WO2015042742A1 - 一种棉花钙调磷酸酶b类似蛋白cbl-3及其编码基因与应用 - Google Patents

一种棉花钙调磷酸酶b类似蛋白cbl-3及其编码基因与应用 Download PDF

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孙超
陈文华
崔洪志
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创世纪转基因技术有限公司
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the present invention relates to plant proteins and their coding genes and applications, and more particularly to a cotton-derived calcineurin B-like protein CBL-3 and its encoding gene, and in the cultivation of transgenic plants with improved drought tolerance application.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Stresses such as temperature, salting and drought can cause serious damage to the growth and development of higher plants, resulting in reduced crop yields, degraded quality, and serious threats to agricultural production and the natural environment.
  • the impact of drought on crop yields ranks first in many natural adversities, and its harm is equivalent to the sum of other disasters. Many regions are the bottleneck of agricultural development.
  • the world's arid and semi-arid regions account for 34% of the land area; China's arid and semi-arid regions account for 52% of the country's land area, and the annual drought-affected area amounts to 200-2.7 million hectares.
  • Cubic meters due to lack of water, less than 350-400 billion kilograms of grain; especially China's main grain-producing areas such as North China, Northeast China and Northwest China are the areas with the most water shortage in China, and the spring drought frequently reaches 10 years.
  • the present inventors used SSH (Suppression Subtractive Hybridization) in combination with RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
  • SSH Stress Subtractive Hybridization
  • RACE Rapid Amplification of cDNA Ends
  • a calcineurin B-like protein of small cotton (a gene encoding this gene was cloned and its DNA sequence was determined. It was found that it could significantly improve the drought tolerance of transgenic plants after it was introduced into plants. Sex, and these traits can be stably inherited.
  • the first aspect of the present invention provides a gene encoding a calcineurin B-like protein gene GhCBL-3 of cotton (designated herein as GhCBL-3); preferably, the sequence thereof is SEQ ID NO: 2.
  • a second aspect of the present invention provides a recombinant expression vector comprising the gene of the first aspect of the present invention, which is obtained by inserting the gene into a basic vector for constructing the recombinant expression vector, And the nucleotide sequence of the gene is operably linked to the expression control sequence of the base vector; preferably, the base vector is pCAMBIA2300; preferably, the recombinant expression vector is 35S- shown in Figure 2 G/d-3-2300 vector.
  • the third aspect of the invention provides a recombinant cell comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention; preferably, the recombinant cell is a recombinant Agrobacterium cell.
  • a fourth aspect of the present invention provides a method for improving drought tolerance of a plant, comprising: introducing the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention into a plant or plant tissue and causing the gene Expression;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a fifth aspect of the invention provides a method for producing a transgenic plant, comprising: cultivating a plant or a plant comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention under conditions effective to produce a plant Tissue;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a sixth aspect of the present invention provides the gene according to the first aspect of the present invention, the recombinant expression vector of the second aspect of the present invention or the recombinant cell of the third aspect of the present invention for improving drought tolerance of a plant and for use in plant breeding Use;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the seventh aspect of the present invention provides the gene-encoded protein according to the first aspect of the present invention, which has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.
  • Fig. 1 is a construction flow of a plant expression vector C35S-G/d-3-2300 of GhCBL-3 (Fig. la-lb).
  • Figure 2 is a plasmid map of the plant expression vector C35S-G/d-3-2300 of GhCBL-3.
  • FIG. 3 shows the results of drought tolerance simulation experiments of GhCBL-3 T1 transgenic Arabidopsis plants (in the figure, T1J4) and non-transgenic Arabidopsis plants (in the figure, CK) as controls.
  • Fig. 3a is an Arabidopsis plant that grows normally for 20 days;
  • FIG. 3b is an Arabidopsis plant treated with drought for 14 days after normal growth for 20 days).
  • Figure 4 is a graph showing the results of protein expression verification at the transcriptional level of transgenic T1 Arabidopsis plants and non-transgenic control plants.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa)
  • 1-7 is a drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plant (in order: T1J1, T1J2, T1J3, T1J4, T1J5, T1J6, T1J7)
  • 8-11 is not drought tolerant
  • 12-15 are non-transgenic Arabidopsis controls.
  • DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The invention is further illustrated by the following non-limiting examples. The examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.
  • a subtractive library was constructed by the method of inhibition subtractive hybridization using the method shown by Clontech's PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit.
  • the mRNA of the leaves of the drought-treated cotton seedlings was used as a sample (Tester) during the experiment, and the mRNA of the leaves of the untreated small cotton seedlings was used as a control.
  • the specific steps are as follows:
  • the above test seedlings were divided into two groups, each with 4 pots and 1 pot per pot.
  • the first group was a control group, which was cultured at 25 ° C, photoperiod of 16 hours light / 8 hours dark, and was normally watered.
  • the second group was the drought treatment group, cultured at 25 °C, photoperiod of 16 hours light/8 hours darkness, stopped watering, and treated for 10 days. After the treatment, the leaves of the top two groups of the seedlings were cut in time. After the nitrogen was rapidly frozen, it was stored in a -70 ° C refrigerator.
  • RNA extraction kit purchased from Invitrogen
  • the absorbance of total RNA at 260 nm and 280 nm was measured by HITACHI's UV spectrophotometer U-2001.
  • the ratio of OD 260 / OD 280 was 1.8-2.0, indicating that the total RNA purity was higher; 1.0% agarose gel was used.
  • Gel electrophoresis detected the integrity of total RNA.
  • the brightness of the 28S band was about twice that of the 18S band, indicating good RNA integrity.
  • mRNA was isolated using Qiagen's purification of poly A+ RNA from total RNA.
  • this experiment In order to increase the validity of the Expressed sequence tag (EST) (Unigene), avoid the gene-free cleavage site and the obtained sequence in the untranslated region, this experiment simultaneously uses the endonuclease Haelll to tester cDNA according to the above steps.
  • the cDNA was digested with Driver cDNA and subjected to two forward subtractive hybridizations and two inhibitory PCR amplifications. Finally, the second inhibitory PCR products of the two groups of forward subtractive hybridization cDNA fragments were combined.
  • the second PCR product of the above combined positive subtractive hybridization cDNA fragment purified using QIAquick PCR Purification Kit, purchased from Qiagen
  • pGEM-T Easy kit purchased from Promega
  • the specific steps are as follows: The following components are sequentially added to a 200 ⁇ PCR tube: the second inhibitory PCR product of the purified combined positive subtractive hybridization cDNA fragment 3 ⁇ 1, 2 ⁇ 4 DNA ligase buffer 5 ⁇ l of liquid, pGEM-T Easy vector 1 ⁇ l, T4 DNA ligase 1 ⁇ , and ligated overnight at 4 °C.
  • SEQ ID No: 3 is the 3 terminal sequence of the coding gene CBL-3. Based on the sequence of SEQ ID NO: 3 which has been obtained, the following three specific primers were designed as specific primers for reverse transcription primers and 5 'RACE.
  • GH-B 122GSP 1 ( SEQ ID NO: 4 ) :
  • the kit comes with universal primers:
  • AAP SEQ ID NO: 7 :
  • GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG AUAP SEQ ID NO: 8 :
  • the Ends kit was purchased from Invitrogen).
  • GH-B122GSP1CSEQ ID NO: 4 was used as a reverse transcription primer, reverse transcription was performed using small cotton mRNA as a template to obtain a cDNA template, and then Poly C tail was added according to the procedure in the above 5' RACE kit instructions to add tail
  • the latter product was subjected to the first round of PCR amplification using the primers of SEQ ID NO: 4 and the universal primer SEQ ID NO: 7 (the kit is self-contained, and I is hypoxanthine modified a, c, g or t ), Specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 each of 2.0 ⁇ 1, and 35 ⁇ 1 of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 ° C, annealing for 45 seconds at 60 ° C, 45 seconds at 72 ° C), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water, and 2.0 ⁇ L was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 5 and the universal primer SEQ ID NO: 8.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 10 X Ex Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq, 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8 Each of 2.0 ⁇ l, and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 ° C, annealing for 45 seconds at 54 ° C, 45 seconds at 72 ° C), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • a strip of approximately 500 bp in the second PCR product (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered and ligated into pGEM-T Easy Vector, then converted to JM109 (specifically the same as above), randomly picked 6 whites
  • the colonies were inoculated separately in LB liquid medium containing 50 g/mL ampicillin, cultured at 37 ° C overnight, and glycerol was added to a final concentration of 20% (v/v), and stored at -80 ° C until use.
  • the primers SEQ ID NO: 5 and the 3' primer SEQ ID NO: 6 were used for PCR amplification (reaction system and reaction conditions as above), and 6 positive clones were obtained, which were sent to Yingji Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. for sequencing. Sequencing, a 5' end sequence of the cDNA of the gene was obtained. The resulting 5' RACE product clone 04 was sequenced to obtain the sequence of SEQ ID NO: 9:
  • GhCBL-3F (SEQ ID NO: 11):
  • GhCBL-3R (SEQ ID NO: 12):
  • the GhCBL-3 full-length coding sequence was cloned by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 95 °C for 2 minutes, 35 cycles (denaturation at 95 °C for 25 seconds, annealing at 52 °C for 25 seconds, extension at 72 °C for 30 seconds), extension at 72 °C for 5 minutes.
  • PCR amplification product plus A tail PCR product hydration to 400 ⁇ 1, first remove the protein with chloroform once, add the supernatant to add 3 ⁇ sodium acetate solution 40 ⁇ l, add 2 times of absolute ethanol, -20 ° C for 10 minutes, Centrifuge, remove the supernatant, allow to dry, and dissolve in 21 ⁇ l of double distilled water. Add 2.5 ⁇ l ⁇ ⁇ ⁇ Buffer, 0.5 ⁇ 1 5 mM dATP, 1.0 ⁇ Ex Taq. Reaction conditions: reaction at 70 ° C for 30 minutes.
  • a DNA fragment of about 2.8 Kbp was recovered (Omega recovery kit), ligated into the pGEM T-easy vector (G 3 ⁇ 4L-3-pGEM plasmid was obtained), and then transformed into JM109, and 6 white colonies were randomly picked and inoculated separately. Incubate in 50 ml/mL ampicillin in LB liquid medium, incubate at 37 °C overnight, add glycerol to a final concentration of 20% (v/v), and store at -80 °C until use.
  • the primers SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were used for PCR amplification (reaction system and reaction conditions as above), and 6 positive clones were obtained and sent to Yingjie Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. for sequencing.
  • SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence of the encoded protein is SEQ ID NO: 1.
  • the plant binary expression vector pCAMBIA2300 (purchased from Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.) was selected as a plant expression vector, and the 35S promoter containing the double enhancer of the ⁇ gene was replaced with the Pnos promoter to reduce the expression of prion protein in plants. . Select the 35S promoter with double enhancer and the terminator Tnos as Promoter and terminator of the GhCBL-3 gene.
  • Pnos were amplified using the plant expression vector pBI121 (purchased from Beijing Huaxia Ocean Technology Co., Ltd.) using primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), and extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was digested with EcoRI and Bglll and ligated into pCAMBIA2300 (Promega, T4 ligase cassette) to obtain pCAMBIA2300-1.
  • SEQ ID NO: 16 and P SEQ ID NO: 17 Amplification of Tnos using pBI121 as a template, using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 The Arabidopsis thaliana 35S promoter was amplified using the pCAMBIA2300 plasmid as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase using TaKaRa 50 ⁇ PCR reaction system: 10 ⁇ 5 > ⁇ PS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ diluted 50-fold pCAMBIA2300 plasmid, 1.0 ⁇ PrimeSTAR, 10 ⁇ primer SEQ ID NO: 18 and P SEQ ID NO: 19 2.0 ⁇ l each, and 31 ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 50 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds;), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was ligated by HindIII and Xbal digestion (connection method is the same as above) pCAMBIA2300-2 to obtain pCAMBIA2300-3 SEQ ID NO: 18:
  • G 3 ⁇ 4L-3-pGEM plasmid using Straugene's PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 95 °C for 2 minutes, 35 cycles (denaturation at 95 °C for 25 seconds, annealing at 52 °C for 25 seconds, extension at 72 °C for 30 seconds, extension at 72 °C for 5 minutes. Digestion by Xbal, Kpnl After the resulting PCR product is ligated (the connection method is the same as above)
  • pCAMBIA2300-3 obtained the plant expression vector 35S-7H5-2300.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (available from Biovector Science Lab, Inc) Preparation of competent cells: Agrobacterium LB A4404 was placed on LB solid medium containing 50 g/ml rifampicin and 50 g/ml streptomycin 1-2 days in advance Single-spot inoculation, culture at 28 ° C for 1 to 2 days. Single colonies were picked and inoculated into 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 rifampicin and 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 streptomycin, and cultured overnight (about 12-16 hours) to OD 6 at 28 °C with shaking. The K) value is 0.4, and a seed bacterial liquid is formed.
  • Transformation of Agrobacterium The competent cells were thawed on ice, and 1 ⁇ M of the positive 35S-G/d-3-2300 plasmid obtained in Example 3 was added to 40 ⁇ M of competent cells, and the mixture was mixed and ice bathed for about 10 minutes. Transfer the mixture of competent cells and plasmid DNA to an ice-cold electric shock cup with a pipette, tap to bring the suspension to the bottom, be careful not to There are bubbles. Place the electric shock cup (purchased from Bio-Rad) on the slide of the electric shock chamber and push the slide to place the electric shock cup on the base electrode of the electric shock chamber.
  • Plants to be transformed Arabidopsis seeds (Columbia type, Arabidopsis thaliana Bioresource Center, Ohio State University) Seeded in peat soil, treated at 4 ° C for 3 days, placed at 23 ° C, 16 hours light Sprouting in an 8 hour dark incubator. After 7 - 10 days, transplanted into a plastic pot with a diameter of 7.5 cm containing peat and vermiculite (3:1 by volume), 6 plants per pot, placed at 23 ° C, 16 hours light / 8 hours dark Growing in the incubator. 40 ml of nutrient solution per pot before transplanting, and the soil moisture should be replenished in time after transplanting. The nutrient solution is properly watered during the growth period.
  • Agrobacterium After removing the bacterial solution of the Agrobacterium-positive transformed clone preserved in Example 4, a single colony of Agrobacterium was picked and inoculated into 10 mL of sterile LB liquid medium (containing 75 mg/L rifampicin). 100 mg/L streptomycin and 100 mg/L kanamycin were shaken overnight at 250 rpm at 28 °C. Then, the obtained bacterial liquid was inoculated into 200 mL of LB liquid medium containing the above antibiotics at a ratio of 1% - 2% (v/v), and the concentration of Agrobacterium was reached at OD 6 (at a constant temperature of 28 °C).
  • the infusion medium contains 5.0% (w/v) sucrose and 0.05% (500 ⁇ ⁇ Silwet L-77) resuspend Agrobacterium and suspend it to an OD 6QQ of approximately 0.80.
  • Infiltration of inflorescence The above Agrobacterium-containing dyeing medium was added to a large-mouth container, and 200-300 mL of the Agrobacterium-containing dyeing medium was added to each container having a diameter of 9 cm for dip dyeing. Invert the plants so that the above ground tissues are completely immersed in the Agrobacterium suspension for 3 - 5 seconds and gently agitated. There should be a liquid film on the plant after infiltration. Dip-infected plants are placed in plastic trays, covered with a clean plastic or plastic wrap to moisturize, then placed in low light or dark places overnight, taking care to prevent direct sunlight from the plants. Remove the cover approximately 12 - 24 hours after processing. The plants are cultured normally, and the plants are further grown for 3 to 5 weeks until the pods are browned and dried. Harvest the seeds and dry the seeds in a centrifuge tube at 4 °C Storage.
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 50 ⁇ PCR reaction system: 5 ⁇ ⁇ Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ DNA, 1.0 ⁇ Ex Taq, 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 each of 2.0 ⁇ l, and 35 ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation for 45 seconds at 94 °C, annealing for 45 seconds at 52 °C, extension of 30 seconds at 72 °C), extension at 72 °C for 7 minutes), numbers of plants identified as positive by PCR (T1J1-T1J12), and save.
  • T1J1-T1J12 numbers of plants identified as positive by PCR
  • T1J1-T1J6 and control Arabidopsis seeds were sown on vermiculite, 10 seeds per pot, 25 °C, 10 hours light culture/14 hours dark culture cycle, 1/2MS every 7 days, after 20 days of culture 4 seedlings of uniform size were kept in each pot for drought experiments.
  • the drought resistance of T1 transgenic plants (plants grown from T0 transgenic plants) showed that the control plants were wilting, while T1J1, T1J2, T1J3, T1J4, T1J5 and T1J6 had 28 strains (each strain).
  • RNA extracted by the plant RNA extraction kit was 0.05 g each of the leaves.
  • the absorbance values of total RNA at 260 nm and 280 nm were measured using a HITACHI UV spectrophotometer U-2001 to calculate the respective RNA concentrations.
  • Reverse transcription (2 ⁇ g of total RNA as a template, reverse transcription primer SEQ ID NO: 13) was carried out according to the method shown by Invitrogen reverse transcription assay L1 box Superscript III Reverse Transcriptase.
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 GhCBL-3 was amplified and the relative expression of CBL-3 protein was detected.
  • PCR was performed using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase with reverse transcribed cDNA as a template.
  • 50 ⁇ l ⁇ Reaction system 10 ⁇ 5 ⁇ PS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ cDNA, 1.0 ⁇ PrimeSTAR 10 ⁇ primer SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 each 2.0 ⁇ l, and
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 29 cycles (denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 52 ° C for 45 seconds, extension at 72 ° C for 45 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa), and 1-7 is a drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plant (in order: T1J1, T1J2, T1J3, T1J4, T1J5, T1J6, T1J7) 8-11 is a drought-tolerant transgenic Arabidopsis thaliana T1 plant, and 12-15 is a non-transgenic Arabidopsis control.
  • the size of the electrophoresis band of the PCR product shown in the figure is the same as the size (about 600 bp).

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Abstract

本发明提供了一个来源于小棉花的钙调磷酸酶B类似蛋白GhCBL-3及其编码基因，以及所述基因在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

种棉花钙调磷酸酶 B类似蛋白 CBL-3及其编码基因与应用
技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于棉花的钙调 磷酸酶 B类似蛋白 CBL-3及其编码基因， 以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的 应用。 背景技术 温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害， 导致作物产 量降低， 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境。 其中干旱对作物产量的影响， 在诸 多自然逆境中占首位， 其危害相当于其它灾害之和， 是许多地区是农业发展的瓶颈。 据 统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积 的 52%， 年受旱面积达 200 - 270万公顷 ， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米， 因缺水 而少收粮食 350 - 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北， 是我国缺水 最严重的地区， 春旱频繁达到十年九遇。
植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状， 利用常规育种方法改良作物的抗旱性 受到周期长、 优异种质资源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达调控 的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。 目前， 利用干旱胁迫相关基因提高植 物的抗旱能力， 已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研 究方向。
植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应， 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的 危害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过程。 但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂， 许多植物对逆境下的生物化学和生理 学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植 物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基 础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE (cDNA末端快速扩增） 相结合的方 法克隆出了小棉花的一种钙调磷酸酶 B类似蛋白 （本文命名为 的编码基因， 并 测定了其 DNA序列。并且发现将其导入植物超量表达后，可明显改善转基因植株的耐旱 性， 而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供棉花的一种钙调磷酸酶 B类似蛋白基因 GhCBL-3 的编码基因 (本文命名为 GhCBL-3) ； 优选地， 其序列为 SEQ ID NO: 2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是 通过将所述基因插入到一种用于构建所述重组表达载体的基础载体而获得的， 并且所 述基因的核苷酸序列与所述基础载体的表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述基础 载体为 pCAMBIA2300; 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-G/d-3-2300 载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明 第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将本发明第一方面所述的 基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下 培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或 植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达 载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途; 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明 图 1是 GhCBL-3的植物表达载体 C35S-G/d-3-2300;>的构建流程 （图 la-lb)。
图 2是 GhCBL-3的植物表达载体 C35S-G/d-3-2300)的质粒图。
图 3是 GhCBL-3 T1代转基因拟南芥植株（图中， T1J4)和作为对照的非转基因拟南 芥植株 （图中， CK) 的耐旱模拟实验结果。 （图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株； 图
3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。 图 4是转基因 T1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验 证结果。 M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa), 1-7为耐旱转基因拟南芥 T1代 植株 （依次为： T1J1、 T1J2、 T1J3、 T1J4、 T1J5、 T1J6、 T1J7), 8-11为不耐旱转基因拟 南芥 T1代植株， 12-15为非转基因拟南芥对照. 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。
下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1 干旱胁迫下小棉花 SSH文库构建
具体方法为：
利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂 交方法构建差减文库。 在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为样本 (Tester), 以未处理的小棉花幼苗的叶片的 mRNA作为对照 （Driver)。 具体步骤简述如 下：
( 1 ) 供试材料：
冀棉 14 (国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-30270 ) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗（光强 2000— 3000 Lx)条件下培养，每周浇 1/2MS液体培养基（含 9.39 mM KN03, 0.625 mM KH2P04， 10.3 mM NH4N03, 0.75 mM MgSO4， 1.5 mM CaCl2， 50 μΜ ΚΙ， 100 μΜ Η3ΒΟ3， 100 M MnS04， 30 μΜ ZnS04, 1 μΜ Na2Mo04, 0.1 μΜ CoCl2， 100 μΜ Na2EDTA, 100 μΜ FeS04) 一次。 当苗株培养 1个月左右时用于实验。
( 2) 材料处理：
将上述供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕后及时 剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。
( 3 ) 总 RNA提取：
分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片各 0.1 g， 用植物 RNA提取试剂盒（购自 Invitrogen)提取棉花叶片的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测 定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0， 表明 总 RNA纯度较高； 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮 度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。
( 4 ) 抑制差减杂交：
按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差 减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA,再以 2 Tester cDNA禾 P 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同接头的 Tester cDNA分别 与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次差减杂交的产物 混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交， 然后通过两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段， 使其得到富集。
为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (Unigene)的有效性， 避 免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区， 本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR 扩增， 最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。
( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定
依照 pGEM-T Easy试剂盒 （购自 Promega) 的产品说明书所示方法， 将上述合并的 正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 向 200 μΐ PCR管中依次加入 下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物 3 μ1, 2χΤ4 DNA连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μΐ ， 于 4°C连接过 夜。 取 10 μL连接反应产物， 加入到 100 μL感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中 并混匀， 冰浴 30分钟、 42 °C热休克 60秒、 冰浴 2分钟， 另加 250 L LB培养液 （含 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药）后置于 37°C 摇床中， 以 225转 /分钟振荡培养 30分钟， 所得菌液即为差减文库菌液。 加甘油至终浓 度 20% (V/V), 于 -80°C保存备用。
取 200 μL所述差减文库菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素 （购自北京拜尔迪）、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃 半乳糖苷） （X-gal和 IPTG均购自 TAKARA) 的 LB (同上） 固体培养平板上， 37°C培育 18小时。 计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随机挑取 198个白色菌 落 (编号： Gh-B001至 Gh-B198)。 将所有白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素 的 LB液体培养基的 96孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 -80°C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1 禾 P Primer 2R ( Clontech 公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增验证， 得到 190个阳 性克隆， 然后将所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。
( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：
将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后， 共得到 135 条
EST(Unigene；)。 经分析有 21个重叠群， 有 114个单一的序列。 经 BlastN发现其中 48条 EST (Unigene) 在 GenBank 中有同源序列， 32条 EST功能未知或者为假定蛋白， 另有 34条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 '或 5'末端非翻译区的较短序列。 实施例 2棉花钙调磷酸酶 B类似蛋白编码基因 GhCBL-3的克隆
克隆子 Gh-B122去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列的 编码的蛋白质属于钙调磷酸酶 B类似蛋白，本文将克隆子 GH-B122对应的全长编码基因 命名为 GhCBL-3， 其对应的蛋白命名为 CBL-3。
SEQ ID No: 3
1 CTAGGI TCG AAGAGTTTGC TGGTGCTCTT TCTGTCTTCC ATCCAAACGC TCCTATTGAG 61 GATAAGATTG ACTTCTCTrT CCAACTATAT GATCTCAAGC AGCAAGGTTT CATTGAGAGG 121 CAGGAGGTTA AGCAAATGGT AGTGGCTACG CTTGCTGAAT CTGGCATGAA CCTTTCAGAT 181 GATGTTATAG AAAGTATAAT TGACAAGACT TTTGAGGAAG CTGATACAAA ACATGATGGG 241 AGGATTGACA AGGAAGAG G GCGAAGCCTT GTTTTGCGAC ATCCCTCCCT TCTGAAAAAT 301 ATGACCCTGC
CBL-3全长编码基因的克隆
根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列分析， SEQ ID No: 3 为编码基因 CBL-3的 3 端序列。 根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列， 设计如下三条特异性引物， 作为反转录引 物及 5 'RACE的特异性引物。
GH-B 122GSP 1 ( SEQ ID NO: 4 ) ：
AGGGAGGGATGTCGCAAAAC GH-B122GSP2 ( SEQ ID NO: 5 ) ：
CACTCTTCCTTGTCAATCCTC GH-B122GSP3 ( SEQ ID NO: 6) ：
CTAGGTTTCGAAGAGTTTGC
试剂盒自带通用引物：
AAP ( SEQ ID NO: 7 ) ：
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG AUAP ( SEQ ID NO: 8 ) ：
GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。
以 GH-B122GSP1CSEQ ID NO: 4)为反转录引物，以小棉花 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾， 以加尾后 的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：
50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录 的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 45秒， 60°C退火 45秒， 72°C延伸 45秒）， 72°C延伸 10分钟。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物， 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 8 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 45秒， 54°C退火 45秒， 72°C延伸 45秒）， 72°C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR 产物中约为 500bp 大小的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) , 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然后转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 6个白色菌落分别 接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终 浓度 20% (v/v), -80°C保存备用。 用引物 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行 菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序， 获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。 所得的 5'RACE产物克隆子 04测序获得序列为 SEQ ID NO: 9：
1 GGGGGGGGGG ATGTTATTTT TGTTATTGAG TCGT CTA T GGAATTTGTT G I TGCTTA
61 CC TGATGCA GTTAGTGTAA GTGAAATAGA AGCACTCTAT GAACTCTTCA AGAAGATAAG
121 GAGTGCAGTG ATAGATGAGG GGCTGATTAA CAAGGAGGAG TTTCAATTGG CG TAT CAA 181 GACAAACAAA AAGGAGAGCT TGTTTGCAGA TCGGGTGT T GACTTGTTTG ATACAAAGCA
241 TAATGGAATT CTAGGTTTGG AAGAGTTTGC TCGTGCTC T TCTGTCTTCC ATCCAAACGC
301 TCCTATTGAG GATAAGATTG AC TCTCITT CCAACTATAT GATCTCAAGC AGCAAGGTTT
361 CATTGAGAGG CAGGAGGTTA AGCAAATGGT AGTGGCTAGG CTTGCTGAAT CTGGCATGAA
421 CCTTTCAGAT GA GTTATAG AAAGTATAAT TGACAAGACT TTTGAGGAAG CTGATACAAA 481 ACATGA GGG AGGATTGACA AGGAAGAGTG 将 5'RACE获得的序列 SEQ ID NO: 9， 与获得的序列 SEQ ID NO: 3拼接， 获得 SEQ ID NO: 10:
1 GGGGGGGGGG ATGTTATTTT TGTTATTGAG TCGTTCTATT GGAATTTGTT GTITTGCTTA 61 CC TGATGCA GTTAGTGTAA GTGAAATAGA AGCACTCTAT GAACTCTTCA AGAAGATAAG 121 GAGTGCAGTG ATAGATGAGG GGCTGATTAA CAAGGAGGAG TTTCAATTGG CGTTATTCAA 181 GACAAACAAA AAGGAGAGCT TGTTTGCAGA TCGGGTGTTT GACTTGTTTG ATACAAAGCA 241 TAATGGAATT CTAGGTTTGG AAGAGTTTGC TCGTGCTCTT TCTGTCTTCC ATCCAAACGC 301 TCCTATTGAG GATAAGATTG ACTTCTCITT CCAACTATAT GATCTCAAGC AGCAAGGTTT 361 CATTGAGAGG CAGGAGGTTA AGCAAATGGT AGTGGCTAGG CTTGCTGAAT CTGGCATGAA 421 CCTTTCAGAT GA GTTATAG AAAGTATAAT TGACAAGACT TTTGAGGAAG CTGATACAAA 481 ACATGA GGG AGGATTGACA AGGAAGAGTG GCGAAGCCTT GTTTTGCGAC ATCCCTCCCT 541 TCTGAAAAAT ATGACCCTGC AATACCTTAA AGATATCACG ACGACAT CC GAAGCTTTGT 601 T TCCACTCG CAAGTCGA G ATACCTGA 根据 SEQ ID NO: 10序列检索分析， SEQ ID NO: 10 为 GhCBL-3的全长序列。 根据 SEQ ID NO: 10序列设计一对引物如下：
GhCBL-3F ( SEQ ID NO: 11 ) ：
ATGTTATTTTTGTTATTGAGTCG
GhCBL-3R ( SEQ ID NO: 12) ：
TCAGGTATCATCGACTTGCG AP ( SEQ ID NO: 13 ) ：
GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 通过 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12来克隆 GhCBL-3全长编码序列。
提取小棉花 RNA， 以引物 SEQ ID NO: 13为反转录引物， 获取小棉花 cDNA .采 用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以小棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 10 X PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μ 1 25 mM 的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase、 10 μ M的引 物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ 1， 以及 37.5 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条 件： 95 °C预变性 2分钟， 35个循环 （95 °C变性 25秒， 52 °C退火 25秒， 72 °C延伸 30 秒） ， 72 °C延伸 5分钟。
PCR扩增产物加 A尾： PCR产物补水至 400 μ1， 先用氯仿抽一遍去除蛋白， 吸取 上清加入 3Μ 醋酸钠溶液 40 μ1， 加 2倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟， 离心， 去上 清， 晾干，用 21 μ 1双蒸水溶解。加入 2.5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0.5 μ 1 5 mM的 dATP ， 1.0 μΐ Ex Taq。反应条件：70°C反应 30分钟。将得到约 2.8Kbp的 DNA片段回收（Omega 回收试剂盒） ， 连接至 pGEM T-easy载体上 （得到 G ¾L-3-pGEM质粒） ， 然后转 化 JM109,随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培 养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% (v/v) ， -80°C保存备用。 用引物 SEQ ID NO: 11与 SEQ ID NO: 12进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 6个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
CBL-3蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: l
1 MLFLLLSRSI GICCFAYLDA VSVSEIEALY ELFKKISSAV IDDGLIM EE FQLALFK K
61 KESLFADRVF DLFDTKHNGI LGFEEFARAL SVFHPNAPID DKIDFSFQLY DLKQQGFIER
121 QEVKQMWAT LAESGM LSD DVIESIIDK FEEADTKHDG RIDKEEWRSL VLRHPSLLKN
181 MTLQYLKDIT TFPSFVFHS QVDD
编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2
1 ATGTTATTTT TGTTATTGAG TCGT CTA T GGAATTTGTT G I TGCTTA CC TGATGCA
61 GTTAGTGTAA GTGAAATAGA AGCACTCTAT GAACTCTTCA AGAAGATAAG CAGTGCAGTG
121 ATAGATGACG GGCTGATTAA CAAGGAGGAG TTTCAATTGG CG TAT CAA GACAAACAAA
181 AAGGAGAGCT TGTTTGCAGA TCGGG GT T GACTTGTTTG ATACAAAGCA TAATGGAATT 241 CTAGGT TCG AAGAGTTTGC TCGTGCTC T TCTGTCTTCC ATCCAAACGC TCCTATTGAC
301 GATAAGATTG ACTTCTCTrT CCAACTATAT GATCTCAAGC AGCAAGGTTT CATTGAGAGG
361 CAGGAGGTTA AGCAAATGGT AGTGGCTACG CTTGCTGAAT CTGGCATGAA CCTTTCAGAT
421 GA GTTATAG AAAGTATAAT TGACAAGACT TTTGAGGAAG CTGATACAAA ACATGATGGG
481 AGGATTGACA AGGAAGAGTG GCGAAGCCTT GTITTGCGAC ATCCCTCCCT TCTGAAAAAT 541 ATGACCCTGC AATACCTTAA AGATATCACG ACGACAT CC CAAGCTTTGT T TCCACTCG
601 CAAGTCGATG ATACCTGA
实施例 3 G iC^ -_？基因植物表达载体构建
选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择含双增强子的 35S启动子及终止子 Tnos分别作为 GhCBL-3基因的启动子和终止子。
用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏 远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ ρΒΙ121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 56°C退火 30 秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物 连接到 pCAMBIA2300 (Promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。
SEQ ID NO: 14 ：
GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 15 :
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17以 pBI121为模板扩增 Tnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO:
17各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94°C 变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI 酶切后将所得 PCR 产物连接到 pCAMBIA2300-lCPromega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。 SEQ ID NO: 16：
CGGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 17：
TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA
SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增拟南芥 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 18禾 P SEQ ID NO: 19各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94°C变性 30秒， 50°C退火 30秒， 72°C延 伸 30秒；)， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Xbal酶切后将所得 PCR产物连接到 （连 接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3 SEQ ID NO: 18：
ACTAAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCT SEQ ID NO: 19：
GCTCTAGAAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21扩增 GhCBL-3 (模板是实施例 2所获得的阳性
G ¾L-3-pGEM质粒） ， 采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer, 0.5μ1 25 mM的 dNTP， 2.0 μΐ GhCBL-3-pGEM质粒， 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:20和 SEQ ID NO: 21各 2.0 μ1， 以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预 变性 2分钟， 35个循环 (95 °C变性 25秒， 52°C退火 25秒， 72°C延伸 30秒， 72°C延伸 5分钟。 通过 Xbal、 Kpnl酶切后将所得 PCR产物连接 （连接方法同上） 到
pCAMBIA2300-3 , 获得植物表达载体 35S-7 )H5-2300。
SEQ ID NO: 20：
AATCTAGAATGTTATTTTTGTTATTGAGTCG SEQ ID NO: 21：
GCGGTACCTCAGGTATCATCGACTTGCG 实施例 4 35S-GhCBL-3-23 表达载体转化农杆菌
农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LB A4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑 接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ§/ιη1利福平和 50 μ§/ιη1链霉素 的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16小时)至 OD6(K)值为 0.4， 形成种子菌 液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养 基中， 28°C摇动培养 2-2.5小时至 OD6(K)=0.8。 冰浴菌液 10分钟， 每隔 3分钟摇匀一次， 使细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 10 ml冰预冷 的 10% (v/v)甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (v/v) 甘油重复洗 3-4次； 加入 4 ml冰浴预冷的 10% (v/v) 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。
转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3 中所得的阳性 35S-G/d-3-2300质粒， 混匀后冰浴约 10分钟。 将所述感受态细胞和质 粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部，注意不要 有气泡。 将电击杯（购自 Bio-Rad)放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室 基座电极处。使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 l ml LB培养基。 快速而轻柔的用移液枪 将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下， 225 rpm培养 1小时。取 100 - 200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基， 含 50 μ§/ιη1利福平、 50 μ§/ιη1链霉素、 50 μ§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C 保存备用。 实施例 5利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥
待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生 物资源中心） 播种在泥炭土中， 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16小时光照 /8小时 黑暗的培养箱中发芽。 7 - 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 )的口径为 7.5 cm 的塑料钵中， 每钵栽种 6株， 置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长。 移 栽前每钵浇营养液 40 ml，移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。 按需要每 3-4周一次 （或者时间更长）。 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植 株第一个花序形成后剪去第一个花序， 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步出现。 当大多数花序约 1 - 10 cm高 （剪去第一个花序后 4 - 8天） 时准备浸染。
农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后， 挑取农 杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中 （含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素 和 100 mg/L卡那霉素）， 28°C恒温下 250转 /分钟振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1% - 2% (v/v) 的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB 液体培养基中， 28 °C恒温振 摇使农杆菌的浓度达到 OD6(K)=1.8， 然后在 4°C下 3000转 /分钟离心 15分钟， 弃去上清液 后用浸染培养基（该浸染培养基含有 5.0%(w/v)的蔗糖和 0.05%( 500 μΙΤθ的 Silwet L-77) 重新悬浮农杆菌， 悬浮至 OD6QQ约 0.80。
花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中， 每个口径 9 cm的容器 中加入 200 - 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置， 使地上组织全 部浸没在农杆菌悬浮液中 3 - 5秒， 并要轻轻搅动。 浸润后植株上应该有一层液体膜。 浸 染过的植株放在塑料盘中， 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在弱光或暗处 过夜， 注意小心防止阳光直射植株。 处理后约 12 - 24小时去掉覆盖。 正常培养植株， 植 株进一步生长 3 - 5周， 直至角果变褐变干。 收获种子， 并将种子用离心管在 4 °C下干燥 贮存。
转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素的水溶液，加入 0.8 % 琼脂粉，用微波炉加 热至琼脂完全溶化，待冷却到 50°C 左右，加入所需量的终浓度为 50 mg 的卡那霉素， 摇匀后每培养皿中倒入 25 mL ， 置实验台冷却凝固后即可播种。 把称量好的种子倒在一 张普通复印纸上， 用手指轻敲复印纸， 将种子均匀地播种在琼脂胶上， 盖上培养皿盖， 置 4 °C冰箱冷处理 72小时后， 移至 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽， 定 期统计种子发芽和幼苗生长情况， 将抗性幼苗及时移栽到营养土中。 移栽后视土壤湿度 及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。取生长 20天的拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA， 用 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12扩增 GhCBL-3: ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 45秒， 52°C退火 45秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 7分钟）， 将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号 （T1J1-T1J12), 并保存。 实施例 6过表达 GhCBL-3的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1J1-T1J6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石 上，每盆播种 10颗种子，25 °C、10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS, 培养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4棵苗， 用于干旱实验。 转基因拟南芥、 对照拟 南芥干旱 14天 （不浇水)， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株 ( T0代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T1J1、 T1J2、 T1J3、 T1J4、 T1J5、 T1J6 六个株系共 28棵 （每株系各 4-5棵） 拟南芥中 25棵能 够存活并继续生长显现出明显的耐旱性 （参见图 3a和 3b， 以 T1J4为例， T1J1、 T1J2、 T1J3、 T1J5、 T1J6 的结果与 T1J4类似， 在此未示出）。 实施例 7在转录水平上验证 G iCB -_？蛋白表达
分别取对照拟南芥植株、耐旱转基因拟南芥 T1代植株（分别属于 T1J1、T1J2、T1J3、 T1J4、 T1J5、 T1J6六个株系）和不耐旱转基因拟南芥 T1代植株的干旱 10天的叶片各 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒 （Invitrogen) 提取的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光 光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓度。 依 照 Invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（ 2 μg 总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 13 )。 通过 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12 扩增 GhCBL-3， 检测 CBL-3蛋白相对表达情况。
采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16禾 Ρ SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1， 以及
30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 29个循环 （94°C变性 45秒， 52°C退火 45秒， 72°C延伸 45秒） ， 72°C延伸 10分钟。
产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa) ， 1-7 为耐旱转基因拟南芥 Tl代植株 （依次为： T1J1、 T1J2、 T1J3、 T1J4、 T1J5、 T1J6、 T1J7) ， 8-11为不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株， 12-15为非转基因拟南芥对照。 图 中所示 PCR产物电泳条带大小与 的大小一致 （约 600bp) 。 结果表明， 对 照拟南芥没有 转录，耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 GhCBL-3的转录较强， 不耐旱转基因拟南芥 T1代植株转录很弱。

Claims

权 利 要 求 书
1. 棉花的一种钙调磷酸酶 B类似蛋白， 其序列为 SEQ ID N0 : 1。
2. 编码 SEQ ID NO : 1的钙调磷酸酶 B类似蛋白的基因， 优选其序列为 SEQ ID NO : 2。
3. 一种重组表达载体， 其含有权利要求 2所述的基因， 并且所述基因的核苷酸 序列与用于构建所述重组表达载体的基础载体的表达控制序列可操作地连接； 优选 地， 所述基础载体为 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体，其为附图 2所示的 35 S-GhCBL-3-2300载体。
5. 一种重组细胞， 其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重 组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植 物是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利 要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法， 其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、 权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 4所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途， 其中所述植物是拟南芥。
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