WO2014100925A1 - 一种棉花钼辅酶因子硫化酶mcsu-1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

提供了一个来源于棉花的钼辅因子硫化酶蛋白MCSU-1和其编码基因GhMCSU-1，及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花钼辅酶因子硫化酶 MCSU-1及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于棉花的钼辅酶 因子硫化酶 MCSU-1 及其编码基因， 以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应 用。 背景技术 干旱、 盐渍和低温等多种环境胁迫均导致植物细胞的渗透胁迫， 影响植物正常的 生长发育， 导致作物产量降低， 品质下降， 对作物产量造成极大损失， 其中干旱对作 物产量的影响,在诸多自然逆境中占首位， 其危害相当于其它灾害之和， 是许多地区是 农业发展的瓶颈。 据统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半 干旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200— 270万公顷 ， 全国灌溉区每年缺 水约 30亿立方米， 因缺水而少收粮食 350— 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华 北、 东北和西北， 是我国缺水最严重的地区， 春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状,利用常规育种方法改良作物的抗旱 性受到周期长、 优异种质资源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达 调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前,利用干旱胁迫相关基因提 高植物的抗旱能力,已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重 要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应， 以降低或消除逆境胁迫给植物带来 的危害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过 程。但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和 生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究 将对植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提 供重要的基础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆出了棉花的一个钼辅酶因子硫化酶 （本文命名为 MCSU-1 ) 的编码基因， 并 测定了其 DNA序列。 并发现将其导入植物超量表达后， 可明显改善转基因植株的耐 旱性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个钼辅酶因子硫化酶 MCSU-1的编码基因（本文命 名为 GhMCSU-l )， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因并且 所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述 载体为附图 2所示的 35S-GhMCSU-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发 明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将本发明第一方面所述 的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件 下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的 植物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表 达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种 的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明 图 1是 GhMCSU-1的植物表达载体 C35 S-GhMCSU-l-2300)的构建流程（图 la-lb)。 图 2是 GhMCSU-1的植物表达载体 C35 S-GhMCSU-l-2300)的质粒图。

图 3是 GhMCSU-1 T1代转基因拟南芥植株（图中， T1A1 ; T1A3 )和作为对照的 非转基因拟南芥植株 （图中， CK1、 CK2 ) 的耐旱模拟实验结果。 （图 3a为正常生长 20天的拟南芥； 图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天， 然后复水 3天的拟南芥）。

图 4干旱胁迫和正常生长条件下的 T1代转基因拟南芥植株及对照植株 ABA含量 变化检测结果。 1-8依次为株系： T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6、 CK1、

CK2, 其中 T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6为转基因植株， CK1、 CK2为 对照植株。

图 5是转基因 T1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验 证结果。 Ml、 M2为 Marker, 1-5泳道为不耐旱转基因拟南芥 T1代植株， 6-9泳道为 对照非转基因的拟南芥， 10-15 泳道为耐旱转基因拟南芥 T1 代植株 （依次为株系： T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6)。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。 实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减 杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为样 本 （tester), 以未处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为对照 （driver)。 具体步骤简述 如下：

( 1 ) 供试材料：

石系亚 1 号（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-08050) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25 °C、 光周期 16h光照 /8h黑暗 （光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 ( 9.39 mM KN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM NH4NO3, 0.75 mM MgS0₄， 1.5 mM CaCl₂， 50 μ M KI， 100 μ M H₃B0₃， 100 μ M MnS0₄， 30 μ M ZnS0₄, 1 μ M Na₂Mo0₄, 0.1 μ M CoCl₂， 100 μ M Na₂ · EDTA, 100 μ M FeS0₄) 一次。 当苗株高达 25-30cm时用于实验。

( 2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25 °C、 光周期

16h光照 /8h黑暗光照培养， 正常浇灌。 第二组为干旱处理组， 25 °C、 光周期 16h光照 /8h黑暗光照培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的 叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子 0.5 g， 用植物 RNA 提取试剂盒

( invitrogen) 提取棉花的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定 总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆₀/OD₂₈。比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA 纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂 盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4) 抑制差减杂交： 按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制 差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别 将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5 h， 然后将酶切后的 Tester cDNA分 成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次差 减杂交的产物混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过 两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST ) (unigene)的有效性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区，本实验同时用内切酶 Haelll按上述步 骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并且进行差减杂交和 PCR扩增，最后合并 两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序， 将上述合并的正向差减杂交 cDNA片段的第 二次 PCR产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接， 其具体步骤如下： 用 200 y l PCR管依次加入 下列成分： 纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， 2 Χ Τ4连接酶 缓冲液 5 μ 1, pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ， 于 4°C连接过夜。 取 10 L连接反应产物， 加入到 100 L感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中， 冰浴 30 min、 热休克 60 s、 冰浴 2 min, 另加 250 μ L LB培养液 （ 1% Tryptone购 自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药） 置 37°C水浴中， 以 225 r/min振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液涂布于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同 上） /X-gal/IPTG ( X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上， 37°C培育 18 h。 计数培养板 中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随机挑取 426个白色菌落 (编号： Gh-L001 至 Gh-L426)。将所有白色克隆分别接种于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养 基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于- 80 °C保存备用。 以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带） 进行菌液 PCR 扩增， 得到 382个阳性克隆， 对所 有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后， 共得到 263 个 EST(unigene) ₀经分析有 36个重叠群， 有 227个单一的序列。 经 BlastN 发现其中 133 条 unigene 在 GenBank 中有同源序列 （蛋白同源性 50%以上）， 57条 EST功能未知 或者为假定蛋白， 另有 37条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 ' 或 5 ' 末端非翻译 区的较短序列。 实施例 2 棉花钼辅酶因子硫化酶编码基因的克隆

克隆子 Gh-MU056去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序 列的编码的蛋白质属于钼辅酶因子硫化酶，本文将克隆子 Gh-MU056对应的全长编码 基因命名为 GhMCSU-l， 其对应的蛋白命名为 MCSU-1。

SEQ ID No : 3

1 TCGCAAATGA AGCTCAGTTC CTACTGATTT CCGAGGAGAG TGTGTCCGAC CTCAACAACA

61 GACTATGCTC AAAAACTCAA AAACTCTCTT GTGGTGCCCC ACCTAACGTC AACCCGATGA

121 GATTTCGGCC CAATCTTGTC ATATCTGGAG GCGAACCATA TGCTGAAGAT GGATGGAGAA

181 ATCTTAGAAT TGGGAACACA TATTTTAGTT CATTAGGTGG TTGCAACCGT TGCCAGATGA

241 TCAACTTTTA TCAGCAAACA GGACAAGTTA AGAAGACAAA TGAACCTTTG GCAACTCTAG

3 01 CATCATACAG GAGAGTAAAG GGGAAGATT

GhMCSU-1全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计两条特异性引物，作为 3 ' RACE的 5 ' 端特异性引物：

Gh-MU056 GSP 1 : SEQ ID NO : 4：

TCGCAAATGAAGCTCAGTTCC

Gh-MU056 GSP2 : SEQ ID NO : 5：

CGACCTCAACAACAGACTATGC

试剂自带通用引物：

AP : SEQ ID NO : 6：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT AUAP : SEQ ID NO : 7：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带的 AUAP引物），以 SEQ ID NO: 6引物（试剂盒自带的 AP引物）和棉花 mRNA反转录得到的 cDNA为模板进 行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下：

50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP 2.0 μ 1 mRNA 反转录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 7各 2.0 μ 1， 以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min 33个循环 （ 94°C 变性 30 s 53 °C退火 30 s 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ 1作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 SEQ ID NO: 7进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物， 1.0 w l Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 （94 V 变性 30 s 56°C退火 30 s 72V 延伸 2min)， 72V 延伸 10 min。 第二次 PCR产 物回收片段约为 400bp条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109(具体方法同上)， 随机挑取 8 个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 5与通用引物 SEQ ID NO: 7进行菌液 PCR扩增， 得到 6 个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA的 3 ' 所得的 3 ' RACE产物克隆子 Gh-MU3-2测序获得序列为 SEQ ID No: 8.

SEQ ID No : 8

1 CGACCTCAAC AACAGACTAT GCTCAAAAAC TCAAAAACTC TCTTGTGGTG CCCCACCTAA

61 CGTCAACCCG ATGAGATTTC GGCCCAATCT TGTCATATCT GGAGGCGAAC CATATGCTGA

121 AGATGGATGG AGAAATCTTA GAATTGGGAA CACATATTTT AGTTCATTAG GTGGTTGCAA

181 CCGTTGCCAG ATGATCAACT TTTATCAGCA AACAGGACAA GTTAAGAAGA CAAATGAACC

241 TTTGGCAACT CTAGCATCAT ACAGGAGAGT AAAGGGGAAG ATTTTGTTTG GGATATTGCT

3 01 GAGGTACGAT CCTGGTAATA AGGCTAGGTT GGATACAAAT TCATGGCTTA AGGTAGGAGA

361 TGAAGTTCAT TCAAATTCGG AATAACAGGT GTTAAAACAA AAAAAAAAAA AAAAAA 根据 3 ' RACE获得的基因 3 ' 端序列 SEQ ID No: 8， 设计三条特异性引物， 作 为反转录引物及 5 ' RACE的特异性引物。

Gh-MU3-2 GSP1 : SEQ ID NO : 9

TTCTTAACTTGTCCTGTTTGCTG Gh-MU3-2 GSP2: SEQ ID NO: 10：

GTTGCAACCACCTAATGAAC

Gh-MU3-2 GSP3: SEQ ID NO: 11：

CAACAGACTATGCTCAAAAACTC

试剂盒自带通用引物：

AAP: SEQ ID NO: 12：

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGI IGGGI IG 实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。 以 Gh-MU3-2 GSP1 (SEQ ID NO: 9) 为反转录引 物， 以棉花 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板按照 5' RACE试剂盒中的步 骤进行加 PolyC尾， 以加尾后的产物为模板进行第一轮 PCR扩增， 用 SEQIDNO: 9 与通用引物 SEQ ID NO: 12 (试剂盒自带， I 为次黄嘌吟修饰的 a， c, g， 或 t)， 具 体步骤如下：

50 lPCR反应体系： 5 μ 1 lOXEx Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 mRNA 反转录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 9禾 P SEQ ID NO: 12各 2.0 μ 1, 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33 个循环 (94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQIDNO: 10与 通用引物 SEQIDNO: 7进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 lPCR反应体系： 5 μ 1 lOXEx Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物， 1.0 wlExTaq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 （94 V 变性 30 s， 53°C退火 30 s， 72V 延伸 2min)， 72V 延伸 10 min。 第二次 PCR产 物回收片段约为 700bp条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到 JM109(具体方法同上)， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨 苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存 备用。 SEQIDNO:10与 3' 端引物 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增 （反应体系及 反应条件同上） ， 得到 3个阳性克隆 （Gh-MU51-2， Gh-MU51-3_; Gh-MU51-5) ，送英 潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA的一段 5' 端序列。

所得的 5' RACE产物克隆子 Gh-MU51-3测序获得序列为 SEQ ID No: 13： SEQ ID No : 13

GGGGGGGGGG GGGTCATCTA TCCAATAAAA TCATGCGCAG GGTTCAGTGT GAATAGTTGG

1 CCTCTGAGCA ATACGGGTTT GCAGTATGAT CGAGAATGGC TTCTTAAAAG CTTGACCGGT21 GAAATTCTTA CACAAAAGAA GGTTCCTGAA ATGTTCCTTA TTAAAACCTT CATTAACCTC81 AATCTGCAGA TATTGTCTGT AGAGTCACCC TATTGCAAAA GCAAATTGCA GATCAAACTA41 GACTCCGATT CATATCTTCC TGGGAAAGAA GAGTTTTATT TGCAGAACCA AAGATATGAA01 GTCCAATGTT ATGAAAATGA AATCAACCAA TGGTTCAGTG ATGCTGTTGG TCAACCTTGT61 ACTTTAGTGC GCTGTTGCCA GTCCGAGTAT TGCTTCTCTT TGAACAAGAA CAGAAGTATG21 GGTATGTGCA GAGATGTGAA CAGTAAGGTG AATTTCGCAA ATGAAGCTCA GTTCCTACTG81 ATCTCCGAGG AGAGTGTGTC CGACCTCAAC AACAGACTAT GCTCAAAAAC TCAAAAACTC41 TCTTGTGGTG CACCACCTAC GTCAACCCGA TGAGATTTCG GCCCAATCTT GTCATATCTG01 GAGGCGAACC ATATGCTGAA GATGGATGGA GAAATCTTAG AATTGGGAAC ACATATTTTA61 GTTCATTAGG TGGTTGCAAC

将 5 ' RACE获得的序列 SEQ ID No: 13， 与 3 ' RACE获得的序列 SEQ ID No: 拼接， 获得 SEQ ID NO: 14:

GGGGGGGGGG GGGTCATCTA TCCAATAAAA TCATGCGCAG GGTTCAGTGT GAATAGTTGG

1 CCTCTGAGCA ATACGGGTTT GCAGTATGAT CGAGAATGGC TTCTTAAAAG CTTGACCGGT21 GAAATTCTTA CACAAAAGAA GGTTCCTGAA ATGTTCCTTA TTAAAACCTT CATTAACCTC81 AATCTGCAGA TATTGTCTGT AGAGTCACCC TATTGCAAAA GCAAATTGCA GATCAAACTA41 GACTCCGATT CATATCTTCC TGGGAAAGAA GAGTTTTATT TGCAGAACCA AAGATATGAA01 GTCCAATGTT ATGAAAATGA AATCAACCAA TGGTTCAGTG ATGCTGTTGG TCAACCTTGT61 ACTTTAGTGC GCTGTTGCCA GTCCGAGTAT TGCTTCTCTT TGAACAAGAA CAGAAGTATG21 GGTATGTGCA GAGATGTGAA CAGTAAGGTG AATTTCGCAA ATGAAGCTCA GTTCCTACTG81 ATCTCCGAGG AGAGTGTGTC CGACCTCAAC AACAGACTAT GCTCAAAAAC TCAAAAACTC41 TCTTGTGGTG CACCACCTAC GTCAACCCGA TGAGATTTCG GCCCAATCTT GTCATATCTG01 GAGGCGAACC ATATGCTGAA GATGGATGGA GAAATCTTAG AATTGGGAAC ACATATTTTA61 GTTCATTAGG TGGTTGCAAC CGTTGCCAGA TGATCAACTT TTATCAGCAA ACAGGACAAG21 TTAAGAAGAC AAATGAACCT TTGGCAACTC TAGCATCATA CAGGAGAGTA AAGGGGAAGA81 TTTTGTTTGG GATATTGCTG AGGTACGATC CTGGTAATAA GGCTAGGTTG GATACAAATT41 CATGGCTTAA GGTAGGAGAT GAAGTTCATT CAAATTCGGA ATAACAGGTG TTAAAACAAA01 AAAAAAAAAA AAAAA 经分析序列 SEQ ID NO: 14 非 GhMCSU-1 基因的完整序列， 需进行第二轮 ' RACE。 根据序列 SEQ ID NO: 14 , 设计三条特异性引物， 作为反转录引物及 ' RACE的特异性引物。

Gh-MU3-2 GSP 1 : SEQ ID NO : 15：

CAGACAATATCTGCAGATTGAG

Gh-MU3-2 GSP2 : SEQ ID NO : 16：

CCTTCTTTTGTGTAAGAATTTC Gh-MU3-2 GSP3 : SEQ ID NO : 17：

AGGGTTCAGTGTGAATAGTTG 具体的操作步骤同上 5 ' RACE步骤。 以 SEQ ID NO: 15与通用引物 SEQ ID NO: 12进行第一轮扩增， 以 SEQ ID NO: 16与通用引物 SEQ ID NO: 7进行第二轮扩增得 到扩增片段约为 1800bp条带，按上述方法进行克隆并鉴定（用 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17引物扩增菌液）后取 3个阳性克隆 （Gh-MU5-l， Gh-MU5-4_; Gh-MU5-6) , 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 5 ' 端序列。

所得的 5 ' RACE产物克隆子 Gh-MU5-6测序获得序列为 SEQ ID No: 18:

1 GGGGGGGGGG GGGAGTTCTC TGCAAATGGA CGGCAAGGAA GAGTTTCTCA AGGAATTCGG

61 TGACTTTTAC GGCTACCCCA ACGCCCCTAA GTCCATCGAC GAAATTCGTT CCACCGAGTT

121 CAAGCGATTA GAAGATACTG TGTATTTGGA TCATGCTGGA GCAACCCTTT ACTCCGAGTT

181 GCAGATGGAA GCTATCTTTA AAGATCTTAC GACTACTGTT TATGGAAATC CTCATAGCCA

241 AAGTGATTCT AGTTCAGCCA CTAGTGACAT TGTAAGGGAA GCACGCAGAC AGGTCCTCGA

3 01 TTACTGCAAT GCTTCTCAAA AGGATTATAA ATGTATATTC ACTTCTGGGG CAACAGCTGC

361 ATTGAAACTC ATAGGGGAGA ACTTTCCCTG GAGCTGTAAG AGCACCTTTA TGTACACAAT

421 GGAAAATCAT AATAGCGTAC TTGGTCTTAG AGAATATGCT CTCAATCAAG GAGCTGCAGC

481 CTTTGCAGTT GATATAAATG AGGCTGTGGA TCAGGGTGGA GCATCTAGAA GCTCTCTGAC

541 TTCATTTAAG GTGATACAGC ATCCAGTGCA GATAAGAAAT GAAGCAAAAG TTTTGGAAGG

601 GGAGCTTACA GGTGATGCTT ACAATTTATT TGCCTTCCCC TCAGAGTGCA ATTTCTCTGG

661 AATGAGATTT GGCCTTGATT TGGTGAATAA TGTTAAGCAA AATGCAGAAA AATTTTTGGA

721 AGGCTCTCCA TATTCAAAGG GACATTGGAT GGTCTTAATC GATGCTGCAA AGGGCTTTGC

781 AGCACAACCT CCCGATTTGT CACTTTATCC TGCAGATTTT GTTGTAATCT CTTTTTATAA

841 GTTGTTTGGC TATCCAACTG GACTTGGTGC TCTCATAATT CGAAATGATG CTGCTAAGTT

901 ATTGAAGAAG ACCTATTTCA GTGGAGGCAC TGTTGCTGCT TCAATTGCTG ACATTGACTT

961 TGTTAGAAGA AGAGAAGCTG TTGAGGAGCA GTTCGAGGAT GGCACCATTT CATTTCTTAG

1021 CATAGCATCT ATTCGTCATG GATTTAAGAT ATTCAATACC CTCACTACAT CTGCAATGTG

1081 CTGGCATACT ATGTCACTTA CCAAGTTTTT GAAGAGGAAG CTCTTAGCTT TGCGACATGA

1141 AAATGGAGAA AGTGTCTGCA CTCTTTATGG CAATTGTCCT CTGAAGGTTT CTAGGCATGA

12 01 CTGTGGCTCT ATTGTCTCGT TTAACCTGAA AAGGCCAGAT GGCTCTTGGT TTGGGCATCG

1261 GGAGGTGGAA AAATTGGCAT CCTTATATGG AATTCAGTTA CGGACAGGAT GCTTTTGCAA

1321 TCCTGGTGCT TGTGCAAAAT ATCTTGGCTT ATCTCACTCA GATCTTCTTT CTAACTTAGA

1381 GGCTGGGCAT GTTTGCTGGG ATGACAATGA TGTAATAAAT GGAAAACCAA CTGGAGCGGT

1441 TAGAGTATCT TTTGGTTACA TGTCAACTTA TGAAGATGCT AAGAAATTTA TTGATTTTAT

1501 AAGAAGTTCC TTCATATCCA TGCCAAGTGA GTTTGAGAAA CGGTACTTGC TCAGATCAAA

1561 GTCAATTCCA TGTCCAACTG AAGGCTTTGA AGATCGACTA CCAAGTTCTG CTTGCCACCT

1621 TAAGTCTATA ACCATCTATC CAATAAAATC ATGCGCAGGG TTCAGTGTGA ATAGTTGGCC

1681 TCTGAGCAAT ACGGGTTTGC AGTATGATCG AGAATGGCTT CTTAAAAGCT TGACCGGTGA

1741 AATTCTTACA CAAAAGAAGG 得两次 5 ' RACE获得的序列 SEQ ID No: 13和 SEQ ID No: 18， 与 3 ' RACE 获得的序列 SEQ ID No: 8拼接， 获得 SEQ ID NO: 19:

1 GGGGGGGGGG GGGAGTTCTC TGCAAATGGA CGGCAAGGAA GAGTTTCTCA AGGAATTCGG

61 TGACTTTTAC GGCTACCCCA ACGCCCCTAA GTCCATCGAC GAAATTCGTT CCACCGAGTT

121 CAAGCGATTA GAAGATACTG TGTATTTGGA TCATGCTGGA GCAACCCTTT ACTCCGAGTT

181 GCAGATGGAA GCTATCTTTA AAGATCTTAC GACTACTGTT TATGGAAATC CTCATAGCCA

241 AAGTGATTCT AGTTCAGCCA CTAGTGACAT TGTAAGGGAA GCACGCAGAC AGGTCCTCGA

3 01 TTACTGCAAT GCTTCTCAAA AGGATTATAA ATGTATATTC ACTTCTGGGG CAACAGCTGC

361 ATTGAAACTC ATAGGGGAGA ACTTTCCCTG GAGCTGTAAG AGCACCTTTA TGTACACAAT

421 GGAAAATCAT AATAGCGTAC TTGGTCTTAG AGAATATGCT CTCAATCAAG GAGCTGCAGC

481 CTTTGCAGTT GATATAAATG AGGCTGTGGA TCAGGGTGGA GCATCTAGAA GCTCTCTGAC

541 TTCATTTAAG GTGATACAGC ATCCAGTGCA GATAAGAAAT GAAGCAAAAG TTTTGGAAGG

601 GGAGCTTACA GGTGATGCTT ACAATTTATT TGCCTTCCCC TCAGAGTGCA ATTTCTCTGG

661 AATGAGATTT GGCCTTGATT TGGTGAATAA TGTTAAGCAA AATGCAGAAA AATTTTTGGA

721 AGGCTCTCCA TATTCAAAGG GACATTGGAT GGTCTTAATC GATGCTGCAA AGGGCTTTGC

781 AGCACAACCT CCCGATTTGT CACTTTATCC TGCAGATTTT GTTGTAATCT CTTTTTATAA

841 GTTGTTTGGC TATCCAACTG GACTTGGTGC TCTCATAATT CGAAATGATG CTGCTAAGTT

901 ATTGAAGAAG ACCTATTTCA GTGGAGGCAC TGTTGCTGCT TCAATTGCTG ACATTGACTT

961 TGTTAGAAGA AGAGAAGCTG TTGAGGAGCA GTTCGAGGAT GGCACCATTT CATTTCTTAG

1021 CATAGCATCT ATTCGTCATG GATTTAAGAT ATTCAATACC CTCACTACAT CTGCAATGTG

1081 CTGGCATACT ATGTCACTTA CCAAGTTTTT GAAGAGGAAG CTCTTAGCTT TGCGACATGA

1141 AAATGGAGAA AGTGTCTGCA CTCTTTATGG CAATTGTCCT CTGAAGGTTT CTAGGCATGA

12 01 CTGTGGCTCT ATTGTCTCGT TTAACCTGAA AAGGCCAGAT GGCTCTTGGT TTGGGCATCG

1261 GGAGGTGGAA AAATTGGCAT CCTTATATGG AATTCAGTTA CGGACAGGAT GCTTTTGCAA

1321 TCCTGGTGCT TGTGCAAAAT ATCTTGGCTT ATCTCACTCA GATCTTCTTT CTAACTTAGA

1381 GGCTGGGCAT GTTTGCTGGG ATGACAATGA TGTAATAAAT GGAAAACCAA CTGGAGCGGT

1441 TAGAGTATCT TTTGGTTACA TGTCAACTTA TGAAGATGCT AAGAAATTTA TTGATTTTAT

1501 AAGAAGTTCC TTCATATCCA TGCCAAGTGA GTTTGAGAAA CGGTACTTGC TCAGATCAAA

1561 GTCAATTCCA TGTCCAACTG AAGGCTTTGA AGATCGACTA CCAAGTTCTG CTTGCCACCT

1621 TAAGTCTATA ACCATCTATC CAATAAAATC ATGCGCAGGG TTCAGTGTGA ATAGTTGGCC

1681 TCTGAGCAAT ACGGGTTTGC AGTATGATCG AGAATGGCTT CTTAAAAGCT TGACCGGTGA

1741 AATTCTTACA CAAAAGAAGG TTCCTGAAAT GTTCCTTATT AAAACCTTCA TTAACCTCAA

18 01 TCTGCAGATA TTGTCTGTAG AGTCACCCTA TTGCAAAAGC AAATTGCAGA TCAAACTAGA

1861 CTCCGATTCA TATCTTCCTG GGAAAGAAGA GTTTTATTTG CAGAACCAAA GATATGAAGT

1921 CCAATGTTAT GAAAATGAAA TCAACCAATG GTTCAGTGAT GCTGTTGGTC AACCTTGTAC

1981 TTTAGTGCGC TGTTGCCAGT CCGAGTATTG CTTCTCTTTG AACAAGAACA GAAGTATGGG

2 041 TATGTGCAGA GATGTGAACA GTAAGGTGAA TTTCGCAAAT GAAGCTCAGT TCCTACTGAT

2101 CTCCGAGGAG AGTGTGTCCG ACCTCAACAA CAGACTATGC TCAAAAACTC AAAAACTCTC

2161 TTGTGGTGCA CCACCTACGT CAACCCGATG AGATTTCGGC CCAATCTTGT CATATCTGGA

2221 GGCGAACCAT ATGCTGAAGA TGGATGGAGA AATCTTAGAA TTGGGAACAC ATATTTTAGT

2281 TCATTAGGTG GTTGCAACCG TTGCCAGATG ATCAACTTTT ATCAGCAAAC AGGACAAGTT

2341 AAGAAGACAA ATGAACCTTT GGCAACTCTA GCATCATACA GGAGAGTAAA GGGGAAGATT

24 01 TTGTTTGGGA TATTGCTGAG GTACGATCCT GGTAATAAGG CTAGGTTGGA TACAAATTCA

2461 TGGCTTAAGG TAGGAGATGA AGTTCATTCA AATTCGGAAT AACAGGTGTT AAAACAAAAA 2521 AAAAAAAAAA AAA

根据 SEQ ID NO: 19序列设计一对引物如下:

GhMCSU-lF: SEQ ID NO : 20：

AGTTCTCTGCAAATGGACGG

GhMCSU-lR: SEQ ID NO : 21：

CACCTGTTATTCCGAATTTGAA 通过 SEQ ID NO:20和 SEQ ID NO: 21来克隆 GhMCSU-1全长编码序列。

采用 stratagene的 PfUUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以棉花的 cDNA为模板 进行 PCR反应。 50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μ 1 25 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μ M 的引物 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21各 2.0 μ 1， 以及 37.5 μ 1的双蒸水。 PCR反 应条件： 95 °C预变性 2 min， 35个循环 （95 °C 变性 25 s， 54°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin30s) , 72 °C 延伸 5 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心， 去上清，晾干，用 21 μ 1双蒸水溶解。加入 2.5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0.5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2.5 l l0 X Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 2400 bp的 DNA片段回 收（Omega回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上（得到 GhMCSU-1 -pGEM质粒）， 转化 JM109(方法同上)， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%，-80°C保存备用。 SEQ ID NO: 20与 SEQ ID NO: 21进行菌液 PCR 扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 4个阳 性克隆,送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序,序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋 白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

MCSU-1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MDGKEEFLKE FGDFYGYPNA PKS IDE IRST EFKRLEDTVY LDHAGATLYS ELQMEAIFKD

61 LTTTVYGNPH SQSDSSSATS DIVREARRQV LDYCNASQKD YKCIFTSGAT AALKLIGENF 121 PWSCKSTFMY TMENHNSVLG LREYALNQGA AAFAVDINEA VDQGGASRSS LTSFKVIQHP

181 VQIRNEAKVL EGELTGDAYN LFAFPSECNF SGMRFGLDLV NNVKQNAEKF LEGSPYSKGH

241 WMVLIDAAKG FAAQPPDLSL YPADFVVISF YKLFGYPTGL GALI IRNDAA KLLKKTYFSG

301 GTVAAS IADI DFVRRREAVE EQFEDGTISF LS IASIRHGF KIFNTLTTSA MCWHTMSLTK

361 FLKRKLLALR HENGESVCTL YGNCPLKVSR HDCGSIVSFN LKRPDGSWFG HREVEKLASL 421 YGIQLRTGCF CNPGACAKYL GLSHSDLLSN LEAGHVCWDD NDVINGKPTG AVRVSFGYMS

481 TYEDAKKFID FIRSSFISMP SEFEKRYLLR SKS IPCPTEG FEDRLPSSAC HLKS ITIYPI

541 KSCAGFSVNS WPLSNTGLQY DREWLLKSLT GE ILTQKKVP EMFLIKTFIN LNQQILSVES

601 PYCKSKLQIK LDSDSYLPGK EEFYLQNQRY EVQCYENE IN QWFSDAVGQP CTLVRCCQSE

661 YCFSLNKNRS MGMCRDVNSK VNFANEAQFL LISEESVSDL NNRLCSKTQK LSCGAPPNVN

721 PMRFRPNLVI SGGEPYAEDG WRNLRIGNTY FSSLGGCNRC QMINFYQQTG QVKKTNEPLA

781 TLASYRRVKG KILFGILLRY DPGNKARLDT NSWLKVGDEV HSNSE *

GhMCSU-1 编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGACGGCA AGGAAGAGTT TCTCAAGGAA TTCGGTGACT TTTACGGCTA CCCCAACGCC

61 CCTAAGTCCA TCGACGAAAT TCGTTCCACC GAGTTCAAGC GATTAGAAGA TACTGTGTAT

121 TTGGATCATG CTGGAGCAAC CCTTTACTCC GAGTTGCAGA TGGAAGCTAT CTTTAAAGAT

181 CTTACGACTA CTGTTTATGG AAATCCTCAT AGCCAAAGTG ATTCTAGTTC AGCCACTAGT

241 GACATTGTAA GGGAAGCACG CAGACAGGTC CTCGATTACT GCAATGCTTC TCAAAAGGAT

301 TATAAATGTA TATTCACTTC TGGGGCAACA GCTGCATTGA AACTCATAGG GGAGAACTTT

361 CCCTGGAGCT GTAAGAGCAC CTTTATGTAC ACAATGGAAA ATCATAATAG CGTACTTGGT

421 CTTAGAGAAT ATGCTCTCAA TCAAGGAGCT GCAGCCTTTG CAGTTGATAT AAATGAGGCT

481 GTGGATCAGG GTGGAGCATC TAGAAGCTCT CTGACTTCAT TTAAGGTGAT ACAGCATCCA

541 GTGCAGATAA GAAATGAAGC AAAAGTTTTG GAAGGGGAGC TTACAGGTGA TGCTTACAAT

601 TTATTTGCCT TCCCCTCAGA GTGCAATTTC TCTGGAATGA GATTTGGCCT TGATTTGGTG

661 AATAATGTTA AGCAAAATGC AGAAAAATTT TTGGAAGGCT CTCCATATTC AAAGGGACAT

721 TGGATGGTCT TAATCGATGC TGCAAAGGGC TTTGCAGCAC AACCTCCCGA TTTGTCACTT

781 TATCCTGCAG ATTTTGTTGT AATCTCTTTT TATAAGTTGT TTGGCTATCC AACTGGACTT

841 GGTGCTCTCA TAATTCGAAA TGATGCTGCT AAGTTATTGA AGAAGACCTA TTTCAGTGGA

901 GGCACTGTTG CTGCTTCAAT TGCTGACATT GACTTTGTTA GAAGAAGAGA AGCTGTTGAG

961 GAGCAGTTCG AGGATGGCAC CATTTCATTT CTTAGCATAG CATCTATTCG TCATGGATTT

1021 AAGATATTCA ATACCCTCAC TACATCTGCA ATGTGCTGGC ATACTATGTC ACTTACCAAG

1081 TTTTTGAAGA GGAAGCTCTT AGCTTTGCGA CATGAAAATG GAGAAAGTGT CTGCACTCTT

1141 TATGGCAATT GTCCTCTGAA GGTTTCTAGG CATGACTGTG GCTCTATTGT CTCGTTTAAC

1201 CTGAAAAGGC CAGATGGCTC TTGGTTTGGG CATCGGGAGG TGGAAAAATT GGCATCCTTA

1261 TATGGAATTC AGTTACGGAC AGGATGCTTT TGCAATCCTG GTGCTTGTGC AAAATATCTT

1321 GGCTTATCTC ACTCAGATCT TCTTTCTAAC TTAGAGGCTG GGCATGTTTG CTGGGATGAC

1381 AATGATGTAA TAAATGGAAA ACCAACTGGA GCGGTTAGAG TATCTTTTGG TTACATGTCA

1441 ACTTATGAAG ATGCTAAGAA ATTTATTGAT TTTATAAGAA GTTCCTTCAT ATCCATGCCA

1501 AGTGAGTTTG AGAAACGGTA CTTGCTCAGA TCAAAGTCAA TTCCATGTCC AACTGAAGGC

1561 TTTGAAGATC GACTACCAAG TTCTGCTTGC CACCTTAAGT CTATAACCAT CTATCCAATA

1621 AAATCATGCG CAGGGTTCAG TGTGAATAGT TGGCCTCTGA GCAATACGGG TTTGCAGTAT

1681 GATCGAGAAT GGCTTCTTAA AAGCTTGACC GGTGAAATTC TTACACAAAA GAAGGTTCCT

1741 GAAATGTTCC TTATTAAAAC CTTCATTAAC CTCAATCAGC AGATATTGTC TGTAGAGTCA

1801 CCCTATTGCA AAAGCAAATT GCAGATCAAA CTAGACTCCG ATTCATATCT TCCTGGGAAA

1861 GAAGAGTTTT ATTTGCAGAA CCAAAGATAT GAAGTCCAAT GTTATGAAAA TGAAATCAAC

1921 CAATGGTTCA GTGATGCTGT TGGTCAACCT TGTACTTTAG TGCGCTGTTG CCAGTCCGAG

1981 TATTGCTTCT CTTTGAACAA GAACAGAAGT ATGGGTATGT GCAGAGATGT GAACAGTAAG 2041 GTGAATTTCG CAAATGAAGC TCAGTTCCTA CTGATTTCCG AGGAGAGTGT GTCCGACCTC

2101 AACAACAGAC TATGCTCAAA AACTCAAAAA CTCTCTTGTG GTGCCCCACC TAACGTCAAC

2161 CCGATGAGAT TTCGGCCCAA TCTTGTCATA TCTGGAGGCG AACCATATGC TGAAGATGGA

2221 TGGAGAAATC TTAGAATTGG GAACACATAT TTTAGTTCAT TAGGTGGTTG CAACCGTTGC

2281 CAGATGATCA ACTTTTATCA GCAAACAGGA CAAGTTAAGA AGACAAATGA ACCTTTGGCA

2341 ACTCTAGCAT CATACAGGAG AGTAAAGGGG AAGATTTTGT TTGGGATATT GCTGAGGTAC

2401 GATCCTGGTA ATAAGGCTAG GTTGGATACA AATTCATGGC TTAAGGTAGG AGATGAAGTT

2461 CATTCAAATT CGGAATAA 实施例 3 GhMCSU-1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择含双增强子的 35S及终止子 Tnos分别作为 GhMCSU-1基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 22和 SEQ ID NO: 23以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏 远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 y l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 pBI121 , 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO :22禾 P SEQ ID NO: 23各 2.0 μ 1， 以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 （94°C 变性 30 s， 56 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO : 22 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO : 23 :

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 24禾 P SEQ ID NO: 25以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP， 1.0 μ 1 ρΒΙ121 , 1.0 μ 1 Prime STAR 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 24禾口 SEQ ID NO: 25各 2.0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33 个循环 (94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。 通过 SacI、EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300-l(promega T4 连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO : 24:

AAGdCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO : 25：

CAGAA rrCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 27以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S启动子。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒， 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 27各 2.0 μ 1， 以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94 °C 变性 30 s， 50°C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Pstl酶切连接到 （连接方法 同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO : 26：

ACTA^CHATGGTGGAGCACGACACTCT

SEQ ID NO : 27：

TGA d AGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC SEQ ID NO: 28和 SEQ ID NO: 29扩增 GhMCSU-1 (模板是实施例 2所获得的阳 性 GhMCSU-1 -pGEM质粒），采用 stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 10 X PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μ 1 25 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 GhMCSU-1 -pGEM质粒， 1.0 μ 1 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μ M 的引物 SEQ ID NO: 28和 SEQ ID NO: 29各 2.0 μ 1， 以及 37.5 μ 1的双蒸水。 PCR反 应条件： 95 °C预变性 2 min, 35个循环 (95 °C 变性 25 s， 56°C退火 30 s， 72V 延伸 lmin30s) , 72 °C 延伸 5 min。 通过 BamHI、 Sad 酶切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300-3 , 获得植物表达载体 35S- GhMCSU-1 -2300。

SEQ ID NO : 28：

TGA GGA fCCATGGACGGCAAGGAAGAG

SEQ ID NO : 29：

AAGdCTCCACCTGTTATTCCGAATTTGA 实施例 4 35S-GhMCSU-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc) 感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 单斑接种， 28 °C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml 链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD₆。。值为 0.4， 形成 种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB 液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h至 OD_6QQ=0.8。 冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇 匀一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min， 弃上清液； 加入一 定量冰预冷 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用冰预冷的 10%甘油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μ 1/ 管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μ ΐ的感受态细胞中加入 1 μ ΐ实施 例 3中所得的阳性 35S-GhMCSU-l-2300质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将所述感受态 细胞和质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底 部， 注意不要有气泡。 将电击杯 （购自 bio-md) 放到电击室的滑道上， 推动滑道将电 击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr" ， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用枪将细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。 取 100— 200 μ 1的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 g/ml利福平、 50 y g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素）， 28°C培养。 筛选阳性 转化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥

待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥 生物资源中心） 播种在泥炭土中， 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16h光照 /8h黑 暗的培养箱中发芽。 7— 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3 : 1 )的口径为 7.5 cm 的塑料钵中， 每钵栽种 7株， 置于 23 °C、 16h光照 /8h黑暗的培养箱中生长。 移栽前 每钵浇营养液 40 ml， 移栽后视土壤湿度及时补充水分。 在生长期间适当浇灌营养液。 按需要每 3-4 周一次 （或者时间更长）。 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多 数植株第一个花序形成后剪去第一个花序， 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步 出现。 当大多数花序约 1一 10 cm高 （剪去第一个花序后 4一 8 d) 时准备浸染。

农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后， 挑取 农杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中 （含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L 链霉素和 100 mg/ L卡那霉素）， 28 °C恒温下 250 r/min振摇过夜培养。再将所得到的 菌液按 1%— 2%接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB 液体培养基中， 28 °C恒温振 摇使农杆菌的浓度达到 OD_6QQ=1.8， 然后在4°C下 3000 r/min离心 15min， 弃去上清液 后用浸染培养基（该浸染培养基含有 5.0%的蔗糖和 0.05% ( 500 L/L)的 Silwet L-77 ) 重新悬浮农杆菌， 悬浮至 OD_6QQ约 0.80。

花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中， 每个口径 9 cm的 容器中加入 200— 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。将植株倒转， 使地上 组织全部浸没在农杆菌悬浮液中 3— 5 s， 并要轻轻搅动。 浸染后植株上应该有一层液 体膜。 浸染过的植株放在塑料盘中， 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在 弱光或暗处过夜， 注意小心防止阳光直射植株。 处理后约 12— 24 h去掉覆盖。 正常培 养植株， 植株进一步生长 3— 5 周， 直至角果变褐变干。 收获种子， 并将种子用离心 管在 4°C下干燥贮存。

转基因种子筛选： 配制含 1/4 MS 大量元素的水溶液,加入 0.8%琼脂粉，用微波炉 加热至琼脂完全溶化，待冷却到 50°C左右,加入所需量的终浓度为 50 mg -L-¹ 的卡那霉 素,摇匀后每培养皿倒 25 mL，置实验台冷却凝固后即可播种。 把称量好的种子倒在一 张普通复印纸上,用手指轻敲复印纸,将种子均匀地播种在水琼脂胶上,盖上培养皿盖, 置 4 °C 冰箱冷处理 72h后,移至 23 °C、 16h光照 /8h黑暗的培养箱中发芽，定期统计种 子发芽和幼苗生长情况,将抗性幼苗及时移栽到营养土中。移栽后视土壤湿度及时补充 水分。 在生长期间适当浇灌营养液。 取生长 20天的拟南芥叶片 0.1 g， 提取 DNA， 用 SEQ ID NO: 28禾 P SEQ ID NO:29扩增 GhMCSU-1： ( 50 μ ΐ PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 28和 SEQ ID NO: 29 各 2.0 μ 1， 以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 （94°C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min)， 将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号 （ Tl Al-Tl A15 )， 并保存。 实施例 6 过表达 GhMCSU-1的转基因拟南芥 Tl代植株的耐旱模拟实验及功能鉴 定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1A1-T1A6及对照拟南芥种子分别播种在 蛭石上， 每盆播种 10颗种子， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 每 7天浇一 次 1/2MS , 培养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4棵苗， 用于干旱实验。 转基因 拟南芥、 对照拟南芥干旱 14天 (不浇水)， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。

T1代转基因植株 （T0代转基因植株的种子长成的植株） 的抗旱性鉴定表明， 对照植 株都萎蔫严重， 而 T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6 六个株系共 24棵 （每 株系各 4棵） 拟南芥中有 22棵能够存活并继续生长显现出明显的耐旱性 （参见图 3a 禾口 3b， 以 T1A1、 T1A3为例， T1A2、 T1A4、 T1A5、 Tl A6的结果与 Tl Al、 T1A3类 似， 在此未示出）。 实施例 7 干旱胁迫后 ABA变化的测定

ABA 是与逆境胁迫相关的一种植物激素，可以作为信号分子调控多个逆境诱导基 因的表达,从而提高植物的抗逆能力。 我们取干旱胁迫 10天和正常生长条件下的转基 因植株 （T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6 ) 及对照植株 （CK1、 CK2 ) 叶 片各 0.2 g左右， 用中国农业大学作物化控研究中心制备的试剂盒测定 ABA含量 (见 图 4)。 实验结果表明， 无论干旱处理还是对照条件下， 转基因植株的 ABA含量均高 于对照 （CK1、 CK2 ) , 证明 GhMCSU-1基因可以正调控植物内源的 ABA含量。 实施例 8 在转录水平上验证 GhMCSU-1蛋白表达

分别取对照拟南芥植株、 不耐旱转基因拟南芥 T1代植株、 耐旱转基因拟南芥 T1 代植株 （分别属于 T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6六个株系） 的干旱 10 天的叶片各 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen)提取的总 RNA。用 HITACHI 公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各 个 RNA浓度。 依照 invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示 方法进行反转录（2 μ g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 6)。 通过 SEQ ID NO:28和 SEQ ID NO: 29扩增 GhMCSU-1， 检测 MCSU-1蛋白相对表达情况。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 28禾 P SEQ ID NO:29各 2.0 μ 1， 以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 29个循环 （94°C 变性 30 s， 56 °C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。

产物电泳结果如图 5所示： Ml为 DNA Ladder Marker(Lambda DNA/EcoR I+Hind III Marker,Fermentas) 、 M2为 DNA Ladder Marker (DL2000,TakaRa) ; 1-5为不耐旱 转基因拟南芥 Tl代植株； 6-9为对照非转基因的拟南芥； 10-15为耐旱转基因拟南芥 T1代植株（分别属于上述六个株系）。图中所示 PCR产物电泳条带大小与 GhMCSU-1 的大小一致 （约 2.4 Kbp)。 结果表明， 对照拟南芥没有 GhMCSU-1转录， 耐旱转基因 拟南芥 T1代植株中 GhMCSU-1的转录较强， 不耐旱转基因拟南芥 T1代植株中没有 GhMCSU-1转录或转录很弱。

Claims

权 利 要 求 书

1. 棉花的一个钼辅酶因子硫化酶编码基因， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

2. 一种重组表达载体，其含有权利要求 1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列 与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

3. 权利要求 2所述的载体， 其为附图 2所示的 35S-GhMCSU-l-2300载体。

4. 一种重组细胞，其含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组 表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

5. 一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将权利要求 1所述的基因或者权利要求 2 或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物 是拟南芥。

6. 一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利要 求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物组织。

7. 权利要求 6所述的方法， 其中所述植物是拟南芥。

8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利要求 4 所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。

9. 权利要求 8所述的用途， 其中所述植物是拟南芥。

10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。