JPH07316197A - 成長ホルモン放出因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ハイブリドポリペプチド中間体を介して成長
ホルモン放出因子を製造する方法の提供。 【構成】 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）のＮ−末端
にトリプトファン（Ｔｒｐ）を介してＴｒｐＥペプチド
のＣ−末端が結合しているハイブリドポリペプチドのＣ
ｙｓ残基を還元しそしてカルボキシアミドメチル化し、
そして次に、ＴｒｐＥのアミノ酸配列及びＧＲＦのアミ
ノ酸配列を連結しているＴｒｐ残基を開裂せしめること
を含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野及び従来の技術】成長ホルモン放出
因子（ＧＲＦ）と称される一群の物質が最近先端肥大症
患者のすい臓腫瘍から単離されている。Ｇｕｉｌｌｅｍ
ｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１８，５８５，１９８２；
及びＥｓｃｈ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１
８０６，１９８３。

【０００２】幾つかの形のＧＲＦが精製され、そしてそ
れらのアミノ酸配列が決定された。ＧＲＦ−４４はＧＲ
Ｆ−４０の完全なアミノ酸配列を含有し、そしてそのカ
ルボキシ末端において４個のアミノ酸により延長されて
いる。今度はＧＲＦ−４０はＧＲＦ−３７の完全なアミ
ノ酸配列を含有し、そしてそのカルボキシル末端におい
て３個のアミノ酸により延長されている。ペプチドＧＲ
Ｆ２９（Ｊ．Ｒｉｖｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３００，２
７６−８，１９８２）もまた生物学的に活性であること
が示されている。

【０００３】ＧＲＦ−４４のカルボキシ末端（Ｌｅｕ）
のみがアミド化されている（ＧＲＦ−ＮＨ₂ −４４）。
ＧＲＦ−ＮＨ₂ −４４が成熟ホルモンであり、そしてＧ
ＲＦ−４０，ＧＲＦ−３７及びＧＲＦ−２９はその蛋白
質分解誘導体であると信じられている。但し、上記のす
べてのＧＲＦは生物学的に活性である。ＧＲＦ類は脳下
垂体による成長ホルモンの合成及び放出の両者に対して
作用すると報告されている。Ｓｃｉ．，７９，７９０
９，１９８２；及びＢａｒｉｎｇａ等、Ｎａｔｕｒｅ，
３０６，８４，１９８３。

【０００４】視床下部から単離されたＧＲＦ−４４ペプ
チド（ｈｈＧＲＦ）はすい臓腫瘍に由来するそれ（ｈｐ
ＧＲＦ）と同一であることが示唆されており、そして事
実、ｈｈＧＲＦと、ｈｐＧＲＦに対する抗体との間に免
疫反応性が検出された。さらに、両ペプチドは、ＨＰＬ
Ｃにより分析された場合同一のプロフィールをもたらす
（Ｂｏｈｌｅｍ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１４，９３０，１９８
３）。さらに最近になって、ｈｐＧＲＦ及びｈｈＧＲＦ
が同じアミノ酸配列を有することが証明された（Ｌｉｎ
ｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８
１，４３０２，１９８４）。

【０００５】ｈｐＧＲＦを生産するすい臓腫瘍から単離
されたメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なＤＮＡの
合成及び特徴付けにより、ＧＲＦ−４４は１０７〜１０
８個のアミノ酸を有するプレ−プロホルモンとして生産
され、そしてＧＲＦはアミノ酸残基３２からアミノ酸残
基７５にわたることが証明された（Ｇｕｂｌｅｒ等、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，４３１
１，１９８３；及びＭａｙｏ等、Ｎａｔｕｒｅ，３０
６，８６，１９８３）。

【０００６】ＧＲＦ−４４配列に続くＧｌｙ−Ａｒｇは
典型的なアミド化部位に類似する（Ｂｏｅｌ等、Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊ．，３，９０９，１９８４；Ｂｒａｄｂ
ｕｒｙ等、Ｎａｔｕｒｅ，２９８，６８６，１９８
２）。ＧＲＦは、成長ホルモンによる治療について現在
考えられているほとんどの分野において医療的に使用す
ることができる。このような医療的用途の例には脳下垂
体性小人症、異状な成長ホルモン生産による糖尿病、創
傷、重症の熱傷の治療が含まれる。

【０００７】幾つかの形態のＧＲＦの大きさは、常用の
ペプチド合成法によってその製造が可能なものである。
確かに、幾つかのＧＲＦ誘導体がこれらの手段によって
製造され、そして生物学的に活性であることが見出され
た（Ｍｕｒｐｈｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２，４６９，１９８
３；Ｔｈｏｒｎｅｒ等、Ｌａｎｃｅｔ，１月１／８，２
４，１９８３；Ａｄａｍｓ等、Ｌａｎｃｅｔ，５月１４
１１００，１９８３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ等、Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．，５７，６７７，１９
８３）。さらに端末アミノ酸にアミド化されたカルボキ
シを有するペプチドを合成することが可能である。しか
しながら、化学的手段によるＧＲＦ−４４の製造は非常
に高価であり、そして組換ＤＮＡ技法によるペプチドの
製造が一層便利であると考えられる。

【０００８】ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．・０１０８
３８７は、メチオニンのコドンにより先行される種々の
形態のＧＲＦをコードする合成ＤＮＡ分子の製造を記載
しており、このメチオニンのコドンは、該ＤＮＡ分子が
適当なベクターに挿入された後の適当な微生物によるメ
チオニン化ＧＲＦの直接合成を可能にする。適当な配列
で連結された場合にＧＲＦペプチドのそれぞれアミノ端
及びカルボキシ端をコードする２つの２本鎖ＤＮＡ分子
をもたらす２系列のオリゴデオキシリボヌクレオチド断
片の製造方法が記載されている。

【０００９】２個の２本鎖ＤＮＡ分子が一緒に連結され
て目的とするＧＲＦ構造遺伝子が得られる。好ましい発
現ベクターは、バクテリオファージλＤＮＡから単離さ
れそしてｔｅｔ^R 遺伝子及びａｍｐ^R 遺伝子の間に挿入
されたＰ_L プロモーターを含有するプラスミドｐＢＲ３
２２の誘導体である。ＧＲＦ分子のＮ末端における追加
のアミノ酸メチオニンの存在が、特に長い治療期間にお
ける不所望の免疫反応の可能性を生じさせる。

【００１０】

【発明の目的】この発明は、組換ＤＮＡ技法により得ら
れるハイブリドポリペプチドによるＧＲＦの製造、及び
そのために使用される材料に関する。このハイブリドポ
リペプチドは、アミノ酸Ｔｒｐを介してＧＲＦのアミノ
酸配列に連結されたＴｒｐＥのアミノ酸１−３２３を含
む。還元及びカルボキシアミドメチル化、Ｔｒｐ残基の
特異的開裂、並びにこれに続くゲル濾過及びＨＰＬＣに
よるＧＲＦの精製により非アミド化ＧＲＦが得られる。

【００１１】従って、この発明は、Ｅ．コリＴｒｐプロ
モーター／オペレーター、Ｔｒｐリーダー及びアテヌエ
ーター、ＴｒｐＥ遺伝子のリボゾーム結合部位、Ｔｒｐ
Ｅポリペプチドの最初の３分の２をコードするＤＮＡ、
Ｔｒｐコドン、並びにＧＲＦペプチドをコードする遺伝
子の使用に基いて、プラスミドによりコードされたハイ
ブリドポリペプチドとしてＧＲＦを製造するための方法
を提供することを目的とする。

【００１２】この発明の他の目的は、ＤＮＡ分子の合成
を提供することであり、このＤＮＡ分子は、ＧＲＦのコ
ード配列、並びにこれに先行するＴｒｐのためのＴＧＧ
コドン、及び正しいリーディングフレームを維持しなが
らＴｒｐＥ構造遺伝子を担持するプラスミド内に前記の
ＤＮＡ分子を挿入することを可能にするヌクレオチド配
列を含む。

【００１３】この発明の他の目的は、高品質のハイブリ
ドＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの合成を行うためにこ
の発明のプラスミドを含有する微生物を増殖せしめる方
法を提供することである。この発明の他の目的は、ハイ
ブリドポリペプチドの抽出のため及び一連の段階を通し
て目的とするＧＲＦペプチドを分離するための方法を提
供することである。

【００１４】この発明のこれらの及びその他の目的は、
以下の詳細な記載から明らかになるであろう。ＧＲＦ−
４４のＤＮＡ分子上には幾つかの制限酵素部位が存在す
るため、この発明の他の面を構成する他の３種類の分
子、すなわちＧＲＦ−４０，ＧＲＦ−３７、及びＧＲＦ
−２９ペプチドをコードするＤＮＡ分子を導くことがで
きる。

【００１５】事実、ＤＮＡ分子をＮａｒＩ制限酵素で分
解し、そして次のオリゴヌクレオチド：

【００１６】

【化１】

【００１７】により３′−末端断片を置き換えてＧＲＦ
−４０をコードするＤＮＡを生じさせることができる。
ＧＲＦ−３７をコードするＤＮＡ分子は次のようにして
得ることができる。 ａ）図１に示すＤＮＡをＢｓｔＸＩ制限酵素で分解し
て、次の３′−末端：

【００１８】

【化２】

【００１９】を生じさせ； ｂ）単鎖テイルをＳ１エキソヌクレアーゼにより除去
し；そして、 ｃ）次のオリゴヌクレオチド：

【００２０】

【化３】

【００２１】を３′−末端に付加して３７番目のコドン
を再生する。図１に示すＤＮＡ分子をＸｂａＩ制限酵素
で分解し、そして３′−末端を次のオリゴヌクレオチ
ド：

【００２２】

【化４】

【００２３】で置き換えることにより、ＧＲＦ−２９を
コードするＤＮＡ分子が得られる。プラスミドｐＳＰ１
９の造成、及びプラスミド由来ＴｒｐＥ−ＧＲＦ−４４
ハイブリドポリペプチドの製造は、次のようにして達成
される。

【００２４】（１）プラスミドｐＳＰ２の造成 ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２，９５−１１３，１９７７）及びλＥＤ１０ｆ（Ａｒ
ｍｓｔｒｏｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，１７２，
１９７７；及びＨｅｌｉｎｓｋｉ等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｔｅｎｔｈ Ｍｉｌｅｓ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９７７，１５１−１６５）
から出発してｐＳＰ２を造成した。λＥＤ１０ｆは、プ
ロモーターからＴｒｐＤ構造遺伝子に延びるＥ．コリＴ
ｒｐオペロンＤＮＡ源として使用した。

【００２５】ｐＢＲ３２２及びλＥＤ１０ｆをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIII 制限酵素により消化した。Ｔｒｐオ
ペロン制限機能部、完全ＴｒｐＥ構造遺伝子及びＴｒｐ
Ｄ構造遺伝子の５′−端を担持するλＥＤ１０ｆからの
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼにより、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ大
断片と連結した。この連結混合物を用いてＥ．コリＷ３
１１０ΔＴｒｐ Ｅ５／ｔｎａ２細胞（Ｎｉｃｈｏｌｓ
及びＹａｎｏｇｓｋｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１０１，１５５，１９８３）を形質転換し
た。

【００２６】形質転換処理された細胞をトリプトファン
を欠く最少培地プレート上にプレートした。１つのＴｒ
ｐ⁺ クローンをｐＳＰ２組換体ＤＮＡプラスミド源とし
て使用した。このクローンの細胞を、５０μｇ／mlのア
ンピシリン（Ａｐ）を添加した富培地中で増殖せしめ、
そして貯蔵した。ｐＳＰ２の制限地図を図２に示す。こ
こで、太い線で示されるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片
はＥ．コリＴｒｐ機能部を担持し、そしてλＥＤ１０ｆ
に由来するものであり、他方、他のＤＮＡはｐＢＲ３２
２に由来する。

【００２７】（２）プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌの造成 プラスミドｐＳＰ２のＤＮＡをＢｇｌIIエンドヌクレア
ーゼにより消化し、そして大断片をアガロースゲル電気
泳動により精製し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより
自己連結した。この連結混合物を用いてＷ３１１０ΔＴ
ｒｐ Ｅ５／ｔｎａ２細胞を形質転換した。Ａｐ^R 形質
転換体を５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するニュト
リエント・アガー（ディフコ）上で選択した。１個のＡ
ｐ^R クローンをｐＳＰ２ｄｅｌのＤＮＡの入手源として
使用した。この制限地図を図３に示す（詳しくは図２の
説明を参照のこと）。

【００２８】ＴｒｐＥ構造遺伝子からのＢｇｌII断片の
除去が、酵素活性を喪失した部分的ＴｒｐＥポリペプチ
ドの発現をもたらす。従って、ｐＳＰ２ｄｅｌを担持す
るＷ３１１０ΔＴｒｐＥ５ ｔｎａ２細胞はトリプトフ
ァンの存在下で増殖せしめなければならない。ｐＳＰ２
ｄｅｌ中のＢｇｌII部位の連結が蛋白質合成の新しい終
止コドンを形成する（Ｎｉｃｈｏｌｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｏｉｌ．１４６，４５−５４，１９８１）。

【００２９】こうして、ｐＳＰ２ｄｅｌ由来部分Ｔｒｐ
Ｅ（ΔＴｒｐＥ）は３４２個のアミノ酸を含有し、これ
に対してプラスミドｐＳＰ２によりコードされる全蛋白
質は５２０個のアミノ酸を含有する（図３を参照のこ
と）。

【００３０】（３）Ｔｒｐ−ＧＲＦ−４４遺伝子のクロ
ーニング ｐＳＰ２ｄｅｌをＢｇｌII及びＢａｍＨＩ制限酵素で分
解し、そして大断片をアガロースゲル電気泳動により精
製した。このＤＮＡを合成Ｔｒｐ−ＧＲＦ−４４コード
ＤＮＡ分子（図１を参照のこと）と混合し、そしてＴ４
ＤＮＡリガーゼと反応せしめた。

【００３１】図４は、プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌ中に合
成遺伝子を挿入することによるｐＳＰ１９プラスミドの
造成を示す。Ｔｃ^S はテトラサイクリンに対する感受性
を示す。連結混合物を使用してＷ３１１０ΔＴｒｐＥ／
ｔｎａ２細胞を形質転換し、そして５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含有するプレート上でＡｐ^R クローンを選択
する。テトラサイクリンに対して感受性（Ｔｃ^S ）であ
る１つのＡｐ^R クローンをｐＳＰ１６ ＤＮＡ源として
使用した。

【００３２】Ｔｒｐ ＧＲＦ ４４遺伝子のヌクレオチ
ド配列は、部分的ＴｒｐＥとＧＲＦ４４がトリプトファ
ン残基により分離されているハイブリドポリペプチドの
合成を可能にする。Ｔｒｐは、後で記載するようにヨー
ドソ安息香酸により分解され得る。ｐＳＰ１９プラスミ
ドＤＮＡによりコードされるハイブリドＤＮＡは図５に
示すアミノ酸配列を有し、そしてＴｒｐＥ−ＧＲＦとし
て示される。最初の３２３アミノ酸はＴｒｐＥの３分の
２を示し、これにＴｒｐ残基及びＧＲＦ ４４のアミノ
酸配列が続く。従ってＴｒｐＥ−ＧＲＦは３６８個のア
ミノ酸から成る。

【００３３】ＴｒｐＥ−ＧＲＦ−４４ハイブリド蛋白質
の製造 Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５ｔｎａ２（ｐＳＰ１９）株 、
３００mlのＳＭＭ（スピッツアー最少培地）中で一夜増
殖せしめた。この培地は１ｌ当り次の成分： (ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ６ｇ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １４ｇ Ｎａ．シトレート．２Ｈ₂ Ｏ １ｇ ＭｇＳＯ₄ ０．２ｇ を含有する水溶液である。オートクレーブにより殺菌し
た後、１０mlの４０％グルコース、及び３．５μｇ／ml
のインドールを加える。

【００３４】培養物（約４．３×１０⁸ 細胞／ml）を１
０ｌの同じ培地中に希釈し、そして細胞を攪拌、及び１
分間当り１気圧の空気１ｌの吹込のもとで増殖せしめ
た。１０ｌの発酵槽中の培地の組成及び増殖条件は、Ｔ
ｒｐオペレーターを担持するｐＳＰ１９を抑制解除状態
に維持し（従って、ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの発
現を可能にし）そしてさらに細胞の増殖を可能にするの
に理想的であることが証明された。２２〜２５時間の増
殖の後、培養物は５９０nmにおける約３．０の０Ｄに達
した。遠心分離により集菌し、そして−８０℃にて貯蔵
した。この細胞のサンプルを使用したポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により蛋白質の分析を行い、目的とする
ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの存在が証明された。

【００３５】ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの精製 凍結した細胞を、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
６），０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ ＣＨ₃ ＣＯＯ
Ｍｇ，０．０１Ｍ β−メルカプトエタノール及び５％
グリセリンを含む緩衝液中で解凍した。アルミナの存在
下で細胞を破砕し、そして細胞破片を遠心除去した。水
相を水で４倍に希釈し、そして最終溶液１ｌ当り１４４
ｇの (ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ を添加することによりハイブリド
蛋白質を沈澱せしめた。沈澱した蛋白質を遠心分離によ
りペレット化し、水に溶解し、そして１０mM ＮＨ₄ Ｈ
ＣＯ₃ に対して十分に透析した。次に透析物をＰＡＧＥ
で分析し、そして凍結乾燥した。

【００３６】ＴｒｐＥ−ＧＲＦハイブリドポリペプチド
からのＧＲＦ−４４の分離 ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを下記の一連の化学反応
にかけＧＲＦペプチド成分を分離した。（１）Ｃｙｓ残基の還元及びカルボキシアミドメチル化 還元及びカルボキシアミドメチル化の条件はＧ．Ａｌｌ
ｅｎの報告、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｌｃｈｉｎｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Vol ９，２８頁、
Ｔ．Ｓ．Ｗｏｒｋ及びＲ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，１９８１から採用した。

【００３７】あらかじめ調製しそして凍結乾燥したＴｒ
ｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，０．１％ ＥＤＴＡ及び６Ｍグアニジン−ＨＣｌ
（pH８．５）を含む緩衝液中に溶解した。最終蛋白質濃
度は２％であった。次に、ＤＴＴを蛋白質中のＣｙｓ含
量より１５倍高い濃度に加えた。次に、混合物を５０℃
にて２時間インキュベートし、そして次にヨードアセタ
ミドをＤＴＴ濃度の２倍加えた。暗中室温にて３０分間
インキュベートした後、β−メルカプトエタノールを添
加することにより反応を停止した。次に反応混合物を水
に対して２時間、そして１０mM ＮＨ₄ ＨＣＯ₃ に対し
て一夜透析した。次に、カルボキシアミドメチル化され
たＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを含有するこの材料を
凍結乾燥した。

【００３８】（２）ヨードソ安息香酸反応 使用した方法は、Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ等、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２０，６９９７，１９８１により記載さ
れたものと実質上同一である。５mgのヨードソ安息香酸
を３７５μｌの４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、８０％酢酸に
溶解した。この溶液に７．５μｌのｐ−クレゾール及び
次に５mgのカルボキシアミドメチル化ＴｒｐＥ−ＧＲＦ
を溶解した。室温にて暗中２０時間反応を行った。次に
７５０μｌの水を加え、そして１０分間の後、混合物を
１２，０００ｇにて５分間遠心分離した。水相はペプチ
ド、特にＧＲＦ−４４を含有する。

【００３９】（３）ＧＲＦ−４４の精製 前に得られた水溶液を、５％酢酸に対して平衡化した１
×５０cmセファデックスＧ−２５カラムを通してゲル濾
過することにより脱塩した。流速は約３ml／時であっ
た。排除された材料を回収し、そして蒸発によりその容
積を減少せしめた。こうして得られた濃縮液をＥｔ₃ Ｎ
によりpH３．５にした１０mM Ｈ₂ ＰＯ₄で平衡化した
Ｃ１８カラムを用いてＨＰＬＣにより分析した。

【００４０】ペプチドをアセトニトリルで溶出し、そし
て画分に集め、次にこの画分をＲＩＡにより分析した。
この結果は主ピーク中に免疫活性が存在することを示し
た。ＴｒｐＥ−ＧＲＦ ４０，ＴｒｐＥ−ＧＲＦ３７及
びＴｒｐＥ−ＧＲＦ２９ハイブリドポリペプチド並びに
対応するＧＲＦ ４０，ＧＲＦ ３７及びＧＲＦ ２９
ペプチドは、ＴｒｐＥ−ＧＲＦ ４４及びＧＲＦ ４４
の製造について上に記載したのと同様の方法により得る
ことができる。

【００４１】記載されたプラスミドを含有するＷ３１１
０ΔＴｒｐＥ５ｔｎａ２細胞はＡＴＣＣに寄託された。 Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ２） Ａ
ＴＣＣ ５３０５６ Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ２−ｄｅ
ｌ）ＡＴＣＣ ５３０５８ Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ１９）Ａ
ＴＣＣ ５３０５４。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＧＲＦ−４４をコードする遺伝子のヌク
レオチド配列を示す。このＤＮＡ分子は構成ブロックと
してジヌクレオチドを使用しそして固体支持体としてポ
リスチレンを用いる固相ホスホトリエステル法により化
学的に合成されたものである。ＢｇｌII，ＸｂａＩ，Ｂ
ｓｔＸＩ、及びＢａｍＨＩはこれらの制限エンドヌクレ
アーゼにより認識される部位を示す。Ｓｔｏｐは蛋白質
合成の終止のためのコドンを示す。この図はさらにＧＲ
Ｆ−４４の全アミノ酸配列を示す。

【図２】図２は、ｐＳＰ２プラスミドベクターの制限地
図であり、ここで細線はｐＢＲ３２２のＤＮＡを示し；
太線はＴｒｐプロモーター／オペレーター、Ｔｒｐリー
ダー配列（ＴｒｐＬ）、完全ＴｒｐＥ構造遺伝子及び部
分的ＴｒｐＤ構造遺伝子（ΔＴｒｐＤ）を担持するＥ．
コリ染色体ＤＮＡを示し；Ａｐ^R 及びＴｃ^R はそれぞれ
アンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性を付与
する遺伝子を示し；そして "Ｏｒｉ" はこのプラスミド
の複製開始点である。

【図３】図３は、プラスミドｐＳＰ２からのプラスミド
ｐＳＰ２ｄｅｌの造成を示すフローチャートであり、Δ
Ｅは不完全なＴｒｐＥ構造遺伝子を示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌからのプラ
スミドｐＳＰ１９の造成を示すフローチャートである。

【図５】図５は、ＴｒｐＥ部位の全アミノ酸配列及びＧ
ＲＦの最初の５個のアミノ酸を示すＴｒｐＥ−ＧＲＦハ
イブリドポリペプチドのアミノ酸配列の模式的構造を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/04 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ステファノ ビラ イタリア国，ローマ，ビア オスラビア 37 (72)発明者 シルビア ドニニ イタリア国，ローマ，エル．ゴ デクリ オルシ 22

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）のＮ−
   末端にトリプトファン（Ｔｒｐ）を介してＴｒｐＥペプ
   チドのＣ−末端が結合しているハイブリドポリペプチド
   のＣｙｓ残基を還元しそしてカルボキシアミドメチル化
   し、そして次に、ＴｒｐＥのアミノ酸配列及びＧＲＦの
   アミノ酸配列を連結しているＴｒｐ残基を開裂せしめる
   ことを含んで成るＧＲＦの製造方法。
2. 【請求項２】 前記還元及びカルボキシアミドメチル化
   をグアニジンに溶解した前記ハイブリドポリペプチドに
   対して行い、そして前記開裂をヨードソ安息香酸を用い
   て行う請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 生成物をゲル濾過にかけ、次にＨＰＬＣ
   によってＧＲＦを精製する請求項１又は２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 プラスミドｐＳＰ２。
5. 【請求項５】 プラスミドｐＳＰ２により形質転換され
   た微生物。
6. 【請求項６】 プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌ。
7. 【請求項７】 プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌにより形質転
   換された微生物。
8. 【請求項８】 λ−ＥＤ１０ｆのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
   III 断片とｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ大
   断片とを連結し、生ずる連結物をＢｇｌIIで消化しそし
   て大断片を連結し、連結された大断片をＢｇｌII及びＢ
   ａｍＨＩで消化し、そして生じた大断片をＧＲＦをコー
   ドする合成ＤＮＡと連結することを含んで成る方法。