PT98332B - Metodo para a producao de uma proteina biologicamente activa por processamento in vitro de proteinas de fusao - Google Patents

Metodo para a producao de uma proteina biologicamente activa por processamento in vitro de proteinas de fusao Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 98.332
REQUERENTE: ciba-geigy ag . , suiça, sede em Klybeckstrasse 141, 4002 Basel industrial, - SUIÇA com
EPÍGRAFE: METODP para a produção de uma PROTEÍNA
BIOLOGICAMENTE ACTIVA POR PROCESSAMENTO IN VITRO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO ' —. --
INVENTORES: JUTTA HEIM e KENJI TAKABAYASHI
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.® da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. 1 8 de Julho de 1990 sob o No.
9015825.4 no Reino Unido
-ϊ
CIBA-BEIBY AG
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ACTIVA POR PROCESSAMENTO IN VITRO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO”
MEMÓRIA DESCRITIVA
RESUMO
O presente invento dis respeito s um novo método para a produção ds proteina biologicamente activa, compreendendo o tratamento de uma proteina. de fusão consistindo ems
í. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo na. referida, proteína biologicamente activa, o aminoácido C~terminal do qual está ligado a uma sequência polipeptídica ligante L e um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido u-termi.” nsl dos referidos sucessivos seqmencos de proteína ou consistindo em
1. um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-térmi2. múltiplos segmentos sucessivos de proteína, cada um consistindo numa sequência polipeptidica ligante L e na referida proteína biologicamente activa» ί
com sndoprotea.se solúvel de solúvel de levedura yscói h i o1oq i oamente activa» levedura ysct s com Ca.r taoxipeptida.se e isolamento da referida proteína.
r ι
presente invente está relacionado com um método para a produção ds proteínas maduras através de um processamento in vitro das proteínas de fusão e com meios necessários para a ão íSb ta.is proteínas ds Tusáo»
A produção de proteínas farmaceuticamente aplicáveis ou erisimaticamente activas é uma área chave na industria da biotecnologia em rápido desenvolvimento» Desde o inicio da era da tecnologia de DNA recombinante foram expressas muitas proteínas heterólogas importantes em células hospedeiras procsrióticas e eucarióticas gue foram transformadas com vectores de expressão adequados contendo sequências ds DNA codificadoras da.s referidas proteínas. No entanto em muitos casos foram encontradas grandes dificuldades na produção ds quantidades suficientes de produtos puros. Frequentemente observa-se, especialmente no caso de proteínas de baixo peso molecular, que o produto é impuro devido á presença de quantidades variáveis ds produtos secundários degradas, principalmente degradados no extremo C, que baixam o rendimento e tornam díficil a purificação. Noutros casos o rendimento global na proteína pretendida não satisfaz e não pode ser significativamente aumentado pela modificação do processo Ce»g, escolha de vectores particulares e estirpes hospedeiras, condições de cultura). Ainda, a purificação de proteína não é uma questão trivial, Frequentemente, a mistura de isolamento primário contem apenas uma quantidade infima da proteína pretendida enquanto que as proteínas específicas do hospedeiro são as dominantes, ft separação destas proteínas específicas do hospedeiro ao mesmo tempo que se mantém a actividade biolóqica e a integridade estrutural da proteína pretendida pode causar graves problemas» dades referidas
Uma. abordagem conhecida para ultrapassar estas dificulé expressar a proteína pretendida, como uma proteína de fusão., i»e. ao extremo C ou. especialmente ao extremo N da proteína pretendida liga-se urn polipeptídeo estabilizador e/ou protector. Este polipeptídeo ê escolhido de acordo com os problemas a serem resolvidos tdegradação$ purzficaçso? etc,) e do hospedeiro usado para a expressão da proteína de fusão, Tais proteínas de fusão mostraram-se eficazes na prevenção da degradação de proteínas pretendidas e na facilitação do processo de purificação,. Foram descritos numerosos polipeptídeos que foram usados como parceiros de fusão nas proteínas de fusãos ver por exemplo H»M» Sassefeld5 Trends in Bíotschnology 8,, 88-9.3 CÍ990>,
São exemplos de polipeptídeos a β-galactosidase, proteína A e cloranfsnicol-acetíItransferase» Tal como na maioria dos casos e por razões óbvias (antigénioidade etc,) a proteína de fusão não tem utilidade prática como tal e ê necessário remover o parceiro de fusão da proteína pretendida após expressão e purificação (como alternativa, a proteína de fusão pode ser uma outra proteína heteróloga e a separação conduz a duas proteínas pretendidas)» Isto è geralmente conseguido por meio de uma sequência de ligação que liga a proteína pretendida ao parceiro de fusão e contem um sítio ds clivagem que pode ser clivada selectivamente por meios químicos ou. enzimáticos, Tais sítios de clivagem incluem, por exemplo, um radical mstionilo que é susceptível de ser atacado com brometo de cianogénio, ou uma cadeia polipeptídica que inclui o radical tetrapeptidilo Asp—Asp-Asp—Lis que é clivado por enteroquina.se a seguir a L.is, é óbvio que tais subsequências de aminoácidos não devem ocorrer na superfície das proteínas pretendidas, Como a remoção conveniente do parceiro da fusão ainda é o problema mais significativo a ser resolvido existe uma necessidade de meios alternativos que permitam a libertação específica e suave da proteína pretendida do parceiro de fusão. Constitui um objectivo do invento proporcionar tais meios»
.A protease yscF (ou endoprotease codificada por KEX2) e a peptidass ysc# (ou carboxípeptidase codificada por KEXi> foram identificados como sendo responsáveis pela maturação do factor de conjugação íç na levedura para dar a feromona factor « maduro. A protease yscF é uma endoprotease ligada a membranas que é activa na gama de pH neutro e está complelamente dependente dos iSes CaJ . Ela possuí perto do extremo C uma região hidrofóbica que foi identificada como sendo responsável pela ligação á membrana. A remoção deste domínio ds ligação à membrana dá um derivado de yscF solúvel que ainda retem a sua actividade enzimátics e especificidade, vis,·, clivagem no lado C-terminal de um par de aminoácidos básicos, tais como Lis-,Arg ou Arg-Arg Ec.f» R.S. Fui ler et al., Proc. Natl» Acad» Sei» USA 86, 1434-1438 (1989)3Por outro lado, a protease yscet é uma. carboxi-exopeptidase que é altamente activa nos aminoácidos básicos do extremo C (Arg, Lis) a um pH entre 6 e 7,5. Tal como yscF, yseu contem um segmento hidrofóbico de ligação a membrana na vizinhança do extremo C» A remoção deste domínio de ligação a. ffleínfarsns conduz a um derivado solúvel de ysca que retem actividade enzimática e especificidade
EA. Cooper e H. Bussey, Encontrou-se agora gue as
Mo1.Ce11. Biol.
(1989)3. poosm Vantajosa* _í..
mente ser usadas em combinação para, a preparação de proteínas maduras por processamento in vitro de proteínas de fusão cortadas adequadamente»
Assim, o presente invento diz respeito a um método para a produção de uma proteína, biologicamente activa compreendendo o tratamento de uma proteína ds fusão consistindo em
í. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada, um consistindo na referida proteína biologicamente activa cujo aminoácido do extremo C está ligado a um,a sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais e no l·
A* caso ds múltiplos segmentos sucessivos de proteína, também o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica ds liagação sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e ftrq, e
2» um polipeptidso ds ligação ligado ao aminoácido do extremo C dos referidos segmentos sucessivos de proteína, ou consistindo em
1. um polipeptídeo de de gação ligado ao aminoácido N-terminal
2. múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L o primeiro ε segundo resíduos de aminoácidos hl-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos da referida sequência polipeptídica ds liqação L sendo aminoácidos básicos ds referida sequência polipeptídica de ligação L sendo proteína proteína biologicamente activa, iqados a referida com endoprotsass solúvel de levedura yscF e com carboxípeptidase solúvel de levedura yscs e isolamento da referida proteína biologicamente activa»
A proteína de fusão pode ser representada pela fórmula
CF-L) -T m
T—CL—P) n
Cl) ou CU), em que P é a proteína biologicamente activa, L é uma sequência polipeptídica de liqação conforme definido atrás, T é um polipeptídeo de identificação,
m é um inteiro entre 1 e 10 e n é um inteiro entre 2 e lík
A proteína biologicamente activa pod π'ρ ser qualquer proteína de interesse biológico e de origem procariótica ou especialmente eucariótica, em particular de eucariotas superiores tais como mamíferos {incluindo animais e humanos), e é por exemplo uma. enzima que pode ser usada, por exemplo, para a produção de nutrientes e para a realização de reacções enzimãtica sem química ou biologia molecularou uma proteína que é útil e importante para o tratamento de doenças humanas e de animais ou para a sua prevenção, por exemplo um polipeptídeo hormona, com propriedades imunomoduladoras, anti-virais e anti-tumorais, um anticorpo, antigénio virai, factor de coagulação do sangue, um agente fibrinolítico, um factor regulador do crescimento, um .alimento e similares.
São exemplos ds tais proteínas e.g» hormonas tais como secretina, timosina, relaxina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona da partiróide, adrenocorticotropina, hormona estimuladora de melanócitos, β—1ipotropina, urogastrons, insulina, factores de crescimento, tais como factor de crescimento epidérmico CE6F), factor de crescimento tipo insulina (IGF), e.g. IGF-I e ISF-TI, factor de crescimento de mastócitos, factor de crescimento das células nervosas, factor de crescimento das células nervosas derivadas da glia, factor de crescimento derivado de plaquetas CPDSF) ou factor de crescimento transformante CTSF), como seja IGFfs, hormonas de crescimento, tais como hormonas de crescimento humanas ou bovinas, interleuquina, tais como interleuquina-í ou -2, factor inibidor da migração de macrófaqos humano CMIF), interferões, como seja interferão a humano, por exempla interferao-aA, aB, «D ou ah, interferão B, interferão gama ou um inter— ferão híbrido, por exemplo ura interferão híbrido «A-«D ou aB-aD,
espscialmente o interferão híbrido BDBB, inibi d ores ds proteína:omo -antitripsina, BLPI símilares.s antiqènio:
dí
S feito i-fetX vírus da hepatite5 tai nuoleóide do vírus da hepatite B ou antigénio do vírus da hepatite A ou antigénio da hepatite não A não B, activadores do plasminogénio, tsis como activador do plasminogénio tipo tecido, tais como K._,tuPA, psptídeo antieoagulanie de de carraças CTAP), factor it de necrose tumoral, somatostatina, rsnína, imunoglobulinas, tais como as cadeias leve e/ou pesadas da imunoglobulina D,· E ou G, ou imunoglobulinas híbridas humano-murganho, factores de ligação a imunoglobulinas, tais como factor dia ligação à imunoglobulina a calcitonina humana, factores peptídso relacionado
5ffi como sntigénio de superfície ou do t:.
coagulação do sangue, tais como factor J.X ou VIIlc, factor 4 de plaquetas, eritropoiatina, eqlina dessulfato-hirudina, como seja dessulfato-hirudina variante HVí, HV2 ou PA, corticostatina.
equistatina, cistatinas, superóxido dismutase humana, quinase virai, ii-lactama.se ou glucose-isomerase, São os qenes codificadores um interferão a humano e t1 m ϊ d i n a p referidos interferão tipo urocina.se de cadeia do plasminogénio híbrido dB ou interferão híbrido, particularmente interferão híbrido BDBB íver EP 205,404), activador do plasminogénio tipo tecido humano (t-PA), activador do plasminogénio simples humano (scu-PA), activador
K._>tuPA (ver EP 277,313) , factor ds crescimento tr-ansformante fí,
X.
calcitonina humana, factor de crescimento I e II tipo insulina e dessulfato-hirudina, e«g. variante HVí, As proteínas contendo um par de aminoácidos básicos, tais como Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e Arg-Lis, expostos na superfície da proteína e portanto susceptíveis è. clivagem proteolítica, não são adequados para o processo de acordo com o invento a terão de ser mutagenízadas de forma a que um dos aminoácidos. básicos constitutivos seja substituído por um outro aminoãcido não básico sem afectar a actividade biológica, Proteínas tendo um aminoãcido C—terminal básico que seja essencial para a actividade biológica não podem ser produzidos por um processa de acordo com o invento Cpois este básico ê removido pela yscd solúvel) a menos que um protector não básico seja adicionado ao extremo C de aminoácido aminoácido t a 4. s ρ r o t e χ
A sequência do polipeptídeo ligante L compreende entre 2 e cerca de 20 aminoácidos, especial mente entre 2 s 12 resíduos; de aminoácidos e contem um ou mais, especialmente 1 a 5, pares de aminoácidos; básicos, tais como Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis ou Arg-Lis, desde que nos compostos da fórmula I Cm>í> e II os primeiro e segundo resíduos; de aminoácidos N~terminais assim como o penúltimo e último aminoácidos do extremo C representem um par de amino,ácidos básicas enquanto que nos compostos da fórmula I Cm=l> basta que os primeiro e segundo aminoácidos M-terminais representem tal par de aminoácidos básicos. A escolha dos resíduos de aminoácidos qua ligam os pares de aminoácidos básicos e/ou união dos pares de resíduos de aminoácidos básicos ac; polipeptídeo etiqueta (cf. compostos da fórmula I com m—1) não é crucial, Por exemblo« qualquer um dos aminoácidos neutros codifidos geneticamente pode ser escolhido esta finalidade. A sequência de ligação mais simples L a um radical dipeptídilo seleccionado de entre Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e Arg-Lis,
Uma vec que a extensão de uma proteína de tamanha médio biologicamente activa demonstrou, influenciar de forma favorável a estabilidade, o polipeptídeo terminal T pode, em principio, ser qualquer polipeptídeo sintético imaginável ou qualquer polipeptítíeo natural ou parte dele. De preferência o polipeptídeo terminal T consiste em cerca de i© a csrca de 1000, em particular 30 a 30®, resíduos de aminoácidos e representa um polipeptídeo de tamanho completo que è bem expresso no hospedeiro usado para a expressão da proteína da fusão íver abaixo) ou uma parte dele, Se o principal objectivo for facilitar a purificação é preferível usar um polipeptideo etiqueta que seja susceptível a cromatografia de afinidade Co polipeptideo etiqueta é, per exemplo, reconhecido por um anticorpo monoclonal ou policlonal ou é ligado por um material específico como seja a celulose) ou cromatografia de permuta iónica
Co polipeptideo etiqueta compreende um grande A- í tais polipeptideos etiqueta incluem por exemplo, fosfatase ácida de levedura PH05, invertase de levedura ou carboxipeptida.se Y de levedura especialmente quando a levedura é usada como hospedeiro, polimerase do fago MS2, β—galactosidase ou fosfatase ácida de 1Ξ« coli especialmente quando E« coli é usada como hospedeiro, neomicina, fosfotransferase, desidrofolatQ--redu.ta.se, uma imunoglobulina ou uma lectina especialmente são usadas células hospedeiras de mamífero, também dessulfato—hirudina, eglina C, quimo— sina, interleuquina í, a proteína Exg de Cellulomonas fimi e similares, sendo também possível usar fragmentos destes polipep— txdeos»
De preferência m é um inteiro entre í e 5 e n é um inteiro entre
A endoprotease solúvel de levedura yscF e a carboxipeptidase de levedura yscn são muteínas de yscF e ds ysc« em que os sítios hidrofóbices de an.coraqem à membrana foram eliminados, A í»equ’sncxa de amxnoácidosda protese-s :F de Si4 resíduos conhecida de K„ liízuno st al. EBiochem,. Biophvs, Res,
Jommun=,
Ibò, 246-254 (1988)3,. 0 sítio de ancoragem à membrana esta situado na região Tiroz z a Met6<y9„ Nas endoproteases yscF solúveis de acordo com o invento o sítio de ancoraqem â membrana foi selectxvaraente removido e portanto o extremo C começando por exemplo no ssiincâcido 700 (Lis) ainda está presente ou todo o extremo C incluindo o sitio de ancoragem à membrana, i.e. 136 a aproximadamente 20® aminoácidos a nartir do extremo C foram removidos„ Tais muteínas de delação solúveis derivadas ds yscF estão descritas por exemplo em EP 327,-377 ou em E„S„ Fuiler et al,, (supra). A sequência de aminoácidos da peptidase de 729 resíduos ysc# é igualmente conhecida EA, Dmochowska et al,, Cell 50, 573-584 (1987)3, 0 sítio de ancoragem à membrana está situado na região Ala- * a Tir^'” , Como atrás, na carboxipeptidase ysca solúvel de acordo com o invento o sitio de ancoragem à membrana foi selectivamente removido deixando portanto o começo do extrema C por exemplo no aminoácido 638 (Asp) iniaeto ou todo o extremo C incluindo o sítio de ancoragem à membrana, i.e, 93 a aproximadamente 110 aminoácidos a partir do extremo C, foi removido,. Uma dessas muteínas solúveis da carboxipeptidase ysca foi descrita por A. Coopere H, Bussey (supra),, A carboxipeptidase yscF solúvel preferida de acordo com o invento tem a sequência descrita na listagem de sequências em SEQ 1D N21 enquanto a carboxipeptidase ysca solúvel preferida tem -a sequência descrita na listagem de sequências em SEQ ID SMS2.
A dogestão das proteínas de fusão com yscF solúvel e ysco solúvel foi realizada usando condições que se sabe serem óptimas para yscF e ysca, i.e. numa solução tamponada a um pH entre cerca de 6,0 e cerca da 7,5, de preferência a cerca de 7,0 numa gama de temperaturas entre cerca de 25‘:‘C e cerca de 37;:;C e durante cerca de 1 a 4 horas, de preferência até a digestão estar completa conforme avaliado pelo controle por HPLC. Como yscF é fortemente dependente da iSes Ca^4, um sal de cálcio, como seja cloreto de cálcio, é adicionado á mistura de digestão. As proporções molares da proteína de fusão: vscF solúvelsysca solúvel na qama de 1:1:1 ,-,4 ,
2+ na gama de ©,ímM a 1© mrf= Facultativamente, pode ser adicionado Lima concentração baixa (<1X> de Lim detergente ruão iónico, como seja Triton X—IGO, pois sabe-se que yscF pode assim ser activado. A proteína da fusão pode ser tratada com uma mistura de digestão •i ~·
contendo yscF e ysca solúveis ou a proteína de fusão pode ser primeiro tratada com tempo suficiente ou p re f e r's'n cia ι n passo de digestão.
:-í_í Sw a iúve s quando digestão decorreu o está completa, então com ysca solúvel, de i.s= sem isolamento do produto do primeiro
A proteína biologicamente activa pode ser isolada a partir da mistura de digestão usando meios convencionais. Passos incluem, por exemplo,, remoção do sal, tais como cromatografia de permuta filtração em gel, cromatografia de de purificação adequadas processos c ramafcog réf icos iónica, cromatografia de partição, HPLC, HPLC em electroforese em qel, electroforese sem veículo, cromatografia de afinidade como seja cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais acoplados a uma matrix insolúvel s similares, ou qualquer combinação destes.
No caso da proteína pretendida não -assumir a estrutura tridimensional correcta devido por exemplo, a uma formação incorrecta de pontes dissulfureto Cse estiverem presentes resíduos císteina), pode ser necessário solubilizá-la em condições que sejam adequadas à sua manutenção numa forma desnaturada e subsequentemente realizar o enrolamento com concomitante formação de ligações dissulfureto Cse estiverem presentes resíduos císteina). São conhecidos métodos adequados para um grande número de proteínas. De outra forma é necessário adaptar métodos conhecidos aos problemas-; específicos encontrados.
Conforme referido atrás algumas muteínas solúveis de delação de yscr e ysca são conhecidas da literatura. Outras muteínas de deleção de accrdo com o Invento podem ser preparadas usando métodos conhecidos, ρο-r exemplo através da preparação ds um DIMA correspondente codificador da referida muteína, sua inserção num DNA vector adequado sob o controle ds uma sequência
da contraia da expressão, transformação de microorganismos hospedeiros adequados com o vector de expressão formado, cultura da microorganisma hospedeiro transformado num meio de cultura adequado e isolamento da muteína produzida» 0 DNA codificador ds qualquer uma das referidas muteínas pode ser produzido por exemplo, usando um plasmídeo contendo o DNA codificador de yscF (KEX2) ou ysca (KEX1) e i» digerindo-o com uma enzima de restrição que cliva dentro do DNA da região codificadora do sítio de ancoragem á membrana ou 3’ relativamente a ela (por exemplo EcoRI, BstXl ou NarI no caso ds KEX2 e HgiAI, Taqll ou Ciai no caso de KEXi), digestão do DNA clivado com uma endonuclease de restrição adequada, por exemplo Bal3í, de tal forma que a referida região do DNA é removida e dá-se a recircularização do plasmídeo linearizada por ligação dos extremos cerses ou similares, ou 2» escolhendo ou criando (por exemplo por mutsgénese dirigida) um sítio de restrição 5’ e um sítio de restrição 3’ relativamente ao
DNA da região codificadora d-o sítio de ancoragem à membrana (por exemplo PvuII e NarI ou EcoRI no caso de ΚΞΧ2, Xhcl, Stul ou Xcal no caso de KEX1; o sítio de restrição 35 pode também estar situada dentro do plasmídeo adjacente ao sinal de paragem da tradução do gene KEX2 ou KEX1), digerindo o plasmídeo com duas enzimas de restrição que reconhecem os referidos sítios de restrição e recircularizaçãodo plasmídeo linearizado por ligação de extremos cerses ou similares, ou 3. deleção do DNA da região codificadora do sitio de ancoragme à membrana usando mutagênese por remoção de ansas ou 4» eliminando totalmente o extremo C por digestão com PvuII no caso de KEX2 e com Xhol, Stul ou Scil no caso de KEXl, respectivamente e recircularização do plasmídeo linearizado por ligação de extremos cerses ou similares» Como as sequências de DNA KEX2 ε KEX1 são conhecidas íf<» Mizumo et al»,, A» umochow-ska et al., supra) pode—se projectar facilmente um oiigonucleótido mutagênico adequado e usado para eliminar a referida região do DNA aplicando o sistema de clonagem em M13.
Deve-se tomar cuidado para que os genes KEX2 é KEXí muta.genizados incluam um sinal de paragem da tradução ÍTAA., TAG ou TGAl- Se necessário, tal sinal de paragem pode ser introduzido no lugar pretendido através de um DNA adaptador sintético ou pode ser proporcionado por DNA vector adjacente- Assim, os genes KEX e KEX1 podem incluir nos seus extremos 35 codSes derivados do DNA vector que codificam alguns Ccomo seja 2 a 2©> aminoácidos adicionais no extrema C das muteínas solúveis de yscF e yscce. Todos estes métodos utilizam técnicas convencionais.
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Preparação da proteína de fusão
As proteínas de fusão de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo a cultura de um hospedeiro transformado em condições que permitam a sua expressão e isolamento da proteína de fusão- Mais especificamente, os compostos pretendidos são produzidos por
a) obtenção de um vector de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência ds DNA codificadora da referida proteína de fusão.
b) transferência do vector recipiente, ds expressão para um hospedeiro
c) cultura do hospedeiro transformad a expressão da proteína de fusão e em condiçSes que permitam
d) isolamento da proteína de fusãoproteínas de cutidos mais
Os passos envolvidos na prep.
fusão pela técnica de DNA recombinante
ação das serão dis detalhadaments abaixo.
Vectores de expressão invento está relacionado com vectores de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína de fusão consistindo em 1. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminaí está ligado a uma sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N~terminais e no caso de múltiplos segmentos de proteína sucessivos, também o penúltimo s o último resíduos de aminoácidos da referida sequência do polipeptídeo de ligação sendo aminoácidos básicas seleccionados entre Lis e Arg e 2„ um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal doCs) referido(s) segmentais) sucessivoís) de proteína ou consistindo em i« um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de 2» múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminsis assim como os penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica de ligação Lsendo aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e Arg e os últimos aminoácidos básicas da referida sequência polipeptídica de ligação L estando ligados à referida proteína biologicamente activa e um método para a sua preparação.
:assets de expre pode ier epresen tada pela fórmula
em que Pr é a sequência de controle ds expressão, S é uma ligação ou. representa uma sequência ds DNA codificadora ds um peptídeo sinal, Dp representa uma sequência de DNA codificadora de uma proteína biologicamente activa, ê uma sequência de DNA codificadora do polipeptídeo de ligação L em que o primeiro e segundo codSes adiacentes ao extremo 5’ de Ds_. e, se m for diferente de 1, também o penúltimo e último codSes -adjacentes ao extremo 5’ de Decodificam aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e Arg, Dy representa uma sequência ds- DNA codificadora de um polipeptídeo etiqueta e T representa uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição, em que S, Dp, D{ e mesma grelha de leitura em é um inteiro de í a ~í ormu 1 a estão uu pela
P r-S- C D_-D, “D-,) -T T L F n
CIv) em qu.e P.
r·'
Dy, Ep s T têm o significado atribuído atrás e em que b, i,y, inteiro de 2 a ÍS
D.
D, e Dp estão na mesma grelha de leitura e n é um kj bao preTerias sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal as construções em que b representa uma
A selecção do vector depende das células hospedeiras que são usadas na transformação. Em principio, são adequados todos os vectores que se repliquem e expressem o gene de acordo com o inventa no hospedeiro escolhido. SSo exemplos ds hospedeiros adequados procariotas e eucariotas, os quais não possuem ou têm poucas enzimas de restrição ou enzimas de modificação e que não têm actividade yscF ou relacionada, com yscF, como sejam bactérias, por exemplo Escherichia coli ou Bacillus subtil is.
X
leveduras, par exempla Saccharomyces cerevisiae, especialmente mutantes kex.2 e ainda células de mamífero em particular linhas estabelecidas de células humanas ou animais, e.g, células de mieloma, fibroblastos de pulmão embrionário humano L-Í32, células L.TK de murganho, células humanas do melanoma maligno de Bowes, células HeLa, células de rim do macaco verde africano COS-7 transformadas com o vírus SV40 ou células de ovário de hamster chinês ÍCHD) e suas variantes, As células de ovário de hamster chinês e estirpes de E, coli e de Sacc haromyces cerevisiae são as preferidas como microorganísmo hospedeiro.
Vectores usados em levedura e em E. coli.
São exemplos de vectores adequados para a expressão do gene da proteína de fusão numa estirpe de E. coli bacteriofagos, par exempla derivados do bacteriofaga lambda ou plasmídeos tais como o plasmídeo coíEí e seus derivadas, por exemplo pMB9, pSF2124, pBR317 ou pBR322» Vectores adequadas contêm um replicão completo e um gene de uma marca., a qual torna possível a selecção e identificação dos micoarganismos transformados pelos plasmídeos CíG θ .--i pC&cõcõêlO pOv~ iT:!32.Q O cê LííBê?. Co.CêíC terística fenotípica, Genes de marcas adequadas conferem ao microorganísmo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos tais como ampicilina, tetraciclina e similares.
Podem ser usadas várias sequências de controle da expressão P . .
r para a reguiaçâo da cassete oe expressão em fcx—ep~íi.
São usados especialmente promotores de genes fortemente expressos, São promotores adequados os promotores lac, tac, trp e Ipp, ainda os promotores N e pL do fago lambda e outros. No presente
PL, trp s lac,
Vectores adequados para replicação e expressão em
W p uma que cerevisiae contêm uma origem de replicação de levedura, e marca genética selectiva para Isvedura. Os vectores híbridos contêm uma origem de replicação de levedura, por exemplo o segmento de replicação autónoma cromossómico ÍARS) sSo retidos fora, do cromossoma dentro da célula de levedura após transformação e são replicadas autonomamente durante a mitose» Também podem ser usados os vectores híbridos que contêm sequências homólogas do DNA do plasmídeo 2 μ de levedura ou que contêm ARS s uma sequência, de um centrómero, por exemplo CEN4« São genes de marcas adequadas para levedura especíalmente os que conferem resistência a. antibióticos ao hospedeiro ou no caso de mutantes auxotróficos de leveduras, genes que complementem as lesSes do hospedeiro» Genes correspondentes conferem por exemplo resistência ao antibiótico ciclo-heximida. ou proporcionam prototrofia. num mutante auxotrófico de levedura, por exemplo o gene URA3, LEU2, HIS5 ou TRP1„
De preferência, os vectores híbridos de levedura contêm uma origem de replicação e um gene de uma marca para um hospedeiro bacteriano, especialmente E» coli, de forma que a construção e a. clonagem dos vectores híbridos © seus precursores pode ser rea. 1 içado ©m E„ coli, As sequências Pr de controle da expressão adequadas à expressão em levedura. s-So, por exmplo, as do gene CYC1, GAL1/10 ou PHQ5 e também promotores envolvidos na qlicóli— se, por exemplo o promotor GAP -C incluindo GAP truncado em 5*), ainda o promotor do factor <a e os promotores híbridos, tais como promotores híbridos ΡΗ05-ΘΑΡ»
Α sequência de DNA codificadora de ura peptídeo sinal S (sequência sinal) deriva de um gene do hospedeiro microbiano codificador de um polipeptídeo que geralmente é secretado» Quando se usa E, coli como organismo hospedeiro pode ser escolhida a sequência sinal de ompA, Ipp, proteína de ligação à maltose, receptor de lambda,, fosfatase ácida ou fl-í actamase»SSo sequênciassinal S adequadas para usar com leveduras, por exemplo, as sequências sinal e prepro dos genes da invertase de levedura, fe-romona peptidase (KE.X1), toxina, assassina e fosfatase ácida reprímivel (PH05), a sequência líder do factor a e a sequência sinal da glucoamila.se derivadas de Asperqi 11 uzs awam-or i» Como alternativa, podem ser construídas sequências sinal fundidas através da ligação de parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligado ao promotor usado (por exem o 1 oF‘HD5), com parte da sequência sinal da proteina biologicamente activa. (se presente)» São favorecidas as combinações que permitam uma clivagem precisa entre o peptídeo sinal e a sequência de aminoácidos da proteína de fusão»
A sequência de DNA contendo sinais de terminação da. transcrição T é preferencialmente a sequência delimitante 3?de um gene derivado do hospdeíro microbiano seleccionado que contem sinais adequados para a terinação da transcrição» São sequências delimitantes 3? adequadas as do gene naturalmente ligado ao promotor usado»
Vectores para usar em células de mamífero
Os vectores para replicação s expressão em células de mamífero são frequentemente proporcionados com DNA de origem virai, e«g = derivado de vírus símio 4© (SV4©)« vírus do sarcoma de Rous í RSV) mutante BK do
, adenovirus 2, vírus do papiloma papovavírus CBKV) ou ou citomegalov bovino CBPV), írus de murganho ou humano C11CMV e HMCV, respecti .mente),
Sequências- Pr de controle ds expressão que são adequadas para usar εηι células de mamífero incluem, inter alia, os promotores precoce s tardio do SV40, o principal promotor tardio do adenovírus, o promotor do gene da metalotioneina siurina e a região do potenciador-promotor do principal gene precoce imediata do citoroegalovírus humano, a região do potenciador—promotor da imunoglobulina humana, o promotor da a-globina humana facultativaments combinado com o potenciador do SV40 e promotores derivados de genes do choque térmico, As sequências sinal S para usar em células de mamífero são, por exemplo, as sequências sinal derivadas da hemaglutinina da sulina.
Tuenza, t-PA humano e prepro-in-
Senes de marcas adequadas para células de mamífero são por exemplo os genes neo e ble do trasnposão TnSque conferem resistência ao antibiótico 8418 e a antibióticos do tipo bleomicina, respectivamente, o gene de E, coli que altera o fenótipo de células DHFR para células DHFR' e/ou confere resistência ao metotrexato e o gene da timidina quinase do vírus herpes simplex que torna as células TK em células fetotipicamente TK+„
De preferência os vectores híbridos para as células de mamífero contêm contendo sinais ρα11aden iIação a região -5? não traduzida de um gene de mamífero para uma. terminação correcta da transcriçãoe ÍT), como seja a região flanqueanie 3’ do gene da {1-globina, Com vantagem, codificadora do polipeptídeo tendo sinais de splicing adições são necessárias pois as regiões flanquesntes da região incluem um ou mais intrões nativas adequados nos seus extremos. Tais os cDNAs e DNAs procarióticos tais
corno os gs?nes de selecção referidos atrás geral mente não possuem tais sinais de transcrição e processamento»
De referência, tais vectores contêm uma origem ds replicação e um gene ds resistência a antibióticos para a propagação em E. coli» Uma origem de replicação de mamífero pode ser proporcionada pela inclusão na construção do vector uma origem eucariótica, como seja a derivada de SV40 ou de uma outra fonte virai ou pode ser proporcionada pelo cromossoma da célula hospedeira quando da integração do vector no cromossoma da célula hospedeira.
As sequências de DNA Dp e Dy codificadoras da proteína biologicamente activa e o polipeptídeo etiqueta são conhecidas, ou casa não α sejam podem ser deduzidas de sequências de aminoácidos conhecidas e produzidas por via. sintética, aplicando métodos conhecidos per se» A sequência de DNA D( codificadora do polipep— tídeo de ligação L é de preferência uma sequência de DNA sintética contendo um ou mais pares, aminoácidos básicos conforme descrito atrás e são preparados sintéticamente usando métodos de síntese convencionais»
Na cassete de expressão de acordo com o invento as às sequências codificadoras e Dy são ligadas outras numa grelha de leitura ininterrupta começando com um ATS no extremo 5? e terminando com um sinal de paragem da tradução (TAA, TAS ou TSA) no extremo 3’. As sequências codificadoras S-íDp-DL-Dy>ffl e S-(DT-DL-Dp)n estão operacionalmente ligadas à sequência de controle da expressão Pr.
Os vectores de expressão de acordo com o invento são sreparados por métodos conhecidos aplicam :do térn nnvsanr · expressão (preparada previamente) como tal ou os componentes da cassete ds expressão sucessivamente na ordem predeterminada ao
DNA vector» Os componentes dos vectores de expressão são ligados através de sítios de restrição comuns e/ou por meio de moléculas sintéticas de ligação e/ou por ligação de extremos cerses»
Hospedeiros transformados
Um outro aspecto do presente invento envolve células hospedeiras transformadas com um vector de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína ds fusão consistindo em í = um ou mais segmentos ds proteína sucessivos cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminal está ligado a uma sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segunda resíduos de aminoácidos M-terminais e no caso de múltiplos segmentos de proteína sucessivos, também os penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência de ligação L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e 2» um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos de proteína sucessivos- ou consistindo em 1» um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de múltiplos segmentos de proteína sucessivos de 2» cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L cujos primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C—terminais da referida sequência polipeptídica de ligação L são aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e o último aminoácido básico da referida sequência de ligação L f efef iua pr>_jte5.na biologicamente activa e um preparação» estando ligado à método para a sua
São exemplos de hospedeiros adequados incluindo hospedeiros procarióticos ’ e eucarióticos os especificados atrãs. 0 método para a preparação de células hospedeiras transformadas compreende a transformação de células hospedeiras com o vector de expressão atrás referido,
A transformação das células hospedeiras procarióticas é conseguida por métodos conhecidos» Por exemplo, a transformação de levedura com os vectores híbridos pode ser conseguida de acordo com o método descrito por Hinnen et
CProc» Natl
Acad, Sei, USA 75, Í9Í9 (1978)3. Este método pode ser dividido em três passos s íi> Remoção da parede celular de levedura, ou partes dela» (2) Tratamento das células de levedura “nuas” (esferoplastos) com o vector de expressão na presença de PESípolíetilenoglicol) e 04iSes Ca » (3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada sólida de aqar»
A introdução de vectores de expressão em células de mamífero é feita por transfecção na presença de compostos auxiliares, e.g, dietilaminodextrano, dimetilsulfóxido, glicerol, políetilenoglicol ou. similares ou como coprecipitados do DNA vector e fosfato de cálcio» Outros métodos adequados incluem microinjecção directa do DNA vector no núcleo celular e electropo ração, i.e. a introdução de DNA através de um pequeno pulso eléctrico que fas aumentar a permeabilidade das membranas celulares» A selecção subsequente das células transfectadas pode ser feita usando uma marca selectiva que está covalentemente integrada no vector de expressão ou é adicionada como uma entidade separada» As siiarcss selectivas incluem genes que conferem
resistência a antibióticos ou. genes que complementem uma lesão genética da célula hospedeira (supra)os v© ί=?Χ©5Πρ
A transformação ds estirpes hospedeiras bacterianas com ctores de expressão de acordo com o invento é realizada, por lo, como descrito na literatura para B- subtil is CAnagnosto-
poulos et al», J. Bacteriol- 81, 741 (1961)3 e E- coli EM» Mandei et al», 3- Mol» Biol- 53, 159 <1970)3» O isolamento das células hospedeiras transformadas é efectuado com vantagem a partir de um meio nutritivo selectivo ao qual foi adicionado, por exemplo, o biocida contra o qual a marca genética contida no plasmídeo de expressão confere resistência» Se por exemplo, os· vectoresR híbridos contêm o gene amp , adiciona-se pois ampicilina ao meio nutritivo» As células que não contêm o vector híbrido são destruídas em tal meio.
Cultura de células hospedeiras transf ormad-as invento diz ainda respeito a um método para a produção de uma proteína de fusão consistindo em 1 - um ou mais segmentos de proteína sucessivos- cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminal está ligado a
uma sequência ρο 1 i. pep t í d ic a de ligação L o primeiru e
resíduos de aminoácidos N- terminais e no caso de
segmentos de proteína suces sivos, também os penúltimo ;
resíduos de aminoácidos C- terminais da ref erida sequ'
último :ia de ligação L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e 2- um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos de proteína sucessivos ou consistindo em 1« um polipeptídeo etiqueta, ligado ao aminoácido FM-terminal de múltiplos segmentos de proteína sucessivos de 2« cada um deles ϊ
consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L cujos primeiro e segundo resíduos de aminoãcidos N-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica de ligação L são aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e o último aminoácido básico da referida sequência de ligação L estando ligado á referida proteína biologicamente activa, caracterizado por serem cultivadas em condições nutritivas adequadas células hospedeiras contendo um vector de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificadora da referida proteína de fusão e isolamento da referida proteína da fusão.
As células hospedeiras transformadas foram cultivadas por métodos conhecidos num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos. Podem ser usadas várias fontes de carbono para a cultura das células de E. coli e de levedura transformadasde acordo com o invento. São exemplos de fontes de carbono preferidas os açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose, ou um acetato, o qual pode ser usado por si só ou em misturas adequadas. São exemplos de fontes adequadas de azoto os aminoãcidos, tais como casaminoácidos, peptídeos e proteínas e seus produtos de degradação, tais como triptona, peptona ou extractos de carne, extractos de levedura, extracto de malte e também sais de amónio, por exemplo cloreto, sulfato ou nitrato de amónio, os quais podem ser usados por si sós ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicas que também podem ser usados são por exemplo sulfatos, cloretos, fosfates e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. 0 meio contem ainda, por exemplo, substâncias promotoras do crescimento, tais como micronutrientes, por exemplo ferro, zinco, manganês e similares e preferencialmente substâncias que exercem uma pressão selectiva e evitam o crescimento das células que perderam o plasmídeo de expressão. Assim, por exemplo, se uma
estirpe de levedura que é auxotrófica, per exemple num aminoácido essencial, fôr usada como microorganismo hospedeiro, o plasmídeo preferencialmente contem um gene codificador de uma encima que complementa o defeito do hospedeiro, A cultura da estirpe de levedura é realizada num meio mínimo deficiente no referida aminoácido.
A cultura é realizada por processos que são conhecidos. As condições de cultura, tais como temperatura, valor do pH do meio e tempo de fermentação, são escolhidos de modo a obter-se um título máximo das proteínas do inventa. Assim, a estirpe de levedura è preferencialmente cultivada em condições aeróbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura de aproximadamente 2© a 40°C, de preferência a cerca de 3©*C e a um valor de pH entre 5 e 8, de preferência a cerca de pH 7, durante aproximadamente 4 a 3© horas, de preferência até se obterem rendimentos máximos das proteínas do invento, As células de mamífero são cultivadas em condições de cultura de tecidos usando meios comerciais facultativamente suplementados com substâncias promotoras do crescimento e/ou soros de mamífero. As células foram cultivadas ligadas a um suporte sólido, e,g, um microveículo ou fibras de vidro poroso ou livres em vasos de cultura adequados, 0 meio de cultura é seleccionado de forma a que seja exercida pressão selectiva e apenas sobrevivam as células que contenham o DMA do vector híbrido incluindo a marca genética, Assim, por exemplo, adiciona—se um antibiótico ao meio quando o vector híbrido inclui o correspondemte gene de resistência a antibiótic os»
Quando a densidade celular atingiu um valor suficiente a cultura é interrompida e isolada a proteína, Se a cassete de expressão compreender uma sequência sinal a proteína de fusão pode ser secretada para o meio, 0 meio contenda o produto é
separado das células ás quais pode ser fornecido mais meio fresco para serem usadas na produção contínua» Quando se usa células de levedura ou células de E» coli a proteína pode acumular-se dentro das células, espeeialmente no espaço peripl&smático» Neste último caso o primeiro passo para a recuperação da proteína de fusão consiste na libertação da proteína a partir do interior da célula» A parede celularé primeiro removida por digestão enzimática com glucosidases (supra) ou como alternativa, a parede celular é removida por tratamento com agentes químicos, i.e» reagentes de tiol ou EDTA, os quais danificam a parede celular permitindo que a proteína produzida seja libertada» A mistura resultante é enriquecida na proteína de fusão por meios convencionais, como seja a remoção da maior parte do material não proteico por tratamento com polietileneimina, precipitação das proteínas usando sulfato de amónio, electroforese em gel, diálise, cromatografia, por exemplo, cromatografia d© permuta tónica (espeeialmente preferido quando o polipeptídeo etiqueta da proteína de fusão inclui um grande número de aminoácidos ácidos ou básicos), cromtaografia de exclusão por tamanho numa coluna de R
Sephadex ' ou similares» A purificação final do produto pré—purificado é conseguida por exemplo por meio de cromatografia de afinidade por exemplo por cromatografia de afinidade com anticorpos, espeeialmente cromatografia de afinidade com anticorpos usando anticorpos fixados a uma matrix insolúvel através de métodos conhecidos, anticorpos esses que reconhecem por exemplo epitopos situados dentro do polipeptídeo etiqueta da proteína de fusão» □ invento diz ainda respeito a proteínas de fusão de acordo com o invento per se que são importantes para a produção de proteínas biologicamente activas in termediários
□ invento diz respeito especialmente a vectores de expressão, aos hospedeiros transformados, às proteínas de fusão e aos métodos para a sua preparação de uma proteína biologicamente ac e ao método para a preparação iva como descrito nos exemplos..
Os -exemplos que se seguem servem para ilustrar o invento mas não devem ser pensados como limitantes do mesmo»
Exemplo í s Construção de um gene KEX encurtado codificador da variante solúvel de yscF gene KEX2 de levedura codifica uma endoprotease designada yscF, a qual é uma proteína ligada à membrana localizada no aparelho de Bolgi» A proteína yscF consiste num domínio catalítico N-terminal um íomínio rico em Ser/Tre, uma domínio que atravessa a membrana e uma cauda C—terminal responsável pela localização no Golgi da proteína yscF» A enzima mutante yscF sem 2®<3 aminoácidos C— terminais, incluindo o domínio rico em Ser/Tre, a cauda C-terminal ainda mantém actividade de protease CFuller Acad» Sei» 86, 1434-1438, Fuiler et
482—4853. Para se ter uma actividade construiu-se um gene mutante KEX2 sem 6O0 pb, codificador dos 200 aminoácidos C—terminais» D pene truncado está sob o controle do o domínio que atravessa a membranan e ef al», 1989, Proc» Natl» al», 1989, Science 249, de protease yscF solúvel, promotor KEX2 indo desde
-502» A tradução terminou num codão de paragem CTAA5 derivado do poli-adaptador de pUCIS,
Detalhadamente, o plasmídeo pUC19 CBoehringer Mannheim GmbH, FRB'1 foi digerido totalmente com HindiII e isoado o fragmenta de 2686 pb» £3s extremos foram preenchidos e o fragmento religado» Uma amostra da mistura de liqação foi adicionada a células das com E» coli competentes cálcio Elnv resistentes
para a transformaç trogen, San Diego, á ampicilina foram
So de E» coli JM101 trataUSAI» 12 transformantesds cultivados na presença de
100 pg/ml de- ampicilina. 0 DNA de plasmídeo foi preparada
analisado por digestão com HindiII assim como com Bam Hl» 0
plasmídeo sem o sítio Hindi11 foi designado pUCí 9woH„
pb de KEX2 (obtido a > foi dotado nos dois uma digestão completa
Um fragmento BalI-AhaIXI de 3207 partir ds DNA genómico total de levedura extremos com adaptadores BamHI seguido de com BamHI» 0 plasmídeo pUC19woH foi totalmsnte cortado com BamHI, o fragmento linear ds 26-90 pb foi isolado s ligado ao fragmento BamHI de KEX2 como descrito atrás» Uma amostra da mistura de células E»_coli JM1O1» 12 cultivadas ligação foi usada parai trtansformar colónias transformadas resistentes à ampicilina foram em meio LB contendo ampicilina í100 pg/ml?, o DNA de plasmídeo foi extraído e analisado por digestão com BamHI» Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e designado pKS3@lb„ □ vector 2gm de levedura pAB24 que corresponde essencial mente ao plasmídeo pDP34 foi cortado totalmente com BamHI e o fragmento linear de pAB24 foi isolado» 0 plasmídeo pKS301b foi digerida com BamHI e o fragmento contendo o gene KEX2 completo foi isolado e ligado ao vector de levedura linearizado pAB24» Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar colÍJM101 e o DNA de plasmídeo de doze clones positivos examinado por digestão com BamHI» Um clone com restrição esperados foi referido como pAB226«
E»_ foi de js fragmentai plasmídeo pKS301b foi Pvu.II e Seal» 0 fragmento Sphl sequências de KEX2 desde -502 digerido totalmente com Sphl, Pvull de 2,37 Kb contendo as até -1-1843 a uma parte do poli--adaptador foi isolado» 0 plasmídeo pUCIS CBoehringer Marinheira, FRB3 foi totalmente cortado cora Sphl e Sraal. 0 fragmento Sphl-Smal de 266© pb do pUCÍS foi ligado ao fragmento Sphl-PvuII ds 2,37 Kb do K.EX2 por ligação Sphl/Sphl e PvulI/Sma. A ligação PvuII/Sraal resulta na fusão da ORF nas sequências ds pUCIS que codificam mais 7 aminoácidos do extremo C C-S-V-P-S-S-N-S) e é seguida de um codão de paragem CTAA)= Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar E» coli JM101» 0 DNA de plasmídeo foi isolado a partir das colónias transformantes resistentes à ampicilina e analisado por digestão com Sphl e EcoRI assim como HindIII» Um clone com o padrão de restrição esperado ê referido como plSkexp» Na listagem de sequências SEO ID NS í está apresentada a ORF codificadora de yscF solúvel com DMA derivado de KEX2» plasmídeo plSkexp foi totalment® cortado com PvuJI, Sall e Seal» Isolou-se o fragmento SalI-PvuII de 2552 pb contendo as sequências KEX5 que vão desde -502 até *1843 assim como 2Oó pb das sequências de pUCÍS» 0 plasmídeo pDP34 foi digerido com BamHI e os extremos do plasmídeo linearizado foram preenchidos» Após inactivação da polimerase de T4 o plasmídeo linearizada e preenchido foi cortado com Sall e isolado o fragmento ds íí»7S Kb» Q fragmento BamHIf— Sall foi ligado ao fragmento Sall—Pvu.II de 2552 pb por ligação Sal.I//SalI e BamHIÍ/PvuII CBamHI&s BamHI preenchido)» Uma amostra da mistura de ligação foi usado para transformar células competentes de E» coli JMÍ01» 0 DMA ds plasmídeo foi extraído a partir das células resistentes à ampicilina e analisado por análise de restrição com Sall, Ncol, Smal, Xbal, EcoRI» Um clone com cs fragmento de restrição esperados foi designado pDPkexp»
Exemplo 2s Ensaio da actividade de sndoprotee.se
As células foram cultivadas como descrito no Exemplo 3. Q caldo de cultura foi centrifugado e separado em células e meio de cultura» A actividade de endoprotea.se foi determinada no meio de cultura, na superfície de células intactas e em células ”permeabili2®das“. As células foram lavadas uma vez com um volume de ©,2M HEPES (ácido 4~í2-Hidroxietil)-piperasina-í-etanossulfónico) pH 7,0 e resuspsnso em um volume de €*,2M HEPES pH 7,0 para medição em células intactas cu ressuspensas em 0S2M HEPES contendo 0,1% Triton X-100 para produzir células permeabilizadas. A actividade de endopratease foi medida como se segues pl de mistura de ensaio í=,2M HEPES pH 7,0, 1 mMCaCl^, 0,5 mM
PMSF Cpara medição da actividade de células permeabiliçadas contendo 0,1% Triton X-1&03) foi incubado com 50 μΐ de amostra a
37':’C durante 2 minutos e determinou-se espectrofotometricamente o m durante este período de incubação» Mão se aumento de Af405nm observou alteração de ΑΛΛβ.„ durante esta pré-incubação sem 4v?5nm substrato» A reacção foi iniciada pela adição de substrato· C50 μΐ de benci1ox icarboni1-L-1i rosi1-L-1isi1-L-arginina-4-πi troanilida mM, Bachem, Bubendot
Switzerland) e um aumento da
A. .-<Γ- foi 405nm anotado para cálculo da actividade de endopratease» 1U de actividade de endoprotease é definida como 1 ymole de 4—nitroanilida produzida por minuto nas condiçSes de ensaia descritas» Cerca de 90‘X da actividade de yscF foi encontrada no meio de cultura»
Exemplo 3; Transformação de S« cerevisiae estirpe ABilO
Saccharomyces cerevisiae es transformada com os plasmídeos pDP34, protocolo de transformação descrito tirpe ABI10 CAlDj 20/96Ϊ foi pAB22ó s pDPkexp usando o por Dohmenet
ECurr
•ΖΑ·
Genet, 15, 3ί9--3253« As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura suplementado com uma mistura de aminoácidos/nucleótidos deficiente em uracilo (mistura de aminoácidos/nucleótidos suplementa o meio de cultura com adenina 12 mg/l, arginina 4® mg/l, histidína 40 mg/l, isoleu™ cina 6® mg/l, leucina 6® mg/l, lisina 6® mg/l, metiorsina 4® mg/l, fenilallanina 50 mg/l, treonina 6® mg/l, triptofano 4® mg/l, tirosina 15 isolados de mq/1 uracilo 4® mg/l, vaiina fe® mq/1) leveduras transformadas foram designados;
Sacc haromycss Sacc harofliyces Sac c ha r omy ces cerevisíae ceravisiae cerevisíae
ABli®/pDP34 ABlí®/pAB22ó ABI1®/pBPkexp
Clones
Exemplo 4; t-ermentação de estirpes de leveduras transformadas numa escala laboratorial
Células de S, cerevisíae ABll®/pBP34, 5. cerevisíae ABI í ®/pAB'226 e S. cerevisíae ABI 10/pBPkexp foram cultivadas em 1® ml de pré-cultura composta por
Difco Yeast Nitrogen Base sem Aminoácidos glucose
HEPES ô,7 g/1 2®,€í g/1 24,® g/1 meio de cultura, foi suplementado com uma mistura de aminoácidos/nucleótidos deficviente em leucina (descrito no Exemplo 3) e o pH foi ajustado a 7,®»
As pré-culturas 3®°C e 18® rpm» foram -cultivadas durante 48 horas
il é composto por?
meio de cultura
Difco Yeast Nitrogen Base sem Aminoácido glucose arginina
Casaminoácidos Difco
HEPES pH ajustado a 7,0=
As culturas principais foram inoculad
6,7 g/1
40 5 0 g/I
8,0 g/1
8,5 g/i
24,0 g/1
com cerca de i% v/v de pré-cuIturs e incubadas a 30‘:'C e 180 rpm alturas durante a fermentação retiraram-se amostras analisou-se a densidade celular, o pH do caldo de actividade de endoprotease. A Figura 1 mostra as = Efíi várias de cultura e cultura e a.
actividadss intracelular e extracelular de yscF sintetizadas pelo transformante S. cerevisiae ABI10/pDPkexp desde que uma variante de yscF solúvel secretaria seja expressa -em comparação com o transformante AB110/pDP34 que é portador apenas do vector de levedura e o transformante AB110/pAB226 que expressa toda a proteína yscF.
Exemplo 5; Demonstração ímunolágica de uma proteína yscF solúvel truncada no meio de cultura de transformantes 8. cerevisiae
ABI10/pDPkexp
As estirpes de 5. cerevisiae ABÍ10/pDP34 foram cultivadas como descrito caldos de cultura foram separados em células cultura por centrifugação. Gs sobrenadantes
AB110/pDPks xp e no exemplo 4. Os e sobrenadantes de de cultura foram concentrados usando filtros Centricon 30Θ00 (Amicon) para 1/5 do volume original. Quantidades diferentes dos sobrenadantes concentrados foram reduzidas com 1,4-ditio-DL-treitol e separadas num gel de 8% de poliacrilamida em condições desnaturantes. As
proteínas foram coradas com azul Coomassie brilhante ou transferidas para filtro de nitrocelulose Ctransferência Western)» Os métodos para PASE e transferências Western estão descritos em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2â Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York» 0 filtro de nitrocelulose foi incubado a 37°C durante 2 horas em 2mM NaH._,FO^, 15® mM NaCl, IX BSA, pH 7,2 seguido de uma segunda incubação nas mesmas condições na mesma solução que agora contem mais anticorpos policlonaís induzidos em coelhos contra uma proteína de fusão lacZ-yscF» (A produção e purificação de anticorpos está descrita em Sambrook et al», 1989, Molecular cloning, 2ã edição, Cold Spring Harbor três vezes
17.
durante 3® minutos a T rit on X-í ®®, ®, 1 XBSA
Laboratory Press, New York») □ filtro foi lavado
37°C em 1® mM NaHoF'D„, 15® mM NaCl
X- » pH 7,2« Ests lavagens foram seguidas de uma reacção de hibridação com um soro ds cabra anti-Igs de coelho conjugado com fosfatase alcalina» A transferência foi lavada três vezes durante 3® minutos em í® mM NaH^PO^, 15® mM NaCl, ®,®ÍX Tween 2®, Ô,1X BSA, pH 7,2. A vizualização da ligação específica ocorre por incubação da transferência numa solução composta por: ®,ÍM Tris-HCl pH 8,8, 1®® mM NaCl, 2 mM MgCl^, 1® mg/1®® ml de 5—Bromo—4—clorindolil—fosfato CBCIP) ε 1®® mg/í®® ml de Nitro— blue-Tetrazolium—Chloride CNBT). Uma proteína adicional de de 68 -tDa foi encontrada nos sobrersadant.es de cultura de S. cerevisiae ABIí®/pDPkexp comparado com os sobrenadantes de cultura de S» :srevisiae AB11 ®/pDP34.
•ta proteína de 68 KDa reage com os anticorpos induzidos contra uma parte da proteína yscF,
Exemplo 6s Processamento in vitro de pre—pro—IGF1
1BF1 é expresso em S» cer e visiae como uma proteína de fusão intracelular composta por IShl maduro fundido com
sequência líder do precursor do factor «· de 5. cerevisiae., A proteína de fusão tem a seguinte estruturas
N-Clíder do factor «>-IGFl~C
A sequência de aminoácidos Tir-Lis-Arq é o extremo C-terminal da sequência líder de 89 aminoácidos do factor a EKurjan, Ja e Herskowitx, I, 1982, Cell 3Q;, 933-9431 e um substrato para a endoprotease yscF. A proteína de fusão é clivada pela protease yscF solúvel truncado«a que conduz aos produtos de digestão N-pre-pro-factor «-C e IGF1 maduro.
Amostras de extracto bruto de S, cerevisiae cada uma contendo 5ô pmoles da proteína de fusão líder do factor a-IGFl foram incubadas com amostras do sobrenadante de cultura de S„ cerevisiae ABÍ10/pDPkexp cada uma contendo actividade de endoprotease yscF solúvel 5 mM (calculado a partir do ensaio de actividade de endoprotease descrita no Exempla 2). As reacções foram realizadas em 10 pl de tampão Na-fosfato 5© mM, pH 7,5 durante diferentes períodos de tempo. IGF1 maduro derivado do processo de processamento in vitro foi detectado por análise de transferência Western”. Este método está descrito no exemplo 5. A hibridação foi realizada usando anticorpos policlonais induzidos em coelhos contra I8Fí maduro. A detecção ds ligação específica está descrita no Exemplo 5» A análise de transferências Western mostra que o processamentode pre-pro~I8Fl com um sobrenadante de cultura contendo a variante solúvel da protease yscF secretada pelo transformante S. cerevisi ae ABI10/pDPkexp. A proteína pre—pro— IBF1 foi processada para dar a proteína IGFÍ fflâdurs dentro de 30 a 120 minutos usando as condições de ensaio descritas
Exemplo 7; Construção de um gene híbrido contendo o promotor BAPFL e o gene estrutural KEXI
Conforme divulgado no Pedido de Patente Europeia N2 341,215 o gene KEXí de tamanho completo foi isolado a partir de DNA genómico total de Sac c ha romyc es c e rev is i ae num fragmento de 3,1 Kb. Este fragmento foi clonado num sítio único HindIII do plasmídeo de levedura pJDB207 CBeggs, J.D., 1981, em D» von Wettstein et al., Ced»), Molecular Benetics in Yeasts, Alfred Benzon Symposium 16» Munsgaard, Copenhagenl» E. coli HBlÔl foi transformado com o plasmídeo resultante pJDB207/KEXl. A estirpe transformada de E» coli foi designada E» coli HB101/KEX1.
Para se obter um nível elevado de expressão de uma forma solúvel secretada de ysco: (a proteína codificada por KEXi), o promotor muito fraco de KEXí presente no fragmento HindIII foi trocado pelo elemento promotor constitutiva forte (BAPFL) do promotor da gliceraldeído—3—fosfato—desidrogenase ds levedura (Pedido de Patente Europeia N2 225,633)» Uma vez que o promotor BAPFL está contido num fragmento Sall-EcoRI de 478 pb, primeiro um sítio EcoRI na região codificadora de KEXI é eliminado por mutagênese in vitro, seguido da introdução de um novo sítio EcoRI directamente 5? relativamente ao codão de iniciação ATE de KEXI para permitir a fusão corrscta do promotor BAPFL à região codificadora de KEX1»
Detalhadamente, o fragmento HindIII de 3,1 Kb contendo KEXÍ foi subclonado no sítio HindIII do vector derivado de M13 pBlusscript KS+ CStratagene, La -Jolla, Ca» USA) para dar KS*/-KEX1. Para remover o sítio interno EcoRI situado 42@ pb a montante do sítio HindIII 55, sintetizou-se o seguinte oligonucleótidos
55-CCTTTTABBBTCAATTCABACSBT-3!
A mutagénese dirigida in vitro foi realizada como descrito (kit Bio-Rad Muta-Gene M13, Bio-Rad, Riehmond, Ca» USA). Primeiro, KS-f-ZKEXl foi usado para transfectar E. coli CJ 236 para incorporar uracilo (kit Muta-Gene, supra). DNA de cadeia simples de E» coli CJ 236 transfectado foi isolado usando o fago auxiliar M13 (Stratagene, supra).
2®0 pmoles do oligonulcéotido iniciador foram desfosforiladas num volume total de 3© μΐ contendo 3 p.l de 1M Tris-HCl pH Β,©, ©,©3 μΐ de 1M MgClo, 0,75 μΐ 0,2M DTT, 0,6 μΐ 2© mM ATP, 4,5 unidades de polinucleótidos-cinase de T4 foram adicionados e a mistura incubada a 37°C durante 45 minutos e a 65°C drante 10 minutos» oligonucleótido fosforilado foi então emparelhado com o DNA molde nas seguintes condições: €3,1 pmoles de DMA contendo uracilo derivado de K3-5-/KEX1 foram incubados com 2 pmoles de iniciador fosforilado num volume total de 10 μΐ de tampão de emparelhamento (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 2mM MgCl^, 5© mM NaCl). A mistura foi aquecida num banho-maria a 80°C ε depois deixada arrefecer lentamente até ser atingida a temperatura ambiente»
Formou-se então acadeia complementar nas seguintescondições-: ί© μΐ da mistura de emparelhamento foram incubados com 4 μΐ de 2mM dNTPs, <0,75 μΐ de ô,5M Tris-HCl pH 7,4, €i,75 μΐ de 0,iM MgCl.-,, 2,15 μΐ de ©,ΞΜ DTT 1 unidade de DNA-polimerase de T4 e 2 unidades de DNA-lígase de T4» A mistura de reaccão foi primeiro incubada em gelo durante 5 minutos e finalmente a 37°C durante 90 minutos» Os DNAs de cadeia duola resultantes foram usados para transformar E. coli JM 101, eficazmente o molde contendo uracilo.
uma estirpe que deixando
Γ*ξ?ίΒΟ Vízí cadeia complementar mutagenisada replicar-se (Bio-Rad, supra). Os plasmídeos foram preparados e analisados na ausência do sítio
EcoRI. A mutagénsse correcta foi ainda confirmada por análise da sequência. Dm plasmídeo com a destruição correcta do sítio interno EcoRI foi designada KS+7KEX1CEcoRI)»
Um novo sítio EcoRI foi agora introduzido em KS-f-ZKtXí(-EcoRI) usando o seguinte oligonucleótido como iniciador?
5?-AGATAAAGACCTGAATTCAGATGTTTTACAAT-35
A mutagénsse in vitro foi i descrita supra. Os plasmídeos foram restrição quanto â presença ds um novo adjacente ao dodão de iniciação e por salivada exacLamente como testados por análise de sítio EcoRI imediatamente
-análise da sequência» Um plasmídeo com o novo sítio EcoRI correcta foi designado como
KS+/KEX1(EcoRInew)» digerido com EcoRI e HindiII e o foi separado num gel preparatiusando SeneClasn (Bio I©1 Inc»,
KS+/KEX1(EcoRInew) foi fragmento contendo KEX1 de 3,® Kb vo de 0,8% de agarose s isolado La Jolla, CA, USA).
's-Z
Para se obter o fragmento com o promotor BAPFL o plasmídeo pJDB207/GAPFL~HIR (Pedido de Patente Europeia N2
225,633) foi digerido o nm Sall e EcoRI e i solado o fragmento de
478 pb usando o mesmo processo como já desc rito í Genec1ean,
supra)„
o,2 pmoles do fragmento promotor SalI-EcoRI de 478 pb.
®,2 pmoles do fragmento EuuRI-HindiII contendo o gene estrutural
KEX1 de tamanho completo e ©,1 pmoles do vector de multicópias de levedura pDP34 ícf» Pedido de Patente Europeia N2 340,170) cortado a partir com Sal I-Hind 11 J. de células E» foram 3 igados
coli 3M101. Um plasmídeo correcto foi referido como pDP34/8APFL-KEX1»
Exemplo 8; Construção de um gene KEXÍ encurtado codificador de actividade ysca solúvel
KEXÍ codifica uma carboxipeptidase ligada a membrana ysca - que está localizada dentro de um sistema secretor, mais provavelmente no aparelho de Bolgi. A proteína vsca consiste num domínio catalítico amino-terminal, seguido ds uma região ácida rica em Asp-Slu, um dominio transmembranar e uma cauda C-terminal, Para permitir a secreção para o meio através da via defeituosa, fazer um extremo C truncado ê o método preferido» Um sítio Xhol único adequado está situado imediatamente a montante do domínio transmembranar no fim da região ácida»
KS+/KEXÍ íEcorínew) foi digerido com EcoRI e Xhol e isolado o fragmento de 1,7 Kb contendo o gene KEXÍ truncado no extremo C. Este fragmento codificador de KEXÍ com i,7 Kb e o fragmento SalI/EcoRI de 478 pb contendo o promotor BAPFL (Exemplo 7) foram então ligados ao sítio único Sall de pDP34. 0 plasmídeo resultante foi referido como pDP34/GAPFL~KEXl#, A ORF codificadora de ysca# solúvel com sequências derivadas de KEXÍ está descrita na listagem de sequências em 8EB- ID N52·,
Exemplo 9; Transformação de S
cerevisiae estirpeTr 1176
a. Cruzamento da estirpe 96 de 5« cerevisiae mutante kexl com a estirpe BVS e análise dos esporos relativamente ã capacidade secretora do factor a e carboxipeptidase yscu CKEX1)
A estirpe % de S.cervisiae mutante kexí Ca,kexl, ade2, trel), que foi obtida do Genetic Gtock Center de leveduras, Berkeley, USA, foi cruzada com S. cervisiae estirpe BYS232-31-42 Cu, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, lis2, leu2, his7> EAchstetter, T» e Wolf, D.H. C1985) EMBO J. 4, 173-177; Wolf, D.H. e Ehmann, C. C1981) J . Bacteriol» 147, 418-4263 portadora do alelo KEXÍ tipo selvagens. As células heterozigóticas diplóides do genótipo kexl/KEXí foram isoladas a partir deste cruzamento. As tétradas que derivam das células diplóides foram dissecadas de acordo com pocessos convencionais de genética EHawthorne, D.C. e mortimer, R.K» ÍÍ960) Geneíics 45, 1085-1110; Methods in Yeast Genetics 1986 (Sherman, F. et al., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.3.
Os quatro esporos de (μι roHz.
a um£ das tétradas foram testados quanto á sua capacidade para secrstareffl o factor u. Para distinguir entre KEXí tipo selvagem e as colónias mutantes kexi, usou—se a estirpe tete de S» cervisiae super—sensível a feromonas RC629 Ca, sst-2, ade2-í, urai , his-6, meti, eanl, cyh2, rme) CChan, R.K. e Otte, C.K» (1982) Mol» Cell. Biol. 2, 11-20; Chan, R.k. e Otte, C.K. C19S2) htol« Cell. Biol. 2, 21-293. Conforme esperado a partir das características codificadas pelo penes nucleares isolados, de todas as tétradas analisadas, dois esporos de cada tétrada secretam o factor enquanto que os dois outro esporos secretam o factor u. Colónias tipo selvagem KEXí do tipo de conjugação & xnibem o crescimento da estirpe teste num grau
muito maior ε portanto produzem um grande halo à volta delas próprias, uma vez que elas são capazes de processar o precursor do factor a completamente e produzem quatro moléculas de factor α activas a partir de uma molécula precursora» Pelo contrário, as colónias do mutante kexl inibem o crescimento da estirpe teste num grau menor e assim produzem um halo menor à volta delas próprias, pois são capazes de produzir apenas uma molécula de factor a madura a partir de uma molécula precursora»
Os esporas ds várias tétradas completas que foramidentificadas como defectivas no gene kexl pelo ensaio de feromonas abaixo descrito, foram finalmente testadas quanto â especificidade de carboxipeptidase ysca» As células foram cultivadas, as suas membranas foram preparadas e testadas relativamente à activdida.de de carboxipeptidase ysca usando Cbz-Txr-iis-Arg como substrato como descrito EWagnsr, J»C» e Wolf, D«H» (1987) FEBS Lett» 221, 2, 423-4263» 0 facto de não se encontrar actividade da earhoxipep tidase ysca nas células mutantes kexl, indica que KEX1 é o gene estrutural desta enzima» Isto implica que a carboxipeptidase ysca está ds facto envolvida no processamento carboxi-terminal do Tactor a»
b. Classificação dos mutantes kexl confirmados relatívamenté a deficiência adicional na proteases yscB, yscY e yscS
Mutan tes kex í relativamente a deficiênc carboxipeptidase yscY e c de S» cerevisiae foram classificados ia de outras proteases Cproteinase yscB, arboxipeptidase ysc-S) e outras necessidades de factores de crescimento
Material celular dos mutantes kexl cfu'ê-’fdi preparada a partir de uma fase estacionária em meio YPD CDifco) foi ressuspen· so em 2Θ0 μΐ de tampão 2® mM Tris-HCl, pH 7,2 num tubo Eppendorf e adicionadas esferas de vidro <©,4 mm de diâmetro) até dois terços do volume, A suspensão foi agitada fortemente três vezes durante í minuto num misturador vortex com arrefecimento intermitente em gelo.
permite a recuperação tos foram dialisados OylmM ZnCl.- de forma livres a partir dos
A centrifugação durante 5 minutos de extractos do sobrenadante, Estes extrac contra tampão ©,ÍS‘i imidazole-HCl pH 5,2 com a activar proteases e a remover aminoácidos extractos.
As sc tivid-ades de proteinase yscEt foram medidas de acordo com o teste de Azocoll CR.E. Ulane et al», (1976) J. Biol, Chem, 25 í, 3367, E, Cabib et al», (1973) Biochem, Biophys, Res, jommun» SO, 186s T.
>aheki et al (1974) Eur
Biochem, 42.
6213. Após medição daconcentração proteica, uma pequena quantidade de cada uma das amostras foi ajustada a ÍÔ© μΐ com fosfato de sódio 6,1M (íMaPi) pH 7,6 para igualar as quantidades de proteína necessárias» A. solução de proteína adicionou-se uma suspensão de 5&Φ pl de Azocoll (24© mg em í© ml de tampão NaPi, pH 7,©), estas misturas foram incubadas a 3©OC durante uma hora com agitação. Após a adição de 5©© pl de ácido tricloroacético a !©’£ que pára a reacção, as misturas foram centrifugadas duas vezes e medidas as espectros de absorção dos sobrenadantes a 52© nm.
As actividades de carboxipeptidase yscY e yscS foram medidas usando o substrato cromogénico Cbz-Bln-Leu Ec,f» D.H. Wolf et al,, (Í978) FEBS Lett» 9Í, 5*9; D»H» Wolf et al», (1977) Eu.r, 3. Biochem» 73, 5533» Os extractos dialisados foram divididas em três porções e a duas delas adicionou-se fluoreto de
0,24 mg/ml 0,40 mg/rnl
-.,' <·':·? λ fenil-metilsulfonilo íPMSF) numa concentração final de 5 mM para bloquear selectivamente as duas actividades de protease, Nomeadamente PMSF inibe a actividade de carboxipeptidase yscV e EDTA inibe a da. carboxipeptidase yscS, As misturas com inibidores foram incubadas a 25*C durante uma hora para completar a inibição, Após a determinação da concentração proteica, duas amostras com inibidor e uma amostra sem inibidor como tesemunha de cada amostra foram completadas para 50 μΐ com tampão 0,1M NaPi pH 7,4 para receberam iguais quantidades de proteína, A estas soluções de proteína adicionaram-se as soluções a testar que se seguem»
500 μΐ de solução teste Is
L—afliinoác ido-ox idase peroxidase de rábano silvestre 0,0Í mM MnCl„ em tampão 0,1M NaPi, pH 7,4 50 μΐ de solução teste II o-dianisidina em água
500 μΐ de solução teste III mM Cbz—Gli—Leu em tampão fosfato de potássio 0,2M, pH 7,4»
As misturas foram incubadas a 28 *C durante uma hora e após adição de 100 μΐ de Triton X—100 a 20% para para a reacção, mediram-se as absorvâncias a 405 nm.
mg/ml
Com a finalidade da subsequente transformação, uma marca auxotrófica para o aminoácido leucina foi avaliada através de réplicas para placas de meio mínimo suplementadas com adenina, treonina, lisina e histidina e com ou. sem leucina.
Por meio dos ensaios atrás descritos, isolaram-se mutantes designados -5, cerevisiae BYSkexi, os quais apresentam uma deficiência quádrupla em proteases Ccí, prb-í, prc-t, cps-3, ke*xí) e uma necessidade adicional relativamente a leucina.
c. Produção da estirpe de levedura TR1176 deficiente em ura-3
Tr 1176 é um derivado ura3 da estirpe BYSkexí descrita atrás, A disrupção do gene URA3 em BYSkexí foi realizada como descrito detalhadamente no Pedido de Patente Europeia NS 340,17®. Tr 1176 tem as seguintes marcas genéticass MATa, prb-í, prc-í, cps-i, kex-í, ade-2, leu2, ura3»
S. cere visi ae Tr 1176 foi transformada com os plasmídeos pDP34/SAPFL —KEX1 e pBP34/6APFL—KEX1® usando o protocolo de transformação descrito por Dohmen (supra). As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura suplementado com leucina e adenina e deficientes em uracilo. Colónias individuais de leveduras foram isoladas e designadas;
Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/pDP34/GAPFL-KEXi
Saccharomyces cerevisiae Tr lí76/pDP34/GAPFL-KEXí*
Exemplo 10 g Actividade biológica de ysca solúvel
Células de Saccaromyces cerevisiae Tr 1176/pDP34/8APFLKEX1 e de Saccharomycgs cerevisiae Tr U7ó/pDP34/SAPFL--Kfc.Xl$ foram cultivadas em meio mínimo composto por5
Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos glucose
L-asparagina adenina
8,4 2Θ.0 í©,0 g/1
0,1 g/1 g/1 g/1 durante 48 horas a 30°C ε 180 rpm.
As células foram separadas do meio por centrifugação, ressuspensas em õ»9% de NaCl e testadas relâtivamente á actividade de ysca pela formação de halos numa camada de células a supersensíveis ao factor α CChan, R»K« e Otts, C»K„ C1982) Mol. Cell» Biol» 2, 11-201» A estirpe Tr 1176 sem plasmídeo apresenta apenas um halo muito pequeno na camada ds células a devido á ausência de actividade ysca. Saccharomyces cerevisiae Tríl76/pDP34/GAPFL-KEX.l e Saccharomyces cerevisiae Tr 117ó/pDP34/SAPFI_KEX1$ ambos apresentam a formação de halos,ysca reteve portanto a sua função biológica normal, i.e» maturação do factor a.
Sobrenadantes de fermentações de bacc haromyces_cerevisiae Tr 1176/' pDPó4/GAPF L-KEX1 ί 176/ pDP-34/e.APFL-KEX 1« í supra ?
e Saccharomyces cerevisiae Tr foram então analisados quanto à presença da actividade de ysca no meio usando como substrato o peptídeo sintético Cbz—Tir-Lis—Arg s um ensaio como descrito (Wolf, D.H. e Weiser, U» C1977) Eur, J. Biochem» 73, 553-556)»
Apenas os sobrenadantes de Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/-pDP34/GAPFL~KEXÍ* apresentaram degradação proteolítica do seu substrato enquanto os sobrenadantes de Saccharomyces cerevi s i as
Tr 1176/pBP34/BAPFL~KEXinão apresentaram actividade com Cbz~Tif—
Lis~Arg. Pode concluir-se pois que 1<EX1$ codifica ysc« biologicamente activo que ê libertado para o meio- A nova proteína foi
designada ysc«$»
Exemplo 11s
Purificação de ysc<s$
ml da matrix de permuta iónica Fractogel TSK DEAE 65© (Merck AS, Darmstad, FRG) foram empacotados- numa coluna que se equilibrou com tampão de fosfatas 5© mM, pH 7,©« SC* ml de caldo de cultura de Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/pDP34XBAPFL-K.EXÍ (supra)foram ajustados a pH 7,© e aplicados na coluna durante a noite» ysca naquelas condiçSes lig—se à coluna» As proteínas ligadas foram então eluidas com um gradiente combinada de pH/sal (4© ml de tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,© ε 4© ml de tampão fosfato de sódio 5® mM pH 4,© + ÍM NaCl)» Por volta de ©,2M NaCl ysca? elui numa, forma substancialmente pura com um peso molecular aparente de aproximadamente 66 KDa (peso molecular calculado de 65 KDa.) » Quando comparado com carboxipeptidase B do pâncreas de
porco (Boehringer Mannheim, Marinheiro, FRS) ysc«& na mesma concentração proteica, tem a actividade equivalente no substrato CbzTir-Lis-Arg a pH 7,© e actividade ligeiramente superior a pH 4,©»
Exemplo 12: Construção de um peptídeo de fusão recombínante expressando hirudina e caleitonina humana simultgneamente
Construiu-se um peptídeo ds fusão que permite a expressão simultânea de hirudina e de um precursor da caleitonina humana. Entre os dois peptídeos foi introduzido o sítio de reconhecimento Lis-Arg de KEX2/KEX1 para permitir o processamento in vitro com yscF solúvel e yscaS solúvel (supra).
Detalhadamente. o plasmídeo pJDB2®7/8AF’FL-HIR (supra, Exemplo 7) foi digerido com Sall e BamHI e o fragmento de Kb foi subclonado em SalI-BamHI de pBluescript KS*. 0 gene codificador do precursor com glicina C-terminal da caleitonina humana foi montada a partir de oligonucleótidos individuais como descrito para a hirudina (cf. Pedido de Patente Europeia NS 168342) e subclonado no sítio Pstí ds pUC19. A sequência do precursor da caleitonina humana com uma extensão 55 para proporcionar processamento in vitro está descrita na listagem de sequências em SEQ ID NQ3 (como confirmado pela análise da sequência).
fragmento Pstí de Ío2 pb foi retirado sítio Pstí do vector Bluescript contendo a hirudina mantes foram testados relativamente â orientação inserção e um plasmídeo correcto foi designado j s clonado no Os transforcorrecta da
S+/SAPFL-HIRCALC.
plasmídeo pJDb2€ / -Ui-íF r L—Η Σ h
HindiII e isolado o fragmento grande plasmídeo pJBB207/8APFL-HIR foi digerido se obter o fragmento terminador de PH05 foi diger ds 7,® Kb com BamHI ds 35© pb.
xtío uum CaιI e d o v ec t o r, 0 e Hindi II para
Finalmente o fragmento vector p JDB207, o fragmento terminador e o fragmento SalI-BamHI de ligados numa ligação tripla para dar o
KS*/8APFL-HIR—CALC foram plasmídeo p3DB207/SAPFLHIR-CALC,
Saccharomyces cerevisiae estirpe HT246 íDSM 4084) foi transformada com o plasmídeo pJDB207ZSAPFL-HIR-CALC de acorda com o Exemplo 3« As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para leveduras -deficientes em leucina. Células de levedura transformadas foram isoladas e referidas como 8» cerevisiae HT24ÓZpJDB207ZGAPFL-HIR-CALC.
Para a expressão e secreção da proteína de fusão 5. cerevisiae HT24ó/pJDB207/GAPFL--Hl'R-CALC foi cultivada como descrito no Pedido de Patente Europeia N2 340170 (exemplo 10 aqui)» Após 48 horas e 72 horas de cultura retiraram-se amostras, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante de cultura contendo a proteína de fusão foi retirado para posterior processamento» Primeiro o sobrenadante contendo a proteína de fusão hirudina-calcitonina foi clivado endoproteoliticamente por digestão com a proteína yscF truncada solúvel de acordo com o Exemplo 6» Esta clivagem resulta num precursor de tamnho completo da calcitonina humana e numa variante da hirudina que ainda cantem uma extensão 1isina-arginina no seu extremo C» Esta extensão 1isina-arginina foi removida por digestão com ysca$ usando enzima purificada (ver Exemplo li). A remoção correcta da extensão 1isina-arginina foi demonstrada da mistura de reacção como divulgado no por HPLC de fase reversa Pedido de Patente Euro-
Exemplo ld; Construção de uma proteína ds fusão recombinante expressando eqlina C
Construiu-se um psptídeo de fusão que permite a expressão de uma proteína de fusão de acordo com o invento de acordo com a fórmula P-L-T em que P é o polipeptídeo da eqlina C (Rink H„ et al., Í9S4 Nucl» Acids Res. 12, 6309-6387), L a sequência de ligação Lis-Arg-Slu-Ala-Blu-Ala-Trp-Vâl-Pro e T um domínio de liagação a celulose da proteína Exg de Ce11u1omonas fimi codificada pelo gene cex de Cellulomonas fimi íMeill 6.0. st al., Í986 ©ene 44, 325-330).
Detalhadamente o plasmídeo pEC~í CNeill 6.0. et al.
fragmento de 433 pb codificador do domínio de ligação à celulose do gene de cex de celulomonas foi isolada» 0 plasmídeo plSkexp (exemplo 1) foi cortado com Asp71S e os extremos coesivos foram preenchidos usando polimerase Klenow resultando em extremos cerses. 0 plasmídeo linearizado foi ligado ao fragmento Smal—Stul ds 433 pb de cex e usado para transformar E. coli HB 101. Os clones foram testados quanto à orientação do fragmento cex de 433 pb» Um clone com a orientação que faz a acoplagem da grelha de leitura do gene KEX2 com a grelha de leitura do gene cex foi designado plSkexpcex» plasmídeo pUClv foi cortado com Bali e BamHI e o fragmento SalI—BamHI de 276 pb do pBR322 foi inserido. 0 plasmí— deo resultante pUCiPpBR foi cortado com BamHI e ecoRÍ e ligado na presença do fragmento BamHI-EcoRI contendo o promotor BAPDH resultando no plasmídeo pTMl. pTMJ. foi cortado com EcoRI e inserida a seguinte adaptador
5’-AATTCATGCA TGCATGCABA TCT-3* de tal forma sequências do pTM2» que o sítio EcoRI foi reconstituído adjacente às promotor, 0 plasmídeo resultante foi desigando plasmídeo pML147 (Rink H» et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12, 6369-6387) foi cort-ado totalmente com EcoRI e BamHI» 0 fragmento EcoRI-BamHI da eglinaC foi clonado em pBR322 cortado com EcoRI/BamHI. Um plasmídeo com a sequência pretendida foi designado pML141» Usando os oligonucleótidos
5*—CCGGTACCCA ABCTTCBBCT TCTCTCTTAC CAACATGCGB AACATG3’
5’-CGGGATCCAA GAATTCTGA CTGAATT-3’ (a sequência codificadora da sequência L adaptadora referida atrás está sublinhada) uma reacção de PCR foi realizada em pHLÍ41 usando o kit de PCR da Perkin-Elmer-Cetus e seguindo as estricta— mente as instruções do fornecedor, A reacção de pCR resulta na amplificação de um fragmento de 257 pb contendo o gene da eglinaC ligado à sequência adaptadora L. 0 fragmento foi isolado a partir de um gel de agarose e cortado totalmente com BamHI e Asp7ÍB. O plasmídeo plBkexpcex (ver atrás) foi totalmente cortado com BamHIe Asp71B e isolado o fragmento de 3,1 Kb» O fragmento BamHI-Asp718 de 3,1 Kb do plBkexpcex contendo fragmento do gene cex e as sequências de pUC19 foi ligado ao fragmento BamHI—Asp71S da eglina C obtido por PCR s o plasmídeo resultante foi designado plBeglincex» 0 plasmídeo contem uma grelha de leitura aberta que vai desde o primeiro aminoácido da eglina C até ao último aminoácido da proteína Exg. Ds dois domínios, i.e. eglina C e os 133 aminoácidos C—terminais de Exg (incluindo uma prolina -extra), foram separados pela sequência adaptadora dada atrás» ft sequência de nucleótidos codificadora da proteína de fusão (ver SEQ ID NS4) foi confirmada por sequenciação de DNA» plasmídeo pTÍ12 (ver atrás) foi cortado com EcoRI e os extremos 5? foram desfosforilados, 0 plasmídeo plGeglincex foi cortada com EcoRI e o fragmenta eglina-cex de 686 pb foi isolado. Este fragmento de 686 pb foi ligado ao vector pTM2 cortado com quanto á orientação do fragmento eglina-cex. Um clone com a orientação pretendida resultando na ordem que sa segue das sequências GAPDH-eglina-cex foi designado pí9/GAF‘DH-EGLIN-CEX, plasmídeo pl9/SAPDH-ESLIN-CEX foi digerido com BamHl e BglU e isolado o fragmento codificador das sequências GAPDHeglin-cex , 0 plasmídeo pDP34 foi cortado com BamHl, os extremos 55 foram desfosforilados e o fragmento resultante foi ligado ao fragmento BamHI-BglII» Os clones foram testados quanto á orientação do fragmento BamHI-BglII ds 1,1 Kb e referidos como pDP348APDH~eglincex—ί e pDP34GAPDH—eglincex—2 em que o índice 1 indica que -a inserção GAPDH-eglxn-cex está orientada no sentido dos ponteiros do relógio no plasmídeo pDP34 enquanto que 2 indica que uma orientação contrária ao sentido dos ponteiros do relógio» pDF'34SAPDH-egl incex-1 foi usado para transformar Saccharomyces cerevisiae estirpe ABI10 (ATCC 2079ó) de acordo com o exemplo 3, As células de ABI10/pDP34SftPDH~eglincex-1 foram cultivadas em 10 ml de meio mínimo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos 6,7 g/l, glucose 40 g/1, mistura de aminoâcidos/nucleótidos de acorda com o Exemplo 3 sem 1-eucina) durante 24 horas a 30“-'C com ÍS0 rpm, As culturas- principais, 250 ml de meio mínimo foram inoculadas com a pré-cultura e cultivadas a 30°C durante 24 horas com 180 rpm» A cultura de produção foi ampliada como se segues As células da cultura principal foram separadas do caldo
de meio 3,4 g/1, acordo 24 horas de cultura por centrifugação, rsssuspensas em 250 ml mínimo duplo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos í glucose 4® g/1, 2x mistura de aminoácidos/nucleótidos de com o exemplo 3 sem leucina? e fermentada a 3®°C durante com 18® rpm»
As células da produção foram separadas do meio de cultura por centrifugação, lavadas primeiro em 200 ml e depois em 40 ml de tampão A (tampão As 5® mM Tris—HCI pH 7.,®, 10® mM NaCl). As células foram rebentadas com esferas de vidro em passos repetidos cada um deles em cerca de 1® ml de tampão A e o extracto bruto de um volume total de 48 ml foi clarificado por centrifugação (2‘588& xg, Í5 minutos, 4°C) » 5q (peso seco) de celulose ÍAvicel ou celulose fibrosa) foi adicionado ao extracto bruto e incubado num agitador durante 1,5 horas a 4C‘C»
A proteína de fusão ligada à celulose foi eluida com água como uma proteína de fusão e depois digerida com yscF resultando em eglina C com -a extensão C-terminal Lis-Arg» Estes dois aminoácidos- C-terminais foram removidos por digestão com ysc«» Mais detalhadamentes A celulose após incubação no extracto bruto foi colocada numa coluna de cromatografia (1,6 x 2® cm) e lavada na coluna com três volumes de coluna de tampão A» Em seguida aplicou-se um gradiente de tampão A e água» O gradiente é linear e corre entre iôGX do tampão A, ®K de água e de tampão, Í00X de água com três volumes da coluna» As fracçSes foram colhidas e testadas relativamente à proteína de fusão pelo método imunológico como descrito no exemplo 5» As fracções contendo a proteína de fusão foram sujeitas a um tratamento com a protease solúvel yscF como descrito no exemplo 6 resultando no produto de clivagem eglinaC-Lis-Arg que depois foir digerido com ysca® solúvel para, remover a cauda Lis—Arg»
Come alternativa, a proteína de fusão ligada à celulose e uma proteina consistindo em eglina C com a extensão C-terminal Lis-Arg ê liberta» Esta proteína é dpois digerida com yseu* para remover estes dois aminoácidos C-terminais» Detalhamenteu diferentes quantidades íi® mg para 5®® mg) de celulose após incubação com o extracto bruto foram incubadas com a proiease solúvel yscF como descrito no exemplo 6 pelo que é libertada eglina C-Lis-Arg. A eglina C-Lis-Arg é ainda digerida com ysc#.# solúvel para remover a cauda Lis-Arg» A eglina C obtida é idêntica estruturalmente à eglina C natural conforme evidenciado por HPLC»
Depósito de microorganismos
As estirpes de depositadas na Deutsche Mascheroder Weg ib, D-33ÔS microorganismos que se seguem foram Sammlung von Mikroorganismen CDSM), · Braunschweig ísão dadas datas dos depósitos e números de acesso)5
Escherichia coli JMl®9/pDP34: 14 de Março, 1988, DSM 4473. Saccharomyces cerevisiae BYS232-3Í-42: ó de Maio, 1988, DSM 4583» Escherichia coli JMÍ®l/pKS3®íb? 25 de Junho, 199®, DS1Í602S. Escherichia coli HBÍ0Í/KEX1: 25 de Junho, 199®, DSM ó®27. Escherichia coli JMl®l/pl9/BAPDH-EGLIN-CEXs 3 de Junho, 1991,
DSM6546
SEQ ID ΝΘ1
Tipo de sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo
Comprimento da sequências Í866 pares de bses
Tipo de cadeias dupla
Topolog ia; linear
Fontes
Fonte e xperimental imediatas E. coli JMÍ0i/pKS301bíDSM6028)
Característiuass desde 1 até 1866 região codificadora de yscF
{ ™··* solúvel
> ATG AAA GTG AGG AAA TAT ATT ACT TTA TGC TTT TGG TGG 39
Met Lys Vai Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp
t 1 5 10
] GCC TTT TCA ACA TCC GCT CTT GTA TCA TCA CAA CAA ATT 78
Ala Phe Ser Thr Ser Ala Leu Vai Ser Ser Gin Gin Ile
j 15 20 25
1 CCA TTG AAG GAC CAT ACG TCA CGA CAG TAT TTT GCT GTA 117
Pro Leu Lys Asp His Thr Ser Arg Gin Tyr Phe Ala Vai
30 35
'k GAA AGC AAT GAA ACA TTA TCC CGC TTG GAG GAA ATG CAT 156
Glu Ser Asn Glu Thr Leu Ser Arg Leu Glu Glu Met His
40 45 50
CCA AAT TGG AAA TAT GAA CAT GAT GTT CGA GGG CTA CCA 195
- Pro Asn Trp Lys Tyr Glu His Asp Vai Arg Gly Leu Pro
55 60 65
AAC CAT TAT GTT TTT TCA AAA GAG TTG CTA AAA TTG GGC 234
Asn His Tyr Vai Phe Ser Lys Glu Leu Leu Lys Leu Gly
70 75
AAA AGA TCA TCA TTA GAA GAG TTA CAG GGG GAT AAC AAC 279
Lys Arg Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gin Gly Asp Asn Asn
80 85 90
GAC CAC ATA TTA TCT GTC CAT GAT TTA TTC CCG CGT AAC' 312
Asp His Ile Leu 95 Ser Vai His Asp Leu 100 Phe Pro Arg Asn
GAC CTA TTT AAG AGA CTA CCG GTG CCT GCT CCA CCA ATG 351
Asp Leu Phe Lys Arg Leu Pro Vai Pro Ala Pro Pro Met
105 110 115
GAC TCA AGC TTG TTA CCG GTA AAA GAA GCT GAG GAT AAA 390
Asp Ser Ser Leu Leu Pro Vai Lys Glu Ala Glu Asp Lys
120 125 130
CTC AGC ATA AAT GAT CCG CTT TTT GAG AGG CAG TGG CAC 429
Leu Ser Ile Asn Asp Pro Leu Phe Glu Arg Gin Trp His
135 140
TTG GTC AAT CCA AGT TTT CCT GGC AGT GAT ATA AAT GTT 468
Leu Vai Asn Pro Ser Phe Pro Gly Ser Asp Ile Asn Vai
145 150 155
CTT GAT CTG TGG TAC AAT AAT ATT ACA GGC GCA GGG GTC 507
Leu Asp Leu Trp Tyr Asn Asn Ile Thr Gly Ala Gly Vai
160 165
GTG GCT GCC ATT GTT GAT GAT GGC CTT GAC TAC GAA AAT 546
Vai Ala Ala Ile Vai Asp Asp Gly Leu Asp Tyr Glu Asn
170 175 180
GAA GAC TTG AAG GAT AAT TTT TGC GCT GAA GGT TCT TGG 585
Glu Asp Leu Lys Asp Asn Phe Cys Ala Glu Gly Ser Trp
185 190 195
GAT TTC AAC GAC •AAT ACC AAT TTA CCT AAA CCA AGA TTA 624
Asp Phe Asn Asp Asn Thr Asn Leu Pro Lys Pro Arg Leu
200 205 t
d>
TCT GAT Ser Asp GAC TAC CAT GGT ACG AGA TGT GCA GGT GAA ATA. 663
Asp iyr His Gly Thr Arg 215 Cys Ala Gly Glu 220 Ile
210
GCT GCC AAA AAA GGT AAC AAT TTT TGC GGT GTC GGG GTA 702
Ala Ala Lys Lys Gly Asn Asn Phe Cys Gly Vai Gly Vai
225 230
GGT TAC AAC GCT AAA ATC TCA GGC ATA AGA ATC TTA TCC 741
Gly Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly Ile Arg Ile Leu Ser
235 240 245
GGT GAT ATC ACT ACG GAA GAT GAA GCT GCG TCC TTG ATT 780
Gly Asp Ile Thr Thr Glu Asp Glu Ala Ala Ser Leu Ile
250 255 260
TAT GGT CTA GAC GTA AAC GAT ATA TAT TCA TGC TCA TGG 819
Tyr Gly Leu Asp Vai Asn Asp Ile Tyr Ser Cys Ser Trp
265 270
GGT CCC GCT GAT GAC GGA AGA CAT TTA CAA GGC CCT AGT 858
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Arg His Leu Gin Gly Pro Ser
275 280 285
GAC CTG GTG AAA AAG GCT TTA GTA AAA GGT GTT ACT GAG 897
Asp Leu Vai Lys Lys Ala Leu Vai Lys Gly Vai Thr Glu
290 295
GGA AGA GAT TCC AAA GGA GCG ATT TAC GTT TTT GCC AGT 936
Gly Arg Asp Ser Lys Gly Ala Ile Tyr Vai Phe Ala Ser
300 305 310
GGA AAT GGT GGA ACT CGT GGT GAT AAT TGC AAT TAC GAC 975
Gly Asn Gly Gly Thr Arg Gly Asp Asn Cys Asn Tyr Asp
315 320 325
GGC TAT ACT AAT TCC ATA
Gly Tyr Thr Asn Ser 330 Ile
ATT GAT CAC AAA GAT CTA
Ile Asp 340 His Lys Asp Leu
TGT TCC GCC GTC ATG GCA
Cys Ser Ala Vai 355 Met Ala
GGC GAA TAT ATT CAT TCG
Gly 365 Glu Tyr Ile His Ser 370
AGT AAT AGC CAC GGT GGA
Ser Asn Ser 380 His Gly Gly
GCT GCC GGT GTT TAC ACT
o Ala Ala Gly Vai Tyr 395 Thr
AAC CTA ACT TGG AGA GAC
\_z Asn Leu 405 Thr Trp Arg Asp
TCT GCG GTA GGG TTA GAA
Ser Ala Vai Gly 420 Leu Glu
AGA GAT AGC GCC ATG GGG
Arg 430 Asp Ser Ala Met Gly 435
TAT TCT ATT ACT ATT GGG GCT 1014
Tyr Ser Ile Thr 335 Ile Gly Ala
CAT CCT CCT TAT TCC GAA GGT 1053
His 345 Pro Pro Tyr Ser Glu 350 Gly
GTC ACG TAT TCT TCA GGT TCA 1092
Vai Thr Tyr 360 Ser Ser Gly Ser
AGT GAT ATC AAC GGC AGA TGC 1131
Ser Asp Ile Asn Gly 375 Arg Cys
ACG TCT GCG GCT GCT CCA TTA 1170
Thr Ser 385 Ala Ala Ala Pro Leu 390
TTG TTA CTA GAA GCC AAC CCA 1209
Leu Leu Leu Glu 400 Ala Asn Pro
GTA CAG TAT TTA TCA ATC TTG 1248
Vai 410 Gin Tyr Leu Ser Ile 415 Leu
AAG AAC GCT GAC GGA GAT TGG 1287
Lys Asn Ala 425 Asp Gly Asp Trp
AAG AAA TAC TCT CAT CGC TAT 1326
Lys Lys Tyr Ser His Arg Tyr
440
GGC TTT GGT AAA ATC Ile GAT GCC CAT AAG TTA ATT GAA ATG 1365
Gly Phe Gly 445 Lys Asp Ala His 450 Lys Leu Ile Glu Met 455
TCC AAG ACC TGG GAG AAT GTT AAC GCA CAA ACC TGG TTT 1404
Ser Lys Thr Trp Glu Asn Vai Asn Ala Gin Thr Trp Phe
460 465
TAC CTG CCA ACA TTG TAT GTT TCC CAG TCC ACA AAC TCC 1449
Tyr Leu Pro Thr Leu Tyr Vai Ser Gin Ser Thr Asn Ser
470 475 480
ACG GAA GAG ACA TTA GAA TCC GTC ATA ACC ATA TCA GAA 1482
Thr Glu Glu Thr Leu Glu Ser Vai Ile Thr Ile Ser Glu
485 490
AAA AGT CTT CAA GAT GCT AAC TTC AAG AGA ATT GAG CAC 1521
Lys Ser Leu Gin Asp Ala Asn Phe Lys Arg Ile Glu His
495 500 505
GTC ACG GTA ACT GTA GAT ATT GAT ACA GAA ATT AGG GGA 1560
Vai Thr Vai Thr Vai Asp Ile Asp Thr Glu Ile Arg Gly
510 515 520
ACT ACG ACT GTC GAT TTA ATA TCA CCA GCG GGG ATA ATT 1599
Thr Thr Thr Vai Asp Leu Ile Ser Pro Ala Gly Ile Ile
525 530
TCA AAC CTT GGC GTT GTA AGA CCA AGA GAT GTT TCA TCA 1638
Ser Asn Leu Gly Vai Vai Arg Pro Arg Asp Vai Ser Ser
535 540 545
GAG GGA TTC AAA GAC TGG ACA TTC ATG TCT GTA GCA CAT 1677
Glu Gly Phe Lys Asp Trp Thr Phe Met Ser Vai Ala His
550 555
TGG GGT GAG AAC Asn GGC Gly GTA GGT GAT TGG AAA ATC AAG GTT 1716
Trp Gly 560 Glu Val 565 Gly Asp Trp Lys Ile 570 Lys Val
AAG ACA ACA GAA AAT GGA CAC AGG ATT GAC TTC CAC AGT 1755
Lys Thr Thr Glu Asn Gly His Arg Ile Asp Phe His Ser
575 580 585
TGG AGG CTG AAG CTC TTT GGG GAA TCC ATT GAT TCA TCT 1794
Trp Arg Leu Lys Leu Phe Gly Glu Ser Ile Asp Ser Ser
590 595
AAA ACA GAA ACT TTC GTC TTT GGA AAC GAT AAA GAG GAG 1833
Lys Thr Glu Thr Phe Val Phe Gly Asn Asp Lys Glu Glu
600 605 610
GTT GAA CCA GGG GTA CCG AGC TCG AAT TCG TAA 1866
Val Glu Pro Gly Val Pro Ser Ser Asn Ser
615 620
f S ΐ
SEQ ID NS2
Tipo de sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo Comprimento da sequências 1797 pares de bses Ti po de cadeias duρIa
Topolog ias Iinear
v_z' Fontes DNA genómico de 1evedura
Fonte e ΧΠΡΓ imental ií?ied ia ta <t u- a col i HB101ZKtX1(DSM6027
Car ac te r 4.3 t .λcs3 π i & V7Q7 Ldp x / / / regi •zíQ codi •f icador a dg?
solúvel -
□ ATG TTT TAC AAT AGG TGG CTC GGA ACG TGG CTA GCC ATG 39
Met Phe Tyr Asn Arg Trp Leu Gly Thr Trp Leu Ala Met
1 5 10
TCT GCT TTA ATA AGG ATC TCA GTA TCC CTT CCG TCA TCT 78
Ser Ala Leu Ile Arg Ile Ser Vai Ser Leu Pro Ser Ser
15 20 25
GAG GAG TAC AAA GTG GCA TAT GAG CTG TTG CCA GGG TTA 117
Glu Glu Tyr Lys Vai Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Leu
30 35
O TCT GAA GTG CCA GAC CCT TCA AAT ATT CCA CAG ATG CAT 156
Ser Glu Vai Pro Asp Pro Ser Asn Ile Pro Gin Met His
40 45 50
GCT GGC CAT ATT CCT TTA CGT TCC GAA GAT GCG GAT GAA 195 '
Ala Gly His Ile Pro Leu Arg Ser Glu Asp Ala Asp Glu
55 60 65
CAG GAT AGC TCT GAC TTG GAG TAC TTT TTT TGG AAG TTT 234
Gin Asp Ser Ser Asp Leu Glu Tyr Phe Phe Trp Lys Phe
70 75
ACC AAT AAC GAC TCT AAT GGC AAT GTC GAC CGT CCC TTA 279
Thr Asn Asn Asp Ser Asn Gly Asn Vai Asp Arg Pro Leu
í ' €
ATT ATA TGG TTA AA GGT GGA CCC GGT TGC TCT TCC ATG. 312
Ile Ile Trp Leu 95 Asn Gly Gly Pro Gly Cys 100 Ser Ser Met
GAT GGT GCC TTG GTC GAA TCC GGC CCT TTT AGG GTG AAT 351
Asp Gly Ala Leu Vai Glu Ser Gly Pro Phe Arg Vai Asn
105 110 115
TCA GAC GGT AAA CTT TAT CTA AAT GAA GGG TCC TGG ATA 390
Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Gly Ser Trp Ile
120 125 130
TCC AAA GGC GAT CTT TTA TTT ATC GAC CAA CCT ACT GGT 429
Ser Lys Gly Asp Leu Leu Phe Ile Asp Gin Pro Thr Gly
135 140
ACT GGG TTT TCT GTC GAA CAA AAT AAA GAC GAA GGT AAA 468
Thr Gly Phe Ser Vai Glu Gin Asn Lys Asp Glu Gly Lys
145 150 155
ATC GAC AAA AAC AAA TTT GAC GAA GAC CTA GAA GAT GTG· 507
Ile Asp Lys Asn Lys Phe Asp Glu Asp Leu Glu Asp Vai
160 165
ACC AAG CAT TTT ATG GAT TTT CTG GAG AAC TAT TTC AAG 546
Thr Lys His Phe Met Asp Phe Leu Glu Asn Tyr Phe Lys
170 175 180
ATT TTT CCA GAA GAC CTC ACT AGG AAA ATC ATA CTA TCG 585
Ile Phe Pro Glu Asp Leu Thr Arg Lys Ile Ile Leu Ser
185 190 195
GGT GAA AGT TAC GCT GGC CAA TAC ATA CCA TTC TTT GCC 624
Gly Glu Ser Tyr Ala Gly Gin Tyr Ile Pro Phe Phe Ala
200 205 ϊ ν’ ί
AAT GCA Asn Ala ATT TTG AAC CAT AAC AAA TTT TCA AAG ATC GAC 663
Ile Leu Asn His Asn 215 Lys Phe Ser Lys Ile 220 Asp
210
GGG GAT ACA TAC GAC TTG AAG GCG CTA TTG ATT GGT AAC 702
Gly Asp Thr Tyr Asp Leu Lys Ala Leu Leu Ile Gly Asn
225 230
GGT TGG ATT GAC CCC AAT ACA CAG TCC CTA TCG TAC CTT 741
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Thr Gin Ser Leu Ser Tyr Leu
235 240 245
CCG TTT GCT ATG GAG AAG AAA CTG ATT GAT GAA AGC AAC 780
Pro Phe Ala Met Glu Lys Lys Leu Ile Asp Glu Ser Asn
250 255 260
CCC AAT TTC AAA CAC TTA ACG AAC GCA CAC GAG AAT TGC 819
Pro Asn Phe Lys His Leu Thr Asn Ala His Glu Asn Cys
265 270
CAG AAT CTG ATA AAC TCT GCC AGT ACA GAT GAG GCA GCC 858
Gin Asn Leu Ile Asn Ser Ala Ser Thr Asp Glu Ala Ala
275 280 285
CAT TTT TCG TAT CAG GAA TGT GAG AAT ATT TTA AAC CTT 897
His Phe Ser Tyr Gin Glu Cys Glu Asn Ile Leu Asn Leu
290 295
CTA TTG TCT TAT ACC AGG GAA TCT TCG CAA AAG GGA ACA 936
Leu Leu Ser Tyr Thr Arg Glu Ser Ser Gin Lys Gly Thr
300 305 310
GCG GAT TGC TTG AAC ATG TAT AAC TTC AAT TTA AAA GAT 975
Ala Asp Cys Leu Asn Met Tyr Asn Phe Asn Leu Lys Asp
315 320 325
1014
AGT TAT CCA TCT TGT GGT ATG AAT TGG CCG AAA GAT ATT
Ser Tyr Pro Ser Cys Gly Met Asn Trp Pro Lys Asp = Ele'
330 335
TCC TTT GTC AGT AAA TTC TTC AGC ACA CCT GGT GTT ATT
Ser Phe Vai Ser Lys Phe Phe Ser Thr Pro Gly Vai Ile
340 345 350
GAT TCG TTG CAT CTT GAT TCT GAT AAA ATT GAT CAT TGG
Asp Ser Leu His Leu Asp Ser Asp Lys Ile Asp His Trp
355 360
AAG GAA TGC ACT AAT AGC GTT GGA ACT AAA TTG TCT AAT
Lys Glu Cys Thr Asn Ser Vai Gly Thr Lys Leu ‘Ser Asn
365 370 375
CCT ATT TCA AAG CCA TCT ATC CAT TTA TTA CCT GGT CTA
Pro Ile Ser Lys Pro Ser Ile His Leu Leu Pro Gly Leu
380 385 390
CTT GAA AGT GGA ATA GAG ATT GTC TTG TTC AAT GGT GAC
Leu Glu Ser Gly Ile Glu Ile Vai Leu Phe Asn Gly Asp
395 400
AAA GAC TTG ATT TGT AAT AAC AAG GGC GTA TTA GAT ACT
Lys Asp Leu Ile Cys Asn Asn Lys Gly Vai Leu Asp Thr
405 410 415
ATA GAC AAT CTA AAA TGG GGT GGA ATA AAG GGA TTT AGC
Ile Asp Asn Leu Lys Trp Gly Gly Ile Lys Gly Phe Ser
420 425
GAC GAT GCT GTT TCG TTC GAT TGG ATC CAT AAA TCG AAG
Asp Asp Ala Vai Ser Phe Asp Trp Ile His Lys Ser Lys
1053
1092
1131
1170
1248
1287
430
435
440
1209
1326
AGT ACA GAC GAC AGC GAA GAA TTT AGC GGA TAC GTG. £AG Lys 455 1365
Ser Thr Asp Asp 445 Ser Glu Glu Phe 450 Ser Gly Tyr Val
TAT GAT AGA AAT TTG ACG TTT GTT AGC GTT TAT AAT GCT 1404
Tyr Asp Arg Asn Leu Thr Phe Val Ser Val Tyr Asn Ala
460 465
TCT CAC ATG GTA CCC TTC GAT AAA AGT TTA GTG AGT AGA 1443
Ser His Met Val Pro Phe Asp Lys Ser Leu Val Ser Arg
470 475 480
GGC ATT GTC GAT ATT TAC TCG AAC GAT GTT ATG ATC ATT 1482
Gly Ile Val Asp Ile Tyr Ser Asn Asp Val Met Ile Ile
485 490
GAC AAC AAT GGG AAA AAT GTT ATG ATT ACT ACT GAC GAC 1521
Asp Asn Asn Gly Lys Asn Val Met Ile Thr Thr Asp Asp
495 500 505
GAT AGT GAT CAA GAT GCT ACT ACT GAA AGC GGT GAT AAG 1560
Asp Ser Asp Gin Asp Ala Thr Thr Glu Ser Gly Asp Lys
510 515 520
CCA AAA GAA AAC CTC GAA GAG GAA GAA CAG GAA GCG CAG 1599
Pro Lys Glu Asn Leu Glu Glu Glu Glu Gin Glu Ala Gin
525 530
AAT GAG GAA GGA AAG GAA AAA GAA GGC AAT AAA GAT AAA 1638
Asn Glu Glu Gly Lys Glu Lys Glu Gly Asn Lys Asp Lys
535 540 545
GAT GGC GAT GAT GAT AAC GAC AAT GAT GAC GAC GAT GAA 1677
Asp Gly Asp Asp Asp Asn Asp Asn Asp Asp Asp Asp Glu
550 555
. 1716
GAC GAT CAC Asp Asp His 560 AAC Asn TCC GAG GGC GAC GAC GAT GAT GAC GAT
Ser Glu 565 Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp 570
GAC GAT GAT GAA GAC GAT AAT AAT GAA AAA CAA AGT AAT
Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asn Asn Glu Lys Gin Ser Asn
575 580 585
CAA GGC CTC GAC TAC GTC GTA AGG CCG TTT CTG ACA GAG
Gin Gly Leu Asp Tyr Vai Vai Arg Pro Phe Leu Thr Glu
590 595
1755
1794
TAA
1797
SEQ ID NQ3
Tipo de sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo Comprimento da sequências 132 pares de bses Tipo de cadeias dupla
Topologias linear
Fonte experimental imediatas S. cerevisiae HT24ó/pJDB207/BAF'FLHIR-CALC
Característicass desde 1 até 7 sequência adaptadora incluindo o sítio de restrição PstI e a região codificadorada sequência de ligação clivâvel por yscF e ysc«$, desde 8 até 127 região codificadora do precursor da calcitonina humanacora glicina C-terminal, desde 125 a 132 sequência incluindo o sítio de restrição PstI
G AAG AGG GTA CAG CTG GAT AAA AGA TGT GGT AAC TTG TCT Lys Arg Vai Gin Leu Asp Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser
10
ACC TGT ATG TTG GGT ACC TAC ACC CAA GAC TTC AAC AAG
Thr Cys Met Leu Gly Thr Thr Thr Gin Asp Phe Asn Lys
15 20 25
TTG CAC ACC TTC CCA CAA ACC GCT ATC GGT GTT GGT GCT
Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala Ile Gly Vai Gly Ala
30 35
CCA GGT TGA CTGCA
Pro Gly
40
118
132
O
SEQ ID NS4
Tipo de Sequências Polipeptídeo
Comprimento da sequências 212 aminoácidos
Topologias Linear
Fonte experimental imediatas S»_cerevisiae ABIl©/pDP34BAPDH eglincex-í ;
Característicass uesde í até 7i sequência de aminoácidos d eglina C, desde 72 até 79 sequência adaptadora, desde até 21 sequência de aminoácidos do domínio de ligação à celulose d proteína C„ fimi Exg.
Met Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu Lys Ser Phe Pro Glu
5 10
Vai Vai Gly Lys Thr Vai Asp Gin Ala Arg Glu Tyr Phe
15 20 25
Thr Leu His Tyr Pro Gin Tyr Asp Vai Tyr Phe Leu Pro
30 35
Glu Gly Ser Pro Vai Thr Leu Asp Leu Arg Tyr Asn Arg
40 45 50
Vai Arg Vai Phe Tyr Asn Pro Gly Thr Asn Vai Vai Asn
55 60 65
His Vai Pro His Vai Gly Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp
70 75
Vai Pro Phe Gly Ala Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
80 85 90
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
95 100
Ser Gly Pro Ala Gly Cys Gin Vai Leu Trp Gly Vai Asn
105
110
115
Gin Trp Asn 120 Thr Gly Phe Thr Ala 125 Asn Vai Thr Vai Lys 130
Asn Thr Ser Ser Ala 135 Pro Vai Asp Gly Trp 140 Thr Leu Thr
o· Phe Ser 145 Phe Pro Ser Gly Gin 150 Gin Vai Thr Gin Ala 155 Trp
Ser Ser Thr Vai 160 Thr Gin Ser Gly Ser 165 Ala Vai Thr Vai
Arg Asn 170 Ala Pro Trp Asn 175 Gly Ser Ile Pro Ala 180 Gly Gly
Thr Ala Gin 185 Phe Gly Phe Asn Gly 190 Ser His Thr Gly Thr 195
Asn Ala Ala Pro Thr Ala Phe Ser Leu Asn Gly Thr Pro
200 205
Ο
Cys Thr Vai Gly 210 <·

Claims (14)

  1. íê. - Método para a produção ds uma proteína biologicamente activa, caracterizado por compreender o tratamento de uma proteina de fusão consistindo em
    1. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo na referida o aminoácido C-terminal sequência ρο1i peρtíd ica proteína b do qua1 ligante «□logicamente activa, está ligado a uma L, os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais e, no caso de múltiplos segmentos sucessivos de proteína, os penúltimo e último resíduos de aminoácidos e também C—terminais da referida sequência de polipeptídeo ligante L sendo aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e
    Arg e um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos sucessivos ds proteína, ou consistindo em um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de
  2. 2» múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo numa sequência de polipeptídeo ligante L, os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N—terminais assim como os penúltimo e últimpo resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica ligante L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg a o último aminoácido básico da referida sequência polipeptídica ligante L estando ligado à referida proteína biologicamente activa, com a endoprotease solúvel de levedura yscF e com a carboxipeptidase solúvel de levedura yscu, e isolamento da referida proteína ! biologicamente activa,
    2â. - Método de acordo com a reivindicação i, caracterizado por a proteína de fusão ter a fórmula
    CP-L) -T m
    T-íL-P) (I) ou (II) , em que P é a proteína biologicamente activa, L tem o significado dado na reivindicação í, T é um polipeptídeo etiqueta, m é um inteiro entre 1 e 1© e n é um inteiro entre 2 s 1©.
  3. 3ã. - Método de acordo com a reivindicação í, caracterizado por a proteína de fusão ter a fórmula
    CP-L) -Τ (I)
    ÍH em que P, L e s têm os significados dados atrás e m é í
  4. 4sl» - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína biologicamente activa ser ds origem procariética ou eucariótica.
  5. 5â. - Método da acordo com rizado por a proteína biologicamente a reivindicação 1, caracteactiva ser de origem mamífera.
    í, usracttÍ” hormona, um ti-virais e de c oa q u1a— regulador do
  6. 6â. - Método de acordo com a reivindicação rizado por a proteína biologicamente activa ser uma polipeptídeo com propriedades imunomoduladoras, an anti-tumorais, um anticorpo, antigénio virai, factor ção do sangue, uma agente fibrinolítico ou um factor c rescimen to»
  7. 7é. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractérizado por a proteína biologicamente activa ser seleccionada do grupo constituido por interferão g humano, um interferão híbrida, um activador do plasminogénio tipo tecido humano, activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humana, u.m activador do plasminogénio híbrido, humano β, calcitonina humana, factor de crescimento transformante factor de crescimento I e II tipo insulina e dessulfato-hirudina.
  8. 8â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência polipeptídica ligante L compreender 2 a 20 resíduos de aminoácidos e conter um ou mais pares ds aminoácidos básicos, desde que os primeiro e segundo aminoácidos N—terminais assim como os penúltimo e último aminoácidos C-tsrminais representem um par de aminoácidos básicos» rizado dipept
  9. 9â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractepor a sequência polipeptídica ligante L ser um radical dilo seleccionada entre Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e
    Arg—Lis»
  10. 10ê« — Método de acordo com a reivindicação í« caracte— rizado por o polipetídeo etiqueta T consistir em cerca de 10 a 1000 resíduos de aminoácidos» llã rizado por m ser r usi inteiro entre 1 e
    12ã.
    Método ds acordo com a reivindicação t-HF* HC IS*“ rizado por n ser um inteiro entre
  11. 13®. - Método de acordo com a reivindicação i5 caracterizado por yscF solúvel ser uma muteína da endoprotes.se de levedura yscF em que o sítio hidrofóbica de ligação à membrana foi eliminado.
  12. 14â» rizado por ysca
    Método de acordo com a reivindicação 1, caractesolúvel ser uma muteína da carboxipeptidase de levedura ysca em que o sítio hidrofóbico de ligação ã membrana foi eliminado»
  13. 15®. - Método ds acordo com a reivindicação í , caracterizado por ser realizado numa solução tamponada a pH entre cerca de e cerca de 7,5 numa gama de temperatura entre cerca ds 25 °C e cerca de 37°C«
  14. 16®. - Método de acordo com a reivindicação í. rizado por a digestão com yscF solúvel ser realizada na tíe iSes ΟβΛ ‘ .
    caractepresença caractsÍ7â» - Método de acordo com a reivindicação rizado por a proteína de fusão ser tratada com uma mistura ds digestão contendo yscF solúvel e yscct solúvel»
    Ζ
    -¾^ « rizado por so1ú ve1 e, .,’·’
    Λ* - 'ΤΌΤ *iS
    HVÇSV. <
    Í8â. - Método de acordo com a reivindicação í, caracte a proteína de fusão ser primeiro tratada com ysc quando a digestão está adiantada ou está completa então com ysc« solúvel.
    Lisboa, ló de Julho de 1991
    J. PEREIRA DA CRUZ
    Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3“ 1200 LISBOA
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