CN114457049A

CN114457049A - 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114457049A
Application number: CN202210137988.0A
Authority: CN
Inventors: 于浩然; 马爽
Original assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Current assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-02-15
Also published as: CN114457049B

Abstract

本发明公开了吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶突变体及其应用，该突变体由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列在31位、56位、100位、311位和313位突变所得。本发明对MbPylRS序列进行改造，提高tRNA的识别速率，进而提高非天然氨基酸的引入效率。经验证，针对不同的非天然氨基酸MbPylRS的突变比MmPylRS具有更高的结合效率，经改造后的MbPylRS对十种非天然氨基酸的引入效率较MbPylRS(N311A/C313A)提高了3‑6倍，并成功将非天然氨基酸用于GFP蛋白的表达。本发明解决了非天然氨基酸引入效率低的问题，方便推广应用。

Description

吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为一种具有特异性的高效生物催化剂，已被广泛地应用于医药、分析检测、工农业生产等领域。通过定点突变和定向进化，可以实现对酶的改造，以适应生产生活的需求。然而，遗传密码编码的天然氨基酸仅有20种，限制了酶的结构和功能的拓展。吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)与它的同源tRNA^Pyl是一种理想的遗传密码扩展工具，这种酶的不同突变体能够将超过100种非天然氨基酸(UAAs)整合入蛋白质中，使非天然氨基酸用于酶分子的改造成为可能。

酶工程的目标之一是提高其催化活性。有大量的研究发现，酶活性位点附近的氨基酸突变可以增加活性。从理性设计到定向进化，再到最近发展的计算机蛋白质设计，都可用来实现这一目标。然而，这些方法常常受到典型氨基酸固有反应活性的限制，无法大幅度改善酶活性或引入新的酶功能。

与天然氨基酸相比，可人为赋予多样性功能集团的非天然氨基酸含有酮基、醛基、叠氮、炔基、烯基、硝基、酰胺基、磷酸根、磺酸根等多样功能集团。向酶蛋白中引入这些非天然氨基酸可以提高酶的活性，甚至引入天然氨基酸无法提供新型催化机制,实现新功能。因此，UAA突变是产生具有独特催化特性而不含辅因子的酶的潜在途径，所获得的含有非天然氨基酸酶比天然酶具有更多的优势，有潜力应用于医药、农药、精细化学品等领域。非天然氨基酸引入的另一个有价值的应用是作为探针来研究酶的结构，功能和催化机制。UAA不仅可以充当化学标签使我们对蛋白质的结构和机理有更深入的了解，它们也可以控制酶的活性和蛋白质结构内非共价相互作用，让我们能够更好地了解复杂生物环境中的酶功能。比如，光不稳定的UAA在化学反应中具有“笼子”功能，以“笼状形式”存在时没有活性，只有在经过紫外线照射后，它才会发生化学分解而产生活性氨基酸。因此，引入光笼化和光转换的非天然氨基酸作为光响应元件，可以实现对酶的光控制。

引入非天然氨基酸最常用的方法有选择性压力掺入和终止密码子抑制。选择性压力掺入利用可以装载其同源天然氨基酸类似物的tRNA来引入非天然氨基酸。这种方法只能引入与天然氨基酸结构相似的非天然氨基酸，且只能实现全局替换，而不能位点特异地插入非天然氨基酸。因为大多数氨基酸存在于蛋白质的多个位置，被替代的氨基酸的位点会被结构类似的非天然氨基酸所全部替代，这会出现大面积的替代从而影响蛋白质的活力或者稳定性，因此这种方法仍有较大的局限性。更好的方法是利用正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对实现的终止密码子抑制，即遗传密码扩展。正交的tRNA合成酶/tRNA对使正交的tRNA与非天然氨基酸结合，该系统的tRNA合成酶不与内源性的tRNA分子相互作用，并且被改造为与非天然氨基酸相互作用，从而代替内源性的天然氨基酸。无意义密码子(通常是琥珀终止密码子UAG)使得翻译终止被抑制，从而将非天然氨基酸引入蛋白质中。

目前通过引入非天然氨基酸进行酶分子改造已取得了许多研究成果，但仍存在一些问题限制着这项技术的应用。首先，识别琥珀密码子的正交氨酰tRNA合成酶/tRNA对与细胞内琥珀密码子终止机制间存在竞争，导致截断蛋白的产生。另外，由于正交tRNA氨酰合成酶效率不高，导致在特定位点引入UAA的突变酶的产量不高。因此有必要对正交氨酰tRNA合成酶进行改造，实现高效率的向蛋白质中引入多种非天然氨基酸。

发明内容

为解决非天然氨基酸引入效率不高的问题，本发明提供了一种定点突变改造的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)突变体，该突变体可以实现在目标蛋白质中高效引入多种非天然氨基酸。

具体技术方案如下：

吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体，所述突变体由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列突变所得，具体突变为以下任意一种：

(1)311位的天冬酰胺突变为丙氨酸，313位的半胱氨酸突变为丙氨酸，且31位的缬氨酸突变为异亮氨酸；

(2)311位的天冬酰胺突变为丙氨酸，313位的半胱氨酸突变为丙氨酸，且56位的苏氨酸突变为脯氨酸；

(3)311位的天冬酰胺突变为丙氨酸，313位的半胱氨酸突变为丙氨酸，且100位的丙氨酸突变为谷氨酸；

(4)311位的天冬酰胺突变为丙氨酸，313位的半胱氨酸突变为丙氨酸，其余突变位点由以下突变位点中的两个组合所得：31位的缬氨酸突变为异亮氨酸、56位的苏氨酸突变为脯氨酸、100位的丙氨酸突变为谷氨酸；

(5)311位的天冬酰胺突变为丙氨酸，313位的半胱氨酸突变为丙氨酸，31位的缬氨酸突变为异亮氨酸，56位的苏氨酸突变为脯氨酸，且100位的丙氨酸突变为谷氨酸。

本发明通过对野生型的马氏甲烷八叠球菌PylRS(MmPylRS)和巴氏甲烷八叠球菌PylRS(MbPylRS)进行序列比对，构建了MbPylRS(N311A/C313A)突变型，实现了多种非天然氨基酸在蛋白质内的引入。进一步，在MbPylRS(N311A/C313A)中构建V31I,T56P,H62Y,A100E的单点和组合突变，提高了其催化效率。

本发明还提供了一种所述吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。

本发明还提供了所述吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体在引入非天然氨基酸中的应用。

进一步地，所述应用包括：将包含有所述编码基因的重组载体与目标蛋白质粒共转化至感受态细胞中进行诱导培养，得到含非天然氨基酸的目标蛋白。

进一步地，所述目标蛋白为GFP蛋白，所述目标蛋白质粒为pEVOL-sfGFP2TAG，所述感受态细胞为大肠杆菌DH10B。

进一步地，所述非天然氨基酸包括：3-碘-L-苯丙氨酸，3-溴-L-苯丙氨酸，3-甲基-L-苯丙氨酸，L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸，3-氯-L-苯丙氨酸，苯乳酸，L-2-三氟甲基苯丙氨酸，3-硝基-L-苯丙氨酸，O-苄基-L-酪氨酸，H-3-ALA(3-苯并噻吩)-OH，O-叔丁基-L-酪氨酸，4-甲氧基-L-苯丙氨酸，2-甲基-L-苯丙氨酸，2-溴-L-苯丙氨酸，2-氯-L-苯丙氨酸。

更进一步地，所述非天然氨基酸为3-碘-L-苯丙氨酸，3-溴-L-苯丙氨酸，3-甲基-L-苯丙氨酸，L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸，3-氯-L-苯丙氨酸，苯乳酸，3-硝基-L-苯丙氨酸，O-苄基-L-酪氨酸，O-叔丁基-L-酪氨酸，4-甲氧基-L-苯丙氨酸中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明对MbPylRS序列进行改造，提高tRNA的识别速率，进而提高非天然氨基酸的引入效率。经验证，针对不同的非天然氨基酸，MbPylRS的突变比MmPylRS具有更高的引入效率，经改造后的MbPylRS对十种非天然氨基酸的引入效率较MbPylRS(N311A/C313A)提高了3-6倍，并成功将非天然氨基酸用于GFP蛋白的表达；本发明解决了非天然氨基酸引入效率低的问题，方便推广应用。

附图说明

图1为本发明所涉及的非天然氨基酸及其结构式；

其中，U1为3-碘-L-苯丙氨酸；U2为3-溴-L-苯丙氨酸；U3为3-甲基-L-苯丙氨酸；U4为L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸；U5为3-氯-L-苯丙氨酸；U6为苯乳酸；U7为L-2-三氟甲基苯丙氨酸；U8为3-硝基-L-苯丙氨酸；U9为O-苄基-L-酪氨酸；U10为H-3-ALA(3-苯并噻吩)-OH；U11为O-叔丁基-L-酪氨酸；U12为4-甲氧基-L-苯丙氨酸；U13为2-甲基-L-苯丙氨酸；U14为2-溴-L-苯丙氨酸；U15为2-氯-L-苯丙氨酸。

图2为实施例1中MbPylRS(N311A/C313A)与MmPylRS(N346A/C348A)针对不同底物的活性；

其中，Mb NACA为pBK-MbPylRS(N311A/C313A)；Mm NACA为pBK-MmPylRS(N346A/C348A)；-UAA为未添加非天然氨基酸的阴性对照。

图3为实施例3中GFP蛋白纯化胶图；

其中，泳道1为MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)+U2；泳道2为Mb PylRS(N311A/C313A)+U2；泳道3为MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)阴性对照，即细胞培养时不填加非天然氨基酸；泳道4为Mb PylRS(N311A/C313A)阴性对照，即细胞培养时不填加非天然氨基酸；泳道5为阳性对照，即不含琥珀突变的全长GFP蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

试剂与材料：非天然氨基酸与吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)；本发明使用的非天然氨基酸(如图1)共15个，母液浓度为100mM，配制时先加1mL 5M的NaOH，再加适量去离子水后超声10min，补充到10mL后超声10min。本发明所涉及的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)分别来自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)和巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)，分别命名为MmPylRS(SEQ ID NO.1)与MbPylRS(SEQ IDNO.2)，委托擎科生物科技公司合成，并装载到pBK载体中。

实施例1 MbPylRS(N311A/C313A)的构建及与MmPylRS(N346A/C348A)活性比较

MmPylRS包含454个氨基酸残基，与MbPylRS的同源性为74％。据报道MmPy lRS(N346A/C348A)具有很高的底物杂乱性，可以接受40多种非天然氨基酸。基于MmPylRS与MbPylRS序列比较，本发明采用定点突变的方法，构建了pBK-MbPylRS(N311A/C313A)，并通过检测绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein，sf GFP)的表达情况对15种不同的苯丙氨酸类似物非天然氨基酸进行引入效率测试，表达载体pGFP2TAG是以pGFP载体为模板，通过PCR使GFP蛋白的第二个位点的丝氨酸三联体碱基序列突变为TAG获得的。

活性检测方法如下：

1.将质粒pBK-MbPylRS(N311A/C313A)和pBK-MmPylRS(N346A/C348A)分别与pGFP2TAG载体共转化进入大肠杆菌感受态BL21(DE3)。冰上融化感受态，超净台内加入质粒各3μL，；冰上静置30min，42℃热激45s，迅速转到冰上静置2min；加入700μL，无抗LB液体，37℃220rpm摇1h；5000g离心1min，弃700μL，上清，剩余100μL，涂布到KT(12.5μg/mLtetracycline+50μg/mL kanamycin)抗性平板中；37℃倒置过夜培养；

2.挑单菌落至5mL含有KT抗性的LB培养基中，37℃220rpm培养6h，取200μL，至酶标板，测OD₆₀₀；

3.根据OD₆₀₀值计算应取的菌液量XμL(X＝200÷OD₆₀₀×0.6)，使每个孔的样品OD₆₀₀在0.2。在1.5mL离心管中加入XμL菌液，8000rpm离心1min，弃上清；

4.加入600μL预混的GMML培养基(GMML+KT+阿拉伯糖(终浓度5mg/mL))，加入6μLUAA(终浓度1mM)，重悬后上样到酶标板，每孔200μL，3个技术重复；

5.37℃300rpm培养14h，OD₆₀₀测浓度，485nm excitation和515nm emission测荧光强度

结果：如图2所示，MbPylRS(N311A/C313A)在所有15个非天然氨基酸中显示出比MmPylRS更高的荧光信号，表明MbPylRS(N311A/C313A)在向蛋白质中引入非天然氨基酸方面具有更高的效率。

表1 MbPylRS(N311A/C313A)与MmPylRS(N346A/C348A)针对不同底物的活性

实施例2 MbPylRS(V31I，T56P，A100E，N311A，C313A)突变体的构建及活性检测

PylRS主要包含2个功能域，约250氨基酸残基组成的C端催化功能域，约140氨基酸残基组成的N端tRNA结合域。本发明以MbPylRS(N311A/C313A)为模板，在PylRS的N端引入一系列突变，以进一步提高其催化效率。

1、单位点突变体构建

根据MbPylRS的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)设计突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pBK-MbPylRS(N311A/C313A)为模板；

(1)对MbPylRS氨基酸序列的31位引入单突变，引物为：

正向引物1：5'-catgaaattagccgcagcaaaatctatattga-3'(下划线为突变碱基)

反向引物2：5'-ctgcggctaatttcatgatgtttgattttatgcagg-3'(下划线为突变碱基)

(2)对MbPylRS氨基酸序列的56位引入单突变，引物为：

正向引物3：5'-gtccggcgcgtgcgtttcgtcat-3'(下划线为突变碱基)

反向引物4：5'-aaacgcacgcgccggacggcagctacggctgttg-3'(下划线为突变碱基)

(3)对MbPylRS氨基酸序列的62位引入单突变，引物为：

正向引物5：5'-cgtgcgtttcgttatcataaataccgcaaaacctgca-3'(下划线为突变碱基)

反向引物6：5'-tgataacgaaacgcacgcgcggt-3'(下划线为突变碱基)

(4)对MbPylRS氨基酸序列的100位引入单突变，引物为：

正向引物7：5'-tggtgagcgaaccgaaagtgaaaaaagcgatg-3'(下划线为突变碱基)

反向引物8：5'-tttcggttcgctcaccacacgcactttca-3'(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min；(95℃30s，60℃30s，72℃1min)30循环；72℃5min。

取10μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热激45s，迅速置于冰上冷却2min。向EP管中加入700μL的LB液体培养基，37℃，220r/min培养60min，6000r/min离心1min，弃掉700μL上清，将剩余的菌液悬浮后涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。挑取单菌落测序验证，分别得到了突变体质粒pBK-MbPylRS(V31I/N311A/C313A)，pBK-MbPylRS(T56P/N311A/C313A)，pBK-MbPylRS(H62Y/N311A/C313A)，pBK-MbPylRS(A100E/N311A/C313A)。

2、多位点突变体构建

以重组载体pBK-MbPylRS(N311A/C313A)为模板，同实施例2第1部分的引物，在PCR反应体系中同时加入多对引物，PCR反应体系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25μL，正向引物1、引物3、引物5、引物7各1μL，反向引物2、引物4、引物6、引物8各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH₂O至50μL。PCR扩增及转化同实施例2第1部分。

挑取单菌落测序验证后，分别得到了突变体质粒

pBK-MbPylRS(V31I/T56P/N311A/C313A)，

pBK-MbPylRS(T56P/A100E/N311A/C313A)，

pBK-MbPylRS(H62Y/A100E/N311A/C313A)，

pBK-MbPylRS(T56P/H62Y/N311A/C313A)，

pBK-MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)，

pBK-MbPylRS(V31I/T56P/H62Y/A100E/N311A/C313A)。

3、活性检测

同实施例1的“活性检测方法”，结果见图3。

结果：该突变MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)对十种非天然氨基酸的引入效率较MbPylRS(N311A/C313A)提高了3-6倍(图3)。

表2突变体对十种非天然氨基酸的活性比较

注：Mb NACA为pBK-MbPylRS(N311A/C313A)；V31I为pBK-MbPylRS(V31I/N311A/C313A)；T56P为pBK-MbPylRS(T56P/N311A/C313A)；H62Y为pBK-MbPylRS(H62Y/N311A/C313A)；A100E为pBK-MbPylRS(A100E/N311A/C313A)；IP为pBK-MbPylRS(V31I/T56P/N311A/C313A)；PE为pBK-MbPylRS(T56P/A100E/N311A/C313A)；YE为pBK-MbPylRS(H62Y/A100E/N311A/C313A)；PY为pBK-MbPylRS(T56P/H62Y/N311A/C313A)；IPE为pBK-MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)；IPYE为pBK-MbPylRS(V31I/T56P/H62Y/A100E/N311A/C313A)；U1为3-碘-L-苯丙氨酸；U2为3-溴-L-苯丙氨酸；U3为3-甲基-L-苯丙氨酸；U4为L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸；U5为3-氯-L-苯丙氨酸；U6为苯乳酸；U8为3-硝基-L-苯丙氨酸；U9为O-苄基-L-酪氨酸；U11为O-叔丁基-L-酪氨酸；U12为4-甲氧基-L-苯丙氨酸。

实施例3引入非天然氨基酸的GFP蛋白的表达纯化

本发明利用MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)在GFP蛋白的第二个氨基酸位点引入非天然氨基酸，诱导表达后纯化出引入了非天然氨基酸的GFP蛋白(图3)，为拓展非天然氨基酸在酶工程领域的应用提供了广阔的前景。

表达纯化方法如下：

1.将质粒pBK-MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)和pBK-MbPylRS(N311A/C313A)分别与pGFP2TAG共转化进入大肠杆菌化转感受态DH10B；涂布到KT(12.5μg/mLtetracycline+50μg/mL kanamycin抗性平板中；37℃倒置过夜培养；

2.挑单菌落至5mL含有KT抗性的LB培养基中，37℃220rpm过夜培养；

3.次日按1％转接量转接到400mL LB液体培养基中，37℃220rpm培养3h加入阿拉伯糖(终浓度5mg/mL)和UAA(终浓度1mM)，30℃220rpm诱导培养20h；

4.目标蛋白的纯化

(1)细胞破碎：用缓冲液(蒸馏水或50mM咪唑)将离心后的菌体重悬后，置于冰上破胞。

(2)离心：≥12000rpm离心35min后收集上清液，上清液过膜后待用。

(3)Ni-NTA亲和柱纯化：

平衡：用10倍左右柱体积纯水清洗Ni-NTA亲和柱后，用10倍左右50mM咪唑平衡Ni-NTA亲和柱。

上样：将破胞过膜后的上清液反复上样五次。

除杂：用10倍柱体积的50mM咪唑冲洗Ni-NTA亲和柱，除去未结合的杂蛋白。

洗脱：用10倍柱体积的500mM咪唑冲洗Ni-NTA亲和柱，洗脱下目的蛋白并收集

5.SDS-PAGE电泳(1)蛋白样品处理：SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5μL与20μL蛋白样品混合均匀，100℃煮沸10min；

(2)加样：使用EasyPAGE蛋白预制胶，每孔上样10μL；

(3)电泳：160V 50min

(4)考马斯亮蓝染色30min，过夜脱色后拍照。

结果：如图3可知，在相同的培养条件下，泳道1和泳道2的条带比泳道3和泳道4的条带更宽，说明非天然氨基酸成功被引入到GFP蛋白中。另外，MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)的条带(泳道1)比MbPylRS(N311A/C313A)的条带(泳道2)更宽，说明表达含非天然氨基酸的GFP蛋白产量更多，MbPylRS(V31I/T56P/A100E/N311A/C313A)比MbPylRS(N311A/C313A)效率更高。

对比例1

除实施例2所提供的位点外，还做了其他位点，实验步骤与实施例2相同，区别仅在于突变位点不同，但结果并不理想，具体如下表3所示：

表3其他位点对十种非天然氨基酸的活性比较

注：U1为3-碘-L-苯丙氨酸；U2为3-溴-L-苯丙氨酸；U3为3-甲基-L-苯丙氨酸；U4为L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸；U5为3-氯-L-苯丙氨酸；U6为苯乳酸；U8为3-硝基-L-苯丙氨酸；U9为O-苄基-L-酪氨酸；U11为O-叔丁基-L-酪氨酸；U12为4-甲氧基-L-苯丙氨酸。

序列表

<110> 浙江大学杭州国际科创中心

<120> 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> 马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)

<400> 1

atggacaaaa agccgctgaa caccctgatt tcggcgaccg ggctgtggat gagccgtacg 60

ggtacgattc ataaaattaa acaccacgaa gtttcgcgta gcaaaattta cattgaaatg 120

gcatgtggcg atcatctggt tgtcaacaat agtcgtagta gccgtaccgc acgtgcactg 180

cgccatcata aataccgcaa aacatgtaaa cgttgtcgtg tgagcgatga ggatctgaat 240

aaatttctga ccaaagcaaa tgaagaccaa accagcgtta aagtgaaagt tgtaagcgca 300

ccgacccgca ccaaaaaggc catgccgaaa agcgttgctc gtgcaccgaa accgctggaa 360

aacaccgaag cagcacaggc acagccgagc ggcagcaaat ttagcccggc aattccagta 420

tcaacccaag aaagcgttag cgtcccagca agtgtaagca ccagcatcag cagcattagc 480

accggtgcaa ccgcaagtgc actggtgaaa ggaaacacaa atcctattac cagcatgtcc 540

gcaccagtac aggcaagcgc accagcactg accaaaagcc aaaccgatcg tctggaagtt 600

ctgctgaacc cgaaagatga aatctcactg aatagcggca aaccgttccg tgaactggaa 660

agcgaactgc tgagccgtcg taaaaaggat ctgcaacaaa tttatgccga agagcgtgaa 720

aactacctgg ggaaactgga acgtgaaatc acccgttttt tcgttgatcg tggttttctg 780

gaaattaaat cacctattct gatcccgctg gaatatattg aacgtatggg aattgataac 840

gatactgagc tgagcaaaca gatttttcgc gttgataaaa atttctgtct gcgtccgatg 900

ctggcaccga atctgtataa ctacctgcgt aaactggatc gtgcgctgcc ggatccgatt 960

aaaatttttg agattggtcc gtgttaccgt aaagaaagcg acggtaaaga acatctggaa 1020

gaatttacca tgctgagctt tattcaaatg ggtagcggtt gtacacgtga aaatctggaa 1080

agcattatta ccgatttcct gaatcatctg ggaattgatt ttaaaatcgt cggtgatagc 1140

tgcatggttt atggtgatac tctggatgtg atgcatggtg acctggaact gagcagcgca 1200

gttgttgggc cgattccgct ggaccgtgaa tggggtattg ataaaccgtg gattggtgcg 1260

ggttttggtc tggaacgcct gctgaaagtg aaacatgatt ttaaaaacat caaacgcgca 1320

gcacgtagcg agagctatta taatggaatt agtacgaatc tgtaa 1365

<210> 2

<211> 1260

<212> DNA

<213> 巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)

<400> 2

atggataaaa aaccgctgga tgtgctgatt agcgcgaccg gcctgtggat gagccgtacc 60

ggcaccctgc ataaaatcaa acatcatgaa gtgagccgca gcaaaatcta tattgaaatg 120

gcgtgcggcg atcatctggt ggtgaacaac agccgtagct gccgtaccgc gcgtgcgttt 180

cgtcatcata aataccgcaa aacctgcaaa cgttgccgtg tgagcgatga agatatcaac 240

aactttctga cccgtagcac cgaaagcaaa aacagcgtga aagtgcgtgt ggtgagcgcg 300

ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaaagc gtgagccgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360

agcgtgagcg cgaaagcgag caccaacacc agccgtagcg ttccgagccc ggcgaaaagc 420

accccgaaca gcagcgttcc ggcgtctgcg ccggcaccga gcctgacccg cagccagctg 480

gatcgtgtgg aagcgctgct gtctccggaa gataaaatta gcctgaacat ggcgaaaccg 540

tttcgtgaac tggaaccgga actggtgacc cgtcgtaaaa acgattttca gcgcctgtat 600

accaacgatc gtgaagatta tctgggcaaa ctggaacgtg atatcaccaa attttttgtg 660

gatcgcggct ttctggaaat taaaagcccg attctgattc cggcggaata tgtggaacgt 720

atgggcatta acaacgacac cgaactgagc aaacaaattt tccgcgtgga taaaaacctg 780

tgcctgcgtc cgatgctggc cccgaccctg tataactatc tgcgtaaact ggatcgtatt 840

ctgccgggtc cgatcaaaat ttttgaagtg ggcccgtgct atcgcaaaga aagcgatggc 900

aaagaacacc tggaagaatt caccatggtt aacttttgcc aaatgggcag cggctgcacc 960

cgtgaaaacc tggaagcgct gatcaaagaa ttcctggatt atctggaaat cgacttcgaa 1020

attgtgggcg atagctgcat ggtgtatggc gataccctgg atattatgca tggcgatctg 1080

gaactgagca gcgcggtggt gggtccggtt agcctggatc gtgaatgggg cattgataaa 1140

ccgtggattg gcgcgggttt tggcctggaa cgtctgctga aagtgatgca tggcttcaaa 1200

aacattaaac gtgcgagccg tagcgaaagc tactataacg gcattagcac gaacctgtaa 1260

<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> 巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)

<400> 3

Met Asp Lys Lys Pro Leu Asp Val Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp

1 5 10 15

Met Ser Arg Thr Gly Thr Leu His Lys Ile Lys His His Glu Val Ser

20 25 30

Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val

35 40 45

Asn Asn Ser Arg Ser Cys Arg Thr Ala Arg Ala Phe Arg His His Lys

50 55 60

Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys Arg Val Ser Asp Glu Asp Ile Asn

65 70 75 80

Asn Phe Leu Thr Arg Ser Thr Glu Ser Lys Asn Ser Val Lys Val Arg

85 90 95

Val Val Ser Ala Pro Lys Val Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val Ser

100 105 110

Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Ser Val Ser Ala Lys Ala Ser Thr

115 120 125

Asn Thr Ser Arg Ser Val Pro Ser Pro Ala Lys Ser Thr Pro Asn Ser

130 135 140

Ser Val Pro Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ser Leu Thr Arg Ser Gln Leu

145 150 155 160

Asp Arg Val Glu Ala Leu Leu Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ser Leu Asn

165 170 175

Met Ala Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Pro Glu Leu Val Thr Arg Arg

180 185 190

Lys Asn Asp Phe Gln Arg Leu Tyr Thr Asn Asp Arg Glu Asp Tyr Leu

195 200 205

Gly Lys Leu Glu Arg Asp Ile Thr Lys Phe Phe Val Asp Arg Gly Phe

210 215 220

Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Leu Ile Pro Ala Glu Tyr Val Glu Arg

225 230 235 240

Met Gly Ile Asn Asn Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile Phe Arg Val

245 250 255

Asp Lys Asn Leu Cys Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Thr Leu Tyr Asn

260 265 270

Tyr Leu Arg Lys Leu Asp Arg Ile Leu Pro Gly Pro Ile Lys Ile Phe

275 280 285

Glu Val Gly Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys Glu His Leu

290 295 300

Glu Glu Phe Thr Met Val Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser Gly Cys Thr

305 310 315 320

Arg Glu Asn Leu Glu Ala Leu Ile Lys Glu Phe Leu Asp Tyr Leu Glu

325 330 335

Ile Asp Phe Glu Ile Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr Gly Asp Thr

340 345 350

Leu Asp Ile Met His Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala Val Val Gly

355 360 365

Pro Val Ser Leu Asp Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro Trp Ile Gly

370 375 380

Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Lys Val Met His Gly Phe Lys

385 390 395 400

Asn Ile Lys Arg Ala Ser Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly Ile Ser

405 410 415

Thr Asn Leu

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgaaatta gccgcagcaa aatctatatt ga 32

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcggctaa tttcatgatg tttgatttta tgcagg 36

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtccggcgcg tgcgtttcgt cat 23

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacgcacgc gccggacggc agctacggct gttg 34

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtgagcga accgaaagtg aaaaaagcga tg 32

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttcggttcg ctcaccacac gcactttca 29

Claims

1.吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体，其特征在于，由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列突变所得，具体突变为以下任意一种：

2.一种如权利要求1所述的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。

5.如权利要求1所述的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体在引入非天然氨基酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：将包含权利要求2所述编码基因的重组载体与目标蛋白质粒共转化至感受态细胞中进行诱导培养，得到含非天然氨基酸的目标蛋白。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目标蛋白为GFP蛋白，所述目标蛋白质粒为pGFP2TAG，所述感受态细胞为大肠杆菌DH10B。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非天然氨基酸包括：3-碘-L-苯丙氨酸，3-溴-L-苯丙氨酸，3-甲基-L-苯丙氨酸，L-3-(2-(5-溴噻吩))丙氨酸，3-氯-L-苯丙氨酸，苯乳酸，L-2-三氟甲基苯丙氨酸，3-硝基-L-苯丙氨酸，O-苄基-L-酪氨酸，H-3-ALA(3-苯并噻吩)-OH，O-叔丁基-L-酪氨酸，4-甲氧基-L-苯丙氨酸，2-甲基-L-苯丙氨酸，2-溴-L-苯丙氨酸，2-氯-L-苯丙氨酸。