CN112522244A - 一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用,本发明采用超滤器透析与用透析袋透析相比,透析效率显著提高,透析时间缩短为原来的1/5,透析外液用量减少至原来的1/20,透析后的rPA溶液澄清透明,盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底;超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20%。本发明对于规模化、工业化包涵体尤其是含二硫键较多的包涵体的复性纯化提供了一种简捷高效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及包涵体复性纯化技术领域,具体地,涉及一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用。
背景技术
重组人组织型纤溶酶激酶衍生物(rPA)适用于成人由于冠状动脉梗塞引起的进行心肌梗塞的溶栓疗法,能改善心肌梗塞后的心室功能。目前rPA因其具有溶栓作用强、起效迅速、维持时间长、再通率高、不良反应小、使用方便等特点已经成为第三代溶栓药物的代表之一。rPA是天然组织型纤溶酶原激酶(tPA)的缺失突变体,只保留了tPA丝氨酸蛋白酶区(与酶的活性有关)和Kringle2区(与纤维蛋白定向性质有关)。因不含糖基化位点,可以利用基因重组技术在大肠杆菌中表达生产。rPA含有18个半胱氨酸,有9对分子内二硫键,在大肠杆菌中表达时基本全部以包涵体形式存在。
由于外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时形成的包涵体具有不可溶、无生物活性的特点,将包涵体恢复为有活性的目的蛋白,必须对包涵体进行增溶、复性等操作。一般情况下,包涵体复性的活性回收率不高,仅为5%~20%,尤其在大规模工业化复性时复性率更低,从而导致许多蛋白药物成本升高。其中对包涵体增溶液的透析是复性前不可缺少而又影响复性回收率较大的因素。包涵体蛋白的增溶一般需要加入变性剂盐酸胍或尿素等,复性之前需要去除盐酸胍,常规做法是利用透析袋对增溶液透析,如专利CN102367264B提供了一种纯化包涵体蛋白质的方法,但是该方法溶液处理量少,透析时间长,工作量大,浪费物料,效率低,效果相对本发明所述方法较差;且在透析时,rPA蛋白在两种变性剂换相过程中会出现蛋白折叠而导致目的蛋白沉淀析出的现象。
因此,找到一种可有效去除盐酸胍,提升透析效率,减少rPA透析时的析出现象,从而提高rPA蛋白的回收率的方法,对于规模化、工业化rPA包涵体的复性纯化具有相当的必要性。
发明内容
本发明旨在提供一种利用超滤器进行重组人组织型纤溶酶激酶衍生物(rPA)包涵体增溶液高效透析换相的方法,与用透析袋透析相比,该方法透析效率显著提高,透析时间缩短为原来的1/5,透析外液用量减少至原来的1/20,透析后的rPA溶液澄清透明,盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底。超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20%。对于规模化、工业化制药生产蛋白质的透析,尤其针对二硫键较多的包涵体増溶透析,提供了一种简捷高效的方法。
本发明的首要目的是提供一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法。
本发明的另一目的是提供所述方法在对rPA包涵体的复性纯化中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
本发明提供了一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法,包含如下步骤:
S1.增溶液的配制:配制pH为7~9,包含5~7mol/L盐酸胍,45~55mmol/L Tris,0.8~1.2mmol/L EDTA·Na2的水溶液作为增溶液;
S2.增溶透析内液的制备:将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1~2kg:20~40L的比例混合;再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为35~45mmol/L,调整pH为7~9,混合均匀,再调整pH为2.5~3.5,即得到增溶透析内液;
S3.透析外液的配制:配制pH为2.5~3.5,包含7~10mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2的水溶液作为透析外液;
S4.超滤器透析:取增溶透析内液先浓缩至原体积的一半,加入等体积的透析外液混合后再次浓缩至原体积的一半,得到透析内液;然后使用超滤器浓缩透析内液,连续加入透析外液进行换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相时间为2~4小时。
本发明通过控制包涵体增溶液和透析外液的制备,以及采用超滤器透析,可显著降低rPA透析时的析出现象,显著提升rPA透析过程的澄清度,既可降低对超滤器造成堵塞,又可提升rPA的回收率。对于规模化、工业化包涵体尤其是含二硫键较多的包涵体的复性纯化提供了一种简捷高效的方法。
优选地,步骤S1所述增溶液的pH为8.6,盐酸胍为6mol/L,Tris为50mmol/L,EDTA·Na2为1mmol/L。
优选地,步骤S2中增溶透析内液的制备为:将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1.5kg:30L的比例混合;再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为40mmol/L,调整pH为8.6,混合均匀,再调整pH为3,即得到增溶透析内液。
优选地,步骤S2所述混合均匀为搅拌2h混匀。
优选地,步骤S3所述透析外液的pH为3。
优选地,步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8~10mol/L。
最优选地,步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8mol/L。
优选地,步骤S4所述超滤器为使用截留量为10kD的膜包进行透析换相,可有效截留rPA蛋白,盐酸胍、还原剂DTT等小分子透过膜后废弃。
优选地步骤S4所述透析换相时间为3.25~4小时。最优选为4小时。
本发明还请求保护上述方法在对rPA包涵体的复性纯化中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明使用超滤器进行包涵体增溶液换相的新型方法与用透析袋透析相比,该方法透析效率显著提高,透析时间缩短为原来的1/5,透析外液用量减少至原来的1/20,透析后的rPA溶液澄清透明,盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底。超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20%。对于规模化、工业化制药生产蛋白质的透析,尤其针对二硫键较多的包涵体増溶透析,提供了一种简捷高效的方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1溶液的配制
(1)增溶透析内液的制备:配制增溶液(6mol/L盐酸胍,50mmol/L Tris,1mmol/LEDTA·Na2,pH为8.6);取rPA包涵体加入到增溶液中,包涵体与增溶液按照1.5kg:30L的比例混合,再向其中加入二硫苏糖醇(DTT)至浓度为40mmol/L,用NaOH溶液微调pH为8.6,搅拌2h后,再用稀盐酸调pH为3.0,得到增溶透析内液,备用。
(2)配制透析外液:
透析外液1(4mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液2(5mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液3(6mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液4(7mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液5(8mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液6(9mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0);
透析外液7(10mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2,pH3.0)。
实施例2利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液1混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液1进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10ml,标记样品A1、A2、A3。
实施例3利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液2混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液2进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10ml,标记样品B1、B2、B3。
实施例4利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液3混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液3进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10ml,标记样品C1、C2、C3。
实施例5利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液4混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液4进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10ml,标记样品D1、D2、D3。
实施例6利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液5混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液5进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10ml,标记样品E1、E2、E3。
实施例7利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液6混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液6进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取增溶透析内液10ml,标记样品F1、F2、F3。
实施例8利用超滤器对重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液进行透析
取实施例1中增溶透析内液4L,使用截留量为10kD的膜包(2.5平方)进行超滤换相,先浓缩至2L,加入2L的透析外液7混合后再浓缩至2L,然后使用透析外液7进行透析换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相4h。透析换相过程2h25min、3h15min、4h分别取透析内液10mL,标记样品G1、G2、G3。
实施例9试验样品的外观检查和蛋白回收率检测对比试验
一、试验样品:实施例2~8中的取样样品,总计21个。
二、评价方法:
1.外观检查:按照中国药典方法分别进行外观检查(可见异物检测法)。
2.蛋白回收率检测:分别取1.5ml样品离心,离心后的上清液用Lowry法测蛋白浓度,每个样品测三次计算平均值,然后计算蛋白总回收率。
3.电导率检测:用于监测盐酸胍残留量,使用电导率仪监测21个样品的电导率。
三、试验结果见表1
表1 21个样品的外观、蛋白回收率、电导率的试验结果
由表1可以看出,当透析外液中的尿素浓度在7~10mol/L时,溶液澄清透明,无可见异物,蛋白的回收率达到99~100%,尤其是当透析外液中的尿素浓度为8~10mol/L时,蛋白的回收率高达100%。其中,样品E3为最优化产品。而当透析外液中的尿素浓度为4~6mol/L时,溶液不澄清透明,有析出物,且蛋白的回收率低于95%。
此外,透析换相过程2h25min、3h15min、4h,通过溶液电导率证实透析换相时间越长,即透析外液使用体积越大,透析效果越好,盐酸胍等小分子物质去除越充分。当透析换相时间为3h15min时,即透析外液体积为增溶透析内液体积2倍左右时,透析内液电导率为9.0~11.5ms/cm;当透析换相时间为4h,即透析外液体积为增溶透析内液体积2.5倍左右时,透析内液电导率为5.0~5.4ms/cm。因此,从透析效果比较,优选透析换相时间为4h。
对比例1
1、增溶透析内液和透析外液的制备
增溶透析内液的制备同实施例1;
透析外液的制备同实施例1中的透析外液5。
2、透析方法
透析袋透析:取实施例1中增溶透析内液4L,分装至8个截留量为14kD的透析袋中,每个透析袋平均分装500ml。透析过程分4次,每次透析要求:透析袋全部没入透析外液中,8个透析袋尽量均匀放置,透析外液底部缓慢搅拌。
第1次透析先放入40L透析外液5中透析2h,每30min取出透析袋上下反复倒置混匀;第2次透析取出8个透析袋再放入40L透析外液5中透析2h,每30min取出透析袋上下反复倒置混匀;第3次透析取出8个透析袋再放入40L透析外液5中透析2h,每30min取出透析袋上下反复倒置混匀;第4次透析取出8个透析袋再放入80L透析外液5中透析过夜约15h。透析2h、4h、6h、21h时,混匀包涵体増溶内液分别取10ml,标记样品a、b、c、d。
3、按照实施例9的方法对试验样品的外观检查和蛋白回收率检测。
试验样品a,b,c,d的外观检查和蛋白回收率检测对比实验结果见表2。
表2透析袋透析方法得到的4个样品的外观、蛋白回收率、电导率的试验结果
由表2可以看出,在透析袋透析过程中,透析内液的外观呈现从澄清→较澄清→不澄清→较澄清的变化,从蛋白回收率变化趋势也可证明这一现象,本对比例采用透析袋透析,使用透析外液5的总体积为200L,透析总时间为21h。和本发明采用超滤器透析相比较,超滤器的透析时间缩短为透析袋的1/5,透析外液用量减少至透析袋的1/20,同时超滤器透析内液最终的电导率相对更低,盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除效果更为彻底。使用透析袋透析最后有15%左右蛋白沉淀析出,需离心去除,,而使用超滤器透析,选用透析外液5、透析外液6、透析外液7,其最终增溶透析内液澄清,蛋白回收率为100%,在本步蛋白回收率即提升约20%。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法,其特征在于,包含如下步骤:
S1.增溶液的配制:配制pH为7~9,包含5~7mol/L盐酸胍,45~55mmol/L Tris,0.8~1.2mmol/L EDTA·Na2的水溶液作为增溶液;
S2.增溶透析内液的制备:将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1~2kg:20~40L的比例混合;再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为35~45mmol/L,调整pH为7~9,混合均匀,再调整pH为2.5~3.5,即得到增溶透析内液;
S3.透析外液的配制:配制pH为2.5~3.5,包含7~10mol/L尿素,1mmol/L EDTA·Na2的水溶液作为透析外液;
S4.超滤器透析:取增溶透析内液先浓缩至原体积的一半,加入等体积的透析外液混合后再次浓缩至原体积的一半,得到透析内液;然后使用超滤器浓缩透析内液,连续加入透析外液进行换相,保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h,透析换相时间为2~4小时。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S1所述增溶液的pH为8.6,盐酸胍为6mol/L,Tris为50mmol/L,EDTA·Na2为1mmol/L。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S2中增溶透析内液的制备为:将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1.5kg:30L的比例混合;再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为40mmol/L,调整pH为8.6,混合均匀,再调整pH为3,即得到增溶透析内液。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S3所述透析外液的pH为3。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8~10mol/L。
6.根据权利要求5所述方法,其特征在于,步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8mol/L。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S4所述超滤器为使用截留量为10kD的膜包进行透析换相。
8.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S4所述透析换相时间为3.25~4小时。
9.根据权利要求8所述方法,其特征在于,步骤S4所述透析换相时间为4小时。
10.权利要求1~9任一所述方法在对rPA包涵体的复性纯化中的应用。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113981045A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-28 | 广州达安基因股份有限公司 | 制备恒温扩增混合酶系的方法 |
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CN112522244B (zh) | 2022-07-22 |
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