90 ° at 90 ° C), and extension at 72 ° C for 10 minutes.
- the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water, and 2.0 ⁇ L was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 5 and the universal primer SEQ ID NO: 8.
- the specific steps are as follows:
- PCR reaction system 5 ⁇ 1 10 X Ex Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq, 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8 Each of 2.0 ⁇ l, and 35 ⁇ l of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 ° C, annealing for 45 seconds at 58 ° C, extension of 90 ° C for 90 seconds)), extension at 72 ° C for 10 minutes.
- a strip of approximately 1.5 Kbp in the second PCR product was recovered (Gel Extraction Kit was purchased from OMEGA) and ligated into pGEM-T Easy Vector, then converted to JM109 (specifically the same as above), randomly picked 6 White colonies
- the cells were inoculated in an LB liquid medium containing 50 g/mL ampicillin, cultured at 37 ° C overnight, and glycerin was added to a final concentration of 20% (v/v), and stored at -80 ° C until use.
- the primers SEQ ID NO: 5 and the 3' primer SEQ ID NO: 6 were used for PCR amplification (reaction system and reaction conditions as above), and 6 positive clones were obtained, which were sent to Yingji Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. for sequencing. , obtaining a 5' end sequence of the cDNA of the gene.
- the resulting 5' RACE product clone 02 was sequenced to obtain the sequence of SEQ ID NO: 9:
- GH-12902GSP1 SEQ ID NO: 11 :
- CTGCAGTCAGTGATCCAAATC GH-12902GSP2 SEQ ID NO: 12:
- the AGGATCAAGGGAGGCTGACC experimental procedure was performed according to the kit instructions (5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit purchased from Invitrogen).
- GH-12902GSP1CSEQ ID NO: 11 was used as a reverse transcription primer, and reverse transcription was performed using cotton mRNA as a template to obtain a cDNA template. Then, according to the procedure in the above 5' RACE kit instructions, Poly C tail was added to add tail. The product was subjected to the first round of PCR amplification using the primers of SEQ ID NO: 11 and the universal primer SEQ ID NO: 7 (the kit is self-contained, I is a hypoxanthine modified a, c, g or t) , Specific steps are as follows:
- PCR reaction system 5 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 7 each of 2.0 ⁇ ⁇ , and 35 ⁇ ⁇ of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (94 ° C Denaturation for 45 seconds, annealing at 58 ° C for 45 seconds, elongation at 72 ° C for 90 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
- the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water, and 2.0 ⁇ M was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 12 and the universal primer SEQ ID NO: 8.
- the specific steps are as follows:
- PCR reaction system 5 ⁇ 1 10 X Ex Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 wl Ex Taq, 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 12 and P SEQ ID NO: 8 Each of 2.0 ⁇ l, and 35 ⁇ l of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 ° C, annealing for 45 seconds at 58 ° C, extension of 90 ° at 90 ° C)), extension at 72 ° C for 10 minutes.
- a strip of approximately 1.3 Kbp in the second PCR product (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered and ligated into pGEM-T Easy Vector, then converted to JM109 (specifically the same as above), randomly picked 6 White colonies were inoculated separately in LB liquid medium containing 50 g/mL ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C, glycerol was added to a final concentration of 20% (v/v), and stored at -80 ° C until use.
- the primers SEQ ID NO: 12 and the 3' primer SEQ ID NO: 13 were used for PCR amplification (reaction system and reaction conditions as above), and 6 positive clones were obtained, which were sent to Yingji Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. for sequencing. , obtaining a 5' end sequence of the cDNA of the gene.
- the resulting 5 'RACE product clone 4 was sequenced to obtain the sequence of SEQ ID NO: 14:
- GhTPS-2R SEQ ID NO: 17:
- the GhTPS-2 full-length coding sequence was cloned by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.
- the cotton RNA was extracted, and the cotton cDNA was obtained by using the primer SEQ ID NO: 18 as a reverse transcription primer.
- Stratagene's PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase was used for PCR reaction using cotton cDNA as a template.
- 50 ⁇ ⁇ PCR reaction system 5 ⁇ 1 10 X PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 ⁇ 1 25 mM ⁇ dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 each of 2.0 ⁇ 1, and 37.5 ⁇ l of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 95 °C for 2 minutes, 35 cycles (denaturation at 95 °C for 25 seconds, annealing at 53 °C for 25 seconds, extension at 72 °C for 2 minutes), extension at 72 °C for 5 minutes.
- PCR amplification product plus A tail PCR product hydration to 400 ⁇ 1, first remove the protein with chloroform, add 3 ⁇ sodium acetate solution 40 ⁇ 1, add 2 times absolute ethanol, -20 ° C placed 10 Minutes, centrifugation, supernatant, air dry, dissolved in 21 ⁇ l of double distilled water. Add 2.5 ⁇ l 10 X Ex Buffer, 0.5 ⁇ l 5 mM dATP, 1.0 ⁇ Ex Taq. Reaction conditions: reaction at 70 ° C for 30 minutes.
- a DNA fragment of about 2.8 Kbp was recovered (Omega recovery kit), ligated into pGEM T-easy vector (to obtain GM 3 ⁇ 4-2-pGEM plasmid), and then transformed into JM109, and 6 white colonies were randomly picked and inoculated separately. Incubate in 50 ml/mL ampicillin in LB liquid medium, incubate at 37 °C overnight, add glycerol to a final concentration of 20%, and store at -80 °C until use.
- the primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 were used for PCR amplification (reaction system and reaction conditions as above), and 6 positive clones were obtained and sent to Yingjie Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. for sequencing.
- SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence of the encoded protein is SEQ ID NO: 1
- TPS-2 protein SEQ ID NO: 1
- the plant binary expression vector pCAMBIA2300 (purchased from Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.) was selected as a plant expression vector, and the 35S promoter containing the double enhancer of the ⁇ gene was replaced with the Pnos promoter to reduce the expression of prion protein in plants. .
- the 35S promoter containing the double enhancer and the terminator Tnos were selected as promoters and terminators of the GhTPS-2 gene, respectively.
- Primer SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were used to amplify Pnos using the plant expression vector pBI121 (purchased from Beijing Huaxia Ocean Technology Co., Ltd.) as a template, and TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase was used. 50 ⁇ l ⁇ Reaction system: 10 ⁇ 5 xPS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ ⁇ 121, 1.0 ⁇ PrimeSTAR, 10 ⁇ primer SEQ ID ⁇ : 19 and SEQ ID NO: 20 each 2.0 ⁇ l, and 31 ⁇ Double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), and extension at 72 ° C for 10 minutes.
- the resulting PCR product was digested with EcoRI and Bglll and ligated into pCAMBIA2300 (Promega, T4 ligase cassette) to obtain pCAMBIA2300-1.
- SEQ ID NO: 21 and P SEQ ID NO: 22 Amplification of Tnos using pBI121 as a template, using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
- the resulting PCR product was digested with Kpnl, EcoRI and ligated into pCAMBIA2300-1 (Promega T4 ligase cassette) to obtain pCAMBIA2300-2.
- SEQ ID NO: 21 CGGGG7MCCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
- SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 amplify the Arabidopsis thaliana 35S promoter using the pCAMBIA2300 plasmid as a template.
- PrimeSTAR HS DNA polymerase from TaKaRa was used. 50 ⁇ ⁇ Reaction system: 10 ⁇ 5 xPS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ diluted 50-fold pCAMBIA2300 plasmid, 1.0 ⁇ PrimeSTAR, 10 ⁇ primer SEQ ID NO: 23 and P SEQ ID NO: 24 2.0 11, and 31 ⁇ of double distilled water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 50 ° C for 30 seconds, elongation at 72 ° C for 30 seconds;), extension at 72 ° C for 10 minutes.
- the resulting PCR product was ligated by HindIII and Xbal digestion (connection method is the same as above)
- pCAMBIA2300-2 obtained pCAMBIA2300-3
- SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 amplify GhTPS-2 (template is positive for Example 2)
- GhTPS-2-pGEM plasmid using Straugene's PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 95 °C for 2 minutes, 35 cycles (denaturation at 95 °C for 25 seconds, annealing at 53 °C for 25 seconds, extension at 72 °C for 2 minutes, extension at 72 °C for 5 minutes. Digestion by Xbal, Kpnl The resulting PCR product was ligated (ligation method as above) to pCAMBIA2300-3 to obtain a plant expression vector of 35 SG/z 7 ⁇ -2-2300.
- Example 4. 358-( ⁇ 7 ⁇ -2-2300 expression vector was transformed into Agrobacterium.
- Agrobacterium LBA4404 (purchased from Biovector Science Lab, Inc) Preparation of Competent Cells: Agrobacterium LBA4404 was plated on LB solid medium containing 50 g/ml rifampicin and 50 g/ml streptomycin 1-2 days in advance Single spot inoculation, culture at 28 ° C for 1 to 2 days. Single colonies were picked and inoculated into 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 rifampicin and 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 streptomycin, and cultured overnight (about 12-16 hours) to OD 6 at 28 °C. K) value is 0.4, forming seeds Bacteria.
- Transformation of Agrobacterium The competent cells were thawed on ice, and 1 ⁇ of the positive SSS-G/zJ ⁇ SOO plasmid obtained in Example 3 was added to 40 ⁇ of the competent cells, and the mixture was mixed and ice bathed for about 10 minutes. The mixture of competent cells and plasmid DNA was transferred to an ice-cold electric shock cup with a pipette, and tapped to bring the suspension to the bottom, taking care not to have air bubbles. Place the electric shock cup (purchased from Bio-Rad) on the slide of the electric shock chamber and push the slide to place the electric shock cup on the base electrode of the electric shock chamber.
- Example 5 Transgenic Arabidopsis thaliana was obtained using Agrobacterium-mediated transformation.
- Plants to be transformed Arabidopsis seeds (Columbia type, Arabidopsis thaliana Bioresource Center, Ohio State University) Seeded in peat soil, treated at 4 ° C for 3 days, placed at 23 ° C, 16 hours light Sprouting in an 8 hour dark incubator. After 7-10 days, transplanted into a plastic pot with a diameter of 7.5 cm containing peat and vermiculite (3:1 by volume), 6 plants per pot, placed at 23 ° C, 16 hours light / 8 hours dark Growing in the incubator. Before transplanting, apply 40 ml of nutrient solution for each sputum. After transplanting, the soil moisture should be replenished in time. The nutrient solution is properly watered during the growth period.
- Inflorescence dip dyeing The above Agrobacterium-containing dyeing medium was added to a large-mouth container, and 200-300 mL of the Agrobacterium-containing dyeing medium was added to each container having a diameter of 9 cm for dip dyeing. Invert the plants so that the above ground tissues are all immersed in the Agrobacterium suspension for 3-5 seconds and gently agitate. There should be a liquid film on the plant after infiltration. Dip-infected plants are placed in plastic trays, covered with a clean plastic or cling film to moisturize them, and then placed in low light or dark places for the night, taking care to prevent direct sunlight from shining on the plants. Remove the cover approximately 12-24 hours after processing. The plants are cultured normally, and the plants are further grown for 3-5 weeks until the pods are browned and dried. Harvest the seeds and use the centrifuge tube at 4! Store under dry conditions.
- Transgenic seed screening Prepare a large amount of 1/4 MS (4.695 mM KN0 3 , 0.3125 mM KH 2 P0 4 ,
- PCR reaction conditions Pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 53 ° C for 45 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 7 minutes), PCR-positive plants were performed. No. (T1H1-T1H12), and preserved.
- Example 6 Drought tolerance simulation experiment and functional identification of transgenic Arabidopsis thaliana T1 plants overexpressing GhTPS-2. The sterilized vermiculite was soaked in 1/2 MS medium.
- T1H1-T1H6 and control Arabidopsis seeds were planted on vermiculite, 10 seeds per pot, 25 ° C, 10 hours light culture / 14 hours dark culture cycle, 1/2 MS every 7 days, after 20 days of culture 4 seedlings of uniform size were kept in each pot for drought experiments.
- T1 transgenic plants TO generation seeds of the transgenic plants grown plants
- T1 h Twenty-eight of the six strains of T1H2, T1H3, T1H4, T1H5, and T1H6 (4-5 each) each of the Arabidopsis thaliana survived and continued to grow with obvious drought tolerance (see Figures 3a and 3b, Taking T1H2 as an example, the results of T1H1, T1H3, T1H4, T1H5, T1H6 are similar to T1H2, not shown here).
- Example 7 Verification of protein expression at the transcriptional level.
- RNA extracted by the plant RNA extraction kit was 0.05 g each of the leaves.
- the absorbance values of total RNA at 260 nm and 280 nm were measured by HITACHI's UV spectrophotometer U-2001 to calculate the individual RNA concentrations.
- Reverse transcription (2 g total RNA as a template, reverse transcription primer SEQ ID NO: 18) was carried out according to the method described by Invitrogen reverse transcription assay [J Box Superscript III Reverse Transcriptase].
- the relative expression of TPS-2 protein was detected by amplifying GhTPS-2 by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.
- PCR was performed using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase with reverse transcribed cDNA as a template.
- 50 ⁇ l ⁇ Reaction system 10 ⁇ 5 xPS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ cDNA, 1.0 l PrimeSTAR, 10 ⁇ primer SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 each 2.0 ⁇ 1, and 30 ⁇ Double steamed water.
- PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 minutes, 29 cycles (denaturation at 94 °C for 45 seconds, annealing at 53 °C for 45 seconds, extension at 72 °C for 2 minutes), extension at 72 °C for 10 minutes.
- M is the DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa)
- 1-4 is the non-transgenic Arabidopsis control
- 5-11 is the drought tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plant (in order: T1H1)
- 12-15 are drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plants.
- the size of the electrophoresis band of the PCR product shown in the figure is consistent with the size of GhTPS-2 (approximately 2.8 Kbp).
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Abstract
本发明公开了一种来源于棉花的海藻糖合成酶TPS-2及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。
Description
种棉花海藻糖合成酶 TPS-2及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一种来源于棉花的海藻 糖合成酶 TPS-2及其编码基因， 以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。 背景技术
温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害， 导致作物产 量降低， 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境。 其中干旱对作物产量的影响， 在诸 多自然逆境中占首位， 其危害相当于其它灾害之和， 是许多地区是农业发展的瓶颈。 据 统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积 的 52%， 年受旱面积达 200-270万公顷， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米， 因缺水而 少收粮食 350-400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北， 是我国缺水最 严重的地区， 春旱频繁达到十年九遇。
植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状， 利用常规育种方法改良作物的抗旱性 受到周期长、 优异种质资源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达调控 的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。 目前， 利用干旱胁迫相关基因提高植 物的抗旱能力， 已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研 究方向。
植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应， 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的 危害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过程。 但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂， 许多植物对逆境下的生物化学和生理 学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植 物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基 础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE (cDNA末端快速扩增） 相结合的方 法克隆出了一种棉花海藻糖合成酶 （本文命名为 的编码基因， 并测定了其 DNA
序列。 并且发现将其导入植物过量表达后， 可明显改善转基因植株的耐旱性， 而且这些 性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供棉花的一种海藻糖合成酶 GhTPS-2 的编码基因 （本文命名为 GhTPS-2 ) ， 其序列为 SEQ ID NO: 2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因并且所 述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述载体 为附图 2所示的 - GhTPS-2-2，载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明 第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将本发明第一方面所述的 基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下 培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或 植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达 载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途; 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明 图 I是 GhTPS-2的植物表达载体 pSS-G/zr ^^^SOO)的构建流程 （a-b)。
图 2是 GhTPS-2的植物表达载体 (SSS-G/zr ^^^SOO)的质粒图。
图 3是 T1代转基因拟南芥植株 （T1H2 ) 和作为对照的非转基因拟南芥植 株 （CK) 的耐旱模拟实验结果。 （a为正常生长 20天的拟南芥植株； b为正常生长 20 天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。
图 4是转基因 T 1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验 证结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, TakaRa) , 1-4为非转基因拟南芥对照， 5- 11为耐旱转基因拟南芥 T 1代植株 （依次为： T 1H1、 T 1H2、 T 1H3、 T1H4、 T 1H5、
T1H6、 T1H7), 12-15为不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株。
具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。
下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 在本发明中， 如果没有注明并且在上下文中没有歧义， 比例和百分比是基于重量计 算的。
实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建。
具体方法为：
利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂 交方法构建差减文库。 在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为样本 (Tester),以未处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为对照（Driver)。具体步骤简述如下：
( 1 ) 供试材料：
冀棉 14 (国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-30270 ) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗（光强 2000-3000 Lx ) 条件下培养， 每周浇 1/2MS液体培养基（含 9.39 mM KN03， 0.625 mM KH2P04， 10.3 mM NH4N03, 0.75 mM MgSO4， 1.5 mM CaCl2， 50 μΜ ΚΙ, 100 μΜ Η3ΒΟ3， 100 μΜ MnS04， 30 μΜ ZnS04, 1 μΜ Να2Μο04, 0.1 μΜ CoCl2, 100 μΜ Na2EDTA, 100 μΜ FeS04) 一次。 当苗株培养 1个月左右时用于实验。
( 2) 材料处理：
将上述供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕后及时 剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。
( 3 ) 总 RNA提取：
分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片各 0.1 g， 用植物 RNA提取试剂盒（购自 Invitrogen)提取棉花叶片的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测 定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0， 表明
总 RNA纯度较高； 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮 度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。
( 4 ) 抑制差减杂交：
按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差 减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA，再以 2 Tester cDNA禾 P 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与 过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次差减杂交的产物混 合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交， 然后通过两次抑制性 PCR扩 增差异表达的片段， 使其得到富集。
为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (Unigene) 的有效性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区， 本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤 对 Tester cDNA禾 P Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR扩增， 最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。
( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定
依照 pGEM-T Easy试剂盒 （购自 Promega) 的产品说明书所示方法， 将上述合并的 正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 向 200 μΐ PCR管中依次加入 下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物 3 μ1, 2χΤ4 DNA连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， Τ4 DNA连接酶 1 μ1，于 4°C连接过夜。 取 10 μL连接反应产物， 加入到 100 μL感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA)中并混 匀，冰浴 30分钟、 42°C热休克 60秒、冰浴 2分钟，另加 250 μL LB培养液（含 1% Tryptone 购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药）后置于 37°C摇床中， 以 225转 /分钟振荡培养 30分钟，所得菌液即为差减文库菌液。加甘油至终浓度 20%(V/V)， 于 -80°C保存备用。
取 200 所述差减文库菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素 （购自北京拜尔迪）、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃 半乳糖苷） (X-gal和 IPTG均购自 TAKARA)的 LB (同上）固体培养平板（ 1.5%琼脂，
下同） 上， 37°C培育 18小时。 计数培养板中直径 > l mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随 机挑取 198个白色菌落 (编号： Gh-B001至 Gh-B 198)。 将所有白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基的 96孔细胞培养板 （CORNING) 中， 37°C培养 过夜后加甘油至终浓度 20%， 于 -80°C保存备用。 以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增验 证， 得到 190个阳性克隆， 然后将所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测 序。
( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：
将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 135 条 EST (Unigene) o经分析有 21个重叠群，有 114个单一的序列。经 BlastN发现其中 48条 EST (Unigene) 在 GenBank中有同源序列， 32条 EST功能未知或者为假定蛋白， 另有 34 条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 '或 5 '末端非翻译区的较短序列。 实施例 2、 棉花海藻糖合成酶编码基因 GhTPS-2的克隆。
克隆子 Gh-B 129去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列的 编码的蛋白质属于海藻糖合成酶， 本文将克隆子 GH-129 对应的全长编码基因命名为 GhTPS-2, 其对应的蛋白命名为 7¾^。
SEQ ID No : 3
1 ATGACAACCA TGCCAGAACA CTTGAACATG GAATGGGTTG ATAGTCTGAA GCATGTTTTT
61 GAGTATTTCA CTGAAAGAAC ACCAAGATCA GAGTTTGAGA TCCGCACTAC ATCGCTCCTA
121 TGGAATTACA AGTATGCAGA TGTTGAATTT GGAAGACTTC AGGCTAGAGA TATGCTGCAG
181 CATCTCTGGA CCGGCCCAAT TTCTAATGCA TCTGTTGATG TTGTTCAAGG GAGTCGATCG
241 GTTGAGGTTA GACCTGTTGG TGTTACAAAG GGGGCAGCTA TTGATCGTAT TTTAGGAGAA
301 ATAGTTCACA ACAAGTCGAT GACAACACCA ATTGATTGTG TCCTTTGTGT TGGACATTTC
361 CTGGGGAAGG ATGAAGATGT TTATACATTT TTTGAGCCAG AGCTGCCTTC TGATGCAAAT
421 ATGGCAAAAT GCAAGCCAAT CGATGCACCA AAGTTACCTA CTGAGAAAAA GGCTCCCTCG
481 AAGCTTCCAG CAACCAAAAG TGGGCCAAAA TCATCACAAA CAAAGACACC CAAGGCATCC
541 CCGGGTCCTG ATAAAAGAAC TGTCAATAAC CATAGCAGTG GGAGCTCCCG GCGTGCATCA
601 CCTGAAAAGG TAAAGGAGAA GGAAAAGATG GCCTGGAGCG TGCTTGATCT CAAAGGAGAT
661 AACTACTTCT CCTGTGCTGT CGGACGGAAG CGTACATCTG CTCGATATTT ACTTGGTTCA
721 TCAGATGATG TTGTCTCGTT CCTGAGCAGA CTAGCAAAAG GCACTTGA
TPS-2全长编码基因的克隆
根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列分析： SEQ ID No : 3为编码基因 TPS-2的 3 端序列。
根据已经获得的 SEQ ID NO : 3序列， 设计如下三条特异性引物， 作为反转录引
物及 5 'RACE的特异性引物。
GH-129GSP1 : SEQ ID NO: 4：
CGAGGGAGCCTTTTTCTCAG GH-129GSP2: SEQ ID NO: 5：
CGATTGGCTTGCATTTTGCC GH-129GSP3 : SEQ ID NO:6:
ATGACAACCATGCCAGAACA
试剂盒自带通用引物：
AAP: SEQ ID NO: 7：
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG AUAP: SEQ ID NO: 8：
GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。
以 GH-129GSP1 (SEQ ID NO: 4；)为反转录引物， 以棉花 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾， 以加尾后 的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：
50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录 的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 45秒， 58°C退火 45秒， 72°C延伸 90秒）， 72°C延伸 10分钟。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 l PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物， 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 8 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 45秒， 58°C退火 45秒， 72°C延伸 90秒））， 72°C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR 产物中约为 1.5 Kbp大小的条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA), 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然后转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 6个白色菌落分别
接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终 浓度 20% (v/v), -80°C保存备用。 用引物 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行 菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。
所得的 5'RACE产物克隆子 02测序获得序列为 SEQ ID NO: 9：
1 GGGGGGGGGG GAGGATCAAG GGAGGCTGAC CCGTGTTGCT GCGTTTCCTA TTGGGATAGA 61 CTCTCTACCG TTCCAAAACG CACTTCTGGT TCCTCAGGTC CAGGAACACA TCAAAGAATT 121 GAAAGAAAGG TTTTCTGGCC GAAAGGTAAT GCTTGGTGTT GATCGTCTTG ATATGATTAA 181 AGGAATTCCC CAAAAGATAC TGGCATTTGA AAAGTTCCTT GAGGAAAATC CTAACTGGCG 241 TGATAAAGTG GTTTTGCTTC AAATTGCAGT GCCAACAAGA ACTGATGTTC CTGAATACCA 301 GAAACTTACA AGCCAAGTTC ATGAAATTGT TGGGCGAATT AATGGTCGAT TTGGATCACT 361 GACTGCAGTA CCAATACATC ACCTGGATCG TTCACTTGAC TTTCACGCAC TATGTGCATT 421 ATATGCTGTT ACCGATGTAG CACTTGTCAC ATCTTTAAGG GATGGCATGA ACCTTGTCAG 481 TTATGAGTTT GTTGCTTGCC AAGAAGCAAA GAAAGGGGTC CTCATTCTCA GTGAATTTGC 541 TGGTGCTGCA CAATCTCTGG GTGCTGGAGC AATTCTAGTA AATCCTTGGA ATATCACTGA 601 AGTGGCTGCT TCTATTGCCC AGGCTTTGAA CATGTCGGCT GAAGAAAGGG AGAAGCGACA 661 TCAACAGAAT TTCCATCATG TGACAAAGCA TACTGCTCAA GAATGGGCTG AAATGTTTGT 721 AAGTGAACTG AACGATACCG TTGTTGAAGC ACAGCTAAGG ACAAGCAAAG AGCCTCCTGA 781 GCTTCCACAG AATGATGCAG TGGAACGTTA CTTGCGGTCT GGCAATAGAT TATTGATACT 841 GGGTTTTAAT TCAACATTAA CCGAACCTGT GGATACTTCT GGGAATAGAA GTGATCAAAT 901 CAGAGAAAAG AATCCTAATT TGCACCCGGA ATTAAAAGAA CACTTAACAG CTCTCTGTAA 961 TGATAAAAAG ACAACTATAG TTGTCCTTAG TGGGAGCAAA AGTGAAGTCT TGGATAAGAA 1021 CTTTGCGGAG TATGATATGT GGTTGGCGGC AGAAAATGGG ATGTTTCTAC GCCATACAAA 1081 GGGTGACTGG ATGACAACCA TGCCAGAACA CTTGAACATG GAATGGGTTG ATAGTCTGAA 1141 GCATGTTTTT GAGTATTTCA CTGAAAGAAC ACCAAGATCA GAGTTTGAGA TCCGCACTAC 1201 ATCGCTCCTA TGGAATTACA AGTATGCAGA TGTTGAATTT GGAAGACTTC AGGCTAGAGA 1261 TATGCTGCAG CATCTCTGGA CCGGCCCAAT TTCTAATGCA TCTGTTGATG TTGTTCAAGG 1321 GAGTCGATCG GTTGAGGTTA GACCTGTTGG TGTTACAAAG GGGGCAGCTA TTGATCGTAT 1381 TTTAGGAGAA ATAGTTCACA ACAAGTCGAT GACAACACCA ATTGATTGTG TCCTTTGTGT 1441 TGGACATTTC CTGGGGAAGG ATGAAGATGT TTATACATTT TTTGAGCCAG AGCTGCCTTC 1501 TGATGCAAAT ATGGCAAAAT GCAAGCCAAT CG 将 5'RACE获得的序列 SEQ ID NO: 9， 与获得的序列 SEQ ID NO: 3拼接， 获得 SEQ ID NO: 10:
1 GGGGGGGGGG GAGGATCAAG GGAGGCTGAC CCGTGTTGCT GCGTTTCCTA TTGGGATAGA
61 CTCTCTACCG TTCCAAAACG CACTTCTGGT TCCTCAGGTC CAGGAACACA TCAAAGAATT
121 GAAAGAAAGG TTTTCTGGCC GAAAGGTAAT GCTTGGTGTT GATCGTCTTG ATATGATTAA
181 AGGAATTCCC CAAAAGATAC TGGCATTTGA AAAGTTCCTT GAGGAAAATC CTAACTGGCG
241 TGATAAAGTG GTTTTGCTTC AAATTGCAGT GCCAACAAGA ACTGATGTTC CTGAATACCA
301 GAAACTTACA AGCCAAGTTC ATGAAATTGT TGGGCGAATT AATGGTCGAT TTGGATCACT
361 GACTGCAGTA CCAATACATC ACCTGGATCG TTCACTTGAC TTTCACGCAC TATGTGCATT
421 ATATGCTGTT ACCGATGTAG CACTTGTCAC ATCTTTAAGG GATGGCATGA ACCTTGTCAG
481 TTATGAGTTT GTTGCTTGCC AAGAAGCAAA GAAAGGGGTC CTCATTCTCA GTGAATTTGC
541 TGGTGCTGCA CAATCTCTGG GTGCTGGAGC AATTCTAGTA AATCCTTGGA ATATCACTGA
601 AGTGGCTGCT TCTATTGCCC AGGCTTTGAA CATGTCGGCT GAAGAAAGGG AGAAGCGACA
661 TCAACAGAAT TTCCATCATG TGACAAAGCA TACTGCTCAA GAATGGGCTG AAATGTTTGT
721 AAGTGAACTG AACGATACCG TTGTTGAAGC ACAGCTAAGG ACAAGCAAAG AGCCTCCTGA 781 GCTTCCACAG AATGATGCAG TGGAACGTTA CTTGCGGTCT GGCAATAGAT TATTGATACT 841 GGGTTTTAAT TCAACATTAA CCGAACCTGT GGATACTTCT GGGAATAGAA GTGATCAAAT 901 CAGAGAAAAG AATCCTAATT TGCACCCGGA ATTAAAAGAA CACTTAACAG CTCTCTGTAA 961 TGATAAAAAG ACAACTATAG TTGTCCTTAG TGGGAGCAAA AGTGAAGTCT TGGATAAGAA 1021 CTTTGCGGAG TATGATATGT GGTTGGCGGC AGAAAATGGG ATGTTTCTAC GCCATACAAA 1081 GGGTGACTGG ATGACAACCA TGCCAGAACA CTTGAACATG GAATGGGTTG ATAGTCTGAA 1141 GCATGTTTTT GAGTATTTCA CTGAAAGAAC ACCAAGATCA GAGTTTGAGA TCCGCACTAC 1201 ATCGCTCCTA TGGAATTACA AGTATGCAGA TGTTGAATTT GGAAGACTTC AGGCTAGAGA 1261 TATGCTGCAG CATCTCTGGA CCGGCCCAAT TTCTAATGCA TCTGTTGATG TTGTTCAAGG 1321 GAGTCGATCG GTTGAGGTTA GACCTGTTGG TGTTACAAAG GGGGCAGCTA TTGATCGTAT 1381 TTTAGGAGAA ATAGTTCACA ACAAGTCGAT GACAACACCA ATTGATTGTG TCCTTTGTGT 1441 TGGACATTTC CTGGGGAAGG ATGAAGATGT TTATACATTT TTTGAGCCAG AGCTGCCTTC 1501 TGATGCAAAT ATGGCAAAAT GCAAGCCAAT CGATGCACCA AAGTTACCTA CTGAGAAAAA 1561 GGCTCCCTCG AAGCTTCCAG CAACCAAAAG TGGGCCAAAA TCATCACAAA CAAAGACACC 1621 CAAGGCATCC CCGGGTCCTG ATAAAAGAAC TGTCAATAAC CATAGCAGTG GGAGCTCCCG 1681 GCGTGCATCA CCTGAAAAGG TAAAGGAGAA GGAAAAGATG GCCTGGAGCG TGCTTGATCT 1741 CAAAGGAGAT AACTACTTCT CCTGTGCTGT CGGACGGAAG CGTACATCTG CTCGATATTT 1801 ACTTGGTTCA TCAGATGATG TTGTCTCGTT CCTGAGCAGA CTAGCAAAAG GCACTTGA 根据 SEQ ID NO: 10序列检索分析， SEQ ID NO: 10不是 GhTPS-2的全长序列。 需进一步进行 5 ' RACE, 从而获取基因全长。 根据 SEQ ID NO: 10序列， 设计如下 三条特异性引物， 作为反转录引物及 5 ' RACE的特异性引物。
GH-12902GSP1 : SEQ ID NO: 11 :
CTGCAGTCAGTGATCCAAATC GH-12902GSP2: SEQ ID NO: 12：
CAACAATTTCATGAACTTGGC GH-12902GSP3 : SEQ ID NO: 13：
AGGATCAAGGGAGGCTGACC 实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。
以 GH-12902GSP1CSEQ ID NO: 11)为反转录引物，以棉花 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾， 以加尾后 的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 11与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：
50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录 的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 7各 2.0 μ ΐ，以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件：94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C
变性 45秒， 58°C退火 45秒， 72°C延伸 90秒）， 72°C延伸 10分钟。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 12与 通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物， 1.0 w l Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 8 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 45秒， 58°C退火 45秒， 72°C延伸 90秒））， 72°C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR 产物中约为 1.3 Kbp大小的条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA) , 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然后转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 6个白色菌落分别 接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终 浓度 20% (v/v)， -80°C保存备用。 用引物 SEQ ID NO: 12与 3'端引物 SEQ ID NO: 13进 行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆， 送英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。 所得的 5 'RACE产物克隆子 4测序获得序列为 SEQ ID NO: 14：
1 GGGGGGGGGG ATGCCTGGAA ACAAGTACAA CGGTAATTCG CCGCATATAC CAACTCGCAC 61 GGAACGCCTT TTGCGTGATA GAGAGCTAAG GGAGCAAAGG AAAAGCAACA GAACTTCCCA 121 TTTAGATGAA GTGATTGATA TTCGTAAGGG GGCTGAAGTA TCTGAAAATG GACCACGTTT 181 TAGAGAAGCT GACAACTCTA AGGCTGATTT TGTTGAAAAA TACTTGGAAG ACGCTGCAGT 241 TGCAAGGGCA CTGACTGAGG GATGCGAAAG ACAAGATGGA AGGCCTTTTA GGCAACGACT 301 GTTGGTAGTG GCCAATAGGC TTCCTGTTTC TGCCGTGAGG AGAGGTGAAG ATTCATGGTC 361 ACTGGAAATA AGTGCTGGAG GTCTTGTAAC TGCTCTCTTG GGTGTCAAGG AGTTTGAAAC 421 AAGGTGGATT GGATGGGCTG GTGTGAATGT TCCGGATGAG ATTGGACAGA AGGCACTTAC 481 TAAAGCTTTA GCTGAAAAGT GGTGTATCCC AGTATTCCTT GATGAAGAGA TTGTTCATCA 541 GTACTACAAT GGTTATTGCA ATAATATATT GTGGCCTCTA TTTCACTACC TTGGACTTCC 601 ACAAGAAGAC CGCCTTGCTA CTACAAGAAG TTTCCAGTCC CAGTTTGCTG CATACAAGAA 661 AGCCAATCAA ATGTTTGCTG ATGTCGTAAA TATGCACTAT GAAGAGGGGG ATGTTGTCTG 721 GTGCGATGAT TACCACCTAA TGTATCTTCC CGAATGCCTG AAGAACCATA ACAATAATAT 781 GAAAGTTGGT TGGTTTCTAC ATACACCATT CCCTTCTTCT GAAATTCATA GGACACTGCC 841 ATCCAGATCT GAGCTTTTGC GTTCAGTTCT TGCTGCTGAC TTGGTTGGTT TTCATACCTA 901 TGACTATGCC AGACATTTTG TTAGTGCCTG TACTCGAATT CTTGGAATTG AGGGGACACC 961 TGAAGGAGTT GAGGATCAAG GGAGGCTGAC CCGTGTTGCT GCGTTTCCTA TTGGGATAGA 1021 CTCTCTACCG TTCCAAAACG CACTTCTGGT TCCTCAGGTC CAGGAACACA TCAAAGAATT 1081 GAAAGAAAGG TTTTCTGGCC GAAAGGTAAT GCTTGGTGTT GATCGTCTTG ATATGATTAA 1141 AGGAATTCCC CAAAAGATAC TGGCATTTGA AAAGTTCCTT GAGGAAAATC CTAACTGGCG 1201 TGATAAAGTG GTTTTGCTTC AAATTGCAGT GCCAACAAGA ACTGATGTTC CTGAATACCA 1261 GAAACTTACA AGCCAAGTTC ATGAAATTGT TG 将第 2轮 5 'RACE获得的序列 SEQ ID NO : 14， 与拼接序列 SEQ ID NO : 10拼接， 获得 SEQ ID NO: 15 :
1 GGGGGGGGGG ATGCCTGGAA ACAAGTACAA CGGTAATTCG CCGCATATAC CAACTCGCAC 61 GGAACGCCTT TTGCGTGATA GAGAGCTAAG GGAGCAAAGG AAAAGCAACA GAACTTCCCA 121 TTTAGATGAA GTGATTGATA TTCGTAAGGG GGCTGAAGTA TCTGAAAATG GACCACGTTT 181 TAGAGAAGCT GACAACTCTA AGGCTGATTT TGTTGAAAAA TACTTGGAAG ACGCTGCAGT 241 TGCAAGGGCA CTGACTGAGG GATGCGAAAG ACAAGATGGA AGGCCTTTTA GGCAACGACT 301 GTTGGTAGTG GCCAATAGGC TTCCTGTTTC TGCCGTGAGG AGAGGTGAAG ATTCATGGTC 361 ACTGGAAATA AGTGCTGGAG GTCTTGTAAC TGCTCTCTTG GGTGTCAAGG AGTTTGAAAC 421 AAGGTGGATT GGATGGGCTG GTGTGAATGT TCCGGATGAG ATTGGACAGA AGGCACTTAC 481 TAAAGCTTTA GCTGAAAAGT GGTGTATCCC AGTATTCCTT GATGAAGAGA TTGTTCATCA 541 GTACTACAAT GGTTATTGCA ATAATATATT GTGGCCTCTA TTTCACTACC TTGGACTTCC 601 ACAAGAAGAC CGCCTTGCTA CTACAAGAAG TTTCCAGTCC CAGTTTGCTG CATACAAGAA 661 AGCCAATCAA ATGTTTGCTG ATGTCGTAAA TATGCACTAT GAAGAGGGGG ATGTTGTCTG 721 GTGCGATGAT TACCACCTAA TGTATCTTCC CGAATGCCTG AAGAACCATA ACAATAATAT 781 GAAAGTTGGT TGGTTTCTAC ATACACCATT CCCTTCTTCT GAAATTCATA GGACACTGCC 841 ATCCAGATCT GAGCTTTTGC GTTCAGTTCT TGCTGCTGAC TTGGTTGGTT TTCATACCTA 901 TGACTATGCC AGACATTTTG TTAGTGCCTG TACTCGAATT CTTGGAATTG AGGGGACACC 961 TGAAGGAGTT GAGGATCAAG GGAGGCTGAC CCGTGTTGCT GCGTTTCCTA TTGGGATAGA 1021 CTCTCTACCG TTCCAAAACG CACTTCTGGT TCCTCAGGTC CAGGAACACA TCAAAGAATT 1081 GAAAGAAAGG TTTTCTGGCC GAAAGGTAAT GCTTGGTGTT GATCGTCTTG ATATGATTAA 1141 AGGAATTCCC CAAAAGATAC TGGCATTTGA AAAGTTCCTT GAGGAAAATC CTAACTGGCG 1201 TGATAAAGTG GTTTTGCTTC AAATTGCAGT GCCAACAAGA ACTGATGTTC CTGAATACCA 1261 GAAACTTACA AGCCAAGTTC ATGAAATTGT TGGGCGAATT AATGGTCGAT TTGGATCACT 1321 GACTGCAGTA CCAATACATC ACCTGGATCG TTCACTTGAC TTTCACGCAC TATGTGCATT 1381 ATATGCTGTT ACCGATGTAG CACTTGTCAC ATCTTTAAGG GATGGCATGA ACCTTGTCAG 1441 TTATGAGTTT GTTGCTTGCC AAGAAGCAAA GAAAGGGGTC CTCATTCTCA GTGAATTTGC 1501 TGGTGCTGCA CAATCTCTGG GTGCTGGAGC AATTCTAGTA AATCCTTGGA ATATCACTGA 1561 AGTGGCTGCT TCTATTGCCC AGGCTTTGAA CATGTCGGCT GAAGAAAGGG AGAAGCGACA 1621 TCAACAGAAT TTCCATCATG TGACAAAGCA TACTGCTCAA GAATGGGCTG AAATGTTTGT 1681 AAGTGAACTG AACGATACCG TTGTTGAAGC ACAGCTAAGG ACAAGCAAAG AGCCTCCTGA 1741 GCTTCCACAG AATGATGCAG TGGAACGTTA CTTGCGGTCT GGCAATAGAT TATTGATACT 1801 GGGTTTTAAT TCAACATTAA CCGAACCTGT GGATACTTCT GGGAATAGAA GTGATCAAAT 1861 CAGAGAAAAG AATCCTAATT TGCACCCGGA ATTAAAAGAA CACTTAACAG CTCTCTGTAA 1921 TGATAAAAAG ACAACTATAG TTGTCCTTAG TGGGAGCAAA AGTGAAGTCT TGGATAAGAA 1981 CTTTGCGGAG TATGATATGT GGTTGGCGGC AGAAAATGGG ATGTTTCTAC GCCATACAAA 2041 GGGTGACTGG ATGACAACCA TGCCAGAACA CTTGAACATG GAATGGGTTG ATAGTCTGAA 2101 GCATGTTTTT GAGTATTTCA CTGAAAGAAC ACCAAGATCA GAGTTTGAGA TCCGCACTAC 2161 ATCGCTCCTA TGGAATTACA AGTATGCAGA TGTTGAATTT GGAAGACTTC AGGCTAGAGA 2221 TATGCTGCAG CATCTCTGGA CCGGCCCAAT TTCTAATGCA TCTGTTGATG TTGTTCAAGG 2281 GAGTCGATCG GTTGAGGTTA GACCTGTTGG TGTTACAAAG GGGGCAGCTA TTGATCGTAT 2341 TTTAGGAGAA ATAGTTCACA ACAAGTCGAT GACAACACCA ATTGATTGTG TCCTTTGTGT 2401 TGGACATTTC CTGGGGAAGG ATGAAGATGT TTATACATTT TTTGAGCCAG AGCTGCCTTC 2461 TGATGCAAAT ATGGCAAAAT GCAAGCCAAT CGATGCACCA AAGTTACCTA CTGAGAAAAA 2521 GGCTCCCTCG AAGCTTCCAG CAACCAAAAG TGGGCCAAAA TCATCACAAA CAAAGACACC 2581 CAAGGCATCC CCGGGTCCTG ATAAAAGAAC TGTCAATAAC CATAGCAGTG GGAGCTCCCG 2641 GCGTGCATCA CCTGAAAAGG TAAAGGAGAA GGAAAAGATG GCCTGGAGCG TGCTTGATCT 2701 CAAAGGAGAT AACTACTTCT CCTGTGCTGT CGGACGGAAG CGTACATCTG CTCGATATTT 2761 ACTTGGTTCA TCAGATGATG TTGTCTCGTT CCTGAGCAGA CTAGCAAAAG GCACTTGA 根据 SEQ ID NO: 15序列检索分析， SEQ ID NO: 15为 GhTPS-2的全长序列。 根 据 SEQ ID NO: 15序列设计一对引物如下：
GhTPS-2¥: SEQ ID NO: 16：
ATGCCTGGAAACAAGTACAAC
GhTPS-2R: SEQ ID NO: 17：
TCAAGTGCCT TTTGCTAGTC AP : SEQ ID NO: 18：
GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17来克隆 GhTPS-2全长编码序列。
提取棉花 RNA， 以引物 SEQ ID NO: 18为反转录引物， 获取棉花 cDNA。 采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ ΐ PCR反应体系：5 μ 1 10 X PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μ 1 25 mM ^ dNTP, 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ 1， 以及 37.5 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预 变性 2分钟， 35个循环 （95 °C变性 25秒， 53 °C退火 25秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C 延伸 5分钟。
PCR扩增产物加 A尾： PCR产物补水至 400 μ 1， 先用氯仿抽一遍去除蛋白， 吸 取上清加入 3Μ 醋酸钠溶液 40 μ 1， 加 2倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟， 离心， 去上清，晾干，用 21 μ 1双蒸水溶解。加入 2.5 μ 1 10 X Ex Buffer, 0.5 μ 1 5 mM的 dATP ， 1.0 μΐ Ex Taq。反应条件：70°C反应 30分钟。将得到约 2.8Kbp的 DNA片段回收（Omega 回收试剂盒） ， 连接至 pGEM T-easy载体上 （得到 GM ¾-2-pGEM质粒） ， 然后转化 JM109, 随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养 基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 16与 SEQ ID NO: 17进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 6个阳 性克隆， 送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的 蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1
TPS-2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1
1 PGNKYNGNS PHI PTRTERL LRDRELREQR KSNRTSHLDE VIDIRKGAEV SENGPRFREG
61 DNSKADFVEK YLEDAAVARA LTEGCERQDG RPFRQRLLW ANRLPVSAVR RGEDSWSLEI 121 SAGGLVTALL GVKEFETRWI GWAGVNVPDE IGQKALTKAL AEKWCI PVFL DEEIVHQYYN
181 GYCNNILWPL FHYLGLPQED RLATTRSFQS QFAAYKKANQ FADWN HY EEGDWWCHD
241 YHL YLPECL K HNNN KVG WFLHTPFPSS EIHRTLPSRS ELLRSVLAAD LVGFHTYDYA
301 RHFVSACTRI LGIEGTPEGV EDQGRLTRVA AFPIGIDSLR FQNALLVPQV QEHIKELKER
361 FSGRKV LGV DRLD IKGI P QKILAFEKFL EENPNWRDKV VLLQIAVPTR TDVPEYQKLT 421 SQVHEIVGRI NGRFGSLTAV PIHHLDRSLD FHALCALYAV TDVALVTSLR DG NLVSYEF
481 VACQEAKKGV LILSEFAGAA QSLGAGAILV NPWNITEVAA S IAQALNMSA EEREKRHQHN
541 FHHVTKHTAQ EWAE FVSEL NDTWEAQLR TSKEPPELPQ NDAVERYLRS GNRLLILGFN
601 STLTEPVDTS GNRSDQIREK NPNLHPELKE HLTALCNDKK TTIWLSGSK SEVLDK FAE
661 YD WLAAENG FLRHTKGDW TT PEHLN EWVDSLKHVF EYFTERTPRS EFEIRTTSLV
721 WNYKYADVEF GRLQARDMLQ HLWTGPISNA SVDWQGSRS VEVRPVGVTK GAAIDRILGE
781 IVHNKS TTP IDCVLCVGHF LGKDEDVYTF FEPELPSDAN MAKCKPIDAP KLPTEKKAPS
841 KLPATKSGPK SSQTKTPKPS PAPDKRTVNN HSSGSSRRAS PEKVKEKEK AWSVLDLKGD
901 NYFSCAVGRK RTSARYLLGS SDDWSFLSR LAKGT
编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2
1 ATGCCTGGAA ACAAGTACAA CGGTAATTCG CCGCATATAC CAACTCGCAC GGAACGCCTT
61 TTGCGTGATA GAGAGCTAAG GGAGCAAAGG AAAAGCAACA GAACTTCCCA TTTAGATGAA
121 GTGATTGATA TTCGTAAGGG GGCTGAAGTA TCTGAAAATG GACCACGTTT TAGAGAAGGT
181 GACAACTCTA AGGCTGATTT TGTTGAAAAA TACTTGGAAG ACGCTGCAGT TGCAAGGGCA
241 CTGACTGAGG GATGCGAAAG ACAAGATGGA AGGCCTTTTA GGCAACGACT GTTGGTAGTG
301 GCCAATAGGC TTCCTGTTTC TGCCGTGAGG AGAGGTGAAG ATTCATGGTC ACTGGAAATA
361 AGTGCTGGAG GTCTTGTAAC TGCTCTCTTG GGTGTCAAGG AGTTTGAAAC AAGGTGGATT
421 GGATGGGCTG GTGTGAATGT TCCGGATGAG ATTGGACAGA AGGCACTTAC TAAAGCTTTA
481 GCTGAAAAGT GGTGTATCCC AGTATTCCTT GATGAAGAGA TTGTTCATCA GTACTACAAT
541 GGTTATTGCA ATAATATATT GTGGCCTCTA TTTCACTACC TTGGACTTCC ACAAGAAGAC
601 CGCCTTGCTA CTACAAGAAG TTTCCAGTCC CAGTTTGCTG CATACAAGAA AGCCAATCAA
661 ATGTTTGCTG ATGTCGTAAA TATGCACTAT GAAGAGGGGG ATGTTGTCTG GTGCCATGAT
721 TACCACCTAA TGTATCTTCC CGAATGCCTG AAGAACCATA ACAATAATAT GAAAGTTGGT
781 TGGTTTCTAC ATACACCATT CCCTTCTTCT GAAATTCATA GGACACTGCC ATCCAGATCT
841 GAGCTTTTGC GTTCAGTTCT TGCTGCTGAC TTGGTTGGTT TTCATACCTA TGACTATGCC
901 AGACATTTTG TTAGTGCCTG TACTCGAATT CTTGGAATTG AGGGGACACC TGAAGGAGTT
961 GAGGATCAAG GGAGGCTGAC CCGTGTTGCT GCGTTTCCTA TTGGGATAGA CTCTCTACGG
1021 TTCCAAAACG CACTTCTGGT TCCTCAGGTC CAGGAACACA TCAAAGAATT GAAAGAAAGG
1081 TTTTCTGGCC GAAAGGTAAT GCTTGGTGTT GATCGTCTTG ATATGATTAA AGGAATTCCC
1141 CAAAAGATAC TGGCATTTGA AAAGTTCCTT GAGGAAAATC CTAACTGGCG TGATAAAGTG
1201 GTTTTGCTTC AAATTGCAGT GCCAACAAGA ACTGATGTTC CTGAATACCA GAAACTTACA
1261 AGCCAAGTTC ATGAAATTGT TGGGCGAATT AATGGTCGAT TTGGATCACT GACTGCAGTA
1321 CCAATACATC ACCTGGATCG TTCACTTGAC TTTCACGCAC TATGTGCATT ATATGCTGTT
1381 ACCGATGTAG CACTTGTCAC ATCTTTAAGG GATGGCATGA ACCTTGTCAG TTATGAGTTT
1441 GTTGCTTGCC AAGAAGCAAA GAAAGGGGTC CTCATTCTCA GTGAATTTGC TGGTGCTGCA
1501 CAATCTCTGG GTGCTGGAGC AATTCTAGTA AATCCTTGGA ATATCACTGA AGTGGCTGCT
1561 TCTATTGCCC AGGCTTTGAA CATGTCGGCT GAAGAAAGGG AGAAGCGACA TCAACACAAT
1621 TTCCATCATG TGACAAAGCA TACTGCTCAA GAATGGGCTG AAATGTTTGT AAGTGAACTG
1681 AACGATACCG TTGTTGAAGC ACAGCTAAGG ACAAGCAAAG AGCCTCCTGA GCTTCCACAG
1741 AATGATGCAG TGGAACGTTA CTTGCGGTCT GGCAATAGAT TATTGATACT GGGTTTTAAT
1801 TCAACATTAA CCGAACCTGT GGATACTTCT GGGAATAGAA GTGATCAAAT CAGAGAAAAG
1861 AATCCTAATT TGCACCCGGA ATTAAAAGAA CACTTAACAG CTCTCTGTAA TGATAAAAAG
1921 ACAACTATAG TTGTCCTTAG TGGGAGCAAA AGTGAAGTCT TGGATAAGAA CTTTGCGGAG
1981 TATGATATGT GGTTGGCCGC AGAAAATGGG ATGTTTCTAC GCCATACAAA GGGTGACTGG
2041 ATGACAACCA TGCCAGAACA CTTGAACATG GAATGGGTTG ATAGTCTGAA GCATGTTTTT
2101 GAGTATTTCA CTGAAAGAAC ACCAAGATCA GAGTTTGAGA TCCGCACTAC ATCGCTCGTA
2161 TGGAATTACA AGTATGCAGA TGTTGAATTT GGAAGACTTC AGGCTAGAGA TATGCTGCAG
2221 CATCTCTGGA CCGGCCCAAT TTCTAATGCA TCTGTTGATG TTGTTCAAGG GAGTCGATCG
2281 GTTGAGGTTA GACCTGTTGG TGTTACAAAG GGGGCAGCTA TTGATCGTAT TTTAGGAGAA 2341 ATAGTTCACA ACAAGTCGAT GACAACACCA ATTGATTGTG TCCTTTGTGT TGGACATTTC 2401 CTGGGGAAGG ATGAAGATGT TTATACATTT TTTGAGCCAG AGCTGCCTTC TGATGCAAAT 2461 ATGGCAAAAT GCAAGCCAAT CGATGCACCA AAGTTACCTA CTGAGAAAAA GGCTCCCTCG 2521 AAGCTTCCAG CAACCAAAAG TGGGCCAAAA TCATCACAAA CAAAGACACC CAAGCCATCC 2581 CCGGCTCCTG ATAAAAGAAC TGTCAATAAC CATAGCAGTG GGAGCTCCCG GCGTGCATCA 2641 CCTGAAAAGG TAAAGGAGAA GGAAAAGATG GCCTGGAGCG TGCTTGATCT CAAAGGAGAT 2701 AACTACTTCT CCTGTGCTGT CGGACGGAAG CGTACATCTG CTCGATATTT ACTTGGTTCA 2761 TCAGATGATG TTGTCTCGTT CCTGAGCAGA CTAGCAAAAG GCACTTGA 实施例 3、 GTirPS-2基因植物表达载体构建。
选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择含双增强子的 35S启动子及终止子 Tnos分别作为 GhTPS-2基因的启动子和终止子。
用引物 SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO:20以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏 远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ ρΒΙ121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID ΝΟ: 19和 SEQ ID NO: 20各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 56°C退火 30 秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物 连接到 pCAMBIA2300 (Promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。
SEQ ID NO: 19 ：
GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO:20 :
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
SEQ ID NO: 21禾 P SEQ ID NO: 22以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 21禾 P SEQ ID NO: 22各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94°C 变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI 酶切后将所得 PCR 产物连接到 pCAMBIA2300-l (Promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO: 21：
CGGGG7MCCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
SEQ ID NO: 22：
TCKGAA rrCCC AGTGAATTCCCGATCT AGT A
SEQ ID NO: 23和 SEQ ID NO: 24以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增拟南芥 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΙ ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:23禾 P SEQ ID NO:24各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94°C变性 30秒， 50°C退火 30秒， 72°C延 伸 30秒；)， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Xbal酶切后将所得 PCR产物连接到 （连 接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3
SEQ ID NO: 23：
ACT^GCrJATGGTGGAGCACGACACTCT
SEQ ID NO: 24：
GCJC7¾G^AGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC
SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26扩增 GhTPS-2 (模板是实施例 2所获得的阳性
GhTPS-2-pGEM质粒） ， 采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer, 0.5μ1 25 mM的 dNTP， 2.0 μΐ GhTPS-2-pGEM质粒， 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:25禾 P SEQ ID NO: 26各 2.0 μ1， 以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预 变性 2分钟， 35个循环 (95 °C变性 25秒， 53 °C退火 25秒， 72°C延伸 2分钟， 72°C延 伸 5分钟。 通过 Xbal、 Kpnl酶切后将所得 PCR产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-3 , 获得植物表达载体 35 S-G/z 7^-2-2300。
SEQ ID NO: 25：
AArC7¾&4ATGCCTGGAAACAAGTACAAC
SEQ ID NO: 26：
GCGG¾CCTCAAGTGCCTTTTGCTAGTC
实施例 4、 358-(^7 ^-2-2300表达载体转化农杆菌。
农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑 接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ§/ιη1利福平和 50 μ§/ιη1链霉素 的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 小时)至 OD6(K)值为 0.4， 形成种子
菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培 养基中， 28°C摇动培养 2-2.5小时至 OD6Q()=0.8。冰浴菌液 10分钟，每隔 3分钟摇匀一次， 使细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 1 ml冰预冷 的 10% (v/v)甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (v/v) 甘油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10% (v/v) 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。
转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3 中所得的阳性 SSS-G/zJ ^^^SOO质粒， 混匀后冰浴约 10分钟。 将所述感受态细胞和质 粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部，注意不要 有气泡。 将电击杯（购自 Bio-Rad)放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室 基座电极处。使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"， 电击一次。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。 快速而轻柔的用移液 枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下， 225 rpm培养 1小时。取 100-200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基， 含 50 μ§/ιη1利福平、 50 μ§/ιη1链霉素、 50 μ§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C 保存备用。
实施例 5、 利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥。
待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生 物资源中心） 播种在泥炭土中， 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16小时光照 /8小时 黑暗的培养箱中发芽。 7-10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 ) 的口径为 7.5 cm 的塑料钵中， 每钵栽种 6株， 置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长。 移栽 前每钵浇营养液 40 ml, 移栽后视土壤湿度及时补充水分。 在生长期间适当浇灌营养液。 按需要每 3-4周一次 （或者时间更长）。 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植 株第一个花序形成后剪去第一个花序， 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步出现。 当大多数花序约 1-10 cm高 （剪去第一个花序后 4-8天） 时准备浸染。
农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后， 挑取农 杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中 （含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素 和 100 mg/L卡那霉素）， 28°C恒温下 250转 /分钟振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1%-2% 的体积比接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB液体培养基中， 28°C恒温振摇使农杆菌 的浓度达到 OD6(K)=1.8， 然后在 4°C下 3000转 /分钟离心 15分钟， 弃去上清液后用浸染培
养基 （该浸染培养基含有 5.0%的蔗糖和 0.05% ( 500 μΙΤί) 的 Silwet L-77) 重新悬浮农 杆菌， 悬浮至 OD6QQ约 0.80。
花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中， 每个口径 9 cm的容器 中加入 200-300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置， 使地上组织全部 浸没在农杆菌悬浮液中 3-5 秒， 并要轻轻搅动。 浸润后植株上应该有一层液体膜。 浸染 过的植株放在塑料盘中， 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在弱光或暗处过 夜， 注意小心防止阳光直射植株。 处理后约 12-24 小时去掉覆盖。 正常培养植株， 植株 进一步生长 3-5周， 直至角果变褐变干。 收获种子， 并将种子用离心管在 4 ！下干燥贮 存。
转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素 （4.695 mM KN03, 0.3125 mM KH2P04，
5.15 mM H4N03, 0.375mM MgS04， 0.75mM CaCl2, 25 μΜ KI, 50 μΜ Η3ΒΟ3， 50 μΜ MnS04， 15 μΜ ZnS04， 0.5 μΜ N Mo04， 0.05 μΜ CoCl2， 50 μΜ Na2EDTA, 50 μΜ FeS04) 的水溶液， 加入 0.8 %琼脂粉， 用微波炉加热至琼脂完全溶化， 待冷却到 50°C左右， 加入 所需量的终浓度为 50 rn U1的卡那霉素， 摇匀后每培养皿中倒入 25 mL， 置实验台冷却 凝固后即可播种。 把称量好的种子倒在一张复印纸上， 用手指轻敲复印纸， 将种子均匀 地播种在琼脂胶上， 盖上培养皿盖， 置 4 °C冰箱冷处理 72小时后， 移至 23 °C、 16小时 光照 /8 小时黑暗的培养箱中发芽， 定期统计种子发芽和幼苗生长情况， 将抗性幼苗及时 移栽到营养土中。 移栽后视土壤湿度及时补充水分。 在生长期间适当浇灌营养液。 取生 长 20天的拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA，用 SEQ ID NO: 16和8£0 10 ^3: 17扩增（?《7¾>-2: ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反 应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 45秒， 53 °C退火 45秒， 72°C延伸 2 分钟）， 72°C延伸 7分钟），将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号（T1H1-T1H12),并保存。 实施例 6、过表达 GhTPS-2的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定。 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1H1-T1H6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石 上，每盆播种 10颗种子，25°C、10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS, 培养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4棵苗， 用于干旱实验。 转基因拟南芥、 对照拟 南芥干旱 14天 （不浇水）， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株 (TO代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T1H1、
T1H2、 T1H3、 T1H4、 T1H5、 T1H6六个株系共 28棵 （每株系各 4-5 )拟南芥中 25棵能 够存活并继续生长显现出明显的耐旱性（参见图 3a和 3b， 以 T1H2为例， T1H1、 T1H3、 T1H4、 T1H5、 T1H6的结果与 T1H2类似， 在此未示出）。 实施例 7、 在转录水平上验证 蛋白表达。
分别取对照拟南芥植株、 耐旱转基因拟南芥 T1 代植株 （分别属于 T1H1、 T1H2、 T1H3、 T1H4、 T1H5、 T1H6六个株系） 和不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株的干旱 10天 的叶片各 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒 （Invitrogen)提取的总 RNA。 用 HITACHI公 司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA 浓度。 依照 Invitrogen反转录试齐 [J盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反 转录（2 g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 18)。通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17扩增 GhTPS-2， 检测 TPS-2蛋白相对表达情况。
采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 l PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16禾 Ρ SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1， 以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C预变性 5分钟， 29个循环 （94°C变性 45秒， 53 °C退火 45秒， 72°C 延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa), 1-4为非 转基因拟南芥对照， 5-11为耐旱转基因拟南芥 T1代植株（依次为： T1H1、T1H2、T1H3、 T1H4、 T1H5、 T1H6、 T1H7 ) , 12-15为不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株。 图中所示 PCR 产物电泳条带大小与 GhTPS-2 的大小一致 （约 2.8 Kbp)。 结果表明， 对照拟南芥没有 GhTPS-2转录， 耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 GhTPS-2的转录较强， 不耐旱转基因拟 南芥 T1代植株转录很弱或者没有转录。
Claims
1. 一种编码棉花海藻糖合成酶的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为 SEQ ID NO: l o
2. 编码权利要求 1所述蛋白的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。
3. 一种重组表达载体， 其含有权利要求 2所述的基因并且所述基因的核苷酸序 列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体， 其为图 2所示的 35S-GM ^-2-2300载体。
5. 一种重组细胞， 其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重 组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植 物是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利 要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法， 其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、 权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5所述的重组细胞用于改善植物耐旱性或者用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途， 其中所述植物是拟南芥。
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