JP2018509914A - 二重特異性抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスおよびそれに関連する方法と使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、生命科学と医学の分野に関する。詳しくは、本発明はヒトの癌の治療方法に関する。より詳しくは、本発明は二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。さらに本発明は、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを用いた方法や該ベクターの使用に関し、また、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法との両方を用いた方法やこれら両方の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、生命科学と医学の分野に関する。詳しくは、本発明はヒトの癌の治療方法に関する。より詳しくは、本発明は二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。さらに本発明は、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを用いた方法や該ベクターの使用に関し、また、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法との両方を用いた方法やこれら両方の使用に関する。

新規療法が癌治療のために絶えず開発されている。養子細胞療法（ＡＣＴ）は癌を治療するための有力な手法であるが、他の疾患、たとえば感染症および移植片対宿主疾患を治療するための有力な手法でもある。養子細胞移入は、ex vivo で成長した細胞、最も一般的には免疫由来細胞の宿主内への受動移入であり、移入細胞の免疫学的機能性と特性を移入する目的を有する。養子細胞移入は、養子Ｔ細胞療法において一般的であるような自家移植であってもよく、また、感染症または移植片対宿主疾患の治療に典型的な同種異系であってもよい。臨床的には、この手法の一般的な態様は、免疫促進性細胞または寛容原性細胞のいずれか、たとえばリンパ球の患者への移入を行うことにより、ウイルスおよび癌に対する免疫を増強すること、または自己免疫疾患、たとえばＩ型糖尿病もしくは関節リウマチの状況において寛容を促進することのいずれかを達成することを含む。

自家移植腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または遺伝学的に再制御された末梢血単核細胞の養子移入が、黒色腫を有する患者およびＣＤ１９発現血液悪性腫瘍を有する患者を治療するために成功裏に使用されてきた。ＡＣＴにおいて、最も一般的に使用されている細胞種は、時々ＣＤ８＋として分類されるＴ細胞であるが、他の細胞種には、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞および末梢血単核細胞が含まれる。細胞は、たとえばＴＩＬ療法におけるように非改変でもよいし、また、遺伝子改変されていてもよい。ＴＩＬ療法においては、分別されないポリクローナル細胞が用いられる。腫瘍特異的標的に対するＴ細胞の遺伝子ターゲティングを達成するために、２つの一般的な手段が存在する。１つは、既知の特異性（ＴＣＲ療法）および一致したヒト白血球抗原（齧歯動物においては主要組織適合性遺伝子複合体として知られる、ＨＬＡ）型を有するＴ細胞受容体の移入である。もう１つは、人工分子、たとえばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による細胞の改変である。この手法はＨＬＡに依存せず、細胞表面分子のターゲティングに関してより高い柔軟性がある。たとえば、一本鎖抗体が使用されていてもよく、ＣＡＲが共刺激ドメインを組み込んでいてもよい。しかし、ＣＡＲ細胞の標的は標的細胞の膜上に存在することを必要とするのに対して、ＴＣＲ改変は細胞内標的を利用してもよい。ＴＣＲ療法とＣＡＲ療法においては、Ｔ細胞を患者の末梢血から得る。

養子細胞療法の開発にもかかわらず、黒色腫以外の固形腫瘍（ヒトの癌の９０％を超える割合を占め、ガンによる死亡の９５％を占める）への養子Ｔ細胞療法の臨床結果は、失望的なものである。これの主な理由は、腫瘍の微小環境が高度に免疫抑制的であるため、移植Ｔ細胞を不活化およびアネルギー化し、移植Ｔ細胞の局所増殖を阻害し、そして養子移入されたＴ細胞の腫瘍への移動を妨害することである。現在、この問題を解決する効果的な手段は存在しない。

癌の治療にＴ細胞エンゲージャー（T-cell engager）が用いられてきた。主な種類は、３価の抗体、化学結合されたＦａｂ、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であり、ＢｉＴＥは臨床的に最も進歩したものである（Baeuerle PA, Reinhardt C. Cancer Res. 2009 Jun 15;69(12):4941-4）。いくつかの種類のＢｉＴＥが前臨床的に研究されてきており、また、２種類のＢｉＴＥ（blinatumomab（抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ）と solitomab（抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ））は臨床試験が行なわれているが、多くの問題点が浮かんできた。主要な問題は on-target-off-tumor toxicity（腫瘍以外の標的と反応することで引き起こされる毒性）であり、これにより、blinatumomab の臨床試験では毒性死亡率が１２％であることを含めて有害事象発生率が高い結果となった（Topp MS et al. 2011, J Clin Oncol. Jun 20;29(18):2493-8）。他の問題としては、標的（腫瘍）におけるＢｉＴＥの濃度が不十分なことであり、これは、固形腫瘍の容積がＢｉＴＥの侵入と高濃度化を妨害する場合に特に問題となる。おそらくこれが、solitomab の臨床試験では確かな反応（ＲＥＣＩＳＴ基準を満たす腫瘍サイズの縮小）が見られていないことの理由であろう。最良の反応でも、一時的な病状の安定であり、３８％の患者で達成されたにすぎない（Walter M et al. 2012, J Clin Oncol 30, (suppl; abstr 2504)）。ＢｉＴＥのさらなる問題は、ヒトにおいての半減期が短いので人体への持続的注入が必要であり、このために、ルーチンの使用には実用的でないことである。

Ｔ細胞エンゲージャーで武装した腫瘍溶解性ウイルスベクターが癌治療のために提案されている。WO 2014138314 A1（PCT/US2014/020935）および Yu et al.（2014, Mol Ther 22(1):102-11）は、抗ＥｐｈＡ２ ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを記載している。ＢｉＴＥの誘導送達に関しては、二部分からなる単一鎖構築物（dual-single-chain construct）（たとえばＢｉＴＥ）を含めて単一鎖分子は、哺乳類細胞から自動的に分泌されるわけではない。実際、ＢｉＴＥのような単一鎖分子や構築物の分泌が乏しいことが、遺伝子治療でのこれらの使用への妨げとなっている。抗体は通常、Ｂ細胞系列形質細胞によって産生されるので、上皮腫瘍細胞からの抗体の産生と分泌に問題があるとしても驚きではない。

腫瘍溶解性ウイルスベクター単独またはそれと他の療法との併用の効果については、改善の余地がある。治療の特異性の増加と十分な腫瘍殺傷能力が全般的に保障されている。

本発明は、特定のウイルスベクターを、たとえば養子細胞療法と併用することにより、癌治療のための効率的な手段と方法を提供する。

本発明の１つの目的は、非効率で安全ではなく、予測不可能な癌療法に伴う上記問題を克服するための簡便な方法および手段を提供することである。１つの態様において、本発明は養子細胞療法のための新規方法および手段を提供する。本発明の目的は、独立請求項に記載される内容により特徴付けられる、特定のウイルスベクター、方法および構成によって達成される。本発明の具体的な態様は従属請求項に開示されている。

本発明は、移植Ｔ細胞を不活化およびアネルギー化し、移植Ｔ細胞の局所増殖を阻害し、そして養子移入されたＴ細胞の腫瘍への移動を妨害する、高度に免疫抑制的な腫瘍微小環境の問題を、特定の腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて解決することを提案する。本発明は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスが上記問題を解決できるという驚くべき発見に基づく（図１）。特に、本発明に関連するデータは、アデノウイルスはマウスやヒトの腫瘍において、たとえばインターフェロンガンマ産生（図２）によって例示されるような危険信号を誘導でき、これがＴＩＭ３（ＴＩＭ３は腫瘍免疫抑制の主要な指標である）の発現減少を生じることを示す（図３）。重要なことは、もしもアデノウイルス単独で腫瘍において危険信号を産生できるとしても、それだけではＴ細胞を腫瘍へ動員するには不十分なことである（図４）。したがって、養子細胞療法を最適に強化するためには、腫瘍溶解性アデノウイルスをＢｉＴＥで武装することが必要である（図１）。

注目すべきことに、ＴＩＭ３発現、および腫瘍溶解性アデノウイルスがＴＩＭ３を下方制御する能力が、患者の生存期間と相関することを示すヒトについてのデータを本発明者らは持っている。このデータは、アデノウイルスにより引き起こされた危険信号が腫瘍免疫抑制の下方制御を生じ、これが患者の臨床的利益と相関することを示す有力なデータである（図１０）。重要なことに、全ての腫瘍溶解性ウイルスが同様ではなく、実際、ワクシニアウイルスは腫瘍に危険信号を産生できないので、ＢｉＴＥの局所産生を介しての腫瘍免疫療法についてアデノウイルスには匹敵できない（図５と図６）。

ＢｉＴＥの全身毒性の問題および局所的効果の乏しいことの問題に加えて、ヒトでのＢｉＴＥの半減期が短いことの問題が、本発明により解決される。具体的には、本発明は上記問題を、アデノウイルスベクターにより腫瘍においてＢｉＴＥを局所産生することにより解決し、この特徴は、固形腫瘍との関連で特に有利である（図９）。

本発明はまた、単一鎖ＢｉＴＥ分子の分泌が乏しいという問題を、驚くべきやり方で解決する。それは、腫瘍溶解性アデノウイルス（腫瘍細胞でのみ複製する）を用い、複製の最終段階が細胞溶解であれば、ＢｉＴＥが腫瘍の微小環境中に放出される、ということである（図８）。言い換えれば、本発明は、ＢｉＴＥ分泌の問題を、驚くべきことに、腫瘍溶解をＢｉＴＥ放出装置として利用することで解決する。本発明によると、ＢｉＴＥの分泌は不要であり、実際、分泌はむしろ好ましくなく、その理由は、さらなる態様においてはＢｉＴＥ発現を腫瘍のみに制限する（腫瘍細胞のみをウイルスで溶解する）からである。

ＢｉＴＥを腫瘍において産生することで、移植された養子Ｔ細胞を腫瘍に動員することができる（図１）。細胞表面分子受容体（たとえばＣＤ３受容体）への結合により、移植された細胞が腫瘍において活性化される。さらに、アデノウイルスによる腫瘍溶解が危険信号を発生し、これが腫瘍免疫抑制を打ち消す。これらの効果の総合効果により、いずれか単独の効果では達成しえない抗免疫抑制（anti-immunosuppressive）効果を達成する。注目すべきことは、アデノウイルスは、病原体関連パターン認識受容体への結合を介して発揮される、抗免疫抑制的危険信号の誘導能力に関して、腫瘍溶解性ウイルスのなかでも特異なことである。さらに、アデノウイルスはＴ細胞への顕著な効果を示し、一方、ワクシニアウイルスなどの他の多くの腫瘍溶解性ウイルスは、この点でむしろ目立たない性質を有する。言い換えれば、ワクシニアは養子細胞療法の増強には使用できない。最終的に、ワクシニアは養子細胞療法のための良好なプラットフォームではなく、一方、アデノウイルスは腫瘍免疫抑制の克服に最適の装置であることを示すデータを本願明細書は提供している。

抗ウイルス免疫は、腫瘍溶解性アデノウイルスを含めて、ウイルス療法を用いる手法に対して制限的であると考えられてきた。抗ウイルス免疫の１つの態様が抗ウイルスＴ細胞である。しかし、驚くべきことに本発明は、腫瘍におけるＢｉＴＥの産生に腫瘍溶解性アデノウイルスを用いると、抗ウイルスＴ細胞が再び腫瘍を標的とするようにさせることができることを明らかにした。この効果は治療中に増幅し、すなわち、腫瘍溶解性ウイルスの複製がさらなる抗ウイルスＴ細胞を生じ、これらのさらなる抗ウイルスＴ細胞はまた、ウイルスによって産生されたＢｉＴＥを介して腫瘍を標的とするようにされる（図７）。

１つの態様において本発明は、ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスによるＴ細胞療法の増強に関する。腫瘍溶解性アデノウイルスはＢｉＴＥを用いてＴ細胞療法を増強するための最適なプラットフォームであり、その理由は、腫瘍溶解の抗免疫抑制効果と腫瘍におけるＢｉＴＥ発現との間に意外な相乗効果が発揮されるためである。

本願明細書は、組換えアデノウイルスベクターの構築、アデノウイルスベクターに関連する方法、およびそれらの様々な使用を記載している。さらに、Ｔ細胞エンゲージャーをコードする本発明のアデノウイルスベクターを、癌治療のための養子細胞療法と組み合わせてもよい。

本発明の利点は、悪性腫瘍を治療する方法であって、有効量の本発明のアデノウイルスベクター（たとえば単独でまたはＴＩＬと共に）を癌患者に投与して癌の退縮または安定化を引き起こすことを含む方法によって達成される。

本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。

本発明はまた、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含み、
該二重特異性モノクローナル抗体が、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv とを含む、
腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。

本発明はまた、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが、
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含む、医薬組成物に関する。

さらに本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との組合せであって、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが、
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および
Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含む、組合せに関する。

さらに本発明は、癌の治療用である、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との組合せに関する。

さらに本発明は、癌の治療用である養子細胞療法用組成物と組み合わせた、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。

さらに本発明は、養子細胞療法用組成物と組み合わせた、癌の治療用である本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。

さらに本発明は、対象の癌の治療方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを対象に投与することを含む方法に関する。

さらに本発明は、対象における養子細胞療法の効果を増加させるために用いられる腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
Ｅ３領域中の欠失、および
Ｅ３領域中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。

さらに本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、それを必要とする対象へ投与することにより対象における養子細胞療法の効果を増加させるための方法であって、該腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが、
Ｅ３領域中の欠失、および
Ｅ３領域中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
を含み、
該対象は養子細胞療法を、すでに受けたか、または、これから受ける予定である、方法に関する。

本発明はまた、対象の癌の治療用薬剤製造への本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。

本発明はまた、対象における養子細胞療法の効果を増加させるための薬剤の製造への本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。

本発明の構成の利点は、増強された治療効果および低減された副作用であるが、これらに限定されない。本発明で得られる効果増強および本発明者らの手法の抗抑制効果により、移入細胞のための「場所をあける」目的および腫瘍免疫抑制を低減させる目的で従来技術の方法で使用されるプレコンディショニング用化学療法および／または放射線療法の必要性を低減できるので、重度の有害事象、さらには死亡が阻止される。

以下に、添付の図面に参照しながら、具体的態様をもって本発明をより詳しく説明する。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスによるＴ細胞療法の作用メカニズム。 アデノウイルスによる処理で腫瘍中に危険信号が誘導されることを示す。５／３キメラアデノウイルス（Ａｄ３由来の繊維ノブを有するＡｄ５ベースのベクター）による処理でＢ１６−ＯＶＡ腫瘍中に危険信号が誘導されることを、インターフェロンガンマ発現により示す。アデノウイルスの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）が宿主細胞上の Toll 様受容体（ＴＬＲ）に結合するとインターフェロンγの分泌を誘導し、これにより自然免疫応答と獲得免疫応答の急速な活性化が生じる。結果として、アデノウイルスは、免疫システムに効果的に認識される免疫学的腫瘍表現型を生成するために使用することができる。 アデノウイルスが腫瘍微小環境において抗免疫抑制効果を有することを示す。５／３キメラアデノウイルスはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍微小環境において抗免疫抑制効果を有する。腫瘍は免疫攻撃に対して高い耐性を有し、養子移入された多数の腫瘍特異的ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞でさえも腫瘍免疫抑制を克服できない。しかし、マウスを同時に５／３キメラアデノウイルスで処理すると、免疫抑制分子（たとえばＴＩＭ−３）が腫瘍において下方制御される。 免疫抑制を解除しただけでは、腫瘍へのＴ細胞の移動を誘導するには不十分であり、ＢｉＴＥが必要であることを示す。免疫抑制を解除しただけでは、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍へのＴ細胞の移動を誘導するには不十分である。５／３キメラアデノウイルスを腫瘍内に注入すると末梢血中にＣＤ＋８Ｔ細胞を誘導できるが、これらのＴ細胞は腫瘍に効率的には浸潤できない。このようにＴ細胞の腫瘍への移動の乏しいことが、腫瘍溶解性アデノウイルスと養子Ｔ細胞療法を各々単独で用いた場合の欠点の特筆すべき点である。一方、本発明においては、養子移入されたＴ細胞の移動をＢｉＴＥ発現性腫瘍溶解性アデノウイルスにより強化するものである。 細胞性抗腫瘍免疫の誘導においてアデノウイルスはワクシニアよりも優れることを示す。細胞性抗腫瘍免疫の誘導は、養子細胞療法の強化のために決定的に重要な特徴である。アデノウイルス（Ａｄ）とワクシニアウイルス（ＶＶ）との免疫原性の比較。脾臓腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルとＢ１６−ＯＶＡ腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは、５／３キメラアデノウイルスで処理したマウスにおけるほうが、二重欠失腫瘍溶解性ウェスタンリザーブ ワクシニアウイルス（この株は Yu et al Mol Ther 2014 で使用された）で処理したマウスにおけるよりも高かった。したがって、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その本来の免疫原性のために、特に養子Ｔ細胞療法の文脈において、ＢｉＴＥのための理想的な発現プラットフォームであると見受けられる。 抗腫瘍免疫の誘導においてアデノウイルスはワクシニアよりも効果的であることを示す。同系Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにＰＢＳ、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスを腫瘍内注射した。腫瘍細胞サンプルを、オボアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ残基に特異的なＴ細胞受容体を検出するＡＰＣ５量体で染色し、フローサイトメトリーで評価した（ｎ＝３）。データは、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス注入後の抗腫瘍Ｔ細胞の変化を示す。アデノウイルスは抗腫瘍免疫の誘導において遥かに効果的であり、一方、ワクシニアウイルスは抗腫瘍Ｔ細胞の文脈においてはむしろ免疫抑制的であった。 腫瘍溶解性アデノウイルスにより送達されたＢｉＴＥが、抗ウイルスＴ細胞を含めてすべてのクラスのＴ細胞を、腫瘍を標的とするようにさせることを示す。多くの患者において、抗ウイルスＴ細胞の数は抗腫瘍Ｔ細胞の数よりも遥かに多い（Kanerva A et al. Clin Cancer Res. 2013 May 15;19(10):2734-44）。一般的に、抗ウイルスＴ細胞は腫瘍療法にとっては非生産的と考えられており、その理由は、ａ）抗ウイルスＴ細胞は利用可能な有限の免疫応答の大部分を消費し、また、ｂ）抗ウイルスＴ細胞は腫瘍溶解性ウイルスの複製を制限する可能性がある、というものである。これとは反対に、本発明は驚くべきことに、抗ウイルスＴ細胞を、腫瘍を標的とするようにすることで、元々存在する抗アデノウイルスＴ細胞免疫と誘導された抗アデノウイルスＴ細胞免疫を利用するものである（図７）。アデノウイルスで処理した腫瘍のＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞と抗ウイルスＴ細胞の両方を含むので、ＢｉＴＥのＣＤ３に特異的な scFv は、これらのＴ細胞の内因的特異性とは関わりなく（ＭＨＣ Ｉ分子に依存せず）、Ｔ細胞を活性化する。その結果、これらのＴ細胞による腫瘍特異的殺傷を腫瘍細胞表面抗原（たとえばメソテリン、ＥｐＣＡＭ１、ＭＵＣ１）に特異的な scFv により達成でき、“off-tumor/off-target reactivity”（腫瘍以外のもの／標的以外のものとの反応性）は生じないものと考えられる。したがって、この手法により、ウイルスが産生したＢｉＴＥの結合を介して、全てのＣＤ８＋ＴＩＬ（＝抗腫瘍および抗ウイルス）を抗腫瘍Ｔ細胞へと転換する。 機能的抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルス（非増殖性アデノウイルスではなく）を用いることにより、効率的な癌細胞からの抗体の産生および放出が達成されることを示す。細胞にアデノウイルスを感染（濃度は、ウイルス粒子（ＶＰ）１００個／細胞）させて、数日後に抗体発現をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Ａ）またはウエスタンブロット（Ｂ）で分析した。感染後の各時点（図に示した）で、（Ａ）腫瘍溶解性ウイルスＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂ（灰色のバーと黒色のバー）は、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞からの機能的抗体の高度の産生を示した。具体的には、感染および癌細胞殺傷が進行している間、細胞溶解物（ＬＹＳ）中の抗体濃度は減少し、抗体は上清（ＳＮ）中に顕著に蓄積した。一方、これと異なり、非複製性ウイルスＡｄ５／３−Ａｂの場合は、細胞溶解物においては感染後第７日に抗体産生の証拠が示された（白色のバー）にもかかわらず、上清中には検出され得るほどの抗体を産生しなかった。注目すべきことは、非複製性ウイルスＡｄ５／３−Ａｂで処理した細胞は、実験期間を通じて生存しており、したがって、癌細胞による活発な抗体分泌を欠いていた、ということである。（Ｂ）図に示したウイルスに感染させてから６日後に、乳癌ＢＴ−４７４細胞（左）とヒト胚２９３細胞（右）の上清をウエスタンブロットで分析した。還元条件下で、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂにより産生された重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）および完全長抗体は両細胞系列の上清中で可視化させたが、一方、非複製性Ａｄ５−Ａｂウイルスと非複製性Ａｄ５／３−Ａｂウイルスについては、それらの複製を許さないＢＴ−４７４細胞からは抗体の放出は示されなかった。非複製性ウイルスによる抗体発現を確認するために、ヒト胚２９３細胞（右）（この細胞は、Ｅ１Ａ欠失アデノウイルスの複製をも許すものである）を用いたところ、細胞溶解と抗体放出が行われ、ウエスタンブロットで容易に検出された。ルシフェラーゼをコードする非複製性対照ウイルスＡｄ５／３−Ｌｕｃを、負の対照として用いた。ＨＣとＬＣを、それぞれ、ポリクローナル ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およびポリクローナル ロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体で検出した。抗体親和性は、ＨＣに対してよりもＬＣに対しての方が低く、より弱い信号を示すものであった。バーは、“平均 ± 標準誤差”を表す。図中の＊＊について、Ｐ＜０．０１ であり、図中の＊について、Ｐ＜０．０５ である。全て、スチューデントのＴ検定。 抗体（Ａｂ）をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスによる処理は、全身抗体（Systemic Ab）処理の後の場合に比べて、より高い腫瘍内抗体濃度とより低い全身抗体濃度を示す、ことを示す。皮下Ｎ８７胃癌異種移植片を有するヌード／ＮＭＲＩマウス（群当たり ｎ＝５）を、移植後第０日、第４日、第８日および第１５日に、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂの腫瘍内注射（２×１０^８ＶＰ／腫瘍）または市販の抗体の腹腔内注射（Ａｂ；０．３μｇ／ｇ）で処理した。これらマウスの健康状態をモニターし、第３２日と第４０日（全身Ａｂ）、第４６日（全身ＡｂおよびＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルス）、ならびに第５０日（Ａｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルス）に屠殺したマウスから腫瘍と血液サンプルを回収した。Ａ）屠殺時の腫瘍と血液サンプルをヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡで測定して抗体濃度を調べた結果、処理後第４６日と第５０日に屠殺したＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂ処理マウスは、腫瘍中にまだ有意に高い抗体濃度を示した（Ｐ＜０．００１、左）が、循環する血液中の濃度は、それより以前（第３２日、第４０日、第４６日）に屠殺した全身Ａｂ処理マウスと比較して、大幅に低かった（Ｐ＜０．００１、右）。Ｂ）個々のマウスの腫瘍および血液サンプルにおける抗体濃度を互いに比較して、抗体分布を評価した。Ａｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルスで処理したマウスにおける、血液中の抗体の濃度に対する腫瘍中の抗体の濃度の比の平均は１．０よりも高く、一方、全身Ａｂ処理の場合の上記の比の平均は０．０１未満という非常に低い値であった。したがって、抗体発現腫瘍溶解性ウイルスで処理すると腫瘍内の抗体濃度を改善でき、マウスにおける全身暴露を有意に低減できる。注目すべきことに、ウイルス処理したマウスの大部分がより長く生存（５０日まで）し、したがって、抗体が持続して局所的に産生される証拠が示された。エラーバーは、“平均 ＋ 標準誤差”を表す。図中の＊＊について、Ｐ＜０．０１ である。スチューデントのＴ検定。 Ｔ細胞疲弊マーカーと免疫抑制性受容体ＴＩＭ３の発現が、腫瘍溶解性アデノウイルスによる処置の後に減少し、生存期間の向上と相関することを示す。進行固形癌を有する１５人の患者を Advanced Therapy Access Program（先進医療アクセスプログラム）の環境において腫瘍溶解性アデノウイルスで処置した。ベースラインと処置後の腫瘍生検をＲＮＡマイクロアレー（HumanHT-12 v4 Expression BeadChips array、Illumina 社製）で分析し、遺伝子発現レベルを比較して、発現量が変動する遺伝子を同定した。Ｔ細胞免疫グロブリン ムチン−３（ＴＩＭ３）（腫瘍における自然免疫応答と獲得免疫応答の両方の疲弊マーカーおよび負の制御因子である）が、発現量が最も変動する遺伝子の１つであり、具体的には、ＴＩＭ３は５人の患者において大きな下方制御を示し（１．０を超える変化、Δ［ｌｏｇ２］）、また、４人の患者において小さな減少を示した（平均変化は０．３８、Δ［ｌｏｇ２］）。一方、６人の患者はＴＩＭ３の下方制御を示さず、そのうち２人は処置後に上方制御を示した。これらの群の間で全生存期間（overall survival）を比較したところ、ＴＩＭ３の下方制御を示した患者（ｎ＝９）は、「ＴＩＭ３に変化なし／下方制御」の患者（ｎ＝６）に比べて生存期間が有意に向上した（Ｐ＝０．００４、ログランク検定（Log-rank test））。ＴＩＭ３下方制御の群とＴＩＭ３上方制御の群における生存期間の中央値は、それぞれ、２０４日と６４日であった。したがって、腫瘍溶解性アデノウイルスによる処置を受けた患者の３分の２は免疫抑制性受容体と疲弊マーカーＴＩＭ３の減少を示したようであり、これは全生存期間の延長と強く相関する。 ＴＩＬと腫瘍溶解性アデノウイルスとの組合せで in vitro の細胞殺傷性が向上することを示す。ＨａｐＴ１細胞に腫瘍溶解性アデノウイルス（１００ＶＰ／細胞）を３日間かけて感染させてから、ＨａｐＴ１細胞にＴＩＬを加えた。標的細胞の生存率をＴＩＬ添加の２４時間後に決定した。エラーバーは、標準誤差を表す。図中の＊＊＊＊について、ｐ＜０．０００１ である。最良の細胞殺傷は、Ｔ細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスで刺激した場合に見られた。 ＢｉＴＥ分子の不存在下では、ＨａｐＴ１腫瘍から抽出したＴＩＬは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせても、標的細胞殺傷に関して追加的な効果を有しないことを示す。ＨａｐＴ１細胞を９６穴プレートに載せ、腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４、または、ヒトＩＬ−２で武装した該ウイルスと共に、５日間インキュベートした。樹立したＨａｐＴ１腫瘍から抽出したＴＩＬを細胞に１０：１の比で添加して、２４時間後に、細胞の生存率をＭＴＳアッセイで測定した。ウイルスとＴＩＬとの組合せによる相乗効果は見られなかった。 Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３ウイルスを、ヒトＣＤ３特異的ＥｐＣＡＭを標的とするＢｉＴＥ（抗ヒトＥｐＣａｍ、Cat#CABT-33295MH）およびＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）と組み合わせて用いると、結腸癌細胞系列ＳＷ４８０に示す in vitro の細胞溶解活性を示す。ａ）ＳＷ４８０腫瘍細胞を、Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３ウイルスのＶＰを増加させたもの（０．０１、０．１、１、１０、１００、 １０００ＶＰ）、および、１０ｎｇのＢｉＴＥで感染させた。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、エフェクターの標的に対する比を５：１として、添加した。ＭＴＳアッセイを用いて、感染から４８時間後の細胞の生存率を決定した。エラーバーは、３回の測定の標準誤差を表す。“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊）について、Ｐ＝０．０１８４ であり、“ウイルス＋細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ ＋ ＢｉＴＥ”（図中の＊＊＊）について、Ｐ＝０．００１ である。 Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３ウイルスを、ヒトＣＤ３特異的ＥｐＣＡＭを標的とするＢｉＴＥ（抗ヒトＥｐＣａｍ、Cat#CABT-33295MH）およびＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）と組み合わせて用いると、結腸癌細胞系列ＳＷ４８０に示す in vitro の細胞溶解活性を示す。ａ）ＳＷ４８０腫瘍細胞を、１０００ＶＰのＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３ウイルス、および、１０ｎｇのＢｉＴＥで感染させた。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、エフェクターの標的に対する比を５：１として、添加した。ＭＴＳアッセイを用いて、感染から４８時間後の細胞の生存率を決定した。エラーバーは、３回の測定の標準誤差を表す。“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊）について、Ｐ＝０．０１８４ であり、“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＢｉＴＥ ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊＊＊）について、Ｐ＝０．００１ であった。 アデノウイルスもＩＬ−２で武装したアデノウイルスも腫瘍にＴ細胞を蓄積させるには不十分であることを示す。アデノウイルスでの処理と養子Ｔ細胞移入とを組み合わせても、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫へのＴ細胞浸潤は最適値には達しない。処理開始から１８日後に回収した腫瘍をフローサイトメトリーで分析し、オボアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ）とｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を測定した。ＯＶＡとｇｐ１００は黒色腫細胞上に発現するエピトープである。異なる処理を行った群の間の相違は、統計的に有意ではなく、Ｔ細胞療法単独（ウイルス無し）の場合と異ならなかった。水平の線は、平均値を表す。 ハムスター膵臓腫瘍中の細胞障害性Ｔ細胞を示す。腫瘍溶解性アデノウイルスは、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍に動員することができない。皮下ハムスター膵臓腫瘍（ＨａｐＴ１）を腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４単独、またはヒトＩＬ−２で武装した該アデノウイルスで、１９日間に合計５回処理した。第２５日にハムスターを屠殺して、腫瘍細胞を交差反応性抗ラットＣＤ８ｂＰＥ抗体で標識した。（サンプル数は、モックのものおよび非武装のものそれぞれについて ｎ＝５ であり、ＩＬ２で武装したものについて ｎ＝１ であった）。腫瘍溶解性アデノウイルス単独では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍に動員することができなかった。ＩＬ２はもっと有望のように見えたが、増加は有意ではなかった。 免疫応答性ハムスターにおけるリチャレンジの結果を示す。非武装の腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４またはサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−２または両方）処理で武装した該アデノウイルスを用いて以前に治癒したハムスターは、同種の腫瘍（ＨａｐＴ１）には抵抗したが、別種の腫瘍（ＤＤＴ１−ＭＦ２）には抵抗しなかった。以前にどちらの細胞株にも遭遇しなかったナイーブなハムスターを、対照として用いた。防御免疫（＝腫瘍エピトープに対する記憶免疫のしるし）を誘導するためには、抗腫瘍免疫を誘導できる分子（たとえばＢｉＴＥ）でウイルスを武装することが必要である。 武装したまたは非武装の腫瘍溶解性アデノウイルスを、Ｔ細胞療法と併用する場合または併用しない場合の in vivo の効果を示す。樹立したＨａｐＴ１腫瘍に、第１日と第８日に腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４（１×１０^７ＶＰ／腫瘍）を腫瘍内注射した。第２日に、ex vivo で増殖させたＨａｐＴ１腫瘍浸潤リンパ球を腫瘍内注射で投与した（１．５×１０^６個のＴＩＬ／腫瘍）。エラーバーは、標準誤差を表す。図中の＊について、ｐ＜０．０５ であり、 図中の＊＊について、ｐ＜０．０１ である。最良の抗腫瘍効果は、腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスで処理し、かつ、ＴＩＬを加えた場合に見られた。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有する免疫応答性マウスに対してＡｄ−ＢｉＴＥとＯＴ１ Ｔ細胞移入とを組み合わせて用いる in vivo の抗腫瘍効果実験から得られる仮想上の結果を示す。皮下移植されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍（０．２５×１０^６個の細胞／腫瘍）を、ＣＤ８増強ＯＴ１ Ｔ細胞単独の腹腔内注射、Ａｄ−ＢｉＴＥ（１×１０^９ ＶＰ／腫瘍）単独の腫瘍内注射、またはその両方で処理するものとする。ウイルス注射を７日毎に繰り返すものとする。 アデノウイルスによるサイトカインＩＬ２とサイトカインＴＮＦａの送達が養子細胞療法の効果を強化することを示し、これにより、ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスにサイトカインを含める理由が提供される。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７マウスを、第１日に、武装アデノウイルス（ウイルス粒子数：１×１０^９）の腫瘍内注射、および、１．５×１０^６個のＣＤ８増強ＯＴ１ Ｔ細胞（細胞数：１．５×１０^６）の腹腔内注射で処理した。 本発明の構築デザインを示す。 本発明の構築マップを示す。

ウイルスベクター
本発明で使用される腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、ヒトまたは動物を治療するのに適した任意のアデノウイルスベクターであってよい。本願明細書において「腫瘍溶解性アデノウイルスベクター」とは、正常細胞に対する腫瘍細胞における選択的複製によって癌細胞に感染でき、殺傷できるアデノウイルスベクターを意味する。

本発明の１つの態様において、アデノウイルスベクターはヒトウイルスのベクターである。１つの態様において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５ベクター、Ａｄ３ベクターおよびＡｄ５／３ベクターよりなる群から選択される。本願明細書において「アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格」という表現は、Ａｄ５のゲノムを意味する。同様に、「アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格」はＡｄ３のゲノムを意味する。「Ａｄ５／３ベクター」は、Ａｄ５ベクターとＡｄ３ベクターの両方の一部を含むまたは有するキメラベクターを意味する。１つの特定の態様において、アデノウイルスベクターの骨格は、特定の変異を有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格、または、特定の変異を有するアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格である。たとえば、ベクターの繊維領域を改変できる。１つの態様において、骨格は、Ａｄ５由来の核酸骨格であってさらにＡｄ３由来の繊維ノブを含む。言い換えれば、構築物は、Ａｄ３由来の繊維ノブを有すると同時に、ゲノムの残りまたはゲノムの残りの大半がＡｄ５由来である。（たとえば、図２０を参照）

アデノウイルスベクターは、当技術分野において公知の任意の方法で、たとえば任意のウイルス領域を欠失、挿入、変異または改変することによって改変されていてもよい。ベクターを複製に関して腫瘍特異的にする。たとえばアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４における改変、たとえば腫瘍特異的プロモーターの挿入（たとえばＥ１を駆動するため）、領域（たとえば「Ｄ２４」に使用されるようなＥ１の定常領域２、Ｅ３／ｇｐ１９ｋ、Ｅ３／６．７ｋ）の欠失および導入遺伝子の挿入を含んでいてもよい。

腫瘍特異的腫瘍溶解性アデノウイルスを生成するための１つの手法は、Ｅ１の定常領域２（ＣＲ２）に影響を与える２４塩基対欠失（Ｄ２４）を作成することである。野生型アデノウイルスにおいてＣＲ２は、合成（Ｓ）期、すなわちＤＮＡ合成または複製期を誘導するための、細胞性Ｒｂ腫瘍抑制因子／細胞周期調節タンパク質を結合するのに関与している。ｐＲｂとＥ１Ａとの間の相互作用はＥ１Ａタンパク質保存領域のアミノ酸１２１〜１２７を必要とし、これらは本発明において欠失している。本発明のベクターは、Heise C. et al．（2000, Nature Med 6, 1134-1139）に従ってベクターのアミノ酸１２２〜１２９に対応するヌクレオチドの欠失を含む。Ｄ２４を有するウイルスは、Ｇ１−Ｓチェックポイントを克服する能力が低く、この相互作用が必要でない細胞、たとえばＲｂ−ｐ１６経路において欠陥のある腫瘍細胞においてのみ効率的に複製することが知られており、これは全てではないが大部分のヒト腫瘍を含む。本発明の１つの態様において、ベクターはアデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）を含む。（図２０を参照）

たとえば腫瘍特異的プロモーターによってＥ１Ａ内因性ウイルスプロモーターを置きかえることも可能である。本発明の１つの特定の態様において、たとえばＥ２Ｆ１プロモーター（たとえばＡｄ５ベースのベクターにおける）またはｈＴＥＲＴプロモーター（たとえばＡｄ３ベースのベクターにおける）がＥ１Ａ内因性ウイルスプロモーターの代わりに利用される。１つの態様において、本発明のベクターはＥ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーターを含む。

Ｅ３領域は in vitro でのウイルス複製に必須ではないが、Ｅ３タンパク質は宿主免疫応答の調節において、すなわち自然免疫応答と特異的免疫応答の両方の阻害において、重要な役割を有する。本発明の１つの態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのＥ３領域における核酸配列の欠失は、ウイルスｇｐ１９ｋリーディングフレームとウイルス６．７ｋリーディングフレームの欠失である。Ｅ３におけるｇｐ１９ｋ／６．７ｋ欠失は、アデノウイルスＥ３Ａ領域の９６５塩基対の欠失を意味する。得られたアデノウイルス構築物において、ｇｐ１９ｋ遺伝子と６．７ｋ遺伝子の両方が欠失している（Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94）。ｇｐ１９ｋ遺伝子産物は、小胞体内の主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ヒトにおいてＨＬＡ１として知られているＭＨＣ１）分子に結合して封鎖し、細胞障害性Ｔリンパ球による感染細胞の認識を阻止することが知られている。多くの腫瘍はＨＬＡ１／ＭＨＣ１に欠損があるので、ｇｐ１９ｋの欠失はウイルスの腫瘍選択性を増加させる（ウイルスは野生型ウイルスより速く正常細胞から除去されるが、腫瘍細胞内で相違は存在しない）。６．７ｋタンパク質は細胞表面上で発現され、それらはＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体２を下方制御するのに関わる。（図２０を参照）

ｇｐ１９ｋと６．７ｋの両方の欠失は本発明の１つの特定の態様に関して驚くべき利点を提供する。本発明者らは養子移入Ｔ細胞に対する腫瘍エピトープの提示のためのＨＬＡ／ＭＨＣの発現を回復しようと試みているので、ｇｐ１９ｋタンパク質の発現は非生産的であり、実際にＨＬＡ／ＭＨＣの上方制御はｇｐ１９ｋの欠失を必要とする。６．７ｋに関しては、本発明の１つの特定の態様はウイルスからのＴＮＦアルファの産生であり、その抗腫瘍活性の１つが、（形質導入と非形質導入バイスタンダー細胞の両方への）直接的な抗腫瘍アポトーシス促進効果であるので、６．７ｋの存在は非生産的である。

本発明の１つの態様において、１個または２個以上の導入遺伝子がＥ３プロモーターの支配下の、ｇｐ１９ｋ／６．７ｋ欠失Ｅ３領域内に配置される。これは、導入遺伝子発現を、ウイルスの複製およびその後のＥ３プロモーターの活性化を可能にする腫瘍細胞に制限する。１つの特定の態様において、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv を含む二部分分子（bipartite molecule）をコードする核酸配列が、ウイルスｇｐ１９ｋリーディングフレームとウイルス６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失の場所に挿入される。本発明の他の１つの態様において、Ｅ３ｇｐ１９ｋ／６．７ｋはベクター内に維持されるが、１つまたは多くの他のＥ３領域は欠失している（たとえばＥ３ ９−ｋＤａ、Ｅ３ １０．２ｋＤａ、Ｅ３ １５．２ｋＤａおよび／またはＥ３ １５．３ｋＤａ）。

Ｅ３プロモーターは、当技術分野において知られている任意の外因性プロモーター（たとえばＣＭＶまたはＥ２Ｆプロモーター）または内因性プロモーター、具体的には内因性Ｅ３プロモーターであってよい。Ｅ３プロモーターは主に複製によって活性化されるが、Ｅ１が発現される時、多少の発現が生じる。Ｄ２４型ウイルスの選択性はＥ１発現後（Ｅ１がＲｂに結合できない場合）に生じるので、これらのウイルスは形質導入正常細胞においてもＥ１を発現する。したがって、Ｅ３プロモーター媒介性導入遺伝子発現を腫瘍細胞に制限するためにＥ１発現も調節することが非常に重要である。

本発明の特定の態様は、二重選択性装置（すなわち、定常領域２が変異しており、産生されるＥ１Ａタンパク質が細胞中でＲｂに結合できないアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の前に配置されたＥ２Ｆ（たとえばＥ２Ｆ１）腫瘍特異的プロモーター）により複製がｐ１６／Ｒｂ経路に制限された、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター（たとえばＡｄ５ベクターまたはＡｄ３ベクター）を含む。さらに、繊維が５／３キメラ現象で改変されて腫瘍細胞への効率的侵入が可能になっている。また、ＢｉＴＥ導入遺伝子、および所望によりさらに他の導入遺伝子を、ｇｐ１９ｋオープンリーディングフレームと６．７ｋオープンリーディングフレームとが欠失したＥ３領域に配置する。この武装化手法は、導入遺伝子発現をウイルス複製に関連付けて、異種プロモーターの必要を無くするものである。特定の態様において、Ｌ（左）−ＩＴＲ配列および／またはＲ（右）−ＩＴＲ配列もベクターに含まれていてもよい。逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列はウイルスゲノムの効率的増幅を可能にし、とりわけ、ヘアピン形成能力を与える。

本発明の１つの特定の態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、
１）Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター；
２）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）；
３）ウイルスｇｐ１９ｋリーディングフレームとウイルス６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失；および
４）上記３）で定義する核酸配列欠失の代わりの、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv を含む二部分分子をコードする核酸配列、
を含む。（図２０を参照）

二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片を含み、したがって２種の異なる抗原に結合できる人工的なタンパク質である。言い換えれば、二重特異性抗体は、２個または３個以上の抗原認識要素を組み合わせて１つの構築物にしたものであり、２個または３個以上の標的に結合可能である。

二重特異性モノクローナル抗体の例はＢｓＭＡｂを含み、ＢｓＭＡｂは細胞障害性細胞（ＣＤ３などの受容体を用いる）と、破壊すべき腫瘍細胞などの標的との両方に同時に結合するように作成されている。第一世代のＢｓＭＡｂ（３価の抗体と呼ばれる）が開発されてきた。この抗体は、２種の異なる抗体に由来する２個の重鎖と２個の軽鎖からなる。２個のＦａｂ領域（腕の部分）は２種の抗原を標的とする。Ｆｃ領域（脚の部分）は２個の重鎖からなり、第３の結合部位を形成する。このために、３価の抗体と呼ばれるのである。他の種類の二重特異性抗体としては、化学結合されたＦａｂ（Ｆａｂ領域のみからなる）や、多様な種類の２価と３価の一本鎖可変断片（scFv）（すなわち２個の抗体の可変ドメインを模倣した融合タンパク質）がある。本発明の１つの特定の態様において、二重特異性モノクローナル抗体は、３価の抗体、および２価と３価の一本鎖可変断片（scFv）からなる群より選ばれる。本発明の１つの態様において、二重特異性モノクローナル抗体は２価の一本鎖可変断片である。２価の一本鎖可変断片の群に含まれるのは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）と、ｍＡｂ２（すなわちＦｃ定常領域の代わりにＦｃａｂ抗原結合断片を含むように設計・作成された抗体）である。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は人工的な二重特異性モノクローナル抗体の種類である。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、宿主の免疫システム、より詳しくはＴ細胞の細胞障害性を制御して、癌細胞への攻撃に向ける。ＢｉＴＥは、異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（scFv）、または４つの異なる遺伝子が発現するアミノ酸配列を合わせて約５５キロダルトンの単一のペプチド鎖にしてなる、融合タンパク質である。ＢｉＴＥにおける scFv のうちの１つは、細胞表面分子（たとえばＣＤ３受容体）を介してＴ細胞に結合し、他の１つは腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する。

１つの具体的態様において、二重特異性モノクローナル抗体は、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv を含む二部分分子である。本願明細書において「細胞表面分子に特異的な」とは、特定種類の細胞表面分子に結合する能力を意味する。また、本願明細書において「腫瘍抗原に特異的な」とは、特定種類の腫瘍抗原に結合する能力を意味する。

本発明の１つの態様において、該細胞表面分子は免疫エフェクター細胞上にある。本願明細書において「免疫エフェクター細胞」とは、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞、および末梢血単核細胞からなる群より選ばれる細胞を意味する。１つの具体的態様において、免疫エフェクター細胞とはＴ細胞、すなわちＴリンパ球を意味する。１つの態様において、細胞表面分子はＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４より選ばれてよい。

１つの態様において、腫瘍抗原は、表１（表−１〜表１−４）より選ばれるか、または、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１からなる群より選ばれる。

１つの態様において、細胞表面分子はＣＤ３であり、また、腫瘍抗原は、表１より選ばれるか、または、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１より選ばれる。他の１つの態様において、細胞表面分子はＣＤ８であり、また、腫瘍抗原は、表１より選ばれるか、または、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１より選ばれる。さらなる態様において、細胞表面分子はＣＤ４であり、また、腫瘍抗原は、表１より選ばれるか、または、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１より選ばれる。非常に具体的な１つの態様において、腫瘍抗原がメソテリンで、細胞表面分子がＣＤ３であり；腫瘍抗原がＥｐＣＡＭ１で、細胞表面分子がＣＤ３であり；または、腫瘍抗原がＭＵＣ１で、細胞表面分子がＣＤ３である。実際、ＢｉＴＥ導入遺伝子に関しては、具体例としては、抗メソテリン−リンカー−抗ＣＤ３、抗ＥｐＣＡＭ１−リンカー−抗ＣＤ３、および抗ＭＵＣ１−リンカー−抗ＣＤ３が挙げられる。

１つの態様において、本発明のベクターは、二重特異性モノクローナル抗体をコードし、さらに他の導入遺伝子を含んでもよい。１つの特定の態様において、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、２個または３個以上の導入遺伝子をコードする。本発明の特定の態様は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと少なくとも１つのサイトカインをコードするアデノウイルスベクターを含む。本発明に用いられるサイトカインは、当技術分野において公知の任意のサイトカインから選択できる。本発明の１つの特定の態様において、サイトカインはＩＬ−２、ＴＮＦアルファまたはＣＤ４０Ｌである。実際、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、二重特異性モノクローナル抗体に加えて、たとえば、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファおよび／またはＣＤ４０Ｌの導入遺伝子をさらに含んでもよい。

サイトカインは、腫瘍へのＴ細胞の動員を含む、様々な機構を介して作用することによって免疫応答に関与する。サイトカイン導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、任意の動物、たとえばヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、イヌまたはネコ由来であってもよいが、具体的には、それはヒト配列によってコードされる。導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、その効果を改善するために改変されていてもよく、また、改変されていない、すなわち野生型でもよい。

さらに、ＢｉＴＥと少なくとも１種のサイトカインの両方をコードするアデノウイルスベクターと養子細胞療法との組み合わせは、想定され得るよりも幅広い標的についてより効果的な結果を提供する。

他のサイトカインは、Ｔ細胞を誘引し、活性化し、腫瘍免疫抑制を低減することによって機能するのに対して、ＩＬ−２はＴ細胞移植片の増殖を誘導する。それゆえ、ＩＬ−２は、Ｔ細胞療法において典型的に行われるような全身注射（副作用を引き起こし得る）の代わりに、ＩＬ−２が必要とされる腫瘍において局所的に産生される。したがって、従来技術の療法の主要な問題（すなわち全身性ＩＬ−２の毒性）がこの態様によって防止され得る。実際、ウイルスが腫瘍内で複製しながらＩＬ２を産生する場合、細胞を患者内へ移入した後に移入細胞を増殖させ維持するために従来技術の方法で使用されるＩＬ２の別途投与が必要でないので、重度の有害事象、さらに死までも防止される。腫瘍における局所産生はまた、有害事象の原因である全身曝露を低減させながら、ＩＬ−２の所望の効果（移植片の刺激および増殖）を増強し得る。本発明は、健常組織に対する毒性または損傷の少ない選択的治療を提供する。

腫瘍溶解性ウイルスの複製と、ウイルスＤＮＡによる病原体関連分子パターン認識受容体の活性化と、導入遺伝子の作用とにより提供される危険信号は、腫瘍免疫抑制を、プレコンディショニング療法を省略できる程度まで低減させることができる。その結果として、従来技術における主要な問題であるプレコンディショニング化学療法および放射線に起因する毒性が回避され得る。

本発明の１つの態様において、ウイルスベクターは、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または所望によりリボソームシャント部位２Ａを含む。したがって、ＩＲＥＳまたはリボソームシャント部位２Ａが、任意の導入遺伝子、たとえば二重特異性モノクローナル抗体と任意のサイトカインとの間にあってよい。本願明細書において「ＩＲＥＳ」は、タンパク質合成においてメッセンジャーＲＮＡ配列の中間における翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。ＩＲＥＳは任意のウイルス由来であってよいが、本発明の１つの態様において、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来である。本願明細書において「リボソームシャント部位２Ａ」は、リボソームが５’非翻訳領域内の一部を物理的に迂回して開始コドンに到達するような、翻訳開始部位を意味する。ＩＲＥＳとＡ２の両方は、ウイルスに１つのプロモーター（Ｅ３プロモーター）から２つの導入遺伝子を産生させることができる。ＩＲＥＳはたとえば、アデノウイルス構築物における以下の部分で使用できる（図２０）。抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２（配列番号１、２、３、５、６、９参照）；抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ（配列番号１、２、３、５、６、７参照）；抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２（配列番号１、２、３、４、５、６参照）；抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ（配列番号１、２、３、４、５、７参照）；抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２（配列番号１、２、３、５、６、８参照）；抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ（配列番号１、２、３、５、７、８参照）。核酸配列は本発明のアデノウイルス構築物に由来し、表２に示す。

たとえば本発明に使用してよいウイルスゲノムの一般的な設計の概略図は、図２０に示される（Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子）。導入遺伝子として抗メソテリン−抗ＣＤ３（たとえば抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１、２、３、５、６、９参照；抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ、配列番号１、２、３、５、６、７参照）、抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３（たとえば抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１、２、３、４、５、６参照；抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ、配列番号１、２、３、４、５、７参照）、抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３（たとえば抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１、２、３、５、６、８参照；抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ、配列番号１、２、３、５、７、８参照）を含むウイルスベクターのヌクレオチド配列を、表２に挙げる配列にしたがって構築した。アデノウイルスベクター構築のための一般的方法は、当業者に周知であり、また、たとえば、Koski et al. 2010 および Hemminki et al. 2015 に記載されている。これらの方法を本発明のアデノウイルスベクターの構築にも使用してよい。

上記の他の利点に加えて、少なくとも１種のサイトカイン導入遺伝子を含むウイルスベクターを利用する本発明のさらなる利点は、以下の通りである。（ｉ）サイトカインおよびウイルス自体が、Ｔ細胞および他の免疫細胞を腫瘍に動員する危険信号を引き起こす。（ｉｉ）サイトカインが、腫瘍と局所リンパ器官の両方においてＴ細胞増殖を誘導する。（ｉｉｉ）サイトカインおよびウイルス自体が、Ｔ細胞（養子Ｔ細胞移植片と天然の先天性抗腫瘍Ｔ細胞の両方）が腫瘍において増殖するように誘導することができる。（ｉｖ）サイトカインおよび／またはウイルスが、癌細胞上の抗原提示分子（ＨＬＡ）の上方制御を誘導し、それらをＴ細胞による認識および殺傷に対して感受性にする。（ｖ）サイトカインおよびウイルス複製が、免疫抑制および細胞アネルギーを低減させることによって腫瘍微小環境を有利に変える。

本発明で用いるウイルスベクターはまた、上記以外の改変を含んでいてもよい。任意のさらなる構成成分または改変を所望により用いてもよいが、本発明に必須ではない。

外因性エレメントの挿入は、標的細胞においてベクターの効果を増強することができる。外因性組織または外因性腫瘍特異的プロモーターの使用は組換えベクターにおいて一般的であり、それらもまた本発明に利用することができる。

養子細胞療法
本発明の１つの手法は、癌と反応して癌を破壊することができる免疫リンパ球の移入を使用する、癌を有する患者のための治療の開発である。単離された腫瘍浸潤リンパ球は培養液中で多くの数まで成長し、患者内へ注入される。本発明において、少なくとも１種の二重特異性モノクローナル抗体をコードするアデノウイルスベクターを、リンパ球の効果を増加させるために利用することができる。本願明細書において、「養子細胞療法の効果を増加させる」という用語は、養子細胞療法用組成物を単独で用いた場合に比べ、本発明のアデノウイルスベクターを養子細胞療法用組成物と組み合わせて用いた場合の方が、対象への高い治療効果を引き起こすことができる状況を意味する。図１は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを用いたＴ細胞療法を図解することによって、効果を増加させる本発明の機構を説明している。本発明の１つの特定の態様は、対象の癌の治療方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを対象に投与することを含み、養子細胞療法用組成物を対象に投与することをさらに含む方法に関する。養子細胞療法用組成物と本発明のベクターとは、個別に投与される。養子細胞療法用組成物およびアデノウイルスベクターの個別投与に先立って、骨髄破壊的（myeloablating）または非骨髄破壊的（non-myeloablating）プレコンディショニング化学療法および／または放射線療法を行ってもよい。養子細胞療法による治療は、患者における癌を低減または除去することを意図する。

本発明の１つの特定の態様は、アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物（たとえば腫瘍浸潤リンパ球、ＴＣＲ改変リンパ球またはＣＡＲ改変リンパ球）とを用いた治療法に関する。本発明において、特にＴ細胞療法を用いてもよいが、他の養子療法、たとえばＮＫ細胞療法その他の細胞療法を用いてもよい。実際、本発明において、養子細胞療法用組成物は、ＴＩＬ療法におけるような改変されていない細胞、または遺伝子改変された細胞を含んでいてもよい。腫瘍特異的標的に対するＴ細胞の遺伝子ターゲティングを達成するための２つの一般的な方法が存在する。１つは、既知の特異性および一致したヒト白血球抗原（齧歯動物においては主要組織適合遺伝子複合体として知られている、ＨＬＡ）型を有するＴ細胞受容体の移入（ＴＣＲ療法）である。もう１つは、人工分子、たとえばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による細胞の改変である。この手法は、ＨＬＡに依存せず、ターゲティング分子に関してより柔軟性がある。たとえば、一本鎖抗体が使用されていてもよく、ＣＡＲも共刺激ドメインを組み込んでいてもよい。しかしながら、ＣＡＲ細胞の標的は標的細胞の膜上に存在することを必要とするのに対して、ＴＣＲ改変は細胞内標的を利用していてもよい。

本願明細書において、「養子細胞療法用組成物」とは、養子細胞移入に適した細胞を含む任意の組成物を意味する。本発明の１つの態様において、養子細胞療法用組成物は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＴＣＲ（即ち、異種Ｔ細胞受容体）改変リンパ球およびＣＡＲ（即ち、キメラ抗原受容体）改変リンパ球からなる群より選ばれる細胞種を含む。本発明の他の１つの態様において、養子細胞療法用組成物は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞および末梢血単核細胞からなる群より選ばれる細胞種を含む。他の１つの態様において、ＴＩＬ、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞または末梢血単核細胞は、養子細胞療法用組成物を形成する。本発明の１つの特定の態様において、養子細胞療法用組成物はＴ細胞を含む。本願明細書において、「腫瘍浸潤リンパ球」即ちＴＩＬとは、血流から出て腫瘍内に移動した白血球を意味する。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を含む３つの群に分類することができる。本発明の他の１つの特定の態様において、養子細胞療法用組成物は、標的特異的キメラ抗原受容体または特異的に選択されたＴ細胞受容体により改変されているＴ細胞を含む。本願明細書において、「Ｔ細胞」とは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞およびγδＴ細胞を含む、ＣＤ３＋細胞を意味する。

適切な細胞に加えて、本発明に使用される養子細胞療法用組成物は任意の他の薬剤、たとえば薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤、アジュバント、添加剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／または増粘剤、および／または対応する医薬品に通常見出される任意の構成成分を含んでいてもよい。組成物を製剤化するための好適な成分および適切な製造方法の選択は、当業者の常識に属する。

養子細胞療法用組成物は投与に適した任意の形態、たとえば固体、半固体または液体形態であってよい。製剤は、溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群より選択してもよいが、これらに限定されない。組成物は、特定の製剤に限定されず、任意の公知の薬学的に許容される製剤に製剤化してよい。医薬組成物は当技術分野において公知の任意の従来の方法によって製造してよい。

本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との組合せとは、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物とを使用するが、それぞれ別個の組成物として使用することを言う。当業者にとって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物とは単一の組成物として使用されるのではないことは明らかである。実際、アデノウイルスベクターは、養子細胞を改変するために使用するのではなく、標的腫瘍を改変し、それによって当該腫瘍が細胞移植の所望の効果を受けやすくなるようにするために使用される。特に、本発明は、腫瘍への養子移植細胞の動員を高め、養子移植細胞の腫瘍での活性を高める。本発明の１つの特定の態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との組合せは、同時にまたは任意の順序で連続して対象に投与するためのものである。

癌
本発明の組換えベクターは、腫瘍細胞内で複製可能である。本発明の１つの態様において、ベクターは、Ｒｂ経路、具体的にはＲｂ−ｐ１６経路を欠損している細胞の中で複製することが可能である。これらの欠損細胞には動物およびヒトにおける全ての腫瘍細胞が含まれる。本願明細書において、「Ｒｂ経路の欠損」とは、経路のいずれかの遺伝子またはタンパク質における変異および／または後成的変化を意味する。これらの欠損に起因して腫瘍細胞はＥ２Ｆを過剰発現するので、有効な複製に通常は必要とされるＥ１Ａ ＣＲ２によるＲｂの結合は不要である。さらに、本発明のアデノウイルスベクターの選択性はＥ２Ｆプロモーターによって媒介され、そのＥ２Ｆプロモーターは、Ｒｂ／ｐ１６経路欠損細胞において見られるように、遊離Ｅ２Ｆの存在下でのみ活性化する。遊離Ｅ２Ｆの不存在下ではＥ１Ａの転写は生じず、ウイルスは複製しない。アデノウイルスベクターがＥ２Ｆ１プロモーターを含むことは、正常組織内でのＥ１Ａの発現を阻止するのに重要である。正常組織内でＥ１Ａが発現すると、Ｅ３プロモーターからの導入遺伝子発現を許すことを通じて、直接にも間接にも毒性を引き起こし得る。

本発明は、対象における癌を治療するための手法に関する。本発明の１つの態様において、対象はヒトまたは動物、具体的には動物患者またはヒト患者、より具体的には癌を患っているヒトまたは動物である。

本発明の手法は、任意の癌または腫瘍（悪性腫瘍と良性腫瘍の両方を含む）を治療するために用いることができ、原発腫瘍と転移癌の両方が手法の標的であってもよい。本発明の１つの態様において、癌は腫瘍浸潤リンパ球の存在を特徴とする。本発明の手段は、腫瘍浸潤リンパ球の存在を特徴とする転移性固形腫瘍の治療に特に有望である。他の１つの態様において、Ｔ細胞移植片はキメラ抗原受容体の腫瘍または組織特異的Ｔ細胞受容体によって改変されている。

本願明細書において、「治療」または「治療する」という用語は、癌または腫瘍に関連する疾患または症状の完全な治癒だけでなく、予防、改善または緩和を含む目的のために、対象、好ましくは哺乳動物対象またはヒト対象への、少なくとも腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの投与、または少なくとも腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との投与を意味する。治療効果は、患者の症状、血液中などにおける腫瘍マーカー、腫瘍のサイズなど、または患者の生存期間の長さをモニターすることによって評価されてもよい。

本発明の１つの態様において、癌は、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌（renal cancer）、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌（choriocarcinoma）、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、ページェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎臓癌（kidney cancer）、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌（trophoblastic cancer）、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群より選ばれる。

ヒトまたは動物患者を本発明の治療法に適すると分類する前に、臨床医は患者を検査してもよい。正常から外れて腫瘍または癌の存在を示す結果に基づいて、臨床医は患者のために本発明の治療を提案してもよい。

医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の少なくとも１種類のウイルスベクターを含む。１つの態様において、本発明の医薬組成物は腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含み、該ベクターは、Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および、Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列を含み、該二重特異性モノクローナル抗体は、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的なscFvとを含むものである。さらに組成物は、少なくとも２種、３種または４種の異なるベクターを含んでいてもよい。ベクターに加えて、医薬組成物はまた、他の治療的に有効な薬剤、任意の他の薬剤、たとえば薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤、アジュバント、添加剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／または増粘剤、および／または対応する医薬品に通常見出される任意の構成成分を含んでいてもよい。組成物を製剤化するための好適な成分および適切な製造方法の選択は、当業者の常識に属する。

医薬組成物は投与に適した任意の形態、たとえば固体、半固体または液体形態であってよい。製剤は、溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群より選択されてもよいが、これらに限定されない。本発明の組成物は、特定の製剤に限定されず、任意の公知の薬学的に許容される製剤に製剤化してよい。医薬組成物は、当技術分野において公知の任意の従来の方法によって製造してよい。

本発明の１つの態様において、ウイルスベクターまたは医薬組成物はＴ細胞を動員するためのインサイチュービヒクル（in situ vehicle）として作用し、それらの治療効果を高め、腫瘍におけるそれらの増殖を可能にする。

本発明の医薬キットは、二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、または、養子細胞療法用組成物と二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターとを含んでいてよい。１つの特定の態様において、養子細胞療法用組成物は第１の製剤に製剤化され、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは第２の製剤に製剤化される。本発明の他の１つの態様において、第１の製剤および第２の製剤は、同時にまたは任意の順序で連続して対象へ投与するためのものである。

投与
本発明のアデノウイルスベクターまたは医薬組成物は、植物、動物およびヒトからなる群より選ばれる任意の真核生物対象に投与してよい。本発明の１つの特定の態様において、対象はヒトまたは動物である。動物は、ペット、家畜および生産動物からなる群より選択してよい。

任意の従来の方法を、ベクターまたは組成物を対象に投与するために用いてよい。投与経路は、組成物の製剤状態または形態、疾患、腫瘍の位置、患者、共存症および他の要因に依存する。

本発明の１つの態様において、アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との両方が対象に投与される。養子細胞療法用組成物と少なくとも１種の二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターとの対象への投与は、同時にまたは任意の順序で連続して行ってよい。本発明の１つの態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物とは、個別に投与される。本願明細書において、「個別投与」または「個別」とは、養子細胞療法用組成物と腫瘍溶解性アデノウイルスベクターとが、互いに別個の２つの異なる医薬品または組成物である状況を意味する。

本発明のアデノウイルスベクターの１回のみの投与、または養子細胞療法用組成物とアデノウイルスベクターとの１回のみの投与が、治療効果を有してもよい。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの投与の間隔、および、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞療法用組成物との投与の間隔は、たとえば患者および癌の種類、程度または位置に応じて、任意の期間であってよい。本発明の１つの態様において、養子細胞療法用組成物および二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの連続投与の間隔は、１分〜４週間、具体的には１〜１０日、より具体的には１〜５日の期間である。養子細胞療法用組成物と腫瘍溶解性アデノウイルスベクターとを複数回投与することも可能である。養子細胞療法用組成物および腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの投与回数はまた、治療期間の間、異なっていてもよい。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬もしくは養子細胞療法用組成物は、たとえば、最初の２週間、４週間、１カ月間または治療期間の間に１〜１０回投与してよい。本発明の１つの態様において、ベクターまたは任意の組成物の投与は、最初の２週間、次の４週間、その次の１カ月間に、それぞれ３〜７回行われる。本発明の１つの特定の態様において、投与は、最初の２週間、次の４週間、その次の１カ月間に、それぞれ４回行われる。治療期間の長さは様々に変動して選択ができ、たとえば２〜１２カ月またはもっと長く続けてもよい。

本発明の１つの特定の態様において、養子細胞療法用組成物および腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは同日に投与され、その後、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、たとえば１〜６カ月または１〜１２カ月またはもっと長く続けてもよい治療期間の間、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または１カ月に１回、投与される。

本発明の１つの態様において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、腫瘍内注射、動脈内注射、静脈内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、腔内注射もしくは腹膜注射、または経口投与により行われる。投与の任意の組合せも可能である。本発明の手法は、局所注射であるにも関わらず全身的効果を与えることができる。養子細胞療法用組成物は、静脈内または腫瘍内に投与してもよい。１つの態様において、養子細胞療法用組成物および／または少なくとも１種の二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスベクターの投与は、腫瘍内注射、動脈内注射、静脈内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、腔内注射もしくは腹膜注射、または経口投与により行われる。本発明の１つの特定の態様において、ＴＩＬまたはＴ細胞は静脈内に投与され、ウイルスベクターは腫瘍内および／または静脈内に投与される。注目すべきことに、ウイルスはＴ細胞の投与とは別に腫瘍に送達されるのであって、ウイルスは ex vivo でＴ細胞移植片を改変するために使用されるのではない。本質的に、Ｔ細胞移植片がよりよく作用できるようなやり方で、ウイルスは腫瘍を改変する。

ベクターの有効量は、治療を必要とする対象、腫瘍の種類、腫瘍の位置および腫瘍のステージに少なくとも依存する。投与量は、たとえば約１×１０^８ウイルス粒子（ＶＰ）〜約１×１０^１４ＶＰ、具体的には約５×１０^９ＶＰ〜約１×１０^１３ＶＰ、より具体的には約８×１０^９ＶＰ〜約１×１０^１２ＶＰの範囲内で変動して選択ができる。１つの態様において、二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、１×１０^１０〜１×１０^１４ウイルス粒子の量で投与される。本発明の他の１つの態様において、投与量は約５×１０^１０〜約５×１０^１１ＶＰの範囲である。

移入される細胞の量もまた患者によって変動するが、典型的な量は１回の注射につき１×１０^９〜１×１０^１２個の細胞の範囲である。注射の回数も変動するが、典型的な態様は、数週間（たとえば２〜４週間）の間隔を空けた１または２ラウンドの治療を含む。

任意の他の治療または治療の組合せを、本発明の治療法に加えて用いてもよい。１つの特定の態様において、本発明の方法または使用は、放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法または他の抗癌薬もしくは介入（手術を含む）の対象への同時または順次の適用をさらに含む。

本願明細書において、「治療する」または「増加する」という用語、およびそれらから派生する単語は、必ずしも１００％即ち完全な治療または増加を意味するとは限らない。むしろ、当業者が潜在的な利点または治療効果を有すると認識する様々な程度が存在する。これに関して、本発明の方法は、Ｔ細胞療法の効果において任意の量の増加を提供でき、または疾患の任意の程度の治療または予防を提供できる。

図１〜７は、本発明の方法および機構を示す。

技術の進歩に応じて本発明の考えが様々な方法で適用され得ることは、当業者には明らかである。本発明およびその諸態様は、上記の例に限定されず、特許請求の範囲内で変更してもよい。

材料および方法
Ｂ１６−ＯＶＡ動物モデル：オボアルブミンを発現するＢ１６細胞（Ｂ１６−ＯＶＡ）を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、２０ｍＭのＬ−グルタミン、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液（GIBCO 社製）中に維持した。４〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６免疫応答性メスマウスに、５０μｌのＲＰＭＩ、０％ＦＢＳ中の２．５×１０^５個のＢ１６−ＯＶＡ細胞を、１匹のマウスにつき１つの腫瘍で右脇腹に皮下移植した。腫瘍移植のおおよそ１０日後（腫瘍が注射可能な、約３ｍｍの最小直径になったとき）、マウスを群に分け、いくつかの実験において、５０μｌのＰＢＳまたは５０μｌのＰＢＳ中の腫瘍溶解性アデノウイルスの１×１０^９個のウイルス粒子（ＶＰ）のいずれかの腫瘍内注射により６日間連続して処理した。別の実験において、第０日、第２日および第４日に３回注射を与えた。マウス細胞はヒトアデノウイルスに対して非許容性であるので、ウイルス複製により誘導される炎症を模倣するために複数の腫瘍内ウイルス注射を使用した（Blair et al., 1989）。

養子移入：腫瘍内処理の最初の日に、マウスはまた、養子移入によって腹腔内空洞において、１００μｌのＲＰＭＩ、０％ＦＢＳ中の一晩置いた、ＣＤ８ａを濃縮し増殖させた５×１０^５〜２×１０^６個の脾細胞を受けた。この脾細胞は、オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８ Ｔ細胞受容体のみを有するように遺伝子操作された４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ（ＯＴ−１）マウスに由来するものであった。ＣＤ８ａ濃縮は、製造業者の説明書（米国 Miltenyi Biotech 社製、カタログ番号 130-049-401）に従って移入の５日前にマウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓによって実施した。濃縮細胞は、組換えマウスＩＬ−２（１６０ｎｇ／ｍｌ）および可溶性抗マウスＣＤ３ε抗体（０．３μｇ／ｍｌ、Abcam 社製、クローン 145-2C11）の存在下でリンパ球培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのＬ−グルタミン、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）中で５日間増殖させた。

フローサイトメトリーのための組織処理：マウスを安楽死させ、脾臓、流入領域リンパ節および腫瘍を１〜１０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中で採取し、末端心臓出血によって血液を胸腔内に回収し、使い捨てシリンジによってＥＤＴＡ含有微小遠心管内に移し、分析のために処理した：固形腫瘍組織を外科用メスによって大まかに解離し、５〜１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）入りの１０ｍｌの使い捨て滅菌ピペットチップ中で粉砕し、室温（ＲＴ）にて約２０分間インキュベートし、細胞を１２００ｒｐｍ、５分間、＋４℃にてペレット化し、その後、細胞の推定量に応じて、細胞を１〜１０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、４０μｍの無菌フィルターを通過させ、単個細胞溶液を作製した。いくつかの実験において、代わりに腫瘍組織を、外科用メスを用いて切断した直後（ＡＣＫを加える前）に、３７℃、５％ＣＯ_２にて１〜２時間、全体積１ｍｌのプロテアーゼカクテル（ＲＰＭＩであって、以下のものが補足されている：１ｍｇ／ｍｌのＡ型、Ｈ型またはＰ型コラゲナーゼ、Roche 社製、および、ベンゾナーゼ、１２５単位／ｍｌ（最終濃度）、Sigma 社製、E1014-25KU）中で処理し、その後、１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液を加え、細胞を上記のように処理した。２００μｌの全血を５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液中にピペットで加え、上記のように処理した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートするか、または、直接に免疫染色およびフローサイトメトリーによって分析した。

サイトカイン分析のための組織処理：マウスを安楽死させ、約２〜１０ｍｍ^３の腫瘍断片をドライアイス上の２ｍｌの微小遠心管内で凍結し、−８０℃で保存した。腫瘍断片を秤量し、２００μｌの氷冷ＰＢＳを加えた。断片を Tissue Master 125 ローターによりホモジナイズし、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma 社製）および０．１％（最終濃度）ＢＳＡを加え、管を氷上に維持した。腫瘍ホモジネートを２０００ｒｐｍ、１０分間、＋４℃にて回転させ、製造業者の説明書に従って、BD FACSArray 上で CBA Flex Set サイトカインビーズ（米国ＢＤ社製）を用いて上清を分析した。

本発明を支持する実験
実験は、本願明細書の「材料および方法」の項と、公報 WO2014170389 および以前に公刊された論文（Parviainen et al. 2014, Tahtinen et al. 2015, Tahtinen et al. 2015）に記載された実験の項にしたがって、実施した。

実験１（アデノウイルスを用いた処理は、腫瘍に危険信号を誘導する）
５／３キメラアデノウイルスであるＡｄ５／３−ｄ２４−ＧＭＣＳＦによる処理は、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍に危険信号を誘導した。宿主細胞上の Toll 様受容体（ＴＬＲ）へのアデノウイルス病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の結合は、インターフェロン−γの分泌を誘導する。インターフェロン−γは、免疫細胞の活性化とＴ細胞の刺激とに関係し、自然免疫応答および獲得免疫応答の急速な活性化を導く。したがって、アデノウイルスを、免疫系によって効果的に認識される免疫原性腫瘍表現型を生成するために用いることができる。（図２）

実験２（アデノウイルスは、腫瘍微小環境において、抗免疫抑制効果を有する）
５／３キメラアデノウイルスは、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍微小環境において抗免疫抑制効果を有した。腫瘍は免疫攻撃に対して大きな抵抗力を有し、多数の腫瘍特異的ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞をもってしても、腫瘍免疫抑制を克服できなかった。しかし、５／３キメラアデノウイルスをも同時に用いてマウスを処理したら、腫瘍中の免疫抑制分子（たとえばＴＩＭ−３）は下方制御された。（図３）

実験３（免疫抑制を解除することだけでは、腫瘍へのＴ細胞の移動を誘導するのに十分ではない：ＢｉＴＥが必要である）
免疫抑制を解除することは、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍へのＴ細胞の移動を誘導するのに十分ではなかった。５／３キメラアデノウイルスの腫瘍内注射はＣＤ８＋Ｔ細胞を末梢血液に誘導したが、これらの細胞は腫瘍に効率的には浸潤しなかった。腫瘍へのＴ細胞のこの不十分な移動は、腫瘍溶解性アデノウイルスと養子Ｔ細胞療法とをそれぞれ単独で用いることの欠点を強く示すものであり、本発明が、養子的に移送されたＴ細胞の輸送を、ＢｉＴＥを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによって高めることを支持するものである。（図４）

実験４（アデノウイルスは、細胞性抗腫瘍免疫を誘導することにおいて、ワクシニアより優れている：養子細胞療法の効果を高めるための決定的に重要な特徴）
アデノウイルス（Ａｄ）とワクシニアウイルス（ＶＶ）との免疫原性の比較。脾臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度およびＢ１６−ＯＶＡ腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度は、二重欠失腫瘍溶解性ウェスタンリザーブ ワクシニアウイルス（この株は、Yu et al Mol Ther 2014 によって使用された）で処理したマウスにおいてよりも、５／３キメラアデノウイルスで処理したマウスにおいての方が高かった。したがって、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その本来の免疫原性により、特に養子Ｔ細胞療法の文脈において、ＢｉＴＥのための理想的な発現プラットホームのようである。（図５）

実験５（アデノウイルスは、抗腫瘍免疫を誘導することにおいて、ワクシニアより効果的である）
ＰＢＳ、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスを、同系Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスに腫瘍内注射した。腫瘍細胞サンプルを、オボアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ残基に特異的なＴ細胞受容体を検出するＡＰＣ５量体で染色し、フローサイトメトリーによって評価した（ｎ＝３）。データは、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスの注射の後の抗腫瘍Ｔ細胞の変化を示す。抗腫瘍免疫を誘導することにおいて、アデノウイルスの方が遥かに効果的であった。（図６）

実験６（腫瘍溶解性アデノウイルスによって送達されるＢｉＴＥは、腫瘍療法にとっては非生産的と一般的に考えられている抗ウイルスＴ細胞を含め、すべてのクラスのＴ細胞が腫瘍を標的とするようにさせる）
さらに、本発明は、通常はアデノウイルスベクターの臨床的利用を制限する、ヒト集団における広範な既存のＡｄ５ Ｔ細胞免疫を利用する。アデノウイルス処理した腫瘍のＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞および抗ウイルスＴ細胞の両方を含むので、ＢｉＴＥのＣＤ３に特異的な scFv は、これらのＴ細胞の内因的特異性にかかわりなく（ＭＨＣ Ｉ分子に依存せず）、これらのＴ細胞を活性化する。したがって、これらのＴ細胞による腫瘍特異的殺傷は、腫瘍細胞表面抗原（たとえば、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１）に特異的な scFv によって達成されるのであって、off-tumor/off-target reactivity（腫瘍以外のもの／標的以外のものとの反応性）は生じないものと考えられる。したがって、この手法は、ウイルスによって産生されたＢｉＴＥの結合を介して、すべてのＣＤ８＋ＴＩＬ（＝抗腫瘍および抗ウイルス）を抗腫瘍Ｔ細胞へと転換する。（図７）

実験７（機能的抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルス（非複製性アデノウイルスではなく）が、癌細胞からの抗体の効率的な産生と放出とをもたらす）
ＳＫＯＶ−３細胞、ＢＴ−４７４細胞および２９３細胞を、図に示したアデノウイルスに感染させ（１００ウイルス粒子（ＶＰ）／細胞）、数日後、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Ａ）またはウェスタンブロット（Ｂ）により、抗体発現を分析した。感染後の各時点（図に示した）において、（Ａ）腫瘍溶解性アデノウイルスであるＡｄ５／３−ｄ２４−Trastuzumab（灰色のバーおよび黒色のバー）は、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞からの機能的抗体の高い産生を示した。抗体の濃度は、感染および癌細胞殺傷が進行している間、細胞溶解物（ＬＹＳ）においては減少し、上清（ＳＮ）においては有意な増加を示した。（図において、ＯＶはＡｄ５／３−ｄ２４を表し、Ａｂは抗体 Trastuzumab を表す。）対照的に、非複製性ウイルスであるＡｄ５／３−Ａｂは、細胞溶解物においては感染後第７日に抗体産生の証拠（白色のバー）が示されたにもかかわらず、上清においては検出され得るほどの抗体を産生しなかった。注目すべきことに、非複製性ウイルスＡｄ５／３−Ａｂで処理した細胞は、実験の間中、生存しており、癌細胞による活発な抗体の分泌がなかったことを示した。一方、（Ｂ）乳癌ＢＴ−４７４細胞（左）およびヒト胚２９３細胞（右）の上清を、図に示したウイルスに感染させてから６日後にウェスタンブロットで分析した。還元条件の下で、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂによって産生される重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）および完全長抗体を、両方の細胞株の上清において可視化させた。一方、非複製性ウイルスＡｄ５−Ａｂおよび非複製性ウイルスＡｄ５／３−Ａｂについては、それらの複製を許さないＢＴＢ−４７４細胞からは抗体の放出は示されなかった。非複製性ウイルスによる抗体発現を確認するために、ヒト胚２９３細胞（右）（この細胞は、Ｅ１Ａ欠失のアデノウイルスの複製をも許すものである）を用いたところ、細胞溶解および抗体放出が行われ、ウェスタンブロットで容易に検出された。ルシフェラーゼをコードする非複製性ウイルスであるＡｄ５／３−Ｌｕｃを、負の対照として用いた。ＨＣ及びＬＣを、それぞれポリクローナル ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およびポリクローナル ロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて検出した。抗体親和性は、ＨＣに対するよりもＬＣに対する方が低く、より弱い信号を示すものであった。バーは、“平均 ± 標準誤差”を表す。図中の＊＊について、Ｐ＜０．０１ であり、図中の＊について、Ｐ＜０．０５ である。すべて、スチューデントのＴ検定。（図８）

実験８（抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスによる処理を行うと、全身抗体処理の後よりも、腫瘍内抗体濃度が高く、全身抗体濃度が低い）
皮下Ｎ８７胃癌（Park et al. 1990）異種移植片を有するヌード／ＮＭＲＩマウス（群当たり ｎ＝５）を、第０日、第４日、第８日および第１５日に、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂ（２×１０^８ ＶＰ／腫瘍）の腫瘍内注射または市販の抗体（Ａｂ； ０．３ μｇ／ｇ）の腹腔内注射で処理した。動物の健康をモニターし、腫瘍および血液サンプルを、第３２日および第４０日（全身Ａｂ処理）、第４６日(全身Ａｂ処理、およびＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルス処理)、ならびに第５０日（Ａｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルス処理）に屠殺したマウスから回収した。Ａ） 動物屠殺時における腫瘍および血液サンプルをヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡで測定して抗体濃度を評価した。処理後第４６日および第５０日に屠殺したＡｄ５／３−ＯＶ−Ａｂ処理マウスは、より早く第３２日、第４０日および第４６日に屠殺した全身Ａｂ処理マウスに比べ、腫瘍において依然として有意により高い抗体濃度を示した（Ｐ＜０．００１、左）が、循環する血液においてはずっと低い濃度を示した（Ｐ＜０．００１、右）。Ｂ） 個々の各動物の腫瘍および血液サンプルにおける抗体濃度を比較して、抗体分布を評価した。血液中の抗体に対する腫瘍中の抗体の比の平均は、Ａｄ５／３−ＯＶ−Ａｂウイルスで処理したマウスにおいては１．０を越えたが、全身Ａｂ処理マウスにおいては０．０１未満という非常に低い比であった。したがって、抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルスによる処理は、動物における抗体の全身的暴露を有意に低減させつつ、改善された腫瘍内抗体濃度を達成することができる。注目すべきことに、ウイルスで処理したマウスの大部分は、より長く生存し（５０日間まで）、したがって、抗体が持続して局所的に産生される証拠を示した。エラーバーは、“平均 ＋ 標準誤差”を表す。図中の＊＊について、Ｐ＜０．０１ である。スチューデントのＴ検定。(図９)

実験９（Ｔ細胞疲弊マーカーおよび免疫抑制性受容体ＴＩＭ３の発現は、腫瘍溶解性アデノウイルスによる処置の後に減少し、改善された生存期間と相関する）
進行した固形腫瘍を有する１５人の患者を、Advanced Therapy Access Program（Taipale et al. 2016）の環境において腫瘍溶解性アデノウイルスで処置した。ベースラインおよび処置後の腫瘍生検をＲＮＡマイクロアレー（HumanHT-12 v4 Expression BeadChips array, Illumina 社製）によって分析し、遺伝子発現レベルを比較して、発現量が変動する遺伝子を同定した。Ｔ細胞イムノグロブリン ムチン−３（ＴＩＭ３）（疲弊マーカーであり、腫瘍における自然免疫応答および獲得免疫応答の両方の負の制御因子である）は、発現量が最も大きく変動する遺伝子のうちの１つであった。ＴＩＭ３は、５人の患者において大きな下方制御を示し（１．０を超える変化、Δ［ｌｏｇ２］）、４人の患者において小さな減少を示した（平均変化は０．３８、Δ［ｌｏｇ２］）小さな。一方、６人の患者はＴＩＭ３の下方制御を示さなかった。これら６人のうち２人は、処置後に上方制御を示した。全生存期間をこれらの患者群の間で比較したところ、ＴＩＭ３の下方制御を示した患者群（ｎ＝９）は、ＴＩＭ３の「無変化／上方制御」の患者群（ｎ＝６）よりも有意に改善された生存期間（Ｐ＝０．００４、ログランク検定）を示した。生存期間の中央値は、ＴＩＭ３下方制御の患者群およびＴＩＭ３上方制御の患者群において、それぞれ２０４日および６４日であった。したがって、腫瘍溶解性ウイルスによる処置を受けた患者の３分の２は、免疫抑制性受容体および疲弊マーカーＴＩＭ３の減少を示したようであり、これは全生存期間の延長と強く相関する。(図１０)

実験１０（ＴＩＬと腫瘍溶解性アデノウイルスとの組合せによる in vitro 細胞殺傷の改善）
ＨａｐＴ１細胞を、ＨａｐＴ１へのＴＩＬの添加の３日前に、腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−ｄ２４（１００ ＶＰ／細胞）に感染させた。標的細胞の生存率を、ＴＩＬの添加の２４時間後に測定した。エラーバーは、標準誤差を表す。図中の＊＊＊＊について、ｐ＜０．０００１ である。最高の殺傷は、Ｔ細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスで刺激したときに見られた。(図１１)

実験１１（ＢｉＴＥ分子が存在しない場合、ＨａｐＴ１腫瘍から抽出されたＴＩＬは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせても、標的細胞殺傷に関して追加的な効果を有しない）
ＨａｐＴ１細胞を９６穴のプレートに載せ、非武装の腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４、または、ヒトＩＬ−２で武装した該ウイルスと共に、５日間インキュベートした。樹立したＨａｐＴ１腫瘍から抽出したＴＩＬを細胞に１０：１の比で添加して、２４時間後にＭＴＳアッセイによって細胞の生存率を測定した。ウイルスとＴＩＬとの組合せによる相乗効果は見られなかった。(図１２)

実験１２（“ウイルス ＋ ＢｉＴＥ ＋ ＰＢＭＣ”という組合せが達成する優れた溶解活性）
ＳＷ４８０腫瘍細胞を９６穴プレートに蒔き（１００００個の細胞／穴）、２４時間インキュベートした。細胞を、ウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３（０．０１個、０．１個、１個、１０個、１００個および１０００個のウイルス粒子／細胞）および１０ｎｇのヒトＣＤ３特異的ＥｐＣＡＭを標的とするＢｉＴＥ（Antihuman EpCam, Cat#CABT-33295MH）に感染させた。ただし、実験は少なくとも３回行い、アッセイ培地（Ｌ−１５、２％ＦＢＳ、２ ｍＭのＬ-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の量は、５０μｌ／穴であった。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、エフェクターの標的に対する比を５：１として、添加した。翌日、５０μｌの１０％ Ｌ−１５を細胞に添加した。感染の４８時間後、感染培地を 10% CellTiter 96 AQueous One Solution（米国ウィスコンシン州マディソン市 Promega 社製）を含む１００μｌの増殖培地に置き換えて、２時間インキュベートした。吸光度を４９０ｎｍで読み取った。エラーバーは、３回の測定の標準誤差を表す。“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊）について、Ｐ＝０．０１８４ であり、“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ ＋ ＢｉＴＥ”（図中の＊＊＊）について、Ｐ＝０．００１ であった（図１３Ａ）。図１３Ｂ：ＳＷ４８０腫瘍細胞を、ウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４−Ｅ３（１０００ＶＰ）および１０ｎｇのＢｉＴＥに感染させた。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、エフェクターの標的に対する比を５：１として、添加した。ＭＴＳアッセイを用いて、感染の４８時間後における細胞生存率を測定した。エラーバーは、３回の測定の標準誤差を表す。“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊）について、Ｐ＝０．０１８４ であり、“ウイルス ＋ 細胞”対“ウイルス ＋ ＢｉＴＥ ＋ ＰＢＭＣ”（図中の＊＊＊）について、Ｐ＝０．００１ であった。

分画産物法
相乗効果を評価するために、分画産物法を用いた。この方法は、Webb（Webb J, 1963）によって初めて開発された方法に由来する。

式 ＝ 期待値（単一療法による産物）／観測値（ウイルス ＋ ＰＢＭＣ ＋ ＢｉＴＥ）

ただし

期待値（単一療法による産物）
＝（ウイルス ＋ 細胞）×（ウイルス ＋ ＰＢＭＣ ＋ 細胞）

０．１ ＶＰ ＝ １．２４５ ＝ 相乗的
１ ＶＰ ＝ １．３２ ＝ 相乗的
１０ ＶＰ ＝ １．２ ＝ 相乗的
１００ ＶＰ ＝ １．１ ＝ 相乗的
１０００ ＶＰ ＝ １．１ ＝ 相乗的

鍵：
相乗的 ＝ 比が１より大きい
追加的効果 ＝ 比が１に等しい
対抗作用 ＝ 比が１より小さい

結果：
これらの結果は、ＢｉＴＥがＴＩＬＴ社製の腫瘍溶解性アデノウイルスと相乗的であることを示す。

実験１３（Ｂ１６−ＯＶＡ標的細胞に対してＡｄ−ＢｉＴＥとＯＴ１ Ｔ細胞とを組み合わせて用いる in vitro 細胞生存率測定実験）（Ａｄ−ＢｉＴＥは、ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスを表す）
Ｂ１６−ＯＶＡ細胞を、９６穴プレートに、１×１０^４個の細胞／穴 で載せ、Ａｄ−ＢｉＴＥ（１００ ＶＰ／細胞）、Ｔ細胞（標的に対するエフェクターの比は、２：１）またはこれらの両方に感染させた。２４時間後に、ＭＴＳアッセイを用いて細胞生存率を測定した。

実験１４（アデノウイルスまたはＩＬ２で武装したアデノウイルスは、Ｔ細胞を腫瘍に蓄積させるためには十分ではない）
アデノウイルス処理を養子Ｔ細胞移送と組み合わせたところ、Ｔ細胞のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍への浸潤は、最適値には達しなかった。処理を開始してから１８日後に回収された腫瘍をフローサイトメトリーを用いて分析し、オボアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ）およびｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を測定した。ＯＶＡおよびｇｐ１００は、メラノーマ細胞上に発現されるエピトープである。異なる処理を行った群の間の相違は、統計的に有意ではなく、また、Ｔ細胞療法単独（ウイルスなし）と異ならなかった。水平の線は、平均値を表す。(図１４)

実験１５（腫瘍溶解性アデノウイルスは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍に動員することができない）
皮下ハムスター膵臓腫瘍（ＨａｐＴ１）を腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４単独またはヒトＩＬ−２で武装した該アデノウイルスで、１９日間に合計５回処理した。第２５日に動物を屠殺し、腫瘍細胞を交差反応性抗ラットＣＤ８ｂ ＰＥ抗体で標識した。（サンプル数は、モックのものおよび非武装のものそれぞれについて ｎ＝５ であり、ＩＬ２で武装したものについて ｎ＝１ であった）。腫瘍溶解性アデノウイルス単独では、ＣＤ８細胞を腫瘍に動員することができなかった。ＩＬ２で武装したものはもっと有望のようであったが、増加は有意ではなかった。(図１５)

実験１６（免疫応答性ハムスターへのリチャレンジ）
非武装の腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−Ｅ２Ｆ−ｄ２４またはサイトカイン（ＴＮＦαのみ、ＩＬ−２のみ、またはこれらの両方）処理によって武装した該アデノウイルスを用いて以前に治癒したハムスターは、同種の腫瘍（ＨａｐＴ１）には抵抗したが、別種の腫瘍（ＤＤＴ１−ＭＦ２）には抵抗しなかった。以前にどちらの細胞株にも遭遇しなかったナイーブ動物を、対照として用いた。抗腫瘍免疫を誘導することができる分子（たとえば、ＢｉＴＥ）でウイルスを武装することは、防御免疫(＝腫瘍エピトープに抗する記憶応答のしるし)を誘導するために必要である。(図１６)

実験１７（武装または非武装の腫瘍溶解性アデノウイルスをＴ細胞療法と組み合わせた場合または組み合わせない場合の in vivo の効果）
樹立したＨａｐＴ１腫瘍に腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ５／３−ｄ２５（１×１０^７ ＶＰ／腫瘍）を第１日および第８日に腫瘍内注射した。第２日に、ex vivo で増殖させたＨａｐＴ１腫瘍浸潤リンパ球（１．５×１０^６個のＴＩＬ／腫瘍）を腫瘍内投与した。エラーバーは、標準誤差を表す。図中の＊について、ｐ＜０．０５ であり、図中の＊＊について、ｐ＜０．０１ である。最高の抗腫瘍効果は、腫瘍に腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、ＢｉＴＥをコードするウイルス）とＴＩＬとが与えられたときに見られた。(図１７)

実験１８（Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有する免疫応答性マウスに対してＡｄ−ＢｉＴＥとＯＴ１ Ｔ細胞移送とを組み合わせて用いる in vivo 抗腫瘍効果実験から得られる仮想上の結果）（Ａｄ−ＢｉＴＥは、ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスを表す）
皮下移植されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍（０．２５×１０^６ 個の細胞／腫瘍）を、ＣＤ８を増強したＯＴ１ Ｔ細胞の単独腹腔内注射、Ａｄ−ＢｉＴＥ（１×１０^９ ＶＰ／腫瘍）の単独腫瘍内注射、または両方で処理するものとする。ウイルス注射を７日毎に繰り返すものとする。(図１８)

実験１９（アデノウイルスによるサイトカインＩＬ２およびサイトカインＴＮＦａの送達は、養子細胞療法の効果を高める：ＢｉＴＥをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスにサイトカインを含ませることの理由）
Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７マウスを、第１日に、武装したアデノウイルス（ウイルス粒子数：１×１０^９）の腫瘍内注射、および、ＣＤ８を増強したＯＴ−１ Ｔ細胞（細胞数：１．５×１０^６）の腹腔内注射で、処理した。ウイルス処理を７日毎に続けた。(図１９)

実験２０（新規ウイルス構築物）
骨格として“Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子”を有する新規な腫瘍溶解性Ａｄ５／３アデノウイルスを構築した。導入遺伝子は、欠失したＥ３ ｇｐ１９ｋ／６．７ｋ領域にある。次の導入遺伝子をベクターの中に用いた。

抗メソテリン−抗ＣＤ３
抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３
抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３
抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２
抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ
抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２
抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ
抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２
抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ

(図２０および２１)
図２０のアデノウイルスベクターや図２１の構築物地図は、たとえば表２に記載の、抗メソテリン−抗ＣＤ３（配列番号９）、抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３（配列番号４）、抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３（配列番号８）などの導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む。本発明のウイルスベクターのヌクレオチド配列は、たとえば、配列番号１、２、３、５、６、９（抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２）、配列番号１、２、３、５、６、７（抗メソテリン−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ）、配列番号１、２、３、４、５、６（抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２）、配列番号１、２、３、４、５、７（抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ）、配列番号１、２、３、５、６、８（抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＩＬ２）、または配列番号１、２、３、５、７、８（抗ＭＵＣ１−抗ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＴＮＦａ）を含むか、または、これらからなる。アデノウイルスベクターは、表２に記載の配列にしたがって構築した。アデノウイルスベクターを構築するための一般的方法は、本発明においても利用され、当業者には周知であり、たとえば Koski et al. 2010, Hemminki et al. 2015 に記載されている。

参考文献

Blair GE, Dixon SC, Griffiths SA, Zajdel ME. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. 1989 Dec;14(4):339-46.
Ekkens MJ, Shedlock DJ, Jung E, Troy A, Pearce EL, Shen H, Pearce EJ. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect Immun. 2007 May;75(5):2291-6.
Hemminki, O., S. Parviainen, J. Juhila, R. Turkki, N. Linder, J. Lundin, M. Kankainen, A. Ristimaki, A. Koski, I. Liikanen, M. Oksanen, D. M. Nettelbeck, K. Kairemo, K. Partanen, T. Joensuu, A. Kanerva and A. Hemminki (2015). Immunological data from cancer patients treated with Ad5/3-E2F-Delta24-GMCSF suggests utility for tumor immunotherapy. Oncotarget 6(6): 4467-4481.
Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94.
Kanerva A et al. Clin Cancer Res. 2013 May 15;19(10):2734-44.
Koski, A., L. Kangasniemi, S. Escutenaire, S. Pesonen, V. Cerullo, I. Diaconu, P. Nokisalmi, M. Raki, M. Rajecki, K. Guse, T. Ranki, M. Oksanen, S. L. Holm, E. Haavisto, A. Karioja-Kallio, L. Laasonen, K. Partanen, M. Ugolini, A. Helminen, E. Karli, P. Hannuksela, S. Pesonen, T. Joensuu, A. Kanerva and A. Hemminki (2010). Treatment of cancer patients with a serotype 5/3 chimeric oncolytic adenovirus expressing GMCSF. Mol Ther 18(10): 1874-1884.
Kratky W, Reis e Sousa C, Oxenius A, Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Oct 18;108(42):17414-9.
Lugade AA, Sorensen EW, Gerber SA, Moran JP, Frelinger JG, Lord EM. Radiation-induced IFN-gamma production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 2008 Mar 1;180(5):3132-9.
Park, J. G., H. Frucht, R. V. LaRocca, D. P. Bliss, Jr., Y. Kurita, T. R. Chen, J. G. Henslee, J. B. Trepel, R. T. Jensen, B. E. Johnson and et al. (1990). Characteristics of cell lines established from human gastric carcinoma. Cancer Res 50(9): 2773-2780.
Parviainen, S., M. Ahonen, I. Diaconu, M. Hirvinen, A. Karttunen, M. Vaha-Koskela, A. Hemminki and V. Cerullo (2014). CD40 ligand and tdTomato-armed vaccinia virus for induction of antitumor immune response and tumor imaging. Gene Ther 21(2): 195-204.
Propper DJ, Chao D, Braybrooke JP, Bahl P, Thavasu P, Balkwill F, Turley H, Dobbs N, Gatter K, Talbot DC, Harris AL, Ganesan TS. Low-dose IFN-gamma induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin Cancer Res. 2003 Jan;9(1):84-92.
Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 2004 Feb;75(2):163-89.
Street D, Kaufmann AM, Vaughan A, Fisher SG, Hunter M, Schreckenberger C, Potkul RK, Gissmann L, Qiao L. Interferon-gamma enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. 1997 May;65(2):265-72.
Tahtinen, S., S. Gronberg-Vaha-Koskela, D. Lumen, M. Merisalo-Soikkeli, M. Siurala, A. J. Airaksinen, M. Vaha-Koskela and A. Hemminki (2015). Adenovirus Improves the Efficacy of Adoptive T-cell Therapy by Recruiting Immune Cells to and Promoting Their Activity at the Tumor. Cancer Immunol Res 3(8): 915-925.
Tahtinen, S., S. Kaikkonen, M. Merisalo-Soikkeli, S. Gronberg-Vaha-Koskela, A. Kanerva, S. Parviainen, M. Vaha-Koskela and A. Hemminki (2015). Favorable alteration of tumor microenvironment by immunomodulatory cytokines for efficient T-cell therapy in solid tumors. PLoS ONE 10(6): e0131242.
Taipale, K., I. Liikanen, J. Juhila, R. Turkki, S. Tahtinen, M. Kankainen, L. Vassilev, A. Ristimaki, A. Koski, A. Kanerva, I. Diaconu, V. Cerullo, M. Vaha-Koskela, M. Oksanen, N. Linder, T. Joensuu, J. Lundin and A. Hemminki (2016). Chronic Activation of Innate Immunity Correlates With Poor Prognosis in Cancer Patients Treated With Oncolytic Adenovirus. Mol Ther 24(1): 175-183.
Webb J. Effect of more than one inhibitor, antagonism, summation, and synergism. In: Webb J, ed. Enzyme and metabolic inhibitors. New York: Academic Press, 1963. 488-512.
Yu et al. 2014, Mol Ther 22(1):102-11.

Claims (27)

1. 腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
   Ｅ３領域の核酸配列中の欠失、および
   Ｅ３領域の核酸配列中の欠失の代わりの、二重特異性モノクローナル抗体をコードする核酸配列
   を含み、
   該二重特異性モノクローナル抗体が、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv とを含む、
   腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
2. アデノウイルスベクターの骨格がアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格またはアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格である、請求項１に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
3. Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーターをさらに含む、請求項１または２に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
4. アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
5. Ｅ３領域における核酸配列の欠失が、ウイルスｇｐ１９ｋリーディングフレームとウイルス６．７ｋリーディングフレームの欠失である、請求項１〜４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
6. １）Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター；
   ２）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）；
   ３）ウイルスｇｐ１９ｋリーディングフレームとウイルス６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失；および
   ４）上記３）で定義する核酸配列欠失の代わりの、細胞表面分子に特異的な一本鎖可変断片（scFv）と腫瘍抗原に特異的な scFv を含む二部分分子（bipartite molecule）をコードする核酸配列、
   を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
7. 骨格がＡｄ５核酸骨格であり、さらにＡｄ３繊維ノブを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
8. 該細胞表面分子が免疫エフェクター細胞上にある、請求項１〜７のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
9. 免疫エフェクター細胞がＴリンパ球である、請求項８に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
10. 腫瘍抗原が、表１より選ばれるか、または、メソテリン、ＥｐＣＡＭ１およびＭＵＣ１からなる群より選ばれる、請求項１〜９のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
11. 該細胞表面分子がＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４より選ばれる、請求項１〜１０のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
12. 腫瘍抗原がメソテリンで、細胞表面分子がＣＤ３であり；腫瘍抗原がＥｐＣＡＭ１で、細胞表面分子がＣＤ３であり；または、腫瘍抗原がＭＵＣ１で、細胞表面分子がＣＤ３である、請求項１〜１１のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
13. ２個または３個以上の導入遺伝子をコードする、請求項１〜１２のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
14. ＩＬ−２、ＴＮＦアルファまたはＣＤ４０Ｌの導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
15. 請求項１〜１４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物。
16. 癌の治療用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
17. 養子細胞療法用組成物と共に用いるための、請求項１６に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
18. 対象の癌の治療方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを対象に投与することを含む方法。
19. 養子細胞療法用組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 養子細胞療法用組成物が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体改変リンパ球、およびキメラ抗原受容体改変リンパ球からなる群より選ばれる細胞種を含む、請求項１７または１９に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは方法。
21. 養子細胞療法用組成物が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞、および末梢血単核球からなる群より選ばれる細胞種を含む、請求項１７または１９もしくは２０に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは方法。
22. 養子細胞療法用組成物がＴ細胞を含む、請求項１７または１９〜２１のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは方法。
23. 癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌（renal cancer）、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌（choriocarcinoma）、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、ぺージェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎臓癌（kidney cancer）、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌（trophoblastic cancer）、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群より選ばれる、請求項１６〜２２のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは方法。
24. 腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび養子細胞療法用組成物の対象への投与を、同時にまたは任意の順序で連続して行う、請求項１６〜２３のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは方法。
25. 同時または順次の放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法または他の抗癌薬もしくは介入の対象への適用をさらに含む、請求項１６〜２４のいずれかに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
26. 対象における養子細胞療法の効果を増加させるために用いられる、請求項１〜１４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
27. 請求項１〜１４のいずれかに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、それを必要とする対象へ投与することにより対象における養子細胞療法の効果を増加させるための方法であって、該対象は養子細胞療法を、すでに受けたか、または、これから受ける予定である、方法。

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