JPWO2020045656A1 - ピロリシルtRNA合成酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) M. mazei PylRSの発現、精製
His6-SUMO-M. mazei PylRS構造遺伝子をpET24にクローニングしたのち、大腸菌BL21-Gold(DE3)に形質転換、1LのLB培地で37℃培養、OD600=0.7のときに1mM IPTGを加え、20℃一昼夜培養した(His6-SUMO-M.mazei PylRSのアミノ酸配列は配列番号1)。菌体を回収し、HisTrap精製、SUMOプロテアーゼ処理後、HiTrap SP、Superdex 200 HiLoad16/60精製を行い、1L培地から4.4 mgのM. mazei PylRS(2.82 mg/ml×1.56 ml)を回収した。このMmPylRSを含有する溶液を濃縮した結果、濃縮限界は2.82mg/mLであった。
1.1 M. alvus PylRSの発現、精製
Methanomethylophilus alvusのPylRS(MaPylRS)構造遺伝子(配列番号2)をpET28にクローニングしたのち、大腸菌BL21-Gold(DE3)に形質転換、1LのLB培地で37℃培養、OD600=0.6のときに1mM IPTGを加え、20℃一昼夜培養した。菌体を回収し、HisTrap精製、Thrombin処理、HiTrapQ、Hitrap Heparin、Superdex 200精製を行い、1L培地から約100mgのMaPylRSを回収した。この回収量は、従来の古細菌のPylRSの場合よりも高かった。Methanosarcina属のPylRSを大腸菌で発現させた場合は、PylRSが沈殿しやすく精製が難しいために回収量が小さかった。また、このMaPylRSを含有する溶液を濃縮した結果、濃縮限界は20mg/mL以上であった。
3.1 無細胞タンパク質合成法における天然型PylRS濃度依存性
TCO*Lys導入において、天然型PylRSを用いた時の濃度依存性を評価した。反応液及び透析外液の組成は表1に準じた。tRNAPylはM. alvus由来のtRNAPylを用いた。PylRSはM. alvus由来の天然型PylRSを用いた。
4.1 MaPylRSの結晶構造解析
実施例1で回収したMaPylRSについて、結晶化スクリーニングにかけたところPEGを沈殿剤とする条件で結晶が出た。台湾ビームライン(TPS05A)で2.2Åの分解能(空間群C2)の回折データを取得、MmPylRS構造で分子置換したのち構造精密化を行った(Rf/Rw=28.8/22.8)。触媒ドメインはM. mazeiと類似した構造であったが、N末の2本のαヘリックスの傾きがM. mazeiと異なっていた。Tyr206(Phe384)がポケットの中まで入らずTyr206の周りの数残基で折れ曲がって内側を向いているため活性部位ポケットが広く開いている。MaPylRSはMmPylRSと活性部位ポケットの形状が若干異なり、ポケットの奥が少し狭いようである。構造を元にPylRS変異体の作製と非天然型アミノ酸導入実験を行った。
5.1 構造解析結果をもとに導入したMaPylRS変異体の評価
構造解析結果をもとに変異導入部位を決定したPylRSを用いて、非天然型アミノ酸導入を評価した。反応液及び透析外液の組成は表1に準じた。tRNAPylはM. alvus由来のtRNAPylを10 μMで用いた。MaPylRSは、従来のPylRS(Y126A/M129A)変異体又はPylRS(Y126A/M129L)変異体に、構造解析結果から導かれた新たな変異(H227I/Y228P)を追加したPylRS(Y126A/M129A/H227I/Y228P)とPylRS((Y126A/M129L/H227I/Y228P)を用いた。PylRSは10 μMで用いた。非天然型アミノ酸はZLys、mAzZLys、pEtZLys及びTCO*Lysを用いた。鋳型DNAはpN11GFPS1sh- A17Ambを用いた。合成反応は反応液(Reaction solution)30 μLを透析外液(External solution)1 mLに対して25℃にて一晩透析して行った。合成後の反応液は1 μL相当を約200倍希釈し、蛍光値を励起485 nm、発光535 nmで測定した。合成されたGFPS1タンパク質量は、1 mg/mLの標準GFPS1の蛍光値をもとに定量した。
6.1 無細胞タンパク質合成法におけるPylRS変異体を用いた非天然型アミノ酸導入のPylRS濃度依存性
反応液及び透析外液の組成は上記表1に準じた。このとき、PylRSはPylRS変異体を用いた。PylRS変異体の終濃度を5 μMから75 μMの間で確認した。水(Milli-Q water)はPylRS変異体濃度変更に伴う液量変化に応じて変更した。
7.1 無細胞タンパク質合成法におけるMaPylRS変異体を用いたZLys非天然型アミノ酸導入
反応液及び透析外液の組成は上記表1に準じた。このとき、PylRSはPylRS変異体を用いた。tRNAPylはM. alvus 由来のtRNAPylを用いた。PylRS変異体はM. alvus由来の図10の変異体を用いた。非天然型アミノ酸はNε-benzyloxycarbonyl-L-lysine (ZLys) (Bachem社)を用いた。非天然型アミノ酸導入用鋳型DNAはpN11GFPS1sh- A17Amb、コントロール用鋳型DNAはpN11GFPS1shを用いた。合成反応は反応液30 μLに対して透析外液1 mLで25℃にて一晩透析して行った。合成後の反応液は1 μL相当を約200倍希釈し、蛍光値を励起485 nm、発光535 nmで測定した。合成されたGFPS1タンパク質量は、1 mg/mLの標準GFPS1の蛍光値をもとに定量し、コントロールの通常合成に対する割合で表示した。
反応液及び透析外液の組成は上記表1に準じた。このとき、PylRSはPylRS変異体を用いた。tRNAPylはM. alvus由来のtRNAPylを用いた。PylRS変異体はM. alvus由来の図11の変異体を用いた。非天然型アミノ酸はNε-(m-azidobenzyloxycarbonyl)-L-lysine (mAzZLys) (Sundia/Namiki社)を用いた。非天然型アミノ酸導入用鋳型DNAはpN11GFPS1sh- A17Amb、コントロール用鋳型DNAはpN11GFPS1shを用いた。合成反応は反応液30 μLに対して透析外液1 mLで25℃にて一晩透析して行った。合成後の反応液は1 μL相当を約200倍希釈し、蛍光値を励起485 nm、発光535 nmで測定した。合成されたGFPS1タンパク質量は、1 mg/mLの標準GFPS1の蛍光値をもとに定量し、コントロールの通常合成に対する割合で表示した。
8.1 MaPylRS変異体を用いたTCO*-Lys非天然型アミノ酸導入Fab抗体の調製
Herceptin Fab抗体のL鎖にクリックケミストリー反応に有望な非天然型アミノ酸TCO*-Lysを導入する無細胞タンパク質合成を、下記表2の反応液及び透析外液の組成で行った。
9.1 大腸菌発現系でのM.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRSによる非天然型アミノ酸の導入効率の比較
非天然型アミノ酸(ncAA)はBocLys、AlocLys(Bachem)を使用した。PylRS遺伝子(野生型)はMaPylS(M.alvus PylRS遺伝子)、MmPylS(M.mazei PylRS遺伝子)、DhPylS(D.hafniense PylRSc遺伝子)を使用した。tRNAPyl遺伝子はMaPylT(M.alvus tRNAPyl)、MmPylT(M.mazei tRNAPyl)、DhPylT(D.hafniense tRNAPyl)を使用した。このとき、PylRS遺伝子とtRNAPyl遺伝子は同じ菌由来のものを組み合わせて使用した。大腸菌はBL21-Gold(DE3)を使用した。プラスミドはpBT5シリーズ (T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl)を使用した。タンパク質発現用プラスミドはpACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、N末から3番目のSerをアンバーコドンに変異)を使用した。
10.1 野生型GST-GFP融合タンパク質(3Ser)とアンバー変異GST-GFP融合タンパク質の解析
野生型GST-GFP、又はGST-GFP(amber3)を1mM BocLys存在下、5ml培地で発現させた。菌体を回収後、Bugbuster Master Mix reagent (Merck Millipore)で破砕、GST SpinTrap (GE Healthcare)でタンパク質を精製し、SDS-PAGE、Simplyblue safe stainで染色した。ゲル片を切り出しTrypsin/Lys-C Mix, Mass Spec grade (Promega)で37℃一昼夜消化後、His SpinTrap TALONで精製、0.1%TFAを含む4 %アセトニトリルで溶出後、MALDI-TOF MS分析を行った。
11.1 大腸菌発現系におけるMaPylRSを用いた非天然型アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入
非天然型アミノ酸(ncAA)はBocLys、AlocLys、DBocLys(Bachem)、PocLys(SynChem)を使用した。PylRSはMaPylRS、MmPylRS(R61K/G131E/Y384F)(BocLysRS2)を使用した。tRNAPylはM. alvus由来、M. mazeiのものをそれぞれ使用した。このとき、PylRSとtRNAPylは同じ菌由来のものを組み合わせて使用した。大腸菌はBL21-Gold(DE3)を使用した。プラスミドはpBT5シリーズ (T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl)を使用した。タンパク質発現用プラスミドはpACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、N末から3番目のSerをアンバーコドンに変異)を使用した。
12.1 大腸菌発現系におけるMaPylRS変異体を用いたZLys系非天然型アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入
非天然型アミノ酸は、ZLys(渡辺化学)、oClZLys、pNO2ZLys(Bachem)、pTmdZLys、oAzZLys、mAzZLys、oEtZLys、AmAzZLys、AzNO2ZLys(新成化学)を使用した。MaPylRS変異体は、Y126A/M129L、Y126A/M129L/Y206Fを使用した。MmPylRS変異体は、Y306A/Y384Fを使用した。tRNAPylはM. alvus由来、M. mazeiのものをそれぞれ使用した。このとき、PylRSとtRNAPylは同じ菌由来のものを組み合わせて使用した。大腸菌はBL21-Gold(DE3)を使用した。プラスミドはpBT5シリーズ(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNAPyl)を使用した。タンパク質発現用プラスミドはpACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、N末から3番目のSerをアンバーコドンに変異)を使用した。
13.1 小麦胚芽系無細胞タンパク質合成法におけるPylRS濃度依存性確認
真核生物タンパク質合成系におけるM. alvus PylRS高濃度化の有効性を確認するために、小麦胚芽系無細胞タンパク質合成法のPremium PLUS Expression Kit (株式会社セルフリーサイエンス)を用いてTCO*Lysの導入試験を行った。
14.1 ヒト系無細胞タンパク質合成法におけるPylRS濃度依存性確認
真核生物の中でも特に有用なヒト細胞由来のタンパク質合成系におけるM. alvus PylRSの有効性を確認するために、ヒト細胞系無細胞タンパク質合成法のHuman Cell-Free Protein Expression Maxi System (TAKARA)を用いてTCO*Lysの導入試験を行った。
15.1 AcLys導入確認試験
M. alvus PylRSを使用して、非天然型アミノ酸Nε-acetyl-L-lysine (AcLys)の導入を確認した。
16.1 Phe誘導体の導入確認試験
M. alvus PylRSを使用して、Phenylalanine(Phe)誘導体である3-iodo-L-Phenylalanine (IPhe)の導入を確認した。
17.1 Tyr誘導体の導入確認試験
M. alvus PylRSを使用して、Tyrosine(Tyr)誘導体であるo-propargyl-L-tyrosine (oPgTyr)の導入を確認した。
18.1 Methanogenic archaeon ISO4-G1由来のPylRSの確認試験
メタン生成古細菌であるMethanogenic archaeon ISO4-G1のPylRS(G1PylRS)の評価を行った。合成に用いたDNA配列は、ISO4-G1のPylRSがATGGTAGTCAAATTCACTGACAGCCAAATCCAACATCTGATGGAGTATGGTGATAATGATTGGAGCGAGGCAGAATTTGAGGACGCTGCTGCTCGTGATAAAGAGTTTTCAAGCCAATTCTCCAAGTTGAAGAGTGCGAACGACAAAGGATTGAAAGACGTCATTGCGAACCCGCGTAATGACCTGACCGACCTTGAAAATAAGATTCGTGAGAAACTTGCTGCACGCGGTTTCATCGAAGTGCATACGCCTATTTTTGTATCTAAGAGTGCATTAGCCAAGATGACAATCACCGAGGATCATCCTTTATTCAAGCAGGTCTTCTGGATCGACGACAAACGTGCCTTGCGTCCAATGCATGCGATGAATCTTTATAAGGTAATGCGCGAGTTGCGCGATCACACAAAGGGACCAGTCAAGATCTTCGAGATTGGCTCGTGCTTCCGCAAGGAAAGCAAGTCATCGACGCATTTGGAAGAATTCACTATGCTGAACTTAGTTGAGATGGGACCCGATGGCGACCCTATGGAGCACCTTAAGATGTATATTGGAGACATCATGGACGCGGTTGGTGTAGAATACACCACCTCACGTGAGGAGTCTGATGTGTACGTAGAGACACTTGACGTGGAGATCAATGGAACTGAAGTTGCGTCAGGAGCAGTAGGTCCTCATAAGCTTGACCCTGCCCACGATGTGCATGAACCCTGGGCAGGAATCGGATTCGGACTGGAGCGTCTGTTGATGCTTAAGAACGGTAAATCGAATGCTCGTAAGACAGGCAAAAGTATCACCTATTTGAATGGTTACAAATTGGAT(配列番号7)であり、tRNAPylがGGAGGGCGCTCCGGCGAGCAAACGGGTCTCTAAAACCTGTAAGCGGGGTTCGACCCCCCGGCCTTTCGCCA(配列番号8)である。ISO4-G1のtRNAPylのRNA配列はGGAGGGCGCUCCGGCGAGCAAACGGGUCUCUAAAACCUGUAAGCGGGGUUCGACCCCCCGGCCUUUCGCCA(配列番号9)である。
19.1 Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS変異体の確認試験
Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRSの変異体としてPylRS(Y125A/M128A)及びPylRS(Y125A/M128L)を用いて、非天然型アミノ酸導入確認を行った。非天然型アミノ酸はZLys、TCO*Lys、BCNLys、pETZLys、pAzZLysを確認した。大腸菌無細胞タンパク質合成系の反応溶液にISO4-G1のtRNAPyl及びPylRS変異体をそれぞれ10 μM、非天然型アミノ酸を1 mM添加した。非天然型アミノ酸導入用鋳型DNAはpN11GFPS1sh- A17Amb、コントロール用鋳型DNAはpN11GFPS1shを用いた。合成反応は反応液30 μLに対して透析外液1 mLで25℃にて一晩透析して行った。合成後の反応液は1 μL相当を約200倍希釈し、蛍光値を励起485 nm、発光535 nmで測定した。合成されたGFPS1タンパク質量は、1 mg/mLの標準GFPS1の蛍光値をもとに定量した。
20.1 無細胞タンパク質合成法におけるMethanogenic archaeon ISO4-G1濃度依存性確認試験
Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS及びPylRS変異体はM. alvus PylRS同様に濃縮限界が高く、高濃度で使用可能である。そこで、図27でコントロール合成量100%に到達しなかったpEtZLysにおいて、Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS変異体のPylRS(Y125A/M128L)を用いた時の濃度依存性を確認した。
反応液および透析外液の組成は表1に準じた。
21.1 動物細胞におけるmAzZLysのタンパク質への導入
M. alvus PylRS変異体(Y126A/M129L/H227I/Y228P)とM. alvus tRNAPyl、又はMethanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS変異体(Y125A/M128L)とISO4-G1 tRNAPylを動物細胞(HEK293c18細胞)で高発現するために、非特許文献(Mukai, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 371, pp. 818-822(2008))に記載されたシステムを用いた。タンパク質については、その遺伝子のコード領域にアンバー・コドンを導入(T137又はN157)した変異遺伝子並びにその発現システムを用いた。
Claims (48)
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のピロリシルtRNA合成酵素(PylRS)と、非天然型アミノ酸と、を接触させる工程を含む、非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法であって、
(a) Methanosarcina mazeiのPylRS(MmPylRS)を用いた無細胞タンパク質合成系を利用した場合に比べて高効率でポリペプチドへ非天然型アミノ酸を導入する工程、又は(b) glmSプロモーターの制御下にある前記PylRSの遺伝子を有するベクターを用いた大腸菌タンパク質合成系を利用した場合、及びglnSプロモーターの制御下にある前記PylRSの遺伝子を有するベクターを用いた大腸菌タンパク質合成系を利用した場合、に比べて高効率でポリペプチドへ非天然型アミノ酸を導入する工程、から選ばれる導入工程を含む、生産方法。 - 前記導入工程は、PylRSとしてMmPylRSを用いた場合に比べて非天然型アミノ酸を1.5倍以上の効率でポリペプチドへ導入する工程である、請求項1に記載の生産方法。
- 前記接触は、高濃度の前記PylRSを含有する非天然型アミノ酸導入系において行われる、請求項1又は2に記載の生産方法。
- 前記非天然型アミノ酸導入系は、無細胞タンパク質合成系の反応溶液であり、前記導入工程は前記(a)の工程である、請求項3に記載の生産方法。
- 前記反応溶液が、15μM以上のPylRSを含有する、請求項4に記載の生産方法。
- 前記反応溶液が、天然型とは異なる位置に終止コドンを有する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項4又は5に記載の生産方法。
- 5mg/mL以上の前記PylRSを含有する溶液と、非天然型アミノ酸と、を混合し、混合溶液を調製する工程を含み、前記導入工程は前記(a)の工程である、請求項1〜6いずれかに記載の生産方法。
- 前記非天然型アミノ酸導入系は、生細胞タンパク質合成系の細胞であり、前記導入工程は前記(b)の工程である、請求項3に記載の生産方法。
- 前記細胞は、MaPylRSと高発現プロモーターとをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項8に記載の生産方法。
- 前記PylRSが、Methanomethylophilus属、Methanomassiliicoccus属、もしくはMethanoplasma属の生物、又はMethanomassiliicoccales archaeon RumEn M1、Methanogenic archaeon ISO4-H5、Methanogenic archaeon ISO4-G1、もしくはThermoplasmatales archaeon BRNA1のPylRSである、請求項1〜9いずれかに記載の生産方法。
- 前記PylRSが、Methanomethylophilus属の生物のPylRSである、請求項1〜9いずれかに記載の生産方法。
- 前記PylRSが、Methanosarcina mazeiのPylRSとアライメントしたときに、N末端側の少なくとも50アミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有する、PylRSである、請求項1〜11いずれかに記載の生産方法。
- 前記PylRSが、Methanomethylophilus alvusのPylRS(MaPylRS)である、請求項1〜11いずれかに記載の生産方法。
- 前記PylRSが、Methanogenic archaeon ISO4-G1のPylRS(G1PylRS)である、請求項1〜10いずれかに記載の生産方法。
- 前記非天然型アミノ酸が、リシン誘導体、チロシン誘導体、フェニルアラニン誘導体、トリプトファン誘導体、アルギニン誘導体、メチオニン誘導体、ロイシン誘導体、ヒスチジン誘導体、プロリン誘導体、システイン誘導体、スレオニン誘導体、セリン誘導体、アラニン誘導体、イソロイシン誘導体、バリン誘導体、グルタミン誘導体、グルタミン酸誘導体、アスパラギン誘導体、アスパラギン酸誘導体、グリシン誘導体、セレノシステイン誘導体、ピロリシン誘導体、キヌレニン誘導体、オルニチン誘導体、シトルリン誘導体、カナバニン誘導体、ジアミノピメリン酸、又はこれらいずれかのαヒドロキシ酸誘導体である、請求項1〜14いずれかに記載の生産方法。
- 前記PylRSが、天然型又は変異型PylRSである、請求項1〜15いずれかに記載の生産方法。
- 前記非天然型アミノ酸含有ポリペプチドは、薬物と結合している、請求項1〜16いずれかに記載の生産方法。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSと、非天然型アミノ酸と、を接触させる工程を含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入方法であって、
(a) MmPylRSを用いた無細胞タンパク質合成系を利用した場合に比べて高効率でポリペプチドへ非天然型アミノ酸を導入する工程、又は(b) glmSプロモーターの制御下にある前記PylRSの遺伝子を有するベクターを用いた大腸菌タンパク質合成系を利用した場合、及びglnSプロモーターの制御下にある前記PylRSの遺伝子を有するベクターを用いた大腸菌タンパク質合成系を利用した場合、に比べて高効率でポリペプチドへ非天然型アミノ酸を導入する工程、から選ばれる導入工程を含む、導入方法。 - 高濃度のMethanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSを含有する、非天然型アミノ酸導入系。
- 無細胞タンパク質合成系の反応溶液である、請求項19に記載の非天然型アミノ酸導入系。
- 前記反応溶液が、15μM以上のPylRSを含有する、請求項20に記載の非天然型アミノ酸導入系。
- 前記反応溶液が、天然型とは異なる位置に終止コドンを有する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項20又は21に記載の非天然型アミノ酸導入系。
- 生細胞タンパク質合成系の細胞である、請求項19に記載の非天然型アミノ酸導入系。
- 前記細胞は、MaPylRSと高発現プロモーターとをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項23に記載の非天然型アミノ酸導入系。
- 前記PylRSが、天然型又は変異型PylRSである、請求項19〜24いずれかに記載の非天然型アミノ酸導入系。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSを含有する、無細胞タンパク質合成系の反応溶液。
- 天然型とは異なる位置に終止コドンを有する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項26に記載の反応溶液。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSと、非天然型アミノ酸と、を細胞外で接触させる工程を含む、非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法。
- MmPylRSを用いた無細胞タンパク質合成系を利用した場合に比べて、非天然型アミノ酸導入効率が高い、請求項28に記載の生産方法。
- 前記PylRSが、天然型又は変異型PylRSである、請求項28又は29に記載の生産方法。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSと、非天然型アミノ酸と、を細胞外で接触させる工程を含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入方法。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSと、非天然型アミノ酸と、tRNAと、を細胞外で接触させる工程を含む、非天然型アミノ酸が結合したtRNAの生産方法。
- 精製された、Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRS。
- 5mg/mL以上のMethanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSを含有する、溶液。
- 前記PylRSが、天然型又は変異型PylRSである、請求項34に記載の溶液。
- 請求項34又は35いずれかに記載の溶液と、非天然型アミノ酸と、を混合し、混合溶液を調製する工程を含む、非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法。
- 前記混合溶液は、無細胞タンパク質合成系の反応溶液である、請求項36に記載の非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法。
- 請求項34又は35いずれかに記載の溶液を無細胞タンパク質合成系の反応溶液に添加する工程を含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入方法。
- 請求項34又は35いずれかに記載の溶液を含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入剤。
- 請求項34又は35いずれかに記載の溶液を無細胞タンパク質合成系の反応溶液に添加する工程を含む、非天然型アミノ酸が結合したtRNAの生産方法。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSと、高発現プロモーターと、をコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記PylRSが、天然型又は変異型PylRSである、請求項41に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項41又は42に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
- 請求項41又は42に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、又は請求項40又は41に記載のポリヌクレオチドからPylRSを発現させる工程を含む、非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法。
- 請求項41又は42に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、又は請求項40又は41に記載のポリヌクレオチドからPylRSを発現させる工程を含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入方法。
- 請求項41又は42に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリペプチドへの非天然型アミノ酸の導入剤。
- 請求項41又は42に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、又は請求項40又は41に記載のポリヌクレオチドからPylRSを発現させる工程を含む、非天然型アミノ酸が結合したtRNAの生産方法。
- Methanomassiliicoccales目又はThermoplasmatales目の生物のPylRSを生細胞で高発現させる工程を含む、非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法。
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