JPH06153904A - 補酵素再生用修飾電極 - Google Patents
補酵素再生用修飾電極Info
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- JPH06153904A JPH06153904A JP4335505A JP33550592A JPH06153904A JP H06153904 A JPH06153904 A JP H06153904A JP 4335505 A JP4335505 A JP 4335505A JP 33550592 A JP33550592 A JP 33550592A JP H06153904 A JPH06153904 A JP H06153904A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ビオロゲンによる反応系の汚染を防止し且つ
電極の反復使用をも可能とした、酸化還元酵素反応を利
用した酸化又は還元工程において使用する補酵素再生用
電極。 【構成】 電極表面上に、ニトロアニリン類の電解酸化
重合とそれに続く電解還元による又はフェニレンジアミ
ン類の電解酸化重合により、密着して形成されたアミノ
基を有する重合物層を備え、且つ、該アミノ基の水素原
子の少なくとも一部を、 【化１】 （式中、ｎは２乃至１０の整数を表す。）で示される基
により置換してなるものである、補酵素再生用修飾電
極、並びに、該修飾電極の重合物層中に残存するアミノ
基の少なくとも一部に酸化還元酵素及び／又はニコチン
アミド系補酵素誘導体を共有結合により固定化したこと
を特徴とする補酵素再生用修飾電極。
電極の反復使用をも可能とした、酸化還元酵素反応を利
用した酸化又は還元工程において使用する補酵素再生用
電極。 【構成】 電極表面上に、ニトロアニリン類の電解酸化
重合とそれに続く電解還元による又はフェニレンジアミ
ン類の電解酸化重合により、密着して形成されたアミノ
基を有する重合物層を備え、且つ、該アミノ基の水素原
子の少なくとも一部を、 【化１】 （式中、ｎは２乃至１０の整数を表す。）で示される基
により置換してなるものである、補酵素再生用修飾電
極、並びに、該修飾電極の重合物層中に残存するアミノ
基の少なくとも一部に酸化還元酵素及び／又はニコチン
アミド系補酵素誘導体を共有結合により固定化したこと
を特徴とする補酵素再生用修飾電極。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酸化還元酵素反応を利
用した目的とする原料基質の酸化又は還元工程におい
て、該工程によって消費される補酵素を再生するための
電極に関する。より詳しくは、本発明は、ビオロゲン基
等のメディエータ、更には酸化還元酵素及び／又は補酵
素自体をも電極表面に固定化したことにより、メディエ
ータによる反応系の汚染の防止及び反復使用を可能とし
た、補酵素再生用の修飾電極に関する。
用した目的とする原料基質の酸化又は還元工程におい
て、該工程によって消費される補酵素を再生するための
電極に関する。より詳しくは、本発明は、ビオロゲン基
等のメディエータ、更には酸化還元酵素及び／又は補酵
素自体をも電極表面に固定化したことにより、メディエ
ータによる反応系の汚染の防止及び反復使用を可能とし
た、補酵素再生用の修飾電極に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、省エネルギー及び省資源のため、
化学工業において工程の一部が酵素反応に切り替えられ
るケースが増えつつある。このうち酸化還元反応の関与
する工程には、酸化還元酵素が使用されるが、この種の
酵素による酸化還元反応においてはニコチンアミド系又
はフラビン系の補酵素の併用が必須である。しかるに、
これらの補酵素は反応の進行にともない還元体又は酸化
体へと変化するため、反応を持続させるにはこれらの変
化した補酵素をもとの形へと再生する必要がある。この
ため、酸化還元酵素反応は通常、関与する補酵素が酸化
される方向に進む酵素反応と還元される方向に進む酵素
反応とを共役させる形で工程に組み込まれるため、一般
に、目的物の直接の原料となる基質以外に補酵素再生工
程において用いる基質も必要となる。しかし、再生工程
にかかる補酵素再生用の基質を含んだ酵素的、化学的反
応を組み込んだのでは、工程全体が複雑化し、合理化の
目的に反するという問題を生ずる。
化学工業において工程の一部が酵素反応に切り替えられ
るケースが増えつつある。このうち酸化還元反応の関与
する工程には、酸化還元酵素が使用されるが、この種の
酵素による酸化還元反応においてはニコチンアミド系又
はフラビン系の補酵素の併用が必須である。しかるに、
これらの補酵素は反応の進行にともない還元体又は酸化
体へと変化するため、反応を持続させるにはこれらの変
化した補酵素をもとの形へと再生する必要がある。この
ため、酸化還元酵素反応は通常、関与する補酵素が酸化
される方向に進む酵素反応と還元される方向に進む酵素
反応とを共役させる形で工程に組み込まれるため、一般
に、目的物の直接の原料となる基質以外に補酵素再生工
程において用いる基質も必要となる。しかし、再生工程
にかかる補酵素再生用の基質を含んだ酵素的、化学的反
応を組み込んだのでは、工程全体が複雑化し、合理化の
目的に反するという問題を生ずる。
【０００３】そこで、この再生工程に電気化学的方法を
用いることが検討されているが。しかし補酵素としてニ
コチンアミド系補酵素を用いる場合、電解酸化は可能で
あっても電解還元では補酵素の二量体化がおこるという
欠点がある。このためこれを補うべく、ビオロゲン及び
その誘導体等のメディエータを併用した補酵素の間接的
電解再生法が種々考案されている。しかし、これらの併
用物が反応系を「汚染」するという問題は未だ完全には
解決されていない。
用いることが検討されているが。しかし補酵素としてニ
コチンアミド系補酵素を用いる場合、電解酸化は可能で
あっても電解還元では補酵素の二量体化がおこるという
欠点がある。このためこれを補うべく、ビオロゲン及び
その誘導体等のメディエータを併用した補酵素の間接的
電解再生法が種々考案されている。しかし、これらの併
用物が反応系を「汚染」するという問題は未だ完全には
解決されていない。
【０００４】メディエータによる反応系の汚染を回避す
る目的でメディエータを電極面に固定化するため、従来
は例えば、ビオロゲン又は高分子量化したビオロゲンを
包括した高分子膜を電極表面に接着させる方法又は電極
の先端に多孔性膜を張ったキャップを取り付けて電極表
面と該多孔性膜との間に高分子量化したビオロゲン溶液
を満たしておく方法等が試みられている。しかし、いず
れの場合にも、ビオロゲン又はその誘導体の電極面から
の漏洩を完全には防止し得ない。
る目的でメディエータを電極面に固定化するため、従来
は例えば、ビオロゲン又は高分子量化したビオロゲンを
包括した高分子膜を電極表面に接着させる方法又は電極
の先端に多孔性膜を張ったキャップを取り付けて電極表
面と該多孔性膜との間に高分子量化したビオロゲン溶液
を満たしておく方法等が試みられている。しかし、いず
れの場合にも、ビオロゲン又はその誘導体の電極面から
の漏洩を完全には防止し得ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このように、メディエ
ータを電極表面に固定化するに際し、高分子量化したメ
ディエータ又はこれらを包括した高分子膜を電極に接触
又は接着させる方法では、メディエータの脱離及びそれ
による反応系の汚染が生じる。本発明はこのような従来
技術の問題点に対し、メディエータが電極表面に確実に
固定化され、それにより反応系の汚染が完全に防止され
るよう構成された、補酵素再生用修飾電極の提供を目的
とする。
ータを電極表面に固定化するに際し、高分子量化したメ
ディエータ又はこれらを包括した高分子膜を電極に接触
又は接着させる方法では、メディエータの脱離及びそれ
による反応系の汚染が生じる。本発明はこのような従来
技術の問題点に対し、メディエータが電極表面に確実に
固定化され、それにより反応系の汚染が完全に防止され
るよう構成された、補酵素再生用修飾電極の提供を目的
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、電解酸化重合
により電極表面に完全に密着した重合物層を形成して支
持体とし、該支持体にメディエーターを共有結合させる
ことによって上記課題を達成した。
により電極表面に完全に密着した重合物層を形成して支
持体とし、該支持体にメディエーターを共有結合させる
ことによって上記課題を達成した。
【０００７】すなわち本発明は、（１）電極表面上に、
ニトロアニリン類の電解酸化重合により密着して形成さ
れた重合物の層を電解還元してなるものである重合物層
又はフェニレンジアミン類の電解酸化重合により密着し
て形成された重合物層を備え、且つ、該重合物層に存在
するアミノ基の少なくとも一部の水素原子を、
ニトロアニリン類の電解酸化重合により密着して形成さ
れた重合物の層を電解還元してなるものである重合物層
又はフェニレンジアミン類の電解酸化重合により密着し
て形成された重合物層を備え、且つ、該重合物層に存在
するアミノ基の少なくとも一部の水素原子を、
【化２】 （式中、ｎは２乃至１０の整数を表す。）で示される基
により置換してなるものである、補酵素再生用修飾電
極、及び（２）前記修飾電極の重合物層中に残存するア
ミノ基の少なくとも一部に酸化還元酵素及び／又はニコ
チンアミド系補酵素誘導体を共有結合により固定化した
ことを特徴とする、請求項１に記載の補酵素再生用修飾
電極である。
により置換してなるものである、補酵素再生用修飾電
極、及び（２）前記修飾電極の重合物層中に残存するア
ミノ基の少なくとも一部に酸化還元酵素及び／又はニコ
チンアミド系補酵素誘導体を共有結合により固定化した
ことを特徴とする、請求項１に記載の補酵素再生用修飾
電極である。
【０００８】ここに、前記酸化還元酵素の固定化は、前
記残存するアミノ基と該酸化還元酵素蛋白質中のカルボ
キシル基との間のアミド結合によるものであるか、前記
残存するアミノ基と該酸化還元酵素蛋白質中のアミノ基
との間のウレイン結合によるものであることが好まし
い。また、前記ニコチンアミド系補酵素の固定化は、前
記残存するアミノ基と該補酵素のアデニン環のアミノ基
との間のウレイン結合によるものであることが好まし
い。
記残存するアミノ基と該酸化還元酵素蛋白質中のカルボ
キシル基との間のアミド結合によるものであるか、前記
残存するアミノ基と該酸化還元酵素蛋白質中のアミノ基
との間のウレイン結合によるものであることが好まし
い。また、前記ニコチンアミド系補酵素の固定化は、前
記残存するアミノ基と該補酵素のアデニン環のアミノ基
との間のウレイン結合によるものであることが好まし
い。
【０００９】電極表面に完全に密着した重合物層を形成
させるには、芳香族アミン類の電解酸化重合が極めて好
ましいことが見出された。一方、ビオロゲン等のメディ
エータを共有結合させるための適当な官能基が支持体表
面に存在することが必要である。このような官能基の導
入された支持体を形成するためには、電極表面上にてフ
ェニレンジアミンのような芳香族多価アミン類を電解酸
化重合させることによって又は電極表面上にてニトロア
ニリン類を電解酸化重合させた後にこれを電解還元処理
することによってそれぞれ得られる、アミノ基を有する
電解重合物層よりなる支持体が好ましいことが判明し
た。また、電解重合を容易とするためには、重合に用い
るモノマーであるこれらの芳香族アミン類はそのアミノ
基に対してパラ位に置換基のないものを選択することが
極めて好ましい。
させるには、芳香族アミン類の電解酸化重合が極めて好
ましいことが見出された。一方、ビオロゲン等のメディ
エータを共有結合させるための適当な官能基が支持体表
面に存在することが必要である。このような官能基の導
入された支持体を形成するためには、電極表面上にてフ
ェニレンジアミンのような芳香族多価アミン類を電解酸
化重合させることによって又は電極表面上にてニトロア
ニリン類を電解酸化重合させた後にこれを電解還元処理
することによってそれぞれ得られる、アミノ基を有する
電解重合物層よりなる支持体が好ましいことが判明し
た。また、電解重合を容易とするためには、重合に用い
るモノマーであるこれらの芳香族アミン類はそのアミノ
基に対してパラ位に置換基のないものを選択することが
極めて好ましい。
【００１０】上記において形成された支持体への共有結
合によるビオロゲン誘導体の固定化は、次の式、
合によるビオロゲン誘導体の固定化は、次の式、
【化３】 （式中、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは２乃至１０の整
数を表す。）に示す１−ハロゲン化アルキル−１’−メ
チル−４，４’−ビピリジニウム塩を使用して行うこと
ができる。ハロゲンとしては塩素、臭素、ヨウ素が好ま
しい。
数を表す。）に示す１−ハロゲン化アルキル−１’−メ
チル−４，４’−ビピリジニウム塩を使用して行うこと
ができる。ハロゲンとしては塩素、臭素、ヨウ素が好ま
しい。
【００１１】ここに、該ビオロゲン基がニコチンアミド
系補酵素の電解還元に際して補酵素の二量体化を防止す
る上で有効に機能するためには、支持体に側鎖として固
定化された該ビオロゲン誘導体の構造のうち電子授受を
行うビピリジン部分がニコチンアミド系補酵素と共に酸
化還元酵素の「鍵穴」の中に取り込まれる必要がある。
この目的のためには、スペーサー部分の存在が必要であ
り、上記式におけるｎが２乃至１０であることが好まし
く、特に好ましくは４乃至８であることが見出された。
系補酵素の電解還元に際して補酵素の二量体化を防止す
る上で有効に機能するためには、支持体に側鎖として固
定化された該ビオロゲン誘導体の構造のうち電子授受を
行うビピリジン部分がニコチンアミド系補酵素と共に酸
化還元酵素の「鍵穴」の中に取り込まれる必要がある。
この目的のためには、スペーサー部分の存在が必要であ
り、上記式におけるｎが２乃至１０であることが好まし
く、特に好ましくは４乃至８であることが見出された。
【００１２】また、ビピリジン部分を取り込むべき酸化
還元酵素が常にメディエータ近傍に存在するならば酵素
反応の容易な進行に有利である。従って、メディエータ
と併せて酸化還元酵素をも支持体に固定化することで補
酵素の電解再生の効率を高め得る。また固定化されるこ
とにより酵素の安定性が増大し及び反復使用が可能とな
ることで、電極としての機能を格段に向上できると期待
される。ここに、酸化還元酵素としては、ニコチンアミ
ド系補酵素又はフラビン系補酵素と共役して酸化還元反
応を触媒する酵素であればよく、例えばリポアミドデヒ
ドロゲナーゼ、フェレドキシンレダクターゼその他、生
化学において既知の種々の酵素を使用することができ
る。
還元酵素が常にメディエータ近傍に存在するならば酵素
反応の容易な進行に有利である。従って、メディエータ
と併せて酸化還元酵素をも支持体に固定化することで補
酵素の電解再生の効率を高め得る。また固定化されるこ
とにより酵素の安定性が増大し及び反復使用が可能とな
ることで、電極としての機能を格段に向上できると期待
される。ここに、酸化還元酵素としては、ニコチンアミ
ド系補酵素又はフラビン系補酵素と共役して酸化還元反
応を触媒する酵素であればよく、例えばリポアミドデヒ
ドロゲナーゼ、フェレドキシンレダクターゼその他、生
化学において既知の種々の酵素を使用することができ
る。
【００１３】支持体への酵素の固定化は、，メディエー
タ固定化後に支持体表面になお残存するアミノ基と該酵
素のカルボキシル基との間で水溶性カルボジイミドを触
媒としてアミド結合を形成させることによって行うのが
好ましい。
タ固定化後に支持体表面になお残存するアミノ基と該酵
素のカルボキシル基との間で水溶性カルボジイミドを触
媒としてアミド結合を形成させることによって行うのが
好ましい。
【００１４】また別の方法として、支持体への酵素の固
定化は、支持体表面上に残存するアミノ基と酵素蛋白質
のアミノ基とをカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、
定化は、支持体表面上に残存するアミノ基と酵素蛋白質
のアミノ基とをカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、
【化４】 を用いて結合させてもよい。その場合には、先ずメディ
エータ固定化支持体表面上の残存アミノ基に対してＣＤ
Ｉを作用させて、
エータ固定化支持体表面上の残存アミノ基に対してＣＤ
Ｉを作用させて、
【化５】 とした上で、これに酵素蛋白質のアミノ基を反応させ
て、
て、
【化６】 としてウレイン結合を形成することにより結合させるの
が好ましい。ＣＤＩとの反応は約１：１の当量比で行う
ことができる。
が好ましい。ＣＤＩとの反応は約１：１の当量比で行う
ことができる。
【００１５】一方、メディエータ固定化支持体に対し
て、その表面上に残存するアミノ基とニコチンアミド系
補酵素のアデニン環のアミノ基とを用いてウレイン結合
を形成することにより、メディエータと補酵素の双方を
固定化した修飾電極を製造することもできる。この場合
には、ニコチンアミド系補酵素のアデニン環のアミノ基
に対しＣＤＩを反応させて、
て、その表面上に残存するアミノ基とニコチンアミド系
補酵素のアデニン環のアミノ基とを用いてウレイン結合
を形成することにより、メディエータと補酵素の双方を
固定化した修飾電極を製造することもできる。この場合
には、ニコチンアミド系補酵素のアデニン環のアミノ基
に対しＣＤＩを反応させて、
【化７】 とし、これを支持体表面上のアミノ基に反応させて、
【化８】 とすることにより補酵素を固定化することができる。
【００１６】また、メディエータを固定化した支持体に
残存するアミノ基に対して、上記酵素及び補酵素の双方
を結合させた修飾電極を製することもできる。かかる電
極の製造は、メディエータを結合させた支持体にカルボ
ジイミドを用いて先ず酵素を上述のようにして固定化
し、次いで支持体表面上の残りのアミノ基に対して、上
述のようにカルボニルジイミダゾールと結合した補酵素
を反応させてウレイン結合を形成させることにより行う
ことができる。
残存するアミノ基に対して、上記酵素及び補酵素の双方
を結合させた修飾電極を製することもできる。かかる電
極の製造は、メディエータを結合させた支持体にカルボ
ジイミドを用いて先ず酵素を上述のようにして固定化
し、次いで支持体表面上の残りのアミノ基に対して、上
述のようにカルボニルジイミダゾールと結合した補酵素
を反応させてウレイン結合を形成させることにより行う
ことができる。
【００１７】
【作用】炭素電極又はＩＴＯ電極のような通常の電極表
面に形成されたアミノ基を側鎖にもつ電解重合物層にビ
オロゲン誘導体を共有結合的に固定化した修飾電極は、
リポアミドデヒドロゲナーゼ或いはフェレドキシンレダ
クターゼのような酸化還元酵素の存在下で、後述の実施
例に示す通りニコチンアミド系補酵素を、二量体化させ
ることなく電解還元する作用を示す。
面に形成されたアミノ基を側鎖にもつ電解重合物層にビ
オロゲン誘導体を共有結合的に固定化した修飾電極は、
リポアミドデヒドロゲナーゼ或いはフェレドキシンレダ
クターゼのような酸化還元酵素の存在下で、後述の実施
例に示す通りニコチンアミド系補酵素を、二量体化させ
ることなく電解還元する作用を示す。
【００１８】また上記の修飾電極表面の重合物層になお
も残存するアミノ基に対し、補酵素再生用の酸化還元酵
素を固定化した修飾電極及び／又はニコチンアミド系補
酵素を固定化した修飾電極は、いずれも耐久性のある補
酵素再生用電極としての機能を示した。特に、高価な酵
素を電極表面に固定化することにより反復使用を可能に
したという点で、本発明は酸化還元酵素を利用した原料
基質の酸化還元工程の工業的価値を向上させる。
も残存するアミノ基に対し、補酵素再生用の酸化還元酵
素を固定化した修飾電極及び／又はニコチンアミド系補
酵素を固定化した修飾電極は、いずれも耐久性のある補
酵素再生用電極としての機能を示した。特に、高価な酵
素を電極表面に固定化することにより反復使用を可能に
したという点で、本発明は酸化還元酵素を利用した原料
基質の酸化還元工程の工業的価値を向上させる。
【００１９】本発明のメディエータ固定化修飾電極の機
能的評価は、サイクリックボルタムメトリーにより行う
ことができる。図１はこれによって得られるサイクリッ
クボルタムグラムを概念的に示す。図において横軸は電
極電位（Volt vs SCE ：飽和カロメル電極に対する電
位）、縦軸は電流（μＡ）である。第一還元波及び第二
還元波はそれぞれ、
能的評価は、サイクリックボルタムメトリーにより行う
ことができる。図１はこれによって得られるサイクリッ
クボルタムグラムを概念的に示す。図において横軸は電
極電位（Volt vs SCE ：飽和カロメル電極に対する電
位）、縦軸は電流（μＡ）である。第一還元波及び第二
還元波はそれぞれ、
【化９】 に示す第一の還元及び第二の還元に対応して出現する。
従って、これらの波の存在はビオロゲンが機能している
ことを示す。なお、該酸化還元反応において酸化還元補
酵素及び酸化還元酵素が存在し機能すると、例えばビオ
ロゲンの酸化体（Ｖ2+）の電極による第一の還元により
生じたカチオンラジカル（Ｖ+.）がＮＡＤ+ によってＶ
2+へと再酸化される等の、次に例示するような反応、
従って、これらの波の存在はビオロゲンが機能している
ことを示す。なお、該酸化還元反応において酸化還元補
酵素及び酸化還元酵素が存在し機能すると、例えばビオ
ロゲンの酸化体（Ｖ2+）の電極による第一の還元により
生じたカチオンラジカル（Ｖ+.）がＮＡＤ+ によってＶ
2+へと再酸化される等の、次に例示するような反応、
【化１０】 が起こることによってビオロゲン及び補酵素の酸化体及
び還元体の間でリサイクルが起こり、補酵素の量に応じ
て反応が進行して電流は実線から破線に示すようにいず
れも大きく変化する。従って、このような電流変化が観
察されることは、ビオロゲン、酵素及び補酵素が共役し
て機能していることを示す。
び還元体の間でリサイクルが起こり、補酵素の量に応じ
て反応が進行して電流は実線から破線に示すようにいず
れも大きく変化する。従って、このような電流変化が観
察されることは、ビオロゲン、酵素及び補酵素が共役し
て機能していることを示す。
【００２０】
〔実施例１〕三極型電解セルに１Ｍの硫酸水溶液を満た
し、これにｏ−ニトロアニリンを０．０２Ｍの濃度とな
るように添加し、作用極に炭素板を、参照極に飽和カロ
メル電極を、対極に白金板を用い、ポテンショスタット
に連結した関数発生器に＋１．５volt vs SCE 、２０秒
開の定電位酸化と−０．５volt vs SCE 、４０秒間の定
電位還元とからなる矩形波電位を入力し、定電位酸化と
定電位還元を、２５℃にて窒素ガスをバブリングさせつ
つ、４０回繰り返した。
し、これにｏ−ニトロアニリンを０．０２Ｍの濃度とな
るように添加し、作用極に炭素板を、参照極に飽和カロ
メル電極を、対極に白金板を用い、ポテンショスタット
に連結した関数発生器に＋１．５volt vs SCE 、２０秒
開の定電位酸化と−０．５volt vs SCE 、４０秒間の定
電位還元とからなる矩形波電位を入力し、定電位酸化と
定電位還元を、２５℃にて窒素ガスをバブリングさせつ
つ、４０回繰り返した。
【００２１】これにより、炭素板表面に密着して厚さ約
１５μｍの電解重合物の薄層が形成されたが、その後、
電解液をそのままにして−０．５Volt vs SCE の一定電
位における電解を２時間継続し、重合物中になおも残存
するニトロ基のアミノ基への電解還元を行った。
１５μｍの電解重合物の薄層が形成されたが、その後、
電解液をそのままにして−０．５Volt vs SCE の一定電
位における電解を２時間継続し、重合物中になおも残存
するニトロ基のアミノ基への電解還元を行った。
【００２２】別に、１−ブロモブチル−１’−メチル−
４，４’−ビピリジニウム塩を周知の方法で合成してお
き、その濃度が２０ｍＭとなるようにｐＨ８．５の緩衝
水溶液を調製し、この中に上記のアミノ基を有する電解
重合物で被覆された電極を浸漬し、１２時間反応させる
ことによりビオロゲン固定化修飾電極を得た。
４，４’−ビピリジニウム塩を周知の方法で合成してお
き、その濃度が２０ｍＭとなるようにｐＨ８．５の緩衝
水溶液を調製し、この中に上記のアミノ基を有する電解
重合物で被覆された電極を浸漬し、１２時間反応させる
ことによりビオロゲン固定化修飾電極を得た。
【００２３】この修飾電極を十分に洗浄し、０．１Ｍ濃
度のトリス−塩酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５）中で常法に
よりサイクリックボルタムグラムを作成したところ、図
２に示される結果を得た。これによりビオロゲン誘導体
が電解酸化重合物層に化学的に結合されていることが判
明した。
度のトリス−塩酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５）中で常法に
よりサイクリックボルタムグラムを作成したところ、図
２に示される結果を得た。これによりビオロゲン誘導体
が電解酸化重合物層に化学的に結合されていることが判
明した。
【００２４】〔実施例２〕三極型電解セルに１Ｍの硫酸
水溶液を満たし、これにｏ−フェニレンジアミンを０．
０２Ｍの濃度となるように添加し、実施例１と同じ電極
の組合せで、＋１．３Volt vs SCE の一定電位で１時間
電解酸化重合を行い、重合物層を炭素板電極表面に形成
させた。
水溶液を満たし、これにｏ−フェニレンジアミンを０．
０２Ｍの濃度となるように添加し、実施例１と同じ電極
の組合せで、＋１．３Volt vs SCE の一定電位で１時間
電解酸化重合を行い、重合物層を炭素板電極表面に形成
させた。
【００２５】この電極を十分に洗浄した後、実施例１と
同様の方法で１−ブロモブチル−１’−メチル−４，
４’−ビピリジニウム塩を反応させ、ビオロゲン誘導体
固定化修飾電極を作製し、同じく常法によりサイクリッ
クボルタムグラムを作成した。
同様の方法で１−ブロモブチル−１’−メチル−４，
４’−ビピリジニウム塩を反応させ、ビオロゲン誘導体
固定化修飾電極を作製し、同じく常法によりサイクリッ
クボルタムグラムを作成した。
【００２６】その結果を図３に示す。実施例１に比して
波高は低いが、ビオロゲン基による還元波及び酸化波が
認められる。
波高は低いが、ビオロゲン基による還元波及び酸化波が
認められる。
【００２７】〔実施例３〕先に実施例１おいて作製した
ビオロゲン誘導体固定化修飾電極２を２００μＬのリポ
アミドデヒドロゲナーゼ、２０ｍｇの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸
塩（水溶性カルボジイミド）及び３ｍｇのハイドロキノ
ンを含むｐＨ７．５の緩衝溶液に浸し、窒素ガスを通じ
つつ３０℃にて４８時間処理し、電極表面の電解重合物
層中のアミノ基に対してアミド結合を形成させることに
よりリポアミドデヒドロゲナーゼを固定化した。この修
飾電極を以下「ビオロゲン−酵素固定化電極」と略記す
る。
ビオロゲン誘導体固定化修飾電極２を２００μＬのリポ
アミドデヒドロゲナーゼ、２０ｍｇの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸
塩（水溶性カルボジイミド）及び３ｍｇのハイドロキノ
ンを含むｐＨ７．５の緩衝溶液に浸し、窒素ガスを通じ
つつ３０℃にて４８時間処理し、電極表面の電解重合物
層中のアミノ基に対してアミド結合を形成させることに
よりリポアミドデヒドロゲナーゼを固定化した。この修
飾電極を以下「ビオロゲン−酵素固定化電極」と略記す
る。
【００２８】次に、蒸留水で十分洗浄した上記ビオロゲ
ン−酵素固定化電極について、（１）ｐＨ７．５のトリ
ス−塩酸緩衝水溶液、及び（２）２．０ｍＭのニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤ+ 」と略
記する。）を含むｐＨ７．５のトリス−塩酸緩衝水溶液
をそれぞれ電解液として、サイクリックボルタムメトリ
ーを行った。ここに参照電極には、飽和カロメル電極
を、対極には白金線を、そして作用極には炭素電極を使
用した。得られたボルタムグラムを図４に示す。
ン−酵素固定化電極について、（１）ｐＨ７．５のトリ
ス−塩酸緩衝水溶液、及び（２）２．０ｍＭのニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤ+ 」と略
記する。）を含むｐＨ７．５のトリス−塩酸緩衝水溶液
をそれぞれ電解液として、サイクリックボルタムメトリ
ーを行った。ここに参照電極には、飽和カロメル電極
を、対極には白金線を、そして作用極には炭素電極を使
用した。得られたボルタムグラムを図４に示す。
【００２９】図４において、実線は電解液（１）につい
ての、破線は電解液（２）についての結果である。ＮＡ
Ｄ+ を含まない電解液（１）の場合には、実施例１と同
様の挙動を示すことが認められたが、電解液（２）の場
合にはビオロゲンの第一及び第二還元波が、添加された
ＮＡＤ+ に応じてそれぞれ増大した。これは次に示すよ
うに、
ての、破線は電解液（２）についての結果である。ＮＡ
Ｄ+ を含まない電解液（１）の場合には、実施例１と同
様の挙動を示すことが認められたが、電解液（２）の場
合にはビオロゲンの第一及び第二還元波が、添加された
ＮＡＤ+ に応じてそれぞれ増大した。これは次に示すよ
うに、
【化１１】 還元体ビオロゲンによるＮＡＤ+ の間接電解還元による
還元体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）の生成に対応する。Ｖ2+はビオロゲンの酸化体、Ｖ
+.は第一還元で生じたビオロゲンのカチオンラジカル、
Ｖ0 は第二還元で生じた零価のビオロゲンである。
還元体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）の生成に対応する。Ｖ2+はビオロゲンの酸化体、Ｖ
+.は第一還元で生じたビオロゲンのカチオンラジカル、
Ｖ0 は第二還元で生じた零価のビオロゲンである。
【００３０】また、電解液（２）の場合＋０．７５Volt
vs SCE 付近には明確な酸化波が認められるが、仮に還
元体の補酵素ＮＡＤＨが二量体化したとすればその酸化
波は０Volt vs SCE 付近に現れるはずであるから、これ
は電解還元過程において電極表面層に形成された還元体
の補酵素ＮＡＤＨが二量体化しなかったことを示す。こ
の結果、本実施例で作製したビオロゲン−酵素固定化電
極は、補酵素ＮＡＤＨの電解再生用電極として十分に機
能することが判明した。なお、この電極を２０℃にてｐ
Ｈ７．５の緩衝液中で保存し、その間２０回のサイクリ
ックボルタムメトリーを行ったが、電極活性は殆ど低下
することなく維持された。
vs SCE 付近には明確な酸化波が認められるが、仮に還
元体の補酵素ＮＡＤＨが二量体化したとすればその酸化
波は０Volt vs SCE 付近に現れるはずであるから、これ
は電解還元過程において電極表面層に形成された還元体
の補酵素ＮＡＤＨが二量体化しなかったことを示す。こ
の結果、本実施例で作製したビオロゲン−酵素固定化電
極は、補酵素ＮＡＤＨの電解再生用電極として十分に機
能することが判明した。なお、この電極を２０℃にてｐ
Ｈ７．５の緩衝液中で保存し、その間２０回のサイクリ
ックボルタムメトリーを行ったが、電極活性は殆ど低下
することなく維持された。
【００３１】〔実施例４〕２０ｍＭのニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ+）と２
０ｍＭのカルボニルジイミダゾールを含むｐＨ７．０の
アセトニトリル溶液を２５℃で３時間攪拌し、補酵素の
イミダゾリルホルメート化合物、
デニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ+）と２
０ｍＭのカルボニルジイミダゾールを含むｐＨ７．０の
アセトニトリル溶液を２５℃で３時間攪拌し、補酵素の
イミダゾリルホルメート化合物、
【化１２】 を生成させたアセトニトリル溶液を調製し、この液中に
実施例３で得たビオロゲン−酵素固定化電極を浸し、同
じく２５℃で８時間処理した。この電極をビオロゲン−
酵素−補酵素固定化電極とする。この電極を蒸留水で十
分に洗浄した後、実施例３と同様の三極セルを用い、ｐ
Ｈ７．５のトリス−塩酸塩緩衝水溶液中でサイクリック
ボルタムグラムを作成した。その結果を図５に示す。−
１．０５Volt vs SCE におけるビオロゲンの第二還元波
の増大が見られ、補酵素ＮＡＤＰ+の間接還元が並行し
て起こっていることが判明した。
実施例３で得たビオロゲン−酵素固定化電極を浸し、同
じく２５℃で８時間処理した。この電極をビオロゲン−
酵素−補酵素固定化電極とする。この電極を蒸留水で十
分に洗浄した後、実施例３と同様の三極セルを用い、ｐ
Ｈ７．５のトリス−塩酸塩緩衝水溶液中でサイクリック
ボルタムグラムを作成した。その結果を図５に示す。−
１．０５Volt vs SCE におけるビオロゲンの第二還元波
の増大が見られ、補酵素ＮＡＤＰ+の間接還元が並行し
て起こっていることが判明した。
【図１】 ビオロゲン固定化修飾電極におけるサイクリ
ックボルタムグラムを概念図に示す。
ックボルタムグラムを概念図に示す。
【図２】 実施例１のビオロゲン固定化修飾電極におけ
るサクリックボルタムグラムを示す。
るサクリックボルタムグラムを示す。
【図３】 実施例２のビオロゲン固定化修飾電極におけ
るサクリックボルタムグラムを示す。
るサクリックボルタムグラムを示す。
【図４】 実施例３のビオロゲン−酵素固定化電極にお
けるサイクリックボルタムグラムを示す。
けるサイクリックボルタムグラムを示す。
【図５】 実施例４のビオロゲン−酵素−補酵素固定化
電極におけるサイクリックボルタムグラムを示す。
電極におけるサイクリックボルタムグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ２５Ｂ 3/02 8414−4Ｋ 3/04 8414−4Ｋ
Claims (2)
- 【請求項１】電極表面上に、ニトロアニリン類の電解酸
化重合により密着して形成された重合物の層を電解還元
してなるものである重合物層又はフェニレンジアミン類
の電解酸化重合により密着して形成された重合物層を備
え、且つ、該重合物層に存在するアミノ基の少なくとも
一部の水素原子を、 【化１】 （式中、ｎは２乃至１０の整数を表す。）で示される基
により置換してなるものである、補酵素再生用修飾電
極。 - 【請求項２】前記修飾電極の重合物層中に残存するアミ
ノ基の少なくとも一部に酸化還元酵素及び／又はニコチ
ンアミド系補酵素誘導体を共有結合により固定化したこ
とを特徴とする、請求項１に記載の補酵素再生用修飾電
極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4335505A JPH06153904A (ja) | 1992-11-19 | 1992-11-19 | 補酵素再生用修飾電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4335505A JPH06153904A (ja) | 1992-11-19 | 1992-11-19 | 補酵素再生用修飾電極 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153904A true JPH06153904A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=18289330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4335505A Pending JPH06153904A (ja) | 1992-11-19 | 1992-11-19 | 補酵素再生用修飾電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153904A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010063453A (ja) * | 2008-08-11 | 2010-03-25 | Toyota Motor Corp | 光合成基板、その製造方法、光合成反応法および光合成装置 |
| CN104109880A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-10-22 | 北京泰克美高新技术有限公司 | 一种还原型辅酶q10的制备方法及其装置 |
| RU2618533C1 (ru) * | 2016-07-05 | 2017-05-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВО "КубГУ") | Способ получения координационного соединения цинка с никотиновой кислотой |
| WO2017119731A1 (ko) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | 주식회사 씨원켐 | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 |
-
1992
- 1992-11-19 JP JP4335505A patent/JPH06153904A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010063453A (ja) * | 2008-08-11 | 2010-03-25 | Toyota Motor Corp | 光合成基板、その製造方法、光合成反応法および光合成装置 |
| CN104109880A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-10-22 | 北京泰克美高新技术有限公司 | 一种还原型辅酶q10的制备方法及其装置 |
| CN104109880B (zh) * | 2014-04-22 | 2016-05-18 | 北京泰克美高新技术有限公司 | 一种还原型辅酶q10的制备方法及其装置 |
| WO2017119731A1 (ko) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | 주식회사 씨원켐 | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 |
| US10240170B2 (en) | 2016-01-06 | 2019-03-26 | C1Chem Co., Ltd. | CO hydratase and method for producing formate using the same |
| RU2618533C1 (ru) * | 2016-07-05 | 2017-05-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВО "КубГУ") | Способ получения координационного соединения цинка с никотиновой кислотой |
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