CN112322619A

CN112322619A - 一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用

Info

Publication number: CN112322619A
Application number: CN202011155055.1A
Authority: CN
Inventors: 束德峰; 崔大勇; 刘婧; 郭宁; 张雪倩; 张宗慧
Original assignee: Qilu Normal University
Current assignee: Qilu Normal University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112322619B

Abstract

本发明公开了一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用，该启动子对高温胁迫信号可以高效响应，通过RNA测序筛选出受高温高效诱导表达的基因，克隆其启动子序列，将该启动子序列构建入含GUS标签的载体中用以转化拟南芥，提高作物耐高温能力。该启动子对于克服现有的遗传改良技术的缺陷和基因调控序列资源的不足，提高作物耐高温能力具有重要意义。

Description

一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

植物在生长发育过程中会受到各种胁迫的影响，其中高温是对植物影响尤其严重的一种非生物胁迫。随着全球气候变暖，高温胁迫愈发成为影响植物生长发育和作物产量的重要的胁迫因子。高温会影响植物的各种生理生化过程，如抑制光合作用、改变细胞膜稳定性、改变激素和次级代谢物的合成、引起氧化胁迫等(邓朝军等,2012)，同时高温也是限制农作物产量的一个重要因素。因此，解析植物耐受干旱胁迫的分子机制，培育高产、抗逆农作物新品种成为高度紧迫的重大问题。

转录调控是植物应答逆境胁迫的一个重要过程，转录活性取决于转录因子(TFs)以及与其结合的顺式作用元件，转录因子在植物非生物胁迫应答中至关重要。近年来的研究表明，和植物高温胁迫抗性相关的转录因子主要有三类，分别是：热激转录因子、脱水应答元件结合蛋白、多蛋白结合因子。另外一些植物体内较大的转录因子家族也部分参与热胁迫应答，比如WRKY转录因子、MYB类转录因子、NAC转录因子、碱性亮氨酸拉链等。

转录水平的调控是影响真核生物基因表达的主要环节，而转录活性与转录因子息息相关，植物响应非生物胁迫的过程往往受到多种类型转录因子的调控。因此，在植物中开展高温胁迫转录因子的筛选将有助于高温胁迫作用机理的解析，对培育耐高温品种具有重要的理论与实践意义。

传统育种方法在耐高温育种中的作用十分有限，主要原因在于：(1)耐非生物胁迫是由多基因控制，利用传统育种方法获得复杂性状和基因的组合比较困难；(2)相兼容品种间已知的抗性相关基因较少，且已知基因间也存在复杂的连锁关系(Grover et al.,2013)。因此，利用转基因技术提高植物的耐热能力成为较为有效的手段。近年来，利用转基因方法提高植物耐高温能力的研究主要通过四种途径：1.改变热激蛋白的表达水平；2.改变细胞渗透性；3.改变细胞膜流动性；4.提高细胞排毒、解毒能力。

然而，当前植物抗逆基因工程多采用组成型强启动子启动抗逆基因过量表达的方式，虽然使转基因植物的抗逆性得以提高，但对植物的一些生理代谢活动却有抑制作用。例如：据Kasuga等报道，组成型启动子CaMV35S启动DREB基因在拟南芥中表达，虽提高了抗逆性，但植株矮化、生长畸形、籽粒数减少；由诱导型启动子rd29A启动的DREB基因在拟南芥中的表达，不仅提高了植株的抗逆性，而且避免了对生长的负面影响。因此鉴定和克隆诱导型启动子，对于植物抗逆基因工程的研究是十分必要的。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用，该启动子对高温胁迫信号可以高效响应，通过RNA测序筛选出受高温高效诱导表达的基因，克隆其启动子序列，将该启动子序列构建入含GUS标签的载体中用以转化拟南芥，提高作物耐高温能力。

一种源于拟南芥的热响应启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有上述启动子的重组表达载体，所述重组表达载体为pMDC163。

上述重组表达载体的构建方法：以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，扩增获得启动子全长序列，将获得的启动子序列连接入下游含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)标签的pMDC163载体中。

上述启动子或在重组表达载体在启动耐高温基因表达中的应用，其特征在于，所述耐高温基因为基因AT2G41240。

上述启动子或重组表达载体在提高拟南芥耐热性能中的应用。

一种提高拟南芥耐热性能的方法，使用至少一个启动子启动至少一个高温诱导基因在拟南芥中超量表达，即可获得具有耐热性能的拟南芥。

进一步的，上述高温诱导基因是高温诱导基因AT2G41240，上述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：

本发明提供一种受高温诱导的启动子，该启动子序列可作为高温诱导型启动子用于植物学研究和作物遗传改良，将启动子导入拟南芥中诱导高温诱导基因过量表达，从而获得耐热植株。该启动子对于克服现有的遗传改良技术的缺陷和基因调控序列资源的不足，提高作物耐高温能力具有重要意义。

附图说明

图1高温处理下AT2G41240的相对表达量(半定量PCR结果)。

图2高温处理下标记基因的表达分析(GUS染色结果)。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例

一、筛选拟南芥高温诱导基因

将野生型哥伦比亚拟南芥种子正常培养7天，然后转到28℃下高温处理0、3、12、48h。提取植物总RNA进行RNA测序。从测序结果中筛选到一个高温诱导下显著高表达的基因。如表1所示，其表达可被高温高效诱导。

表1高温处理下AT2G41240的相对表达量(RNA测序结果)

具体实验方法如下：

(一)植物材料的培养方法：

将哥伦比亚野生型拟南芥种子消毒后播在MS培养基上，黑暗下4℃春化2天，然后转到16小时光照/8小时黑暗条件下，18℃正常生长7天。

(二)植物材料高温处理方法：

将生长的拟南芥植株转到38℃高温下，分别处理0、3、12、48h。

(三)植物总RNA提取方法：

1.在无RNase的离心管中，加入450μl裂解液(使用前加入1％β-巯基乙醇)，取适量植物叶片，在裂解液中用匀浆器迅速研磨成匀浆，涡旋剧烈震荡混匀，室温裂解5min。

2.12,000rpm离心2min，将过滤柱放在收集管中，上清转移至过滤柱上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至无RNase的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

3.加入1/2体积的无水乙醇，混匀后一起转入吸附柱中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4.向吸附柱中加入350μl去蛋白液，12,000rpm离心1min。

5.DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的无RNase离心管中，加入70μl工作缓冲液，轻柔混匀。

6.向吸附柱中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

7.向吸附柱中加入350μl去蛋白液，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

8.向吸附柱中加入500μl漂洗液(使用前加入3倍体积乙醇)，室温静置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

9.重复步骤8。

10. 12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置3min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱放入一个新的无RNase离心管中，向吸附膜的中间部位滴加30-100μl无RNase ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。

(四)高温诱导基因的筛选：

将提取的对照组和处理组植株的总RNA，利用RNA高通量测序技术(深圳华大基因)筛选到一个高温诱导下显著高表达的基因，在拟南芥基因组数据库中查询得到该基因的基因座号为AT3G56970。如表1所示，其表达可被高温高效诱导。

二、高温诱导基因AT2G41240表达量的验证将野生型哥伦比亚拟南芥种子正常培养7天，然后转到38℃高温下分别处理0、1、2、4、8、16h，提取植株的总RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，以内源看家基因GAPC为内参进行qRT-PCR，以分析AT2G41240的表达量。

具体实验方法如下：

(一)植物材料的培养和高温处理方法：

将野生型哥伦比亚拟南芥种子消毒后播在MS培养基上，4℃下避光春化2天，然后转到18℃条件下，以16小时光照/8小时黑暗培养7天。将生长的拟南芥植株转到38℃高温下，分别处理0、1、2、4、8、16h。

(二)植物RNA反转录成cDNA：

用前述方法提取植物总RNA，以RNA为模板进行反转录，具体方法如下：

1.按以下成分配置反应体系：

2.混匀后，65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

3.按以下成分继续配置反应体系：

4.缓慢混匀后，按下列条件进行反转录反应：

42℃ 60min

95℃ 5min

冰上冷却 5min

(三)半定量PCR：

以合成的cDNA为模板，以内源看家基因GAPC为内参进行半定量PCR，反应体系如下：

三、高温诱导基因AT2G41240的启动子序列的分析和克隆

在拟南芥相关公共数据库(https://www.arabidopsis.org/)上查找到该基因，其基因座号为AT2G41240。选取该基因翻译起始密码子位点上游2023个碱基作为启动子区域(序列如SEQ ID NO:1)，将序列上传至启动子分析公共数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行分析。结果显示，在其转录起始位点上游57和1997个碱基处各有一个温度应答相关的顺式作用元件“CCGAAA”。

以AT2G41240_proF(5’-TCCAACTTCGATACTCGGT-3’)和AT2G41240_proR(5’-TTTGAGTTTTAGATAGTTAC-3’)为引物扩增该启动子的全长序列，将克隆到的启动子序列连接入下游含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)标签的pMDC163载体中。

四、含启动子序列载体的遗传转化

将含有启动子序列和下游GUS标签的pMDC163载体转化至EHA105宿主农杆菌。

通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化将其导入到拟南芥哥伦比亚型中，转化共获得30株独立的转基因拟南芥植株。具体步骤：将抽薹的植物上已开的花和角果剪掉，保留未开放的花蕾；将要转化植物的农杆菌接种到含有卡那霉素50mg/L的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，28℃220rpm过夜培养至OD₆₀₀约为1.6；室温下6000rpm离心10min收集菌体；倒掉上清，加入等体积浸染液(5.0％蔗糖溶液+0.025％(v/v)Silwet-L77)重悬菌体；重悬好的菌液放入培养皿中，将拟南芥的花茎在浸染液中充分浸泡；转化完毕的植株浇水并用塑料袋罩住保湿暗培养，约12h后去掉塑料袋正常培养；转化3周后收取转基因材料种子，在含潮霉素20mg/L的1/2MS培养基上筛选获得的T1代转基因阳性苗，T1代植株自交一代收取T2代种子，通过T2代抗性分离比可以确定各株系转基因插入的拷贝数；自交一代收取T3代种子，通过抗性分离比选择纯合的T3代转基因株系。

五、GUS染色验证启动子能被高温诱导

为进一步验证上述启动子能被高温诱导，我们将T3代纯合的转基因株系在1/2MS培养基上于22℃光照培养10天，然后转到38℃下高温处理转基因材料0、2、4、8h后，对植株进行GUS染色。具体步骤为：将植物材料放置于90％的丙酮中固定20min，用漂洗液漂洗3次，加入GUS染液进行染色处理。染色结束后，用70％乙醇脱色完全后，用显微镜记录结果。如图2所示，pAT2G41240::GUS在子叶中表达，高温处理2h后表达开始被增强，在高温处理4h时，莲座叶及根毛区GUS染色程度最大。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁师范学院

<120> 一种源于拟南芥的热响应启动子及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2023

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

tccaacttcg atactcggtt aagacctctc ctacgtgcat tgagatgtga agattggttt 60

gatgctgtag ctgtttcagc agaagtaaga taacctcttt tcgtttatat atttttgttg 120

atgatccgaa acgttttggg agtgagtgtg taaatactta aggtttttgg ttgaatgttt 180

aacaggttga agcggaaaaa ccaaacccga ctatcttctt aaaagcttgt gagttattag 240

aagtgaatcc cgaggatgcg gttcatgtag gagatgaccg taggaatgat gtatggggag 300

ctagagacgc aggctgtgac gcttggctct ggggaagtga agttacgtca tttaaacagg 360

taaacgaatc tctctggttt tgctcaaatc tctcaagaat ttaaaaatca ttggtttact 420

tgaaatgaat gtgcttttgt tttgttctgc aggttgctca acggatagga gtgaaggtct 480

gaagcaaaag catatgagag aaatggttca gagacatgtt cagacttcag ttttagcttc 540

ttcttttttt gtgtgagcag ttttgtatat tccatttctc ttttgtagca taatgtgtgt 600

aatatatgtt gcggctaatg tagaaaacca gaaaacaatg tataataaaa gatcaataat 660

aagcttcatg atcgttctta atccgaaccg aagtgttgta ctgttttcga catttgctta 720

taaaagaagg agaattgagt tctttaaata tgtgatcaag aagagatcaa gaaaaatgga 780

aatttagagt tgaacctagg caacgtatgg acaataccaa aagttgccaa catatcaatg 840

gataaatcta atcaaactgt atctgtgatt attgtgggtt gtattttaac attatgttca 900

taattgttga caaatagtca aatacttcac attttagaga ttatctacat ataatgggct 960

acaaacatgt aaactcattg caaaaaaaag aaaaagaaaa agcaattatc ttagggccaa 1020

ttgtttttag agaagcccat ttagatcttt ggatttaaag aggcgtaaat agaatgagga 1080

aaaatccaaa atatctccgt ctctctttta tcctcgtcca tggataatag aatagaatca 1140

aggcttttgg cctgaccgag atgaccggag ttgacttgtg taatatgatc agaaaggcta 1200

taatataata caaaataaac gatagacact acaccatata agatgtaatt aataaattta 1260

aataaggaat atacatttgt taaatatttg taaacactta atgcctacgt atatactaca 1320

tagaaatggt tggattcagg agaaaagcct taacatattc cacgtgattt gctcgtgcct 1380

ctcaatagtc cacgtccacc aaacccgtgt atcctcgtgt acttcttctc agtgtctgtc 1440

tcttttcttc cagctgcgtc ataattcata tttttggtct tagtttactt aacgtatttg 1500

tggtagaaaa atgtgattgc atattctgta tcttcttata gtagttgttc ctatttaact 1560

gttatttttt gctaactaaa taatttgctt aataaatcga atttctattt tgacacatta 1620

taaaatattt agaatttttg attaatactc atacattcat attcatgtaa ttatacgata 1680

caatagtgta aacttatgtt ataaattacg ataagaacat taggatatta atgcctgtat 1740

ccggaggtca acaggtgatc cttggaacat gctcctactt gggggaaaag tgctcaacca 1800

cgtgtcaacg catgtccact cgtgacccaa tgtattttaa tttattacat atacaacaca 1860

gagtcattag tatttttctt gtgtccgtgt gtgtgtatca gtgtatatat aaacaaaaat 1920

gagtgtccac ataaataatc caactaacac atcagcataa tcccaaccga aacagcttct 1980

agagagagac aaaaaagaac agagtaacta tctaaaactc aaa 2023

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaacttcg atactcggt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttgagtttt agatagttac 20

Claims

1.一种源于拟南芥的热响应启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.含有如权利要求1所述的启动子的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pMDC163。

3.如权利要求1所述的重组表达载体的构建方法：以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，扩增获得启动子全长序列，将获得的启动子序列连接入下游含有β-葡萄糖苷酸酶基因标签的pMDC163载体中。

4.如权利要求1所述的启动子或如权利要求4所述的重组表达载体在启动耐高温基因表达中的应用，其特征在于，所述耐高温基因为基因AT2G41240。

5.如权利要求1所述的启动子或如权利要求4所述的重组表达载体在提高拟南芥耐热性能中的应用。

6.一种提高拟南芥耐热性能的方法，其特征在于，使用至少一个启动子启动至少一个高温诱导基因在拟南芥中超量表达，即可获得具有耐热性能的拟南芥。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的高温诱导基因是高温诱导基因AT2G41240；所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。