CN103667202A - Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(简写为CpK)定点特异插入目标蛋白质的CpK翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入CpK的方法。所述CpK翻译系统包含：(i)Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述CpK优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。本发明还涉及定点特异插入CpK的突变蛋白质通过与四唑类化合物进行光点击反应从而进行蛋白标记方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(简写为CpK)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将CpK定点特异插入目标蛋白质的CpK翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入CpK的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有CpK的突变蛋白质，例如，插入CpK的肌红蛋白和增强型绿色荧光蛋白突变体，以及插入CpK的突变蛋白质的应用。
背景技术
蛋白荧光标记技术目前已经被广泛应用于蛋白质功能的可视化研究中。荧光蛋白常被用来研究蛋白质在生物体内的表达和定位，但由于它本身体积比较大，往往会影响目标蛋白的生理功能。小分子荧光探针以其体积小、膜透性好、背景噪音低以及制备方便的优点成为蛋白质研究的一个有力工具。但是，把各种不同功能的荧光分子引入到蛋白质中的方法的短缺是限制其应用的瓶颈。因此，发展一种高效的蛋白标记技术对生命科学的研究有着重要的意义。
为此，生物正交化学提供了令人兴奋的研究生物体中生物分子动力学及功能的新策略。与以配体为基础的方法相比，生物正交化学则需要能与目标生物分子特异性共价结合的探针分子。因此这种方法具有以下独特的优势：(1)能应用到各种各样的生物体分子中，包括蛋白、核酸、碳水化合物和脂质体。(2)用途广泛，探针分子的选择取决于研究人员的想象力。(3)具有高扩展性，适合活细胞中单个目标生物分子功能注释以及一类生物分子的全基因功能分析。由于这些特征，生物正交化学被成功的运用 到可视化蛋白表达，跟踪蛋白定位，测定蛋白活性，鉴定蛋白相互作用和生物体系中蛋白转换等功能研究。
与其他生物正交反应相比，点击化学由于其具有高选择性、水兼容性和高产率的特点使其在细胞生物学研究中具有巨大的应用前景。光点击化学是由纽约大学的Lin Q.教授提出来的概念，其的主要优点是不需要Cu(I)催化，而是通过光诱导引发反应，并且对细胞没有毒性。这类生物正交反应提供了一种用于研究生物时空分辨和可控引发的化学工具。由于四唑类化合物在紫外光照射下能够释放氮气而原位生成腈亚胺偶极子，该偶极子与烯烃发生瞬间环合生成吡唑啉环加成产物，因此这类反应能够实现时空可控引发。而且吡唑啉环加成产物是有荧光的，这样我们就能用荧光分析来证明特定的环加成产物的生成。近期，已有报道证明降冰片烯能与大环四唑类化合物进行高效地环加成反应，但是由于降冰片烯体积相对较大，有可能会影响蛋白的自身构象，因此我们希望通过扩展基因密码的方法在蛋白的特异性位点掺入含有环丙烯官能团的氨基酸，利用环丙烯官能团与四唑类化合物在一定波长紫外光照射下发生环加成反应，从而进行高效地、可控引发地位点特异性蛋白标记。
为了能在蛋白的特异性位点掺入含有环丙烯官能团的氨基酸，本领域需要能将环丙烯赖氨酸掺入到蛋白质中的新方案。现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸掺入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其发明名称为“METHODS AND COMPOSITIONFOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”；WO 2002/085923，其发明名称为“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”；WO 2004/094593，其发明名称为“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点特异插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，Angewandte Chemie Int.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods 36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.Opinion in Chemical Biology 9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。
发明内容
1、技术问题
本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(简写为CpK)优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入CpK。这是本发明人首次发现的，相应地，在本发明中将其命名为正交Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸氨酰基-tRNA合成酶(CpKRS)。
本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将CpK定点特异插入目标蛋白质的CpK翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入CpK的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有CpK的突变蛋白质及其应用。
因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将CpK定点特异插入蛋白质的CpK翻译系统，并且提供利用该翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入CpK的方法。
本发明还提供利用本发明的CpK翻译系统产生的含有至少一个CpK的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将CpK定点特异插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，肌红蛋白(Myoglobin)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)等。通过本发明的方法得到的包含CpK的突变蛋白通过与四唑类化合物发生光点击反应生成具有 荧光的化合物进而实现蛋白标记。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法也可以用于在肌红蛋白和增强型绿色荧光蛋白之外的多种蛋白中定点特异插入CpK，并不局限于这两种蛋白。
2、技术方案
本发明人经过筛选，首次获得一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。并且，本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研发了Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统。
具体来说，本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)识别选择密码子如琥珀终止密码子(TAG)从而将非天然氨基酸CpK定点特异插入到多肽链中的CpK翻译系统。所述CpK翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会识别O-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地识别内源性tRNA。利用所述翻译系统能够生产在翻译过程中定点特异插入CpK的多种突变体蛋白质。
在一些方面中，本发明提供Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：(a)非天然氨基酸，即Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(简写为CpK)，(b)本发明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和(c)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即CpK)，优先氨酰化所述O-tRNA。
优选地，本发明的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶即为本发明人首次发现的氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4 所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
在本发明的优选方面中，本发明提供一种Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；
(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
优选地，所述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统还包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)。例如，正交tRNA(O-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的吡咯赖氨酸tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，优选地，O-tRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。在优选的实施方案中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。
在一些方面中，本发明的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，并且所述选择密码子是对应的琥珀密码子。
在一些方面中，本发明提供包含正交tRNA序列和编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞，也可以是哺乳动物细胞，优选大肠杆菌和人胚肾(HEK) 293细胞。可以将包含正交tRNA序列的重组载体和包含编码本发明的正交氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重组载体共转化到宿主细胞中，从而获得包含正交tRNA序列和编码本发明的正交氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所述包含正交tRNA序列和编码本发明的正交氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞构成本发明的另一个方面。
本发明还提供产生在至少一个特定位置定点特异插入Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的方法。所述方法利用上述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统。所述方法通常包括下述步骤：(a)提供含有以下组分的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统的步骤：(i)非天然氨基酸，即CpK；(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述非天然氨基酸(即CpK)优先氨酰化所述O-tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入CpK，在所述蛋白质的翻译过程中，CpK氨酰化的O-tRNA识别mRNA上的所述选择密码子以及CpK，从而介导Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸定点插入所述目标蛋白质的特定位置，从而产生在所选位置含有CpK的突变蛋白质。本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可以通过常规分子克隆技术和筛选技术实现。
本领域技术人员应该理解，在步骤(b)中，将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中可以通过多种方式进行，例如，将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列分别可操作性地连接到适当的载体中，再以任意次序或三者共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到另一种不同的 适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中。上述克隆方案都是可行的，本领域技术人员可以根据实验的需要容易地进行适当的选择。
另外，本领域技术人员还应该理解，为了避免宿主细胞对外源重组载体的“踢除”效应，往往选择用带有不同抗生素标记的载体来构建需要共同转化到同一宿主细胞中的核酸序列片段。对于适当的载体的选择、重组载体的构建、宿主细胞的转化或转染等等，都是本领域的常规技术，例如，可以参见美国冷泉港实验室出版的分子克隆手册。
在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即CpK)优先氨酰化所述O-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体(即，本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库进行所述O-RS的正选择和负选择(参见下述实施例2)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供O-tRNA的序列，O-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码子互补的赖氨酸tRNA，例如，所述O-tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。
还可在宿主细胞内实施产生含有Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统(即，包含编码本发明的O-RS的核苷酸序列、O-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加CpK等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异插入CpK。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞和哺乳动物细胞(例如，大肠杆菌 和人胚肾(HEK)293细胞)。
本发明还提供蛋白标记的遗传方法，所述方法利用上述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统进行。这些方法通常始于提供含有以下组分的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统的步骤：(i)Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，简写为CpK；(ii)本发明的正交氨酰tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组；(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰tRNA合成酶用所述CpK优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；然后在所述蛋白质的翻译过程中，CpK氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的所述CpK掺入所述蛋白的所选位置，之后通过与含四唑官能团的化合物在一定波长紫外光照射下发生环加成反应，生成具有荧光的化合物以实现位点特异性蛋白标记。
因此，本发明还提供利用本发明的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统获得的包含至少一个Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的应用，所述突变蛋白质中的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应，产生荧光，用于在体内或体外有效地标记蛋白。所述活体细胞选自真细菌细胞，或哺乳动物细胞，优选大肠杆菌细胞和人胚肾(HEK)293细胞。
3、有益效果
通过生物正交化学的方法选择性的修饰蛋白，可以实现蛋白位点特异性插入生物正交反应基团。应用琥珀密码子在细胞中编码含有环丙烯官能团的氨基酸(CpK)，实现在特定位点插入该非天然氨基酸的蛋白质的高效表达，进而在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应，生成具有荧光的化合物，从而实现在体内或者体外有效地标记蛋白。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显， 其中：
图1是Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(CpK)的化学合成，图1a是CpK的化学合成路线图，图1b是化合物1a的氢谱图，图1c是化合物1b的氢谱图，图1d是化合物1b的碳谱图，图1e是化合物1c的氢谱图，图1f是化合物1c的碳谱图，图1g是化合物1d的氢谱图，图1h是化合物1d的碳谱图，图1i是化合物CpK的氢谱图，图1j是化合物CpK的碳谱图；
图2是四唑类化合物4的化学合成，图2a是四唑类化合物4的化学合成路线图，图2b是化合物4c的氢谱图，图2c是化合物4c的碳谱图，图2d是化合物4的氢谱图，图2e是化合物4的碳谱图；
图3是正交tRNA，氨酰基-tRNA合成酶，肌红蛋白及增强型绿色荧光蛋白突变体序列；
图4a是CpK-肌红蛋白的SDS-PAGE电泳图，图4b是CpK-肌红蛋白的一级质谱图，图4c是CpK-肌红蛋白的二级质谱图；
图5是CpK-肌红蛋白与四唑类化合物3的体外光点击反应图，图5a表示CpK-肌红蛋白与四唑类化合物3的光点击反应示意图，图5b表示CpK-肌红蛋白与四唑类化合物3点击反应后的SDS-PAGE胶图；
图6是CpK-增强型绿色荧光蛋白与四唑类化合物4(在图6中以“4”表示四唑类化合物4)的体内光点击反应图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
实施例1：化学合成
1、Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(CpK)的化学合成(图1)
CpK的化学合成路线参见图1。具体合成反应步骤如下：
向装有磁力搅拌和温度计的1000mL圆底烧瓶中加入叠氮化纳(6.5g， 100mmol)，2M氢氧化钠溶液(200mL，40mmol)，四丁基溴化铵(TBAB)(80mg，0.25mmol)和100mL己烷(100mL)，于0℃冰浴上剧烈搅拌。待完全溶解后，用注射器缓慢滴加三氟甲基磺酸酐(8.2mL，50mmol)，反应10分钟。另取2-甲基乙酰乙酸乙酯(3.53mL，25mmol)溶于100mL乙腈中，然后通过漏斗将2-甲基乙酰乙酸乙酯溶液加入反应烧瓶中，接着再加入10mL乙腈，可以发现初始无色的反应液迅速变黄。继续在0℃冰浴上搅拌30分钟后，用冰浴后的水(100mL)和乙醚(100mL)稀释反应液，并转移到分液漏斗中，收集有机相，用冰浴后的乙醚萃取，再加入无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到亮黄色的油状化合物1a(3.0g，产率84％)。
取一250mL圆底烧瓶，加入四三苯基醋酸二铑(29mg，0.02mmol)，二氯甲烷(80mL)和三甲基乙炔基硅(5.7mL，40mmol)，同时取化合物1a(2.84g，20mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中。然后，通过注射泵于室温下将1a溶液泵入圆底烧瓶中，速率0.6mL/hr。待1a溶液全部泵入烧瓶中后，减压蒸馏，并用10％的醚/己烷作为洗脱剂，通过硅胶层析柱进行分离，得到浅黄色的油状化合物1b(1.9g，产率46％)。
在0℃冰浴条件下，将化合物1b(0.594g，3.0mmol)溶于15mL甲醇溶液中，并加入20mL 2M KOH溶液。反应混合液于室温下搅拌过夜，然后减压，移除甲醇，用6M盐酸调节pH至1-2，再用二氯甲烷萃取三次，收集有机相，用无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到白色固体化合物1c(0.217g，产率74％)。
取N-羟基丁二酰亚胺(0.242g，2.1mmol)于0℃冰浴条件下溶于24mL乙酸乙酯/二恶烷(1∶1)溶液中，再依次加入化合物1c(0.196g，2mmol)和二环己基碳二亚胺(0.433g，2.1mmol)。混合液在室温下搅拌5h，然后过滤，取滤液进行减压蒸馏，再用1∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶层析柱进行分离，得到化合物1d(0.337g，产率84％)。
往烧瓶中加入Fmoc-赖氨酸-OH·HCl(0.689g，1.7mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.490g，3.8)的二甲基甲酰胺(8mL)溶液，另取化合物1d(331mg，1.7mmol)溶于3mL二甲基甲酰胺中，室温下将1d溶液滴加到先前所述混合液中，反应5h，然后进行减压蒸馏，再用50mL乙酸乙酯溶解，并用柠檬酸(25mL×2)，水(25mL)和盐水(25mL)的混合液 进行连续洗脱，收集有机相，用无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到0.500g粗提物。接着将粗提物溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL二乙胺反应5h，得到的混合物进行减压蒸馏，再用乙醚(25mL×2)洗脱，干燥，得到终产物CpK(0.180g，产率88％)。
合成的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(CpK)的化学式为C11H8N2O3，分子量为226.27，结构式参见图1。
2、四唑类化合物3的化学合成
本发明人合成的四唑类化合物3的化学式为C14H12N4O，分子量为252.27，结构式为：
具体合成反应步骤如下：
将苯甲醛(1.06g，10.0mmol)溶于100mL无水乙醇中，加入等当量的苯磺酰肼(1.72g，10.0mmol)，室温下搅拌过夜，待有大量白色固体析出后，过滤，收集固体，干燥后得2.92g产物，收率92％，不需进一步提纯而直接用于下一步反应。将对甲氧基苯胺(615mg，5.0mmol)溶于无水乙醇∶水(1∶1，10mL)中，冰浴冷却后加入1.0mL浓盐酸，搅拌10min后，缓慢滴加5mL NaNO2(363mg，5.25mmol)的水溶液。冰浴下继续搅拌1h后，将其滴加到上述合成的Schiff碱(1.59g，5.0mmol)的20mL吡啶溶液中。TLC跟踪反应进程，待反应结束后，加入等体积的水，有大量固体析出，过滤，用乙醚和乙酸乙酯的混合溶剂(1∶1)洗涤，得到浅粉色固体，即为目标产物，收率为52％。
3、四唑类化合物4的化学合成(图2)
本发明人合成的四唑类化合物4的化学式为C27H30N6O8，分子量为556.56，结构式参见图2。
(E)-甲基4-((2-苯磺酰肼叉)甲基))苯甲酸和6-甲酯基-萘-2-氯在嘧啶溶液中生成四唑4a，然后用氢氧化锂水解，反应溶液为乙醇/三氟乙酸/ 水的混合液，从而得到4b。取4b(88.5mg，0.246mmol)和三乙胺(83.5μL，0.6mmol)溶解于0.3mL 2-(2-苄氧基)乙氧基乙醇，2.7mL甲苯和3.0ml二氧杂环乙烷中，并加入 
的分子筛，在氩气保护下加入叠氮磷酸二苯酯(130μL，0.6mmol)，100℃搅拌回流。待反应完全后，过滤除去分子筛，减压蒸馏，并用硅胶柱分离纯化得到4c。取4c(75mg，0.1mmol)溶于2mL乙醇/三氟乙酸(1∶1)混合液中，在氩气保护下加入20uL2M的盐酸，10％钯和7.5mg碳，然后通入氢气，室温反应12小时，过滤，取滤液进行真空干燥，最后通过重结晶作用获得目标产物(47mg，产率83％)。
以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自北京百灵威公司和北京化工厂，均为分析纯以上级别。
实施例2：进化CpK特异性氨酰基-tRNA合成酶
为了在基因中位点特异性插入CpK，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)琥珀抑制赖氨酰tRNA(Mb tRNACUA Pyl)/赖氨酰tRNA合成酶(Mb PylRS，野生型，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2)对。
Mb PylRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)中，位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-CpK库，该突变库的构建方法为：在Mb PylRS基因上挑选5个位点(L266，L270，Y271，L274和C313)，通过PCR的方法进行随机突变。然后进行正负筛选来进化特异性识别CpK的氨酰基-tRNA合成酶。正筛选质粒包含Mb tRNACUA Pyl，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含Mb tRNACUA Pyl，在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正筛选和2轮负筛选：包含有正筛选质粒的E.coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pBk-CpK库，SOC培养基(2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)在37℃培养1小时。之后换用极限培养基(GMML极限培养基的配方：M9盐/甘油：764g Na2HPO4·7H2O或者30g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g NaCl，5g NH4Cl，50ml甘油，高压灭菌，pH 7.0；1MMgSO4：高压灭菌；50mM CaCl2：高压灭菌；25mM FeCl2：过滤灭菌；0.3M亮氨酸：溶解于0.3M NaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200ml M9盐/甘油，2ml MgSO4，2ml CaCl2，2ml FeCl2，1ml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml 3％琼脂粉水溶液，1mM CpK，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素)，37℃培养60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的pBk-CpK转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl)。37℃培养8-12小时。
最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有1mM CpK、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含CpK、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固体培养基。挑选在在1mM CpK 120mg/L氯霉素的培养基上生长，而在0mM CpK 40mg/L氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。最终挑出1个克隆，插入CpK效率最高，测序表明，克隆所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(CpKRS)的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，其中突变位点为L266M，L270I，Y271L，L274A和C313I。
实施例3：表达CpK-肌红蛋白并进行体外光点击反应
将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和编码肌红蛋白的核苷酸序列(4TAG)(SEQ ID NO：5)构建到pBAD载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上，筛选出来的编码CpKRS的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)构建到pBK载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上，然后共转化到DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37℃培养到OD600约等于0.5时，向LB培养基中加入1mM CpK及0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)培养细胞，对照不加入CpK。6-7小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图4a)。
我们发现，只有在存在CpK的培养基中才能纯化出全长的肌红蛋白，这说明筛选出来的CpKRS可以特异性的识别CpK。在LB培养基中CpK-肌红蛋白的产率为2mg/L，而野生型肌红蛋白的产率为33mg/L。为了检测CpK仅仅插入到肌红蛋白的4位琥珀突变位点，我们对CpK-肌红蛋白进行了ESI-TOF质谱检测，检测结果分子量为18476Da(图4b)，与计算的分子量18476Da吻合。为了进一步验证CpK插入的特异性，我们做了二级质谱验证，b离子和y离子分布显示CpK特异插入到肌红蛋白的第四位而不是其他位置(图4c)。
为了验证CpK能否和四唑类化合物进行光点击反应，我们取纯化的CpK-肌红蛋白(0.5mg/mL)与四唑类化合物3(100μM)在PBS缓冲液中孵育，然后用302nm手提紫外灯分别照射不同时间(1-12分钟)，将反应后的混合物进行SDS-PAGE电泳。待电泳结束后，取出凝胶，在紫外灯下观察是否有荧光。观察结果表明，随着照射时间的延长，荧光强度逐渐增加，在10min时达到最高值(图5b)。
实施例4：表达CpK-增强型绿色荧光蛋白并进行体内光点击反应
既然细菌和哺乳动物细胞中均存在氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，我们接下来验证了正交tRNA/正交氨酰tRNA合成酶(Mb tRNACUA Pyl/MbAcrKRS)是否可以将CpK遗传掺入到哺乳动物细胞蛋白中。我们把MbtRNACUA Pyl(SEQ ID NO：1)和CpKRS编码序列(SEQ ID NO：3)克隆到pCMV-NBK-1载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上，获得重组构建体pCMV-tRNA-CpKRS，由CMV启动子控制CpKRS的表达，U6控制Mb tRNACUA Pyl的转录。同时按照常规分子克隆方法构建pSwan-EGFP质粒(pSwan质粒购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)，并在EGFP的37位引入TAG突变(SEQ ID NO：7)。在35-mm玻底皿(购自杭州生友公司)上用10％FBS DMEM高糖培养基(购自Invitrogen公司)培养人胚肾(HEK)293细胞(购自中国协和医科大学基础医学院)，待其生长至50-60％时，用Lipofectamine 2000试剂(购自Invitrogen公司)将质粒pCMV-tRNA-CpKRS和pSwan-EGFP37TAG共转染到293细胞中，在加入4mM CpK的情况下培养细胞36小时后，再加入 40μM四唑化合物4，培养1.5小时，然后用365nm手提紫外灯照射2分钟，在荧光显微镜下观察，并以未加CpK或者四唑化合物4的细胞作为对照。结果如图6所示：在EGFP通道(488nm激发，499-578nm发射)下，只有加入CpK的细胞可以观察到荧光信号，而没有CpK的情况下无荧光信号，表明CpK成功地通过Mb tRNACUA Pyl/Mb AcrKRS正交对掺入到哺乳动物细胞的遗传密码子编码的蛋白序列中；在吡唑啉通道(pyrazoline channel)(405nm激发，410-498nm发射)下，只有同时加入CpK和四唑化合物4的细胞才能发出氰色荧光，证明CpK在哺乳动物细胞内也能进行高效地光点击反应，从而可以特异性地标记蛋白。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (10)
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ IDNO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
2.一种Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
3.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，并且所述选择密码子是对应的琥珀密码子，并且其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含正交tRNA序列和编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，或哺乳动物细胞，优选大肠杆菌细胞和人胚肾(HEK)293细胞。
6.一种产生在至少一个特定位置定点特异插入Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供权利要求2所述的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统，该系统包含：
(i)Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所述特定的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，在所述蛋白质的翻译期间，Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸氨酰化的正交tRNA识别mRNA上的所述选择密码子以及Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，从而介导Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸定点插入所述目标蛋白质的特定位置，从而产生在所选位置含Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的所述目标蛋白质。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，所述选择密码子是对应的琥珀密码子。
8.生产含有Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的肌红蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码肌红蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：5，在野生型肌红蛋白的4位引入Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
9.生产含有Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的增强型绿色荧光蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码增强型绿色荧光蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：7，在野生型增强绿色荧光蛋白的37位引入Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，所述增强型绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。
10.由权利要求6-8中任一项所述的方法获得的含有Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的应用，所述突变蛋白质中的Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸在光激发下与四唑官能团化合物反应，生成具有荧光的吡唑啉环，从而实现在体内或体外有效的标记蛋白。
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