PT91511B - Processo para producao de sequencias de dna codificadoras de um peptido-sinal, vectores de expressao transportando uma destas sequencias, bacterias gram-negativas transformadas por estes vectores, e processo para a producao periplasmica de um polipetideo - Google Patents
Processo para producao de sequencias de dna codificadoras de um peptido-sinal, vectores de expressao transportando uma destas sequencias, bacterias gram-negativas transformadas por estes vectores, e processo para a producao periplasmica de um polipetideo Download PDFInfo
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Description
presente invento diz respeito a um novo péptido-sina 1, às sequências de ADN que o codificam, os vectores de expressão transportando uma destas ultimas, as bactérias gram-negativas transformadas por estes assim como um processo de produção periplásmica de um polipeptido com auxilio destes últimos.
Saba-se que as bactérias gram-neg£ tivas produzem naturalmente os polipeptideos, sintetizados sob a forma de um precursor no citoplasma e exportados para o periplasma, espaço compreendido entre a membrana cito plásmica e a parede bacteriana, onçde eles se acumulam sob a forma de um polipeptido maduro, quer dizer de um polipeptido capaz de assegurar a sua acção biologica especifica .
Entre estes polipeptidos figuram particularmente os enzimas, tais como por exemplo a fosfatase a 1 ca 1ina.
Sabe-se igualmente que se podem utilizar as bactérias gram-negativas para se fazer produzir no seu periplasma um polipeptido que lhe seja estranho Uma tal produção periplásmica reveste um certo interesse porque a separação do referido polipeptido dos outros constituintes do periplasma é mais facil que a separação deste dos outros componentes do citoplasma, tal como é necessário no caso de uma produção com acumulação citoplag mica. Ela é igualmente interessante porque o polipeptído acumula-se sob a forma madura sem que haja adição de um metionina N-terminal que seria necessário em seguida elim£ nar e sem que haja adopção de uma conformação secundaria desfavorável.
Sabe-se que, para a sua produção, seja periplasmica, um polipeptido deve ser sintetizado sob a forma de um precursor correspondente ao polipeptido madu ro alongado na sua extremidade N-terminal de um peptido constituído geralmente por 15 a 30 ácidos aminados chamados peptido-sina 1. Este peptido-sinal , que desempenha um papel determinante na secreção do polipeptido, é clivado ao longo do processo libertando assim o polipeptido maduro no periplasma.
Tratndo-se de adaptar as bactéria â produção periplasmica de um polipéptido que lhe seja estranho e particulamente um polipeptido de origem eucario ta, os primeiros trabalhos consistiram em transformar as bactérias com auxilio de um vector de expressão transportando uma sequencia de ADN codificadora de um precursor natural do referido polipeptido. Esta estratégia em varias repetições verificou-se ser pouco adaptada em termo de quantidade para uma produção industrial.
Uma tentativa para trazer uma solução satisfatória consistindo em substituir o peptido-sinal natural ou o peptídeo por um polipeptido bacteriano sintetizado sob a forma de um precursor. 0 pedido de patente EP-A-0177343 apresenta os exemplos executados com tais péptidos-sinais.
A requerente, constatando que a es colha de um peptido-sinal bacteriano podei determinar para o precursor de um polipeptido heteróíogo (particularmente de origem eucariota) à medida da sua síntese na bactérias a tomada por esta de uma conformação secundaria importante concebeu um novo peptido-sinal que permite um bom rendi-5mento de produção periplásmica de polipepfidos heterólogos biologicamente activos.
invento diz então respeito a um novo peptido-sinal de formula:
MXKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA em que
A, C, F, G, K, Μ, N, P, S, T e W designam aminoácidos gundo o código seguinte: | |
A = Alanina | M = Metionina |
C = Cisteina | N = Asparagina |
F = Fen i1 a 1an i na | P = Prolina |
G = Glicina | S = Serina |
K = Lisina | T = Treonina |
L = Leucina | W = Triptofano |
e X representa uma ligaçao directa entre M e K, um ácido escolhido no conjunto dos 20 aminoácidos do codigo genetico ou um peptido comportando 2, 3 ou 4 aminoácidos escolhidos cada um independentemente um do outro no conjun to dos 20 aminoácidos do codigo genetico.
Um péptido-sina 1 particularmente aprecidado é aqule no qual X representa uma ligação direc' ta entre M e K, ou todo ou parte do peptido de sequencia APSG.
invento diz respeito, segundo um outro aspecto, as sequências de ADN codificadoras do peptido-sinal segundo o invento. Todas as sequências que permite a degenerescencia do codigo genético podem ser uti lizadas. Duas sequências particularmente apreciadas são as seguintes :
ATG-GCT-CCA-TCT-GGC-AAA-TCC-ACG-CTG
CTT-CTC-TTA-TTT-CTG-CTC-CTG-TGC-CTG
CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGC-GCT
3'
5' que codifica o péptido-sinal de formula (I):
MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA
5' ATG — AAA - TCC - ACG - CTG - CTT - CTC - TTA - TTT - CTG _ CTC - CTG - TGC - CTG - CCC - TCT - TGG — AAC - GCC- GGC GCT - 3' que codifica o peptido-sina 1 de formula (2)
MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA invento diz ainda respeito aos vectores deexpressão transportando uma sequencia de ADN codificadora de um precursor de um polipeptido caracterizado por a porção desta sequencia codificadora do peptido-sinal ser uma sequencia segundo o invento.
peptido-sina 1 segundo o invento as sequências de ADN codificadoras do mesmo e os vectores de expressão, transportando estas sequências encontra a sua aplicação na produção periplasmica de polipeptidos pelas baterias respondendo de modo negativo ao teste de colo ração de Gram (bactérias ditas gram-negativas ), transformadas por estes vectores.
invento diz igualmente respeito às bactérias gram-negativas transformadas pelos vectotes anteriormente definidos.
Entre estas aprecia-se aquela que pertence à especie Escherichia coli. De preferência estas ultimas transportando uma ou varias mutações se possível estáveis, por exemplo as mutações por delecção afectando o gene cya e/ou o gene crp.
invento diz respeito a um outro aspecto a um processo de produção periplasmica de um polipeptido consistindo em cultivar as células de bactérias gram-negativas anteriormente definidos, em submeter as células a um choque osmotico e em separar o polipeptido recombinente do sobrenadante do choque osmótico.
processo segundo o invento permite uma produção tão boa qegundo um modo irredutível, desde que a expressão de sequencia de ADN codante para o precursor seja colocada sobre o controle de um promotor indu tivel que segundo o/um modo constitutivo, em que a produção do polipeptido é continua desde a cultura da estirpe transformada.
processo segundo o invento é conveniente â produção de todas as especies de polipetidos heterologos em relação à estirpe posta em execução.
Ele está assim adaptada à produção de polipeptidos de origem eucariotas. Pode-se tratar de proteinas propriamente ditas, tais como particu 1armente a hormona de crescimento humana (hGH) ou os peptidos de tamenho mais pequeno, tais como particu 1armente uma forma natural ou uma variante, de hirudina, por exemplo a variante HV2 (Lys 47).
-90 presente invento vai agora ser descrito em mais detalhe com auxilio de três exemplos a seguir, nos quais será feita referência às cinco figuras anexadas.
A Figura 1 representa uma carta de restrição do plasmidio p163,1 . Os diferentes segmentos de restrição são marcados de modo arbitrário segundo a legenda a baixo:
Localização da origem de replicação (ORI)
Segmento de ADN proveniente do plasmídeo pBR322
Segmento de ADN contendo a sequencia codifg cadora de um precursor natural de hGH
Segmento de ADN do fago fd contendo um terminador de transcrição / // / / / ! // / / / Π - Segmento de ADN contendo um promotor-opera dor híbrido triptofaηo-1actose UV5
Esstasssaaga - Segmento de ADN codificadora da B-lactamase (ApR: resistência à ampicilina)
A Figura 2 representa a carta de restrição do plasmídeo p160,1 em que os fragmentos Pvul-Xhol-BamHI(1 ) e Pvul-ORI-bamHI (2) provêm respectivamente dos plasmideos p163,1 e pBR327 e em que o pequeno fragmento BamHI(2 )-BamHI(1 ) é o fragmento 3 descrito no exemplo 1 a seguir.
A Figura 3 representa uma carta de restrição comum aos plasmideos p380,1 e p373,2. Os diferentes segmentos de restrição são marcados de modo arbitrário segundo a legenda a seguir indicada;
Sequencia Pvul-BamHI(2 ) proveniente do plasmídeo pBR327 ·~Π / ’ Z ΓΓ
Sequencia Pvul-Xhol proveniente do plasraídeo p16 3 , 1
Sequencia Xhol-HincII proveniente do plasmídeo ρ16 3 . 1
Clal (Hinc ! [ )
Ndel PstI ·······
Fragmento 4 descrito no exemplo 1 a seguir
Fragmento 3 descrito no exemplo 1 a segui r
-11:,... .......... = Segmento de ADN do fago fd contendo um ' terminador de transcrição
Fragmento PstI-HindIII do segmento de ADN contendo a sequencia codificadora = do precursor natural de hGH.
A Figura 4 representa a carta de restrição do plasmídeo p400, 18. Os diferentes fragmentos de restrição são definidos de modo arbitrário segundo a legenda a seguir indicada:
-12Sequencia PvuI-BamHI(2) proveniente do plasmídeo pBR327 c Sequencia Pvul-Xhol proveniente do plasmídeo P 1 6 3 , 1 * Sequencia Xhol-HincII proveniente do plasmídeo p 1 6 3 , 1 \XXXXXXXXXX = Fragmento 3 decsrito no exemplo 1 a seguir
Segme n to de ADN terminador de do fago fd contendo um transcrição
OOL = Segmento de ADN compreendendo em particular o promotor do precursor da hirudina (parte Hincli-Ndel do fragmento1!)
X y X X X
Sequência codificadora do precursor da hirudg na compreendendo a sequencia codificadora do péptido-sina 1 de formula (1) representada pela parte negra deste símbolo (reunião dos fragmentos 5 e 7 )
-13πA Figura 5 representa a carta de restrição do plasmídeo p460. Os diferentes fragmentos são definidos de modo arbitrário segundo a legenda a seguir indicada :
= Sequencia Pvul-BamHI proveniente do plasmídeo PB327
Sequencia Pvul-Xhol proveniente do plasmídeo ρ 1 6 3 , 1 /W/W ~ Sequencia Xhol-HincII proveniente do plasmídeo xxxxxxxxxxx
Fragmento 3 descrito no exemplo 1 a seguir
Segmento de ADN do fago fd contendo um terminador de transcrição
Sequencia codificadora do precursor da hirudiru compreendendo a sequencia codificadora do peptido-sinal de fórmula (2) representada pela .parte negra deste símbolo
5ZEL
Segmento de ADN compreendendo em particular o promotor do precursor da hidrudina (parte HincII-Ndel do fragmento 4)
-14EXEMPLO 1
PRODUÇÃO PERIPLASMICA DA HORMONA DE CRESCIMENTO HUMANA COM O PEPTIDO-SINAL DE FORMULA (I):
MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA
Uma estirpe da especie Escherichia coli directamente aparentada da estirpe, descrita no pedido de patente EP-A-0245138 e depositada na Collection Nationale de Cultores de Microorganismes (CNCM, Paris, França) a 17 de Fevereiro de 1986 sob a referencia 1-529, é posta em execução. Esta estirpe transporta uma mutação cya por delecção e uma mutação crp por delecção.
Um plasmídeo transportando uma sequencia de ADN codificadora de um precursor de hGH em que o peptido-sina 1 é aquele segundo o invento de formula (D:
MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA foi preparado.
Este plasmídeo foi denominado p398.
-151. CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO P398
1a. ) Construção do plasmídeo p373,2
A estratégia posta em execução chama a si fragmentos obtidos a partir de plasmidios preexistentes acessíveis ao publico e a fragmentos preparados por via de sintese segundo as técnicas agora correntemente utilizadas. As técnicas de clonagem empregues são aquelas descritas por T.MANIATIS EF, FRITSCH e J. SAMBROOK em Molecular cloning, um manual de laboratorio (Cold Spring Harbor Laboratory , 1984).
A sintese dos oligonucleotidos é realizada com auxilio de um sintetizador de ADN Biosearch 4 600.
Submeteu-se o plasmideo p 163,1 (figura 1), descrito no pedido de patente EP-A-0245138 (representado sobre a figura 2 deste documento, na qual não aparece o local BamHI (1) representado sobre a figura 1 do presente pedido) e presente na estirpe depositada na CNCM sob a referencia 1-530 em 17 Fevereiro de 1986, a uma digestão pelos enzimas Pvul e BamHI. Este plasmideo contem o gene codificador da hGH. 0 fragmento Pvul-BamHI (1) - a seguir fragmento 1- contendo o local de acção do enzima de restrição Xhol, representado sobre a figura 1, foi purificado.
-16Do mesmo modo submeteu-se o plasmídeo pBR327, bem conhecido por peritos nesta técnica.
(cf. SOBERON, X e col , Gne 9 ( 1980) 287-305) a uma digestão pelos enzimas Pvul e BamHI fragmento Pvu I-BamH I (2 ) - a seguir fragmento
2-, contendo a origem de replicação, foi purificado.
f.-·?
Depois preparou-se o fragmento 3 que -e um fragmento sintético BamHI (1) - BamHI(2) contendo o gene lac i e o seu promotor em que a sequencia é a seguinte sobre a qual as duas extremidades do ramo são marcadas pelos numeros 1 e 2 para precisar a orientação do fragmento nos plasmídeos descritos nas figuras 2 e 3.
-17FRAGMENTO 3
V„
BarcHI(1)
GATCC
GAGCTAACTT 'GAAACCTGTC
GGCGGTTTGC
CGGGCAACAG
AAGCGGTCCA
GGTTAACGGC
CT-ACCGAGAT
ATTGCGCCCA
GATGCCCICA
TCCAGICGCC
TATTTATGCC
GCCCGCTAAC
CGCCCAG1CG
GTCTGGTCAG
TTCCACAGCA
CACTGACGCG
ACGCCGCTTC
GGCGCGAGAT
6ACTGGAGGT
TGTGCCACGC
TTTTTCCCGC aaacggtctg actggtttca
TGCCATACCG
GCGGAAGCAT ACATTAATTG GTGCCAGCTG GTATTGGGCG CTGATTGCCC CGCTGGTTTG GGGATATAAC ATCCGCACCA GCGCCATCTG TTCAGCATTT TTCCCGTTCC AGCCAGCCAG AGCGCGATTT CGTACCGTCT AGACATCAAG ATGGCAICCT TTGCGCGAGA GTTCTACCAT ITAAICGCCG GGCAACGCCA GGTTGGGAAT GTTTTCGCAG ATAACAGACA CATTCACCAC CGAAAGG77T
AAAGTGTAAA CGITGCGCTC CATTAATGAA CCAGGGTGGT IICACCGCCT CCCCACCACC ATGAGCTGTC ACGCGCAGCC ATCGTTGGCA GCATGGTTTG GCTATCGGCT ACGCAGACGC GCTGGTGACC TCATGGGAGA AAATAACGCC GGTCATCCAG AGATTGTGCA CGACACCACC CGACAATTTG ATCAGCAACG GTAATTCAGC AAACGTGGCT CCGGCATACT CCTGAATTGA TGCGCCATTC
GCCTGGGGTG ACTGCCCGCT TCGGCCAACG TTTTCTTTTC GGCCCTGAGA CGAAAATCCT TTCGGTATCG CGGACTCGGT ACCAGCATCG TIGAAAACCG GAATTTGAT T GCC GAGAC AG CAATGCGACC AAATAATACT GGAACATTAG CGGATAGTTA CCGCCGCITT ACGCTGGCAC CGACGGCGCG ACTGT TTGCC TCCGCCATCG GGCCÍGGTTC CTGCGACATC CTCTCTTCCG GA TGGTGTCC
CCTAATGA6T
TTCCAGTCGG
CGCGGGGAGA
ACCAGTGAGA
GAGTTGCAGC
GTTTGATGGT
TCGTATCCCA
AATGGCGCGC
CAGTGGGAAC
GACATGGCAC
GCGAGTGAGA aacttaatgg
AGATGCTCCA
GTTGATGGGT
7GCAGGCAGC
ATGATCAGCC
ACAGGCHCG
CCAGTTGATC
TGCAGGGCCA
CGCCAGTTGT
CCGCTTCCAC
ACCACGCGGG
GTATAACGTT
GGC GC T A T CA
G
BarrHI (2
-18Os fragmentos 1, 2 e 3 foram então ligados de modo a obter o plasmídeo p160,1 respectivamente sobre a figura 2.
Este plasmídeo foi submetido a uma digestão parcial pelos enzimas de restrição HincII e PstI, grande fragmento HincII-PstI, contendo a origem de replicação e representado sobre a figura 2, foi em seguida, ligado ao fragmento 4, representado a seguir, que é um fragmento sintético de ADN transportando uma sequencia codj^ ficadora dos primeiros 44 aminoácidos de um precursor natural de hGH e a montante desta sequencia aos sinais de regulação.
g/ ‘ί -</
FRAGMENTO 4
Ciai
5' tcgagctgactgacctgttgcttatattaca/cga
AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGy
Ndel
TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACA!T atcgcatattacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcaaattgaaattcttcctctatatgta
ATG | GCT | ACC | GGA | TCC | CGG | ACT | AGT | CTG | CTC | CTG | GCT | TTT | GGC | CTG | CTC | TGC | CTG |
tac | CGA | TGG | CCT | AGG | GCC | TGA | TCA | GAC | GAG | GAC | CGA | AAA | CCG | GAC | GAC | ACG | GAC |
A | T | G | S | R | T | S | L | L | L | A | F | G | L | L | C | L | |
-26 | Xhal | ||||||||||||||||
CCC | TGG | CTT | CAA | GAG | GGC | AGT | GCC | TTC | CCA | ACC | ATT | CCC | TTA | TCT | AGA | CTT | TTT |
GGG | ACC | GAA | GTT | CTC | CCG | TCA | CGG | AAG | GGT | TGG | TAA | GGG | AAT | AGA | tct | GAA | AAA |
P | W | L | Q | E | G | S | A -1 | F · 1 | P | T | I | P | L · | S | RÀ | L | F |
GAC | AAC | GCT | ATG | CTC | CGC | GCC | CAT | CGT | CTG | CAC | CAG | CTG | GCC | TTT | GAC | ACC | TAC |
CTG | TTG | CGA | TAC | GAG | GCG | CGG | GTA | GCA | GAC | GTG | GTC | GAC | CGG | AAA | CTG | TGG | ATC |
D | N | A | M | L | R | A | H | R ' | L | H | Q · | ' L | A | F | L · | T | Y |
PstI
CAG | GAG | TTT | GAA | GAA | GCC | TAT | ATC | CCA | AAG | GAA | CAG | AAG | TAT | TCA | TTC | CTG CA |
GTC | CTC | AAA | CTT | CTT | CGG | ATA | TAG | GGT | TTC | CTT | GTC | TTC | ATA | AGT | AAG | G |
Q | E | F | E | E | A | Y | I | P | K | E | Q | K | Y | s | F |
são | designados por | Neste fragmento, os aminoácidos letras segundo o seguinte código: | |
A | = | Alanina | M = Metionina |
C | = | Cisteina | N = Asparagina |
D | = | Acido aspártico | P - Prolina |
E | = | Acido glutâmico | Q = Glutamina |
F | = | Fen i1 a 1an i na | S = Serina |
H | = | Histidina | T = Treonina |
I | = | Isoleucina | V - Va1ina |
K | - | Lisina | W - Triptofano |
L | Leuc i na | Y - Tirosina |
São sucessivamente sublinhados neste fragmento as sequências -35 (TTGCTT) e -10 (TATAAT) da sequencia promotora e a sequencia de Shine e Dalgarno bem conhecida dos peritos nesta técnica.
-210 plasmídeo p380,1 foi assim obtido.
plasmídeo p380,1 (figura 3) foi em seguida submetido a uma digestão pelos enzimas de res trição Cl 11 e Ndel de modo a eliminar o pequeno fragmento Clal-Ndel do fragmento 4 anterior e em lhe substituir o fragmento Clal-Ndel a seguir:
5' «
Ciai
CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT
NruI Ndel atttcacacagtttttcgVgaagaaggagatataca taaagtgtgtcaaaaagcgcttcttcctctatatgtat 5'
A
-220 plasmideo resultante é o plasmideo p373 ,2 (figura 3) .
1b ) Construção do plasmideo p398.
Por fim, o plasmídeo p373,2 foi submetido a uma digestão pelos enzimas de restrição Ndel e Xbal de modo a eliminar o fragmento Ndel-Xbal do fragmento 4 anterior e em lhe substituir o fragmento Ndel-Xbal sintético representado a seguir.
Ndel
Γ* TATG | GCT | CCA | TCT | GGC | AAA | TCC | ACG | CTG |
AC | CGA | GGT | AGA | CCG | TTT | AGG | TGC | GAC |
CTT | CTC | TTA | TTT | CTG | CTC | CTG | TGC | CTG |
GAA | GAG | AAT | AAA | GAC | GAG | GAC | ACG | GAC |
CCC | TCT | TGG | AAC | GCC | GGC | GCp | 'TTC | CCA |
GGG | AGA | ACC | TTG | CGG | CCG | CGA | AAG | GGT |
Xbal
ACC ATT CCC TTA T
TGG TAA GGG AAT AGATC 5 plasmídeo p398 assim obtido comporta a sequencia de ADN preferida codante para o péptido-sinal de formula (i) segundo o invento. Esta sequencia é delimitada anteriormente por duas setas.
-232. Metodologia geral
Os ensaios realizados foram usados sobre 6 clones do plasmidio p398 (clones 2, 3, 5, 6, 7 e 8) os resultados foram apreciados em relação ao plasmideo p373,2 que contem uma sequancia de ADN codificadora do precursor natural de hGH. Eles consistiram em cultivar os respectivos pares hóspede-vector, previamente preparados (cf.§ 2.1), em condições tais que seja obtida uma biomassa suficiente cf.^2.2), e que as células submetidas a uma indução produzema hGH (cf.9)2.3) em ercolher por choque osmótico as proteínas contidas no espeço perplásmico (cf.^ 2.4), em submeter as bactérias a uma lise total de modo a dispor de um extrecto proteico total ( cf2.5) em dosear a hGH periplásmica recolhida em 2.4 (cf.£ 2.6) e em analisar pela técnica dita em Western Blot os sobrenadantes obtidos em 2.4 e em 2.5 (cf.£ 2.7).
-242.1 Preparação dos pares hóspede-vector
Os pares hóspede-vector foram preparados segundo as técnicas de transformação bacteriana conhe cidas do homem da ciência e que são descritas particularmente nas obras a seguir.
- Molecular cloning - A Laboratory manual - T. Maniatis
E. F., Fritsch and Sambrook - Cold Spring Harbor Laboratory - 1982.
- Experimente in molecular Genetics - J. H. MILLERCold Spring Harbor Laboratory - 1972
2.2 Cultura a ) Semente i ra
Uma colonia isolada obtida sobre meio solido (meio LB + agar-agar) foi posta em suspensão em 5 ml de um meio (meio LB).
meio LB utilizado tem as caracteristicas a seguir:
- Os seus componentes introduzidos antes da autoclavagem
. Bactotriptona | 10g |
. extracto de levedura | 5 g |
. cloreto de sodio | 5g |
. água destilada qbp | 11 |
- seu pH é ajustado a 7,3 | antes da autoclavagem |
- adiciona-se ampicilina 100 ug/ml | após autoclavagem na razão |
b) Incubação
A suspensão preparada em a) foi colocada a 37°C durante 18 h de modo que a cultura cheque à fase de crescimento estacionário. A suspensão densa obtida foi diluída em meio LB de modo a obter um valor de densidade optica lida a 600 nm- DO a 600 nm - proximo de 0,03 depois 25 ml desta suspensão bacteriana foi posta em incubação a 37°C sob agitação até obtenção de uma D0 a 600 nm vizinha de 0,3.
-262.3 Indução
A suspensão bacteriana obtida segundo 2.2b adicionou-se isopropi1-B-D-tiogalactose ( ou IPTG) em quantidade tal que a sua concentração final seja a 1 mM; o IPTG foi aqui utilizado para provocar o desencadeamento e a manutenção da sintese do precursor de hGH neutralizando a acção do repressor vindo normalmente fixar-se sobre o operador-1actose.
A suspensão adicionada de IPTG foi mantida sob agitaçao a 37°C durante 2h 30.
2.4 Choque osmótico
Foi referido o protocolo descrito por N.G. NOSSAL e L.A. HEPPEL no The Journal of Biological Chemlstry 241 (1966) 3055-3063..
a) Lavagem com Tris e EDTA
Uma amostra da suspensão, tal como obtida em 2.3, apús indução, foi recolhida e centrifugada 5 minutos a 6 000 g.
deposito foi retomado num volume de tampão a pH 7 (solução a) (cf. em baixo) de modo a que a suspensão obtida apresente uma DO a 600 nm vizinha de 10.
tampãi utilizado foi preparado por adição em âgua destilada de:
. tri(hidroximeti1)aminometano-HC1 ou Tris-HCl adicionado de modo a ter uma concentração final de 30 mM.
. ácido eti1enodiaminotetraacético ou EDTA adicionado de modo a ter uma concentração final de 1 mM.
-28b) Acção da sacarose
A suspensão obtida em 2.4a, foi centrifugada 5 minutos a 6 000 g.
deposito foi retomado delicadamente a volume constante numa solução B preparada extemporaneamente e corresponde à solução A à qual se adicionou sacarose na razão de 15 g por 100 ml.
A suspensão foi deixada 10 minutos a 20°C. Depois ela foi centrifugada 5 minutos a 6000 g.
Os tubos de centrifugação foram colocados em gelo fundente.
Eliminou-se com cuidado o sobrenadan te e substitui-se (a volume constante) a águ.a desionizada e levou-se previamente à temperatura do gelo fundente.
A suspensão assim preparada (em que a D0 a 600 nm era vizinha de 10) foi deixada 5 minutos a 0°C.
-29c) Recolha das proteínas de localização periplásmica
A suspensão obtida em 2.4b foi centrifugada 10 minutos a 18 OOOg. 0 sobrenadante que continha as proteínas de localização periplásmica foi recolhido.
2.5 Lise Total
Uma amostra da suspensão tal como obtida em 2,3., após indução, foi recolhida e centrifugada num tubo Eppendorf 5 minutos a 6000 g.
deposito foi reposto em suspensão num volume de tampão tal que 1 ml de suspensão apresen ta uma DO a 600 nm de 0,2.
tampão foi preparado a partir de um tampão concentrado 2 vezes compreendendo uma solução em agua destilada:
- Tris-HCl 0,125 Μ, pH 6,8;
- dodeci1sulfato de sodio (4% (p/v));
- g1i cerol (20% (p/v ) ;
- B-mercaptoetanol (10% (p/v));
- azul de bromofenol (0,02% (v/v)).
-300 tubo foi colocado 10 minutos em banho-maria regulado a 100 oC depois a suspensão foi centrifugada durante 5 minutos a 6000 g e o sobrenadante foi recolhido.
2.6 Doseamento de hGH periplásmica sobrenadante obtido em 2.4c foi submetido a uma cromatografia do tipo liquido a alta pressão com auxilio de um aparelho munido de um sistema de injecção calibrado e equipado com um detector regulado sobre 220 nm.
uti1izou-se:
. uma coluna de fase inversa C 8 - 300 Angstrõms, em aço, de 10 cm de comprimento e de 4,6 mm de diâmetro interno (SYNCHROM referencia C 8 R103-10).
uma fase movei constituida por um gradiente linear de minutos passando respectivamente de 70 volume de soluções S1 e volumes de solução S2 e 40 volumes de solução S1 e 60 volumes de solução S2.
As soluções S1 e S2 têm as seguintes características:
-31. S1 = água purificada contendo 0,1% (v/v) de acido trifluoroacét i co, . S2 = acetonitrilo para HPLC contendo 0,08% (v/v) de ácido trifluoroacético.
debito era de 1 ml por minuto.
A densidade óptica das fracções foi medida e a quantidade de hGH periplâsmica expressa em microgramas por ml de sobrenadante foi determinada por comparação com uma gama de padrão preéstabelecida.
2.7 Análise pela técnica dita de Western Blot
Procedeu-se sucessivamente â seguintes operações:
- separação e lectroforética sobre gel (segundo o protocolo descrito por LAEMMLI, U.K.,Nature 227 (1970) 680-685) das diferentes proteinas contidas em cada um dos sobrenadantes obtidos segundo 2.4c e 2.5; o gel utilizado era um gel de poliacri1amida (15% p/v) contendo 0,5% de dodecilsulfato de sodio;
- transferencia das ditas proteinas contidas no gel sobre um filtro de nitrocelulose (segundo a técnica de H. TOWBIN e col. Proc. Natl. Acad.Scie. USA 76 ( 1979) 43504354) .
-32- imunodetecção realizada segundo a técnica de BURNETTE (W.W.BURNETTE Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203); ela implica sucessivemente:
. lavagem do filtro de nitrocelulose 10 minutos com um tampão A (Tris-HCl 10mM, NaCl 170 mM, Kl 1mM);
. colocação em contacto do filtro de nitrocelulose durante 30 minytos a 37°C com um tampão B(Tampão A adicionado de soro-albumina bovina na razão de 3 g por 100 ml);
. colocação em contacto do filtro de nitrocelulose durante 18 h a 20°C com um imuno-soro (um anticorpo policlonal reconhecendo a hGH madura e o seu precursor);
. a lavagem do filtro de nitrocelulose com o tampão B:
. colocação em contacto do filtro de nitrocelulose durante 6 h a 20°C com uma solução de proteina A marcada com iodo 125 a 0,1 microcurie por ml;
. a lavagem do filtro com o tampão A;
. secagem do filtro entre duas folhas absorventes;
. colocação em contacto de um filme radiográfico;
. revelação do filme.
-333. RESULTADOS
3.1 Doseamento da hGH periplásmica
Os resultados são relatados no Quadro a seguir:
PLASMIDIO TESTE | |||||||
T e s t e - j mui n h.a. J | PLASMIDIO 398 | ||||||
373,2 | 398,2 | 398,3 | 398,5 | 398,6 | 398,7 | 395,8: | |
hGH periplasmica expressa em micrc gramas/ml de sobr | e 1,5 | 2,5 | 2,9 | 2,8 | 3,1 | 3,1 | í 1 |
nadante recolhidc osmotico e levado a uma tal turbide | q u e DO a 600 nm = 1 | z |
Parece claramente que o plasmídeo 398 permite uma produção periplasmica multiplicada cerca de duas em relação àquela que o plasmídeo 373,2 permite.
-343.2 Análise pela técnica dita de Western Blot
A analise dos filmes autoradiogra ficos revela que o precursor não foi detectado nos extractos obtidos após lise total das bactérias transformadas com o plasmideo p398 enquanto que ele é detectado nos extractos obtidos após lise total das bactérias do clone p373,2 . Este mostra que o peptido-sina 1 segundo o invento permitiu mesmo, com uma grande eficacia, e a trasnposj_ ção pelo precursor da membrana citoplásmica e a sua conco mitante maturação.
Estes resultados sublinham o gran de interesse da utilização do peptido-sinal segundo o invento de formula (1) pela produção periplasmica de uma proteína tal como a hormona de crescimento humana.
EXEMPLO 2
PRODUÇÃO PERIPLASMICA DE UMA VARIANTE DA HIRUDINA COM O PEPTIDO-SINAL DE FORMULA (1):
MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA . Estirpe e plasmídeo
Foi utilizada a estirpe descrita no Exemplo 1.
Um plasmídeo denominado p 400 foi construído a partir de plasmídeo p373,2. Ele transporta uma sequencia de ADN codificadora da variante (Lys47) HVS descrita em EP-A-0273800 e em que a fórmula é a seguir lembrada :
Ile | Thr | Tyr | Thr | Asp | Cys | Thr | Gl u | Ser | Gly | Gl n | Asn | Leu | Cys | Leu |
Cys | Gl u | Gly | Ser | Asn | Vai | Cys | Gly | Lys | Gly | Asn | Lys | Cys | Ile | Leu |
Gly | Ser | Asn | Gly | Lys | Gly | Asn | Gin | Cys | Vai | Thr | Gly | Gl u | Gly | Thr |
Pro | Lys | Pro | Gl u | Ser | His | Asn | Asn | Gly | Asp | Phe | Gl u | Gl u | Ile | Pro |
Gl u | Gl u | Tyr | Leu | Gin |
precedida de uma sequencia codificadora do peptido-sina 1
-36segundo o invento de formula (1).
Construção do plasmídeo p400
Foi preparado um fragmento sintético AccI-HindIII (fragmento 5) contendo uma sequencia codificadora de variante (excepto os 3 primeiros aminoácidos ) .
Ele está representado em baixo, uma seta designando o codão correspondente ao ultimo aminoácido:
-37FRAGMENTO 5
Accl
5' AT ACA GAC TGC ACA GAA TCG GGT.
TGT CTG ACG TGT CTT AGC CCA
CAA | ATT | TTG | TGC | CTC | TGC | GAG | GGA | AGC | AAT |
GTT | TTA | AAC | ACG | GAG | ACG | CTC | CCT | TCG | TTA |
GTT | TGC | GGT | AAA | GGC | AAT | AAG | TGC | ATA | TTG |
CAA | ACG | CCA | TTT | CCG | TTA | TTC | ACG | TAT | AAC |
GGT | TCT | AAT | GGA | AAG | GGC | AAC | CAA | TGT | GTC |
CCA | AGA | TTA | CCT | TTC | CCG | TTG | GTT | ACA | CAG |
-38ACI
TGA
GGC GAA GGT ACA CCG AAA CCT GAA AGC CCG CTT CCA TGT GGC TTT GGA CTT TCG
CAT AAT AAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA
GTA TTA TTG CCG CTA AAG CTT CTT TAA GGT
GAA GAA TAT TTA CA?TGA AAA ATG AAA GAA
CTT CTT ATA AAT GTT ACT TTT TAC TTT CTT
Eco RI
T
TAT | CAA | TCA | TAG | AGA | ATT | TTG | ATT | TGG | GAA |
ATA | GTT | AGT | ATC | TCT | TAA | AAC | TAA | ACC | CTT |
TTC | GAA | AAG | TTC | GCT | GGT | ACT | AAG | GCT | TTG |
AAG i | CTT | TTC | AAG | CGA | CCA | TGA | TTC | CGA | AAC |
TTA | CAC | GAA | GTT | GTC | AAG | AGC | TCT | GCT | GCT |
AAT | CTG | CTT | CAA | CAG | TTC | TCG | AGA | CGA | CG^ |
GGT | AAC | ACC | GTC | ATC | ATT | GGT | GGT | GGT | GAC |
CCA | TTG | TGG | CAG | TAG | TAA | CCA | CCA | CCA | CTG |
ACT | GCC | ACT | GTC | GCT | AAG | AAG | TAC | GGT | GTC |
TGA | CGG | TGA | CAG | CGA | TTC | T1C | ATG | CCA | CAG |
H im | 11 I i | ||||||||
ACT | GAC | AAG | ATC | CCA | |||||
TGA | CTG | TTC | TAG | GGT | TCG | A - | 5 | l |
plasmídeo p373,2 foi submetido a uma digestão pelos enzimas de restrição Ndel e HindIII e
-39o fragmento Ndel-HindIII (fragmento 6) contendo a origem da replicação, tal como representado na figura 3, foi purificado.
tico Ndel-Accl a seguir:
Foi fragmento 7) preparado um fragmento sinte em que a sequencia é dada
FRAGMENTO 7
Ndel
5' T^TGGCTCCATCTGGCAAATCCACGCTGCTTCTCTTATTTCTGCTCCTGTGGCTGCCCTCTACCGAGGTAGACCGTTIAGGIGCGACGAAGAGAATAAAGACGAGGACACGGACGGGAGAAccl
TGGAACGCCGGCGC?A1TACGT ACCTTGCGGCCGCGATAATGCATA 5'
Este fragmento contém uma sequencia de ADN particularmente apreciada codificadora do peptido-40-
-sinal de formula (1), delimitado por duas setas e seguido dos nucleótidos correspondentes aos 3 primeiros codoes de variante de hirudina (Lys )HV2.
Os fragmentos 5, 6 e 7 foram ligados ; plasmídeo obtido é o plasmídeo p400, representado sobre a figura 4.
2. Metodologia geral plasmídeo p400 foi introduzido por transformação na estirpe bacteriana.
Os ensaios foram realizados em pa ralelo sobre dois clones distintos (clone p400,18 e p400,24) e consoante o modo operatorio descrito nos paragrafos 2.1 e 2.2 do exemplo 1. As culturas foram induzidas segundo o método indicado no parágrafo 2.3 do exemplo 1 mas transportando dois arranjos: a indução foi iniciada por adição de IPTG desde que a cultura atinja uma DC a 600 nm de cerca de 0,5 e ela é mantida durante 3h 30 para um primeiro ensaio e 17h para um segundo ensaio.
Após indução, as células foram submetidas a um choque osmótico (cf. 2.4, exemplo 1) e foi medida a actividade antitrobina da hirudina do sobrenadante recolhido.
A determinação desta actividade convoca a técnica descrita por Markwardt, F. e col. (Thromb. Haemostas. 52 (19) 160-163) e precisada por Harvey, R.P. e col. (Proce Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 1084-1088).
A variante de hirudina obtida a par tir de um dos clones foi purificada por cromatografia liquida de alta pressão e foi determinada a sua sequencia Nl^-termi na 1.
3. RESULTADOS
Os resultados são relatados sobre o quadro a seguir.
Eles são expressos e unidades anti trombina por ml de sobrenadante recolhido após choque osmó tico e levado a uma turbina tal que DO a 600 nm = 10.
j | PLASMIDIOpÃOO | | ||
CLONE p400 , 1 8 1 | CLONE pÃOO , 24 ___-! | ||
DURAÇÃO DA INDUÇÃO | 3h. 30 | 241 | 369 | |
17h | f 1595 | Γ 983 1 |
Os valores da actividade antitrobina especifica da hirudina conhecidos estão compreendidos entre 1300 a 1770 unidades antitrombina por mg de hirudina (Loison, G. e col. Bio/Technology 6:72-77(1988)), pode-se deduzir que se extrai após 17 h de indução de 5 a 10 mg de hirudina por litro de sobrenadante a DO a 600 nm =1.
Uma tal quantidade é bem mais eleva_ da que a que Dodt. J. e col. FEBS, 202 (1986) 373-377 descreveram com a variate HVI da hirudina produzida de modo periplasmico numa estirpe de E.coli.transformado com auxilio de um plasmídeo transportando uma sequer codificador de um precursor híbrido da hirudina em que o peptido -sinal é aquele da fosfatase alcalina.
-43Foi por outro lado constatado que a hirudina produzida pelo clone p400,18 tem a extremidade NH2-terminal caracteristica da variante (Lys47) HV2.
Estes resultados mostram que o pepti do-sinal segundo o invento de formula (1) é apropriado para um produção periplásmica eficaz de um peptido tal como a variante (Lys )HV2 da hirudina.
/
Exemplo 3
PRODUÇÃO PERIPLÁSMICA DE UMA VARIANTE DA HIRUDINA COM AUXJ. LIO DO PEPTIDO-SINAL DE FORMULA (2)
MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA
1. Estirpe e plasmideo:
Foi utilizada a estirpe descrita no Exemplo 1.
A estratégia posta em execução para construir o plasmideo p460 que compreende ume sequên cia codificadora da variante (Lys47)HV2 da hirudina descrg ta em EP-A-0273800, precedida de uma sequencia codificadora do peptido-sinal segundo o invento de formula (2):
MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA
-44convoca os fragmentos de ADN obtidos a partir de plasmideo p400,18 descrito no exemplo 2 e tem um fragmento obtido após mutagénese dirigida no fago M13mp19 comercializado por Amersham.
Construção do plasmideo p460 la) fragmentos obtidos a partir do plasmídeo p 400,18 o^) Submeteu-se o plasmideo p 400,18 a uma digestão pelos enzimas Pst e EcoRI. 0 fragmento Pst-EcoRI de 3868pb contendo a origem de replicação a seguir chamado fragmento 8 (representado sobre a figura 5 por F8), foi purificado.
p) Submeteu-se o plasmideo p 400,18 a uma digestão pelos enzimas NruI e PstI. 0 pequeno fragmento NruI-PstI de 1062 pb contendo o promotor, a seguir chamado fragmento 9 (representado sobre a figura 5 por F9), foi puri f içado.
lb) fragmento NruI-EcoRI obtido a pertir do fago M13mp19 có) o fragmento Xhoi-EcoRI de 650pb, proveniente do plasmídeo p400,18 por digestão com auxilio dos enzimas xhol e EcoRI e purificação, que contem a sequencia codifica^ dora do peptido-sinal de formula (1):
foi inserido no poli1igador(polilocal de clonagem) do fago M13 mp 19 (Amersham) nos locais de restrição SaII/ EcoRI. A ligação dos locais Xho I e Sal I levou ao desaparecimento destes dois sites.
p ) Um oligonucleotido de 63 nucleotidos de sequencia:
-455' ATG - AAA - TCC - ACG - CTG - CTT - CTC - TTA - TTT — CTG CTC—' CTG - TGC - CTG - CCC - TCT - TGG - AAC - GCC^ GGC GCT - 3' foi sintetizado. Esta sequencia codigo para o peptido-sina 1 de formula (2)
Utilizou-se para construir um fragmento mutado, no que diz respeito à sequencia codificadora do peptido-sinal, em relação ao fragmento obtido em alfa) a técnica de mutagenese dirigida in vitro, executada com auxilio do equipamente (Kit) Amersham 1523. Esta técnica, descrita em detalhe no livrete que acompanha o kit consi£ te na introdução de um fragmento Xhol-EcoRI'de 650 pb (cf. paragrafo alfa) anterior) na forma de dupla ramificação do fago recombinente, a hibridação do oligonucleotido de 63 nudeótidos mencionados anteriormente, a acção da ADN poiimerase de Kleno W depois da ligase de T4 a fim de obter uma forma circular de dupla ramificação do fago recombinante em que uma das ramificações transporta a mutação desejada.
V.
-46ί) ο fago contendo ο fragmento de ADN mudado foi submetido a uma digestão pelos enzimas NruI e EcoRI. 0 fragmento NruI-EcoRI contendo a sequencia codificadora do peptido -sinal de formula (2) e aquela codificadora da variante (Lys47)HV2 de hirudina, chamada a seguir fragmento 10 (representado sobre a figura 5 por F10) foi purificado.
Os fragmentos 8,9, e dos; o plasmídeo obtido é o plasmídeo p460, sobre a figura 5.
foram ligarepresentado
2. Metodologia geral paslmideo p460 foi introduzido por transformação na estirpe bacteriana descrita no exemplo 1 .
Os ensaios foram realizados em para_ leio sobre dois clones distintos (clones p460,2 e p460,4) nos quais se verificou a presença da sequencia de 63 nucleotidos anteriormente mencionada, e sobre o clone testemunha p 400,18, consoante o modo operatorio descrito nos paragrafos 2.1 e 2.2 do exemplo 1. As culturas foram induzidas segundo o método indicado no parágrafo 2.3 do exemplo 1 mas tendo duas alterações: a indução foi iniciada por adição de IPTG logo que a cultura atinge uma DO a 600 nm de cerca de 0,5 a ela é mantida durante 2 horas.
-47Após indução, as células foram submetidas a um choque osmótico (cf. parágrafo 2.4, exemplo
1) e a variante (Lys^^)HV2 da hirudina assim libertada no sobrenadante da cultura foi doseado por HPLC.
Γ' í
Doseamento da variante (Lys47)
HV2 da hirudina sobrenadante obtido proveniente do choque osmótico foi subsmetido a uma cromatografia liquida alta pressão HPLC com auxilio de um aparelho munido de um sistema de injecção calibrado e equipado com um detector regulado sobre 220 nm.
utili zou-se:
V.
.Uma coluna fase inversa C8 - 300A°, em aço, com 7,5 cm de comprimento e de 4,6 mm de diâmetro interno (BECKMAN Ultrapore referencia 238 771).
. Uma fase móvel constituida por um gradiente linear de 10 minutos, passando respeetivamente de 85 volumes de sol£ ção S1 e 15 volumes de solução S2 a 50 volumes de solução S1 e 50 volumes de solução S2.
-48As soluções S1 e S2 tinham as caracteristicas seguintes:
.S1 = água purificada contendo 0,1% (v/v) de acido trifluo racét i co.
.S2 = acetonitrilo por HPLC contendo 0,08% (v/v) de acido trifluoroacético.
o debito era de 2 ml por minuto.
A densidade óptica das fracções fpi medida e a quantidade de variante (Lys47)HV2 periplasmica, expressa em miligrama por litro de sobrenadante, foi determinada por comparação com uma solução padrao de variante (Lys47))HV2.
III- RESULTADOS
Os resultados são relatados nos quadros a seguir. Eles são expressos em mg/1 de sobrenadante recolhido proveniente do choque osmótico e levado a uma densidade óptica a 600 nm de 1.
-4919. ensaio
PLASMÍDEO TESTE | ||
Tes temunha 400,18 | 460,2 | |
Variante (Lys*1<) HV2 de hirudína em mg/1 de sobrenadante recolhido pro veniente do choque osmóticoelevadoà DO a 6 00 nm =1 > | 1,3 | 3,1 |
9. ensaio | PLASMÍDEO teste | ||
Tes t emu n ha ‘ 400,18 | 460,2 | 460,4 | |
Variante (Lys^?) HV2 de hirudina em mg/1 sobrenadante recolhido prove niente do choque osmdti co e lavado à DO a 600 nm =1 | 1,3 | 5,2 | 4,5 |
-50Parece pela leitura dos quadros em cima que os plasmidios 460,2 e 460,4 permitem uma produção periplásmica de variante (Lys47)HV2 de hirudina, nitidamen te mais importante que a obtida com auxilio do plasmideo 400,18 .
Estes resultados mostram que o peptido-sinal segundo o invento de formula (2) é particularmente apropriado a uma produção periplásmica eficaz de um peptido tal como a variante (Lys47)HV2 da hirudina.
Claims (5)
1§. - Processo para a produção de uma sequência de ADN, codidicadora de um péptido sinal de fórmula:
MXKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA na qual:
e X representa uma ligação directa entre M e K, um amino-ácido escolhido no conjunto dos 20 amino-ãcidos do código genético, ou um péptido comportando
2,
3 ou
4 amino-ácidos escolhidos, cada um independentemente dos outros, no conjunto dos 20 amino-ácidos do código genético, caracterizado por compreender a preparação, por síntese, de acordo com processos clássicos, de toda a sequência de ADN que permite a degenerescência do código genético, codificadora do referido péptido.
-5223. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a preparação por síntese, da sequência de ADN que tem a fórmula a seguir apresentada:
5' ATG-GCT-CCA-TCT-GGC-AAA-TCC-ACG-CTG CTT-CTC-TTA-TTT-CTG-CTC-CTG-TGC-CTG CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GCT 3'
33. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a preparação, por síntese, da sequência de ADN que tem a fórmula a seguir apresentada:
5' ATG-AAA-TCC-ACG-CTG-CTT-CTC-TTA-TTT-CTGCTC-CTG-TGC-CTG-CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGCGCT - 3'
43. - Processo para a preparação de um vector de expressão, caracterizado por se incluir no referido vector uma sequência de ADN codificadora de um precursor de um polipétido, em que a porção desta sequência codificadora do péptido-sinal é uma sequência de acordo com uma das reivindicações 1 a 3.
53. - Bactérias gram-negativas, caracterizadas por serem transformadas por um vector de acordo com a reivindicação 4.
-536§. - Bactérias de acordo com a ção 5, caracterizadas por pertencerem à espécie coli.
reivindicaEscherichia
7§. - Bactérias de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas por transportarem uma mutação Cya por delecção e uma mutação crp por delecção.
8ã. - Bactérias de acordo com uma das reivindicações
5 e 6, caracterizadas por o polipéptido ser uma forma natural ou um variante da hirudina.
9ã. - Bactérias de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas por o variante da hirudina ser o HV2 (Lis47) .
10â. - Bactérias de acordo com uma das reivindicações 5 e 10, caracterizadas por o polipéptido ser a hormona de crescimento humano.
lis. - Processo para a produção de um polipéptido, consistindo em cultivar as células de bactérias gram-negativas transformadas por um vector de expressão de um precursor e um polipéptido, se submeter as células a um choque osmótico e se separar o polipéptido recombinante sobrenadante do choque osmótico, caracterizado por bactérias gram-negativas serem bactérias de acordo com das reivindicações 5 a 10.
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