CN1613869A

CN1613869A - 一种用于重组tPA衍生物的大规模包涵体复性纯化技术

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Publication number: CN1613869A
Application number: CN 200310108421
Authority: CN
Inventors: 张毅; 陆坚峰; 杨胜利; 褚仲梅; 刘成; 屈贤铭
Original assignee: ZHONGKE WUBAIHAO BIOENGINEERING CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: ZHONGKE WUBAIHAO BIOENGINEERING CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2023-11-05
Also published as: CN1260247C

Abstract

本发明提供了一种蛋白质复性方法，包括步骤：(a)将目标蛋白质的包涵体溶解，离心获得溶解有包涵体蛋白质的上清液；(b)用第一复性液稀释，其中第一复性液含氧化还原对；(c)放置一段时间；(d)用第二复性液稀释，第二复性液不含氧化还原对；(e)放置一段时间；(f)过滤、浓缩，获得第一浓缩滤液；(g)过滤，然后将滤液稀释于pH调节缓冲液中，调节pH至4.0－5.5；(h)过滤步骤(g)的稀释溶液，浓缩获得含有复性的目标蛋白的第二浓缩滤液。本发明复性方法成本低，用于大肠杆菌表达的重组tPA或其衍生物的低成本的重组蛋白质。

Description

一种用于重组tPA衍生物的大规模包涵体复性纯化技术

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地涉及对组织纤溶酶原激活剂的包涵体的复性纯化技术。

背景技术

大肠杆菌表达的组织纤溶酶原激活剂的包涵体变性及复性研究是蛋白质包涵体复性及纯化研究的难点问题。由于蛋白质分子中大量二硫键的存在，使得其复性及纯化工艺较为复杂，且成本较高。纯化工艺的成本直接导致了药品价位的居高不下。

对于大肠杆菌表达的以无活性的包涵体形式存在的重组蛋白质，常用的复性方法是首先用高浓度的盐酸胍或尿素将其变性溶解，之后通过变性剂的去除得到复性的重组蛋白质。

在蛋白质的复性过程中，同时存在两种反应：蛋白质的复性及无活性的聚合体的生成。为了获得较好的复性效果，复性过程常常需要在较低的蛋白质浓度条件下进行。这样蛋白质复性时的溶液体积一般较大。有研究表明，重组tPA的复性常常需要在20ug/ml左右的浓度以下方能达到较高的复性效果。

另外，多数重组蛋白质均含有二硫键，二硫键的正确配对对于重组蛋白质的复性至关重要。二硫键的正确配对有助于整个蛋白质分子的正确折叠，另一方面，蛋白质分子多肽链的部分折叠也有助于相应半胱氨酸残基间的结合与二硫键的正确配对。为了提高二硫键的正确配对，常常需要加入氧化还原对(如一定配比的氧化型及还原型谷胱甘肽)。

目前常用的复性工艺中，重组tPA的浓度需要稀释至较低浓度(如约10-100ug/ml)才能达到较好的复性结果，由于tPA或其衍生物分子中含有大量的二硫键(tPA含17对，tPA衍生物含9对)，在复性过程中需要添加氧化还原对以保证二硫键的正确配对。然而，由于氧化型及还原型谷胱甘肽价格很高(其中氧化型几十美金/克)，如果在复性反应的整个过程中均加入氧化还原试剂，将大大增加蛋白质复性及纯化过程的成本。

tPA是一种具有显著疗效和巨大应用潜力的重组药物，九十年代初开发成功的tPA衍生物也已投入市场。迄今为止，大多数基因工程药物已在我国仿制成功，作为具有巨大商业价值的tPA，至今始终未能仿制成功，一个十分重要的因素在于生产工艺技术研究的不足和缺乏。由于tPA或其衍生物使用剂量很大，同时蛋白质复性纯化工艺十分复杂，因此，大规模、低成本的制备工艺，是tPA或其衍生物形成产品无法回避的必要条件。如何能够降低纯化与生产成本，成为这一重组蛋白质能否投入应用的十分重要的课题。

因此，本领域迫切需要开发低成本的tPA衍生物的复性纯化技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种低成本的、使tPA衍生物等重组蛋白的复性的技术。

在本发明的第一方面，提供了一种蛋白质复性方法，包括步骤：

(a)将目标蛋白质的包涵体溶解，离心获得溶解有包涵体蛋白质的上清液；

(b)用第一复性液稀释上清液，形成目标蛋白质的浓度为100-1000微克/毫升的第一稀释溶液，其中，第一复性液含3-7M选自尿素或盐酸胍的变性剂和缓冲液，pH7.5-9.0，并且第一复性液中所含的氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽与目标蛋白质之比为4-10mmol谷胱甘肽：0.1-1mg目标蛋白，且还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为4-6∶0.8-1.2；

(c)在20-28℃下，放置第一稀释溶液16-24小时；

(d)用第二复性液稀释第一稀释溶液，形成目标蛋白质的浓度为10-100微克/毫升的第二稀释溶液，其中，第二复性液含0.1-2.5M尿素和缓冲液，pH7.5-9.0；

(e)在20-28℃下，放置第二稀释溶液16-24小时；

(f)过滤第二稀释溶液，将滤液体积超滤浓缩为原体积的1/8-1/40，获得第一浓缩滤液；

(g)过滤第一浓缩滤液，然后将滤液稀释于3-7倍体积的pH调节缓冲液中，所述的pH调节缓冲液含有10-100mM醋酸碱土金属盐或醋酸铵，pH4.0-5.5；

(h)过滤步骤(g)的稀释溶液，将溶液体积超滤浓缩为原体积的1/3-1/10，获得含有复性的目标蛋白的第二浓缩滤液。

在另一优选例中，第一复性液还含有0.5-1M精氨酸，第二复性液含有0.3-1M精氨酸。

在另一优选例中，第一复性液中氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽与目标蛋白质之比为4-6mmol谷胱甘肽：0.2-0.8mg目标蛋白。

在另一优选例中，第一复性液中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为4-6∶1。

在另一优选例中，步骤(f)中使用孔径为0.22-0.45um的滤膜或截留分子量为10Kd超滤膜；步骤(g)中使用的孔径为0.22-0.45um的滤膜；且步骤(h)中使用截留分子量为10Kd的超滤膜。

在另一优选例中，该方法还包括步骤(i)：对第二浓缩液进行离子交换柱层析纯化，从而获得纯化的目标蛋白。较佳地，所述的离子交换柱层析的条件是用洗脱溶液进行两次洗脱，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵，pH4.5-6.0的洗脱溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵，pH5.5-7.0的洗脱溶液进行洗脱。

在另一优选例中，第一复性液的pH为8.0-9.0，所述变性剂的浓度为3-5M。

在另一优选例中，步骤(g)中pH调节缓冲液中所述的pH为4.0-5.5。

在另一优选例中，所述的目标蛋白选自下组：组织纤溶酶原激活剂、组织纤溶酶原激活剂衍生物、尿激酶、尿激酶原。

在本发明的第二方面，提供了一种对大肠杆菌表达的重组包涵体蛋白质进行分离的方法，它包括本发明上述的复性步骤和常规的纯化步骤。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，在复性过程中，可以采用分段稀释的方法，并且仅需第一次复性的条件中，即在tPA较高浓度(100-1000微克/升)以及较小溶液体积的情况下添加氧化还原对就可使保证二硫键的正确配对，并且使tPA蛋白质分子正确折叠，没有必要在更低浓度下添加氧化还原对，从而大幅缩减了氧化型及还原型谷胱甘肽使用量(减少90％)，在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“tPA”或“组织纤溶酶原激活剂”指一种具有溶解血栓作用的蛋白质分子，其蛋白质分子的氨基酸序列以及cDNA编码序列已知(见Pennica et al.，1983；Nature，301，214)。tPA蛋白质分子量为67kDa，由指形区、表皮生长因子区、两个三角区(K1及K2)以及蛋白酶活性区组成。

如本文所用，术语“tPA衍生物”或“组织纤溶酶原激活剂衍生物”指仅保留有tPA分子K2区及蛋白酶活性区的蛋白质分子。这在众多文献和专利申请中有详细的描述，例如美国专利5223256。

简而言之，在本发明中，首先用8M尿素或7M盐酸胍溶解重组蛋白质包涵体，之后利用梯度稀释的方法分步降低变性剂的浓度，以尽量减少蛋白质分子间的重新聚合。在初次稀释时，加入氧化还原对(如氧化型及还原型谷胱甘肽)，以促进变性蛋白二硫键的正确复性。而在二次稀释过程中则省去氧化还原对的加入。由于一定浓度的变性剂的存在，第一次稀释时可以在较高蛋白质浓度与较小体积的条件下进行。在本发明中，包涵体溶解液与第一次稀释、第二次稀释的体积比约为1∶8-10∶60-100。因此，本发明的复性纯化工艺大大降低了试剂的消耗，降低了成本，同时对于tPA衍生物重组蛋白质的复性也取得了很好的复性效果。

具体而言，本发明的复性方法通常包括以下步骤：

(a)将目标蛋白质的包涵体溶解，离心获得溶解有包涵体的上清液。

该步骤与本领域的常规方法相同，因此可以采用本领域常规方法的反应条件。

(b)第一次稀释。

在该步骤中，用第一复性液稀释上清液，形成目标蛋白质的浓度为100-1000微克/毫升的第一稀释溶液，其中，第一复性液含3-7M尿素和缓冲液，pH7.5-9.0，并且第一复性液中所含的氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽与目标蛋白质之比为4-10mmol谷胱甘肽：0.1-1mg目标蛋白，且还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为4-6∶0.8-1.2。

(c)第一阶段复性

通常在室温(20-28℃)下，缓慢搅拌第一稀释溶液16-20小时。该步骤的条件与本领域现有方法基本相同。

(d)第二次稀释

在一优选例中，用第二复性液稀释第一稀释溶液，形成目标蛋白质的浓度为10-100微克/毫升的第二稀释溶液，其中，第二复性液含0.1-2.5M尿素和缓冲液，pH7.5-9.0，但不必含有氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽。

(e)第二阶段复性

通常室温(20-28℃)下，缓慢搅拌第二稀释溶液15-20小时。该步骤的条件与本领域现有方法基本相同。

(f)第一次浓缩

该步骤与本领域的常规方法相同，因此可以采用本领域常规方法的反应条件。通常，过滤第二稀释溶液，将滤液体积超滤浓缩为原体积的1/8-1/40，获得第一浓缩滤液。其中可用0.45/0.22um滤膜过滤，或选用截留分子量为10Kd超滤膜进行超滤浓缩。

(g)调节pH至酸性

在另一优选例中，可过滤第一浓缩滤液，然后将滤液稀释于3-5倍体积的pH调节缓冲液中，所述的pH调节缓冲液含有10-100mM醋酸碱土金属盐或醋酸铵，pH4.0-5.5。

较佳地，步骤(g)中使用0.45/0.22um的滤膜。

(h)第二次浓缩

该步骤与本领域的常规方法相同，因此可以采用本领域常规方法的反应条件。通常，过滤步骤(g)的稀释溶液，将溶液体积超滤浓缩为原体积的1/3-1/10，这样，就获得含有复性的目标蛋白的第二浓缩滤液。

较佳地，步骤(h)中使用截留分子量为10Kd的超滤膜。

该含有复性的目标蛋白的第二浓缩滤液即为本发明的蛋白质复性产物。当然，还可用本领域常规的纯化方法，对复性产物进行纯化。这可用本领域常见的试剂和反应条件进行纯化。一种优选的方法是离子柱层析方法。

本发明不仅可用于大肠杆菌表达的重组组织纤溶酶原激活剂、组织纤溶酶原激活剂衍生物，还适用于重组尿激酶、尿激酶原等。

以tPA为例，本领域现有的各种生产tPA或其衍生物的大肠杆菌工程菌(如ATCC 53227等)都可用于本发明。在众多文献和专利中公开了生产tPA或其衍生物的大肠杆菌，例如美国专利H2,055(申请人：ZymoGenetics，Inc.，申请号：Appl.No.：778203，申请日1985年9月20日)，美国专利6,027,888(申请人：BoardofRegents，The University of Texas System，申请号：834516，申请日：1997年4月4日)，美国专利5,106,741(申请人：The Upjohn Company，申请号：714365；申请日：1991年6月12日)。

本发明的主要优点在于：

(a)成本低，其中氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的用量下降了80-90％以上。整个复性工艺成本大幅度下降。

(b)复性效果好，与整个过程都使用氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的复性效果基本无差别。

(c)本发明的蛋白质复性的工艺的适用面很广，不仅可用于组织纤溶酶原激活剂、组织纤溶酶原激活剂衍生物，还适用于尿激酶、尿激酶原等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

组织纤溶酶原激活剂的包涵体的复性

取湿重10克的已纯化tPA包涵体，溶解于1000ml变性溶液中(8M尿素或7M盐酸胍，20mM DDT)，室温搅拌2-5小时后，15,000rpm离心50分钟。

将离心上清液稀释至8-12升复性液I中(3-7M尿素，0.5-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0，1-10mM还原型谷胱甘肽GSH，0.05-5mM氧化型谷胱甘肽GSSG)。室温搅拌过夜后，0.45μm滤膜过滤。

将滤液稀释到80-120立升复性液II中(0.1-2.5M尿素，0.3-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0)。在室温复性16-20小时。

过滤(滤膜规格0.22um)，滤液用10K-Millipore超滤膜超滤浓缩至3-10立升，获得第一浓缩液。

用0.45μm滤膜过滤第一浓缩液，滤液稀释到15-30立升pH调节缓冲液中(10-100mM醋酸铵pH4.0-5.5)。

0.22μm滤膜过滤，用10K-Millipore超滤膜超滤浓缩至3-10立升，获得含组织纤溶酶原激活剂的第二浓缩液。全部用于实施例2。

实施例2

组织纤溶酶原激活剂的包涵体的纯化

在本实施例中，用常规的离子柱层析方法对实施例1制备的含组织纤溶酶原激活剂的第二浓缩液进行纯化。

方法：

将实施例1获得的复性样品上Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow柱，上样后用洗脱溶液I(含有0-1M NaCl的50mM醋酸铵pH4.0-5.0)洗脱，之后再用洗脱溶液II(含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵pH4.5-6.0)及洗脱溶液III(含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵pH5.5-7.0)洗脱，得到纯化的重组tPA衍生物。

结果：

最终获得150-200mg左右比活为40,000-200,000IU/mg蛋白质的纯化重组tPA衍生物。复性工艺中谷胱甘肽的使用量下降了90％，成本下降了一半以上。目标蛋白质回收率5-10％左右，与常规方法相同。

实施例3-5

组织纤溶酶原激活剂的包涵体的复性

重复实施例1，不同点在于改变实施例1中部分复性条件，如表1所示。

表1 复性条件

		实施例1	实施例3	实施例4	实施例5
		实施例1	实施例3	实施例4	实施例5	第一复性液	谷胱甘肽浓度	6mM	1.5mM	12mM	15mM
还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽	5∶1	6∶1	5∶1	4∶1			谷胱甘肽浓度	6mM	1.5mM	12mM	15mM
还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽	5∶1	6∶1	5∶1	4∶1	变性剂浓度		3M尿素	5M尿素	5M盐酸胍	6M盐酸胍
精氨酸浓度	0.5M	0.5M	0.5M	1M	变性剂浓度		3M尿素	5M尿素	5M盐酸胍	6M盐酸胍
精氨酸浓度	0.5M	0.5M	0.5M	1M	PH		8.2-8.5	8.0	8.5	7.8
第二复性液	PH	8.2-8.5	8.5	8.0	PH		8.2-8.5	8.0	8.5	7.8	8.8
	PH	8.2-8.5	8.5	8.0	变性剂浓度	0.2M尿素	0.5M尿素	1M尿素	2.5M尿素		8.8
	精氨酸浓度	0.3M	0.3M	0.5M	变性剂浓度	0.2M尿素	0.5M尿素	1M尿素	2.5M尿素	1M

结果：

同样最终获得80-220mg左右比活为40,000-200,000IU/mg蛋白质的纯化重组tPA衍生物。复性工艺中谷胱甘肽的使用量下降了80-90％，成本下降了一半以上。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种蛋白质复性方法，其特征在于，包括步骤：

(b)用第一复性液稀释上清液，形成目标蛋白质的浓度为100-1000微克/毫升的第一稀释溶液，其中，第一复性液含3-7M选自尿素或盐酸胍的变性剂和缓冲液，pH7.5-9.0，并且第一复性液中所含的氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽与目标蛋白质之比为4-10mmol谷胱甘肽∶0.1-1mg目标蛋白，且还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为4-6∶0.8-1.2；

(c)在20-28℃下，放置第一稀释溶液16-24小时；

(e)在20-28℃下，放置第二稀释溶液16-24小时；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一复性液还含有0.5-1M精氨酸，第二复性液含有0.3-1M精氨酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一复性液中氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽与目标蛋白质之比为4-6mmol谷胱甘肽∶0.2-0.8mg目标蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一复性液中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为4-6∶1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)中使用孔径为0.22-0.45um的滤膜或截留分子量为10Kd超滤膜；步骤(g)中使用的孔径为0.22-0.45um的滤膜；且步骤(h)中使用截留分子量为10Kd的超滤膜。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(i)：对第二浓缩液进行离子交换柱层析纯化，从而获得纯化的目标蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的离子交换柱层析的条件是用洗脱溶液进行两次洗脱，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵，pH4.5-6.0的洗脱溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸铵，pH5.5-7.0的洗脱溶液进行洗脱。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一复性液的pH为8.0-9.0，所述变性剂的浓度为3-5M。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(g)中pH调节缓冲液中所述的pH为4.0-5.5。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标蛋白选自下组：组织纤溶酶原激活剂、组织纤溶酶原激活剂衍生物、尿激酶、尿激酶原。