CN103773777B - 一个开花诱导基因在拟南芥植株中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个开花诱导基因在拟南芥植株中的应用。转化所述基因的拟南芥，比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。

Description

一个开花诱导基因在拟南芥植株中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个来源于高粱的开花诱导基因在拟南芥植株中的应用。

背景技术

高等植物生命周期主要包括种子萌发、营养器官生长、开花、受精、胚胎发育和种子形成等过程。其中，开花过程涉及由营养生长向生殖生长的转换，花器官的发生，以及在环境因子作用下，内部各种信号的产生、传递和相互作用等，在植物生命周期中占有中心地位，与农作物产量以及品质密切相关。开花诱导即植物由营养生长向生殖生长转换的过程，它受内源发育信号和环境因子的严格控制。开花诱导由一种复杂的信号途径“网络”形成，是一个非常复杂的过程。根据近年来对拟南芥、金鱼草、玉米等几种模式植物的开花调控信号途径的研究，尤其是对拟南芥的研究，提出了四种开花诱导途径：光周期(Photoperiod)途径、春化(Vernalization)途径、自发(Autonomous)途径和赤霉素(GA)途径。

本研究以高粱品种Roma为试验材料，采用同源克隆的策略，对高梁开花诱导相关的基因SbAGL6进行克隆和测序。高粱是短日照作物，其开花期受光周期的诱导。日照长度影响着其生长发育，尤其是开花。同时，高梁开花期还受温度、湿度等环境因子以及内源发育信号的影响。高梁的开花时期对其栽培和育种研究具有重要意义，解决花期相遇问题是提高结实率以及制种产量的重要内容。我们以拟南芥中开花诱导的基因AtAGL6的序列为参考序列，克隆了高粱中的相应同源基因，命名为SbAGL6，并通过基因工程操作，将其转到拟南芥中，并处于组成型超表达启动子35S的控制下。表型鉴定的结果表明，转基因拟南芥比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。高粱SbAGL6基因具有使植物提早开花的能力，是进行农作物花期性状改良的一个重要候选基因。

发明内容

本发明的目的是提供一个开花诱导基因在拟南芥植株中的应用。

本发明的技术方案是：一个高粱开花诱导基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

SEQ ID NO：1

所述基因根据拟南芥AtAGL6基因的序列，通过同源序列比对获得高粱的SbAGL6基因序列，通过扩增、连接、植物转化等分子生物学操作而获得。具体如下：

采用生物信息学的方法，获得SbAGL6基因序列。利用PRIMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列。提取高粱6B叶片的RNA，将1μg的RNA逆转录为cDNA作为扩增的模板备用。用设计的特异引物进行扩增。将扩增的产物连接到克隆载体上。转入大肠杆菌，筛选阳性的进行测序，获得SEQ ID NO：1所示的基因序列。

将上述克隆到的基因连接到超表达载体，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。结果表明转基因拟南芥比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。

附图说明

图1野生型拟南芥生长四周的图；

图2含有SbAGL6基因的拟南芥生长四周的图；

图3转基因的拟南芥生长四周喷施DEX过表达SbAGL6基因，4d后开花的图。

具体实施方式

下面以高粱的叶片作为试验材料详细说明制备方法。

1.总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液后琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80℃保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScript^TM III First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR，步骤如下：

1)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA；Oligl dT；10mM dNTP。混匀，轻甩离心管，使溶液至底部；

2)离心管置于PCR内，65℃保温5min；

3)迅速取出置于冰上冷却1min以上，将离心管轻微离心；

4)在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strand Buffer；0.1M DTT；Recombinant RNase Inhibitor；SuperScript^TM III RT；

5)轻微震荡混匀后短暂离心；

6)50℃保温50min；

7)70℃保温15min，-20℃保存。

高粱β-Actin F(GenBank accession No.X79378)检测反转录产物。PCR扩增程序：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min。2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.SbAGL6的分离

PCR扩增引物采用“Primer 5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用VectorNTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。用cDNA为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，10×phushion HF buffer，10mmol/L dNTPs，10mM基因特异引物，phusionDNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃1min，30个循环的程序为98℃10s，58℃20s，72℃1min 10s，最后72℃10min。本试验PCR扩增选用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶。

4.PCR产物的加A连接

利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，可用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物、5×Taq buffer、10mM dATP、Taq酶，72℃保持15分钟，取出2μl加A后的PCR回收产物加入2×T₄连接酶缓冲液、pGEM-T载体(50ng/μl)、T₄DNA连接酶(3U/μl)连接到pGEM-T载体上，pGEM-T载体购自Promega公司。

5.连接产物的转化

1)从-80℃冰箱中取出1管(50μl)感受态细胞，置冰上。

2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。

3)42℃水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟。

4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h。

5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟。

6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。

7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

6.重组质粒的PCR鉴定

本实验所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T₇启动子，下游有SP₆启动子和M₁₃启动子，所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下：PCR扩增体系包括10×buffer(含MgCl₂)，dNTP 10mmol/L，T₇和SP₆引物(20ng/μl)，Taq酶，模板为转化后的白色菌斑。反应条件为：94℃，10min；35个循环：94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；72℃延伸5min。最后，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，选择合适大小的阳性克隆测序。测序在华大基因测序部完成。

表达载体的构建：根据SbAGL6基因的ORF序列，将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列，从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段，用于构建表达载体。

7.带有attB位点的基因序列的扩增

以通过测序鉴定的质粒为模板SbAGL6F，SbAGL6R，为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：

反应总体系50μl，包括反转录产物1.5μl，10×phushion HF buffer 10μl，10mmol/LdNTPs 1μl，10mM基因特异引物2.5μl，phusion DNA聚合酶0.5μl，DMSO 1.5μl，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。50μl全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。

8.入门载体的构建

利用得到的AttB-SbAGL6产物和pDONR(Amp)进行BP反应，SbAGL6基因编码序列将pDONR(Amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T7启动子和Sb-AGL6R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物、pDONR(amp)vector、BP clone II enzyme、dd H₂O。

9.表达载体的构建

将鉴定正确的质粒连接到pGWB14表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒、pGWB14 vector、LR clone IIenzyme、dd H₂O。

10.重组质粒pKIGW-SbAGL6农杆菌的电击转化

①取50μl的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μl已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时。

②将①中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷。

③用Bio--Rad细胞融合仪进行电击。

④电击后立即加入1ml不含抗生素的SOC培养基，混合均匀后移至2ml离心管中，28℃震荡培养2h。

⑤8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。

11.PCR验证和菌种保存

挑取平板上长出的单菌落，菌落PCR扩增鉴定。将鉴定正确的菌种取菌液800μl加入400μl甘油，混匀，液氮速冻，-80℃保存备用。

12.转化拟南芥植株

(1)种植野生型拟南芥。

(2)植株发育花蕾后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展，在剪顶后的3-4天内，准备农杆菌的转化；

(3)取鉴定正确且保存于-80℃的菌种接种于含有5ml卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃，培养2d。于5ml含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中活化菌种，28℃，培养1d。将活化后的菌液取1ml于200ml接种于含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。

(4)将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了SilwetL-77的蔗糖溶液液中浸泡1min。

(5)把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T₀代种子。

13.拟南芥T₀代种子筛选

(1)将干燥2周后的T₀代种子先用75％酒精消毒1分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上。

(2)4℃春化两天后置22℃、16h光照条件下，10d后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。于与转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。10后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8～10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。

14.转基因拟南芥的PCR鉴定

用SIGMA公司的Extract-N-Amp^TM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：

(1)DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入Extraction Solution，95℃保10min，加入Dilution Solution，2℃-8℃储存以备用。

(2)PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH₂O、Extract-N-Amp PCR Readymix、10mM Primer F、10mM Primer R、Leaf disk extract；PCR扩增反应程序为：94℃3min，30个循环包括94℃1min、60℃1min、72℃1min30sec，然后72℃10min。

15.转基因植物的表型鉴定

直观观察结果可以明显看到，野生型拟南芥和转基因的拟南芥同时生长四周后，转基因拟南芥叶面喷施DEX过表达sbAGL6，4d后转基因拟南芥提前开花。综上所述，野生型拟南芥5-6周，转基因的拟南芥过表达sbAGL6后4d提前开花。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (1)

1.一个开花诱导基因在拟南芥植株中的应用，其特征在于：所述开花诱导基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将所述开花诱导基因连接到超表达载体上，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株，所述转基因拟南芥植株比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。