NO175318B - Hybridgen for veksthormonfrigjörende faktor, replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor inneholdende et slikt gen, samt mikroorganisme transformert med en slik vektor og hybridpolypeptid som inneholder en Trp-GRF - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et hybridgen for vekst-hormonfrigjørende faktor, en replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor inneholdende et slikt gen, samt en mikroorganisme som er transformert med en slik vektor, og et hybridpolypeptid.

Nylig er en gruppe forbindelser kalt veksthormon-fri-gjørende faktorer (GRF) blitt isolert fra bukspyttkjerteltumoren hos en pasient med akr.omegali. Guillemin et al,

Science 218, 585, 1982; Esch et al, J. Biol. Chem. 258 , 1806, 1983.

Flere former av GRF er blitt renset og aminosyresek-vensene bestemt. GRF-44 inneholder den fullstendige aminosyresekvens til GRF-40 og er forlenget i carboxylenden med fire aminosyrer.

GRF-40 igjen, inneholder den fullstendige aminosyresekvens til GRF-37 og er forlenget i carboxylenden med tre aminosyrer. Peptidet GRF-29 (J. River et al., Nature 300, 276-8, .1982) er også blitt påvist å være biologisk aktivt.

Bare carboxylenden til GRF-44 (Leu) er amidert (GRF-NH2-44). Det antas at GRF-NH2~4 4 er det fullt utviklede hormon og at GRF-40, -37 og -29 er proteolytiske derivater av dette, selv om alle de ovenfor nevnte GRF-forbindelser er biologisk aktive.

Det er blitt rapportert at GRF-forbindelser virker både på syntesen av og frigjørelsen av veksthormon fra bukspyttkjertelen. Brazeau et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 19_, 7909, 1982; Baringa et al., Nature, 306, 84, 1983.

Det har vært antatt at GRF-44-peptidet isolert fra hypothalamus (hhGRF) var identisk med peptidet avledet fra tumor i bukspyttkjertelen (hpGRF), og faktisk ble det påvist immunologiskreaktivitet mellom hhGRF og antistoffer frembragt mot hpGRF. Dertil ga begge peptidene den samme profil når de ble analysert ved hjelp av HPLC (Bohlen et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 930, 1983). I det aller siste er det blitt vist at hpGRF og hhGRF har den samme aminosyresek-1 vens (Ling et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 8JL, 4302, 1984). Syntesen og karakteriseringen av komplementært DNA

for budbringer-RNA isolert fra bukspyttkjerteltumoren som produserer hpGRF har vist at GRF-44 produseres som et pre-

prohormon med 107 - 108 aminosyrer og at GRF strekker seg fra aminosyrerest 32 til aminosyrerest 75. (Gubler et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 80, 4311, 1983; Mayo et al, Nature, 306, 86, 1983).

Den Gly-Arg som følger etter GRF-44-sekvensen ligner svært på et typisk amideringssete (Boel et al, The EMBO J.

_3, 909, 1984; Bradbury et al, Nature, 298, 686, 1982).

GRF-ene kan utnyttes terapeutisk på de fleste områder som nå ansees som kandidater for behandling ved hjelp av veksthormon. Eksempler på slike terapeutiske anvendelser omfatter behandling av hypofyse-dvergvekst, sukkersyke som skriver seg fra unormal veksthormonproduksjon, behandling av sår og alvorlige forbrenninger.

Størrelsen av GRF i dens forskjellige former er slik

at dens fremstilling lar seg gjennomføre ved hjelp av vanlige metoder for peptidsyntese. Flere GRF-derivater har faktisk blitt produsert ved hjelp av disse metodene og funnet å være biologisk aktive (Murphy et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 469, 1983; Thorner et al, Lancet, 1./8. januar, 24, 2983;

Adams et al, Lancet, 14. mai, 1100, 1983; Rosenthal et al, J. Clin. Endocr. Metab. , 5J7, 677, 1983). Videre er det mulig å syntetisere peptider som inneholder en amidert carboxylrest i endeaminosyren. Produksjon av GRF-44 på kjemisk måte er imidlertid svært kostbar og produksjonen av peptidet ved hjelp av teknikker med rekombinant DNA synes å være mer lett-vint.

Europeisk patentsøknad med publikasjonsnummer 0108387 beskriver fremstillingen av syntetiske DNA-molekyler som koder fer forskjellige former av GRF, som har et methionin-kodon foran seg, og som etter innføring i en passende ekspresjonsvektor, muliggjør den direkte syntese av en methionylert GRF ved hjelp av en passende mikroorganisme. Det er beskrevet en frem-gangsmåte som omfatter fremstillingen av to rekker oligode-. oxyribonukleotidfragmenter som, når de bindes sammen i den korrekte sekvens, gir to dobbeltkjedede DNA-molekyler som koder for henholdsvis amino- og carboxylendene i GRF-peptidet.

De to dobbeltkjedede DNA-molekyler ligeres sammen, hvor-ved man får det ønskede strukturgen for GRF. De foretrukne ekspresjonsvektorer er derivater av plasmid pBR322 som inneholder P -promoteren isolert fra bakteriofag lambda DNA og som er innført mellom tet R - og amp R-genene. Tilstedeværelsen av den ytterligere methioninaminosyre i N-enden av GRF-molekylet fremkaller muligheten for uønsket immunologisk reak-sjon, særlig ved langvarige behandlinger.

Oppfinnelsen vedrører hybridgen for fremstilling av en GRF ved hjelp av et hybridpolypeptid erholdt gjennom teknikker med rekombinant DNA, samt det materiale som brukes ved fremstillingen.

Hybridpolypeptidet inneholder aminosyrene 1-323 til TrpE koblet i rekkefølge med aminosyren Trp og aminosyresek-vensen til GRF. En ikke-amidert GRF kan fåes ved reduksjon og carboxyamidomethylering, spesifikk spalting av Trp-resten etterfulgt av gelfiltrering og rensing av GRF ved hjelp av

HPLC.

Følgelig er det et formål ved oppfinnelsen å tilveie-bringe et hybridgen for fremstillingen av GRF som et hybridpolypeptid kodet for av et plasmid og basert på bruken av E. coli Trp promoter/operator etterfulgt av Trp-leder og -attenuator, ved hjelp av det ribosomale bindingssete hos TrpE-genet, ved hjelp av DNA som koder for de første to tredjedeler av TrpE-polypeptidet, et Trp-kodon og ved hjelp av genet som koder for GRF-peptid.

Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebrakt et hybridgen som er kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for en TrpE-homolog aminosyresekvens, fusjo-nert i leseramme til et strukturelt gen som koder for Trp-GRF, og som har et kodon for Trp umiddelbart foran det første N-terminale tyrosinkodon. Videre er det tilveiebrakt en replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor som inneholder et hybridgen ifølge krav 4 og er i stand til å uttrykke genet, en mikroorganisme som er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 5 eller 6, og er i stand til å uttrykke hybridgenet, og et hybridpolypeptid som inneholder en Trp-GRF, hvor aminosyren Trp er umiddelbart foran den første N-terminale aminosyre Tyr, og en TrpE-homolog aminosyresekvens er umiddelbart foran Trp-GRF-sekvensen.

Oppfinnelsen beskrives mer detaljert nedenunder hvor:

Fig. 1 viser nukleotidsekvensen til genet som koder for GRF-44. DNA-molekylet ble syntetisert kjemisk ved hjelp av fosfotriestermetoden i fast fase under anvendelse av di-nukleotider som byggestener og polystyren som den faste bærer. Bgl II, Xbal, BstXI, Narl og BamHI angir de steder som gjen-kjennes av disse restriksjonsendonukleaser. "Stopp" angir kodonet for proteinsynteseavslutning; Fig. 2 er et restriksjonskart for plasmidvektor pSP2 hvor den tynne linje representerer pBR322-DNA, den tykke linje representerer E. coli kromosomal DNA som bærer Trp-promoteren/ operatoren, Trp-ledersekvensen (TrpL), hele det strukturelle genet for TrpE og deler av det strukturelle gen for TrpD (& TrpD). Ap R og Tc angir genene som gir resistens mot henholdsvis ampicillin og tetracyklin, og "Ori" er begynnelses-stedet for replikasjon i dette plasmidet; Fig. 3 viser konstruksjon av plasmid pSP2del fra plasmid pSP2 hvor AE representerer det ufullstendige strukturelle gen for TrpE; Fig. 4 er et skjema for konstruksjonen av plasmid pSP19 fra plasmid pSP2del; og Fig. 5 er den skjematiske struktur for aminosyresek-vensen til hybridpolypeptidet TrpE-GRF som viser hele amino-syresekvensen til TrpE-delen og de første aminosyrene i GRF. Hele sekvensen til GRF-44 er gjengitt i fig. 1.

På grunn av tilstedeværelsen av flere restriksjons-enzymseter på GRF-44-DNA-molekylet, er det mulig å avlede tre andre molekyler som utgjør et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen, dvs. koding for peptidene GRF-40, GRF-37 og GRF-29.

Således kan DNA-molekylet spaltes med restriksjons-enzymet Narl og 3'-endefragmentet kan erstattes med det føl-gende oligonukleotid:

for å frembringe et DNA-molekyl som koder for GRF-40.

Et DNA-molekyl som koder for GRF-37, kan fåes på føl-gende måter: a) DNA-molekylet i fig. 1 spaltes med restriksjonsenzym BstXI som vil frembringe den følgende 3'-ende: b) Den énkjedede ende fjernes med Sl—exonuklase.

c) Det følgende oligonukleotid:

føyes til 3'-enden for på nytt å frembringe det 37. kodon.

Ved å spalte DNA-molekylet ifølge fig. 1 med restriksjonsenzym Xbal og å bytte ut 3<1->endefragmentet med det føl-gende oligonukleotid:

fåes det et DNA-molekyl som koder for GRF-29.

Konstruksjonen av plasmidet pSPl9 og fremstillingen av det plasmidavledede hybridpolypeptid TrpE-GRF-44 ble utført på følgende måte.

1) Konstruksjon av plasmid pSP2. Plasmidet pSP2 ble konstruert

ved å gå ut fra pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95-113, 1977) og A EDlOf (-Armstrong et al., Science, 196, 172, 1977

og Helsinki et al., i: Recombinant Molecules, Tenth Miles International Symposium, Raven Press, 1977, sidene 151-165), som ble brukt som kilden for E. coli Trp operon DNA, som strekker seg fra promoter til det strukturelle gen for TrpD. pBR322 og A EDlOf ble spaltet med restriksjonsenzymene Ecorl og Hindlll. Ecorl-Hindlll-fragmentet fra A EDlOf og som bærer operon-regulatorfunksjonene for Trp, det fullstendige strukturelle gen for TrpE og 5 Lenden av det strukturelle gen for TrpD ble ligert med det store HindIII-EcoRI-fragment fra pBR322 ved hjelp av T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere E-coli W3110 &Trp E5/tna2-celler (Nichols and Yanofsky, Methods in Enzymology, 101, 155, 1983). De transformerte celler ble platet ut på minimalmediumplater som manglet tryptofan. En Trp+-klon ble brukt som kilde for plasmid pSP2 rekombinant DNA. Celler av denne klon ble dyrket og lagret i rikt medium (f.eks. NB, Difco) med tilsetning av 50ug/ml ampicillin (Ap). Restriksjonskartet for pSP2 er vist i fig. 2 hvor det tykke Ecorl-Hindlll-fragment bærer E. coli Trp-funksjonene og er avledet fra A EDlOf, mens den øvrige DNA er avledet fra pBR32 2.

2. Konstruksjon av plasmid pSP2del. Plasmid-DNA fra pSE2 ble spaltet med BglTl endonuklease og det store fragmentet ble renset ved hjelp av agarosegelelektroforese og ligert til seg selv med T4_DNA-ligase. Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere W3110 ATrpE5/tna 2-celler. Ap -transfor-manter ble utvalgt på "Nutrient Agar" (Difco) som inneholdt 50 ug/ml Ap. En Ap -klon ble brukt som kilde for pSP2del-

DNA hvis restriksjonskart er vist i fig. 3. (se beskrivelse av fig. 2 for nærmere detaljer).

Fjerningen av Bgl II-fragment fra det strukturelle

gen for TrpE forårsaket ekspresjon av en del av polypeptidet TrpE med tap av dets enzymatiske aktivitet. De W3110 4TrpE 5tna 2-celler som bærer pSp.2del må derfor dyrkes i nærvær av tryptofan.

Sammenføyningen av Bgl Il-seter i pSP2del skaper et nytt stoppkodon for proteinsyntesen. (Nichols et al, J. Mol. Biol. 146,45-54, 1981).

Den pSP2del-avledede del av TrpE (ATrpE) inneholder således 342 aminosyrer, i motsetning til de 520 i det fullstendige protein som kodes for av plasmid pSE2 (se igjen fig. 3) . 3. Kloning av gen for Trp- GRF- 44. pSP2del-DNA ble spaltet med Bgl II og BamHI restriksjonsenzymer og det store fragmentet ble renset ved hjelp av agarosegelelektroforese. Denne DNA ble blandet med det syntetiske Trp-GRF-44-kodende DNA-molekyl (se fig. 1) og behandlet med T4-DNA-ligase.

Fig. 4 viser konstruksjonen av plasmid pSP19 ved inn-føring av det syntetiske gen i plasmidet pSE2del.

Tc c angir følsomhet for tetracyklm.

Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere W3110 ATrpE/tna2-celler og Ap -kloner ble valgt ut på plater som inneholdt 50 ug/ml Ap.

R S

En Ap -klon som ga følsomhet for tetracyklin (Tc ) ble brukt som kilde for pSP19-DNA.

Nukleotidsekvensen til gen for Trp-GRF-44 lar syntesen av et hybridpolypeptid mellom del-TrpE og GRF-44 adskilt med en tryptofanrest skje. Trp lar seg spalte med iodosobenzoesyre slik som beskrevet nedenunder. Hybridpolypeptidet som kodes for av DNA i plasmid pSPl9, har den aminosyresekvens som er vist i fig. 5, og er på vanlig måte angitt som TrpE-GRF.

De første 323 aminosyrer utgjør den første to tredje-del av TrpE, som etterfølges av en trp-rest og aminosyre-sekvensen til GRF-44. TrpE-GRF er derfor sammensatt av 368 aminosyrer.

Produksjon av hybridproteinet TrpE- GRF- 44

Celler av stamme W3110 4TrpE5tna2 (pSPl9) ble dyrket over natten i 3 ml SMM (Spizizen minimalmedium) som pr.

liter vandig oppløsning inneholder:

Etter sterilisering ved hjelp av autoklavering ble det følgende tilsatt:

10 ml 40% glucose

3,5 ug/ml indol.

g

Kulturen (ca. 4,3 x 10 celler/ml) ble fortynnet i 10 liter av samme medium og cellene ble dyrket under omrøring og innblåsingav 1 liter luft ved 1 atm trykk pr. minutt.

Sammensetningen av mediet og dyrkningsbetingelsene i en 10 liters fermentor er blitt påvist å være ideelle for å holde undertrykkingen av pSPl9 som bærer Trp-promoteren, opp-hevet (slik at ekspresjon av polypeptidet TrpE-GRF kan skje) og også for å muliggjøre dyrkingen av cellene.

Etter 22 - 25 timer med dyrkning nådde kulturen en

OD på ca. 3,0 ved 590 nm. Cellene ble innhøstet ved sentrifugering og lagret ved -80°C. En prøve av disse cellene ble brukt til å analysere proteininnholdet ved hjelp av poly-acrylamidgelelektroforese som påviste tilstedeværelsen av det ønskede polypeptid TrpE-GRF.

Rensing av polypeptid TrpE- GRF

De nedfryste celler ble tint i den følgende buffer: 0. 2 M Tris-HCl pH 7,6; 0,2 M NaCl; 0,01 M CH3COOMg; 0,01 M 3-mercaptoethanolog 5% glycerol. Cellene ble oppmalt i nærvær av alumina og cellerestene ble fjernet ved sentrifugering.

Den vandige fase ble fortynnet fire ganger med 1^0 og hybridproteinet ble utfelt ved tilsetning av 144 g (NH^)2S04 pr. liter sluttoppløsning.

De utfelte proteiner ble pelletert ved sentrifugering, oppløst i vann og grundig dialysert mot 10 mM NH^HCO^.

Dialysatet ble så analysert ved hjelp av PAGE og lyofilisert.

Adskillelse av GRF- 44 fra hybridpolypeptidet TrpE- GRF

Polypeptidet TrpE-GRF ble utsatt for en rekke kjemiske reaksjoner som er beskrevet nedenunder for å muliggjøre ad-skillelsen av GRF-peptidresten.

1. Reduksjon og carboxyamidomethylering av Cys- restene. Be-tingelsene for reduksjon og carboxyamidomethylering ble tatt fra en artikkel av G. Allen: Laboratory Techniques in bio-

chemistry and Molecular Biology, Vol. 9, s. 28, red. T.S.

Work and R.H. Burdon, Elsevier, 1981. Det på forhånd frem-stilte og lyofiliserte polypeptid TrpE-GRF ble oppløst i føl-gende buffer: Tris-HCl 0,5M; EDTA 0,1%; Guanidin-HCl 6M pH 8,5.

Sluttkonsentrasjonen av protein var 2%. DTT ble så tilsatt i en konsentrasjon 15 ganger høyere enn Cys-innholdet i proteinet. Blandingen ble deretter inkubert i 2 timer ved 50°C og iodacetamid ble tilsatt ved dobbel DTT-konsentrasjon. Etter 3 0 minutter med inkubering i mørke ved værelsetemperatur, ble reaksjonen avbrudt ved tilsetning av 3-mercaptoethanol.

Reaksjonsblandingen ble deretter dialysert i 2 timer mot vann og over natten mot 10 mM NH^HCO^. Dette materiale som inneholdt det carboxyamidomethylerte polypeptid TrpE-

GRF, ble deretter lyofilisert.

2. Iodosobenzoesyrereaksjon. Fremgangsmåten som ble brukt var i det vesentlige som beskrevet av A. Fontana et al.: Bio- chemistry 2_0, 6997, 1981. 5 mg iodosobenzoesyre ble oppløst i 375 ul 4M guanidin-HCl, 80% eddiksyre. Til denne oppløsning ble det tilsatt 7,5 ul p-cresol og deretter ble 5 mg carboxy-amidomethylert TrpE-GRF oppløst.

Reaksjonen fikk fortsette i 20 timer i mørke ved værelsetemperatur. 750 pl vann ble deretter tilsatt og etter 10 minutter ble blandingen sentrifugert i 5 minutter ved 12.000 g. Den vandige fase inneholdt peptider, deriblant GRF-44. 3. Rensing av GRF- 44. Den tidligere erholdte vandige opp-løsning ble avsaltet ved gelfiltrering gjennom 1 x 50 cm kolonne av Sephadex<®>G-25, ekvilibrert mot 5% eddiksyre. Gjennom-strømningshastigheten var ca. 3 ml/time. Det utelukkede materiale ble utvunnet og volumet redusert ved inndamping. Den således erholdte konsentrerte oppløsning ble analysert ved hjelp av HPLC under anvendelse av en C18-kolonne: ekvilibrert med 10 mM H3P04, bragt til pH 3,5 med Et^N.

Peptidene ble eluert med acetonitril og samlet opp i

fraksjoner som deretter ble analysert ved hjelp av RIA.

Resultatene viste tilstedeværelse av immunologisk

aktivitet i hovedtoppen.

Hybridpolypeptidene TrpE-GRF-40, TrpE-GRF-37 og TrpE-GRF-29 og de tilsvarende peptider GRF-40, GRF-37 og GRF-29 kan fåes ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge med de som er beskrevet ovenfor for fremstilling av TrpE-GRF-44 og GRF-44.

W3110 ATrpE5 tna2-celler som inneholder de her beskrevne plasmider, er blitt deponert ved ATCC og identifisert på føl-gende måte:

Claims (11)

1. Hybridgen, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for en TrpE-homolog aminosyresekvens, fusjo-nert i leseramme til et strukturelt gen som koder for Trp-GRF, og som har et kodon for Trp umiddelbart foran det første N-terminale tyrosinkodon.

2. Hybridgen ifølge krav 1, karakterisert ved at den TrpE-homologe aminosyresekvens omfatter aminosyrene 1-323 i TrpE.

3. Hybridgen ifølge et av kravene 1-2, karakterisert ved at GRF er valgt fra GRF-44, GRF-40, GRF-37 og GRF-29.

4. Hybridgen ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at det er operativt bundet til en DNA-sekvens som er i stand til å bevirke mikrobiell ekspresjon av det strukturelle gen.

5. Replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder et hybridgen ifølge krav 4 og er i stand til å uttrykke genet.

6. Replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor ifølge krav 5, karakterisert ved at vektoren er et plasmid.

7. Mikroorganisme, karakterisert ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 5 eller 6, og er i stand til å uttrykke hybridgenet.

8. Mikroorganisme ifølge krav 7, karakterisert ved at den er en stamme av E. coli.

9. Hybridpolypeptid som inneholder en Trp-GRF, karakterisert ved at aminosyren Trp er umiddelbart foran den første N-terminale aminosyre Tyr, og en TrpE-homolog aminosyresekvens er umiddelbart foran Trp-GRF-sekvensen.

10. Hybridpolypeptid ifølge krav 9, karakterisert ved at den TrpE-homologe aminosyresekvens er 1-323 av TrpE.

11. Hybridpolypeptid ifølge et av kravene 9 og 10, karakterisert ved at GRF-sekvensen er valgt fra GRF-44, -40, -37 og -29.