CN116732097A - 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116732097A
CN116732097A CN202310641667.9A CN202310641667A CN116732097A CN 116732097 A CN116732097 A CN 116732097A CN 202310641667 A CN202310641667 A CN 202310641667A CN 116732097 A CN116732097 A CN 116732097A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
seq
expression cassette
antigen receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310641667.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李华顺
王珺瑶
张骏
张进平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd
Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd
Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd, Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd, Suzhou University filed Critical Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd
Priority to CN202310641667.9A priority Critical patent/CN116732097A/zh
Publication of CN116732097A publication Critical patent/CN116732097A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及于PD‑1位点定点敲入ROBO1CAR的细胞及其制备方法和应用。基于基因编辑技术，以非病毒转导方式，向细胞内递送基因编辑蛋白和sgRNA，以及ssDNA(表达盒)，对细胞毒性更小，安全可靠。在免疫细胞上实现了于PD‑1基因组特定位点敲入嵌合抗原受体表达盒。与传统的两步法(分别转入嵌合抗原受体和敲除PD‑1基因)相比，本发明仅一步即实现了相同的敲除PD‑1和转入嵌合抗原受体的技术效果，大大缩短了研发时间。本发明将嵌合抗原受体表达盒整合进PD‑1基因组，使得嵌合抗原受体在细胞传代中更加稳定。

Description

于PD-1位点定点敲入ROBO1 CAR的细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及于PD-1位点定点敲入ROBO1 CAR的细胞及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的最重要治病之一，其发病率目前一直呈持续增长趋势，现已成为严重的社会负担。细胞免疫治疗是目前肿瘤精准治疗中的热点，为癌症治疗的模式带来了革命性的变化。与传统疗法和靶向药物疗法不同，细胞免疫疗法针对的是效应细胞而不是肿瘤细胞，通过增强机体肿瘤特异性免疫反应，打破免疫耐受、重塑免疫微环境，以达到延缓肿瘤进展、转移，甚至治愈肿瘤的目的。
CAR即嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)是一种人工构建的能够特异性识别并结合肿瘤相关抗原的细胞膜蛋白，由能够识别肿瘤抗原的抗体单链可变片段、跨膜域、共刺激域和信号转导域融合而成。转入CAR并稳定表达CAR的T细胞，即CAR-T细胞，其具备特异性识别并结合肿瘤抗原以及杀伤肿瘤细胞的能力。2010年，CD19 CAT-T细胞成功治疗了一例淋巴瘤患者。之后，CAR-T细胞疗法开始普遍应用于包括急性和慢性淋巴瘤细胞白血病等难治性B细胞恶性肿瘤的临床治疗，并取得了显著疗效。2017年，诺华CD19 CAR-T细胞药物Kymriah和Kite Pharma的CAR-T疗法Yescart在美国相继上市，证实了CAR-T疗法在肿瘤治疗中的革命性作用，尤其在血液瘤中的巨大潜力。截止到目前，共有8款CAR-T细胞药物获批上市。
目前已有研究表明，ROBO1在包括复发或转移性晚期乳腺癌在内的多种肿瘤组织中过表达，且ROBO1的表达于癌细胞的迁移和血管的发生发展密切相关。同时本实验前期通过对将近400例晚期实体瘤组织切片发现，ROBO1在80％以上的恶性肿瘤中高表达，在正常组织中低表达或者不表达。综上所述，ROBO1可作为实体肿瘤的理想靶点。但传统的表达靶向ROBO1的嵌合抗原受体的免疫细胞中，该嵌合抗原受体的表达盒通常是随机整合进基因组，存在风险。
肿瘤细胞在长期的进化过程中形成了一套自身的免疫逃逸机制，其中PD-1/PD-L1免疫检查点路径已成为肿瘤治疗的研究热点。PD-1(Programmed cell death 1,也称PDCD1)在20世纪90年代初期就已经被发现报道，而其配体PD-L1(Programmed cell death1ligand 1,也称PDCD1LG1)在1999年被相继发现(Dong et al.,1999)。PD-1/PD-L1信号通路的激活广泛参与T/NK等免疫细胞的激活、增殖和凋亡等一系列过程，抑制免疫细胞介导的免疫反应。在生理情况下，该信号通路的激活与免疫耐受息息相关，维持机体的免疫稳态，避免活化过度及自身免疫对正常组织的免疫损伤。其作用机制之一为活化的T/NK细胞表面的PD-1受体与其配体PD-L1结合后，PD-1上的ITSM发生磷酸化，招募含同源结构域的络氨酸磷酸化酶SHP2向PD-1胞内区富集，抑制下游信号分子ζ链相关蛋白磷酸化，从而使下游的效应分子磷脂酰肌醇化酶3(PI3K)去磷酸化，导致蛋白激酶B(AKT)活化降低，整体下调PI3K-AKT-mTOR信号通路，而该通路是调节细胞代谢供能、蛋白合成、增殖分化及凋亡的经典通路之一。目前，涌现出很多针对该通路进行免疫细胞改造的技术方案，但在编辑PD-1基因同时尝试插入嵌合抗原受体表达盒的技术方案还未见报道。
鉴于此，特提出本发明。
需要说明的是，公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有靶向PD-1同源臂的嵌合抗原受体表达盒，和使用该表达盒于PD-1基因组中定点敲入嵌合抗原受体的方法，以及敲入过程中得到的多种生物材料，期望该方法能够通过基因编辑的手段，在特定位点敲入嵌合抗原受体表达序列，使得改造后的细胞在表达嵌合抗原受体的同时，敲除免疫抑制检查点，协同改善肿瘤免疫抑制微环境，进而激发机体产生内在的主动抗肿瘤免疫效应，提高细胞药物对肿瘤细胞的杀伤活性。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供含有靶向PD-1同源臂的嵌合抗原受体表达盒，所述表达盒按照5’至3’方向依次包括启动子元件、嵌合抗原受体表达元件和终止子元件；所述表达盒的上游和/或下游连有靶向PD-1的同源臂。
在可选的实施方式中，所述同源臂靶向PD-1的外显子。
优选地，靶向PD-1的第1外显子或第2外显子。
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1。
优选地，所述启动子元件选自EF-1α、CMV、SV40或CAG；所述终止子元件选自WRPE或BGH。
第二方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包括(a)或(b)：
(a)含有前述实施方式任一项所述表达盒的重组质粒；优选地，所述重组质粒的原始质粒包括pCS质粒、pLVTHM质粒或pLV质粒；
(b)含有前述实施方式任一项所述表达盒或者(a)所述重组质粒的转化细胞；优选地，所述转化细胞的原始细胞包括NK细胞、JM110菌株细胞或大肠杆菌DH5α细胞中的至少一种；更优选为NK92细胞。
第三方面，本发明提供定点敲入嵌合抗原受体表达基因的基因编辑试剂，所述基因编辑试剂包括，(a)前述实施方式任一项所述的表达盒或前述实施方式所述的生物材料，和(b)，
所述(b)包括(b1)独立的Cas核酸酶和sgRNA；或者(b2)Cas核酸酶和sgRNA形成的RNP复合物；所述sgRNA靶向的基因位点与同源臂相同。
优选地，所述Cas核酸酶选自Cas9、Cas12a或Cas12a Ultra。
在可选的实施方式中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:11中任一项所示。
优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述表达盒的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述表达盒的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述表达盒的制备方法，所述制备方法包括选取含有嵌合抗原受体表达盒的质粒载体，进行步骤(a)和步骤(b)：
(a)对紧邻启动子元件的上游酶切位点进行酶切后，在含有上游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入上游同源臂的重组质粒载体a；
(b)对紧邻终止子元件的下游酶切位点进行酶切后，在含有下游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入下游同源臂的重组质粒载体b；
当步骤(a)和步骤(b)均执行时，执行顺序不分先后。
优选地，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述紧邻启动子元件的上游酶切位点为ClaI，所述上游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的下游引物。
优选地，所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述紧邻终止子元件的下游酶切位点为KpnI，所述下游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的下游引物。
第五方面，本发明提供定点敲入嵌合抗原受体表达基因的方法，所述方法包括，将前述实施方式所述的基因编辑试剂与目标编辑细胞混匀，电转化后培养得到定点敲入嵌合抗原受体表达基因的转化细胞。
优选地，所述目标编辑细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞。
第六方面，本发明提供免疫细胞，所述免疫细胞的PD-1基因组中插入有前述实施方式所述的嵌合抗原受体表达盒。
优选地，所述免疫细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞。
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1。
优选地，所述免疫细胞的PD-1基因组的第1外显子或第2外显子中插入有靶向ROBO1的嵌合抗原受体表达盒。
第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前述实施方式所述的免疫细胞和药物学可接受的辅料。
第八方面，本发明提供前述实施方式所述免疫细胞或所述药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用；
所述癌症为ROBO1高表达的肿瘤，优选为乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
本发明提供的技术方案取得以下技术效果：
(1)基于基因编辑技术，以非病毒转导方式，即通过电穿孔手段，向细胞内递送基因编辑蛋白和sgRNA，以及ssDNA(表达盒)，对细胞毒性更小，安全可靠。
(2)在免疫细胞系上实现了于PD-1基因组特定位点敲入嵌合抗原受体表达盒。与传统的两步法(分别转入嵌合抗原受体和敲除PD-1基因)相比，本发明仅一步即实现了相同的敲除PD-1和转入嵌合抗原受体的技术效果，大大缩短了研发时间。
(3)本发明将嵌合抗原受体表达盒整合进PD-1基因组，使得嵌合抗原受体在细胞传代中更加稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中的sgRNA和同源臂设计示意图；
图2为本发明实施例2中选取的载体质粒示意图；
图3为本发明实施例2中引物设计示意图；
图4为本发明实施例2中设计得到的重组质粒示意图；
图5为本发明实施例3中ssDNA酶切后理论条带分布示意图；
图6为本发明实施例3中ssDNA酶切后实际电泳结果图；
图7为本发明实施例5中NK92细胞阴性对照分选结果图；
图8为本发明实施例5中电转后的NK92细胞分选结果图；
图9为本发明实施例6中PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞株鉴定中使用各引物对设计示意图；
图10为本发明实施例6的步骤(1)中PCR产物的电泳结果图；
图11为本发明实施例6的步骤(1)中PCR产物的上游部分测序结果图；
图12为本发明实施例6的步骤(1)中PCR产物的ROBO1 CAR部分测序结果图；
图13为本发明实施例6的步骤(1)中PCR产物的下游部分测序结果图；
图14为本发明实施例6的步骤(2)中PCR产物的电泳结果图；
图15为本发明实施例6的步骤(2)中PCR产物的测序结果图；
图16为本发明实施例6中PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92未染抗体的阴性对照流式图；
图17为本发明实施例6中PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92染PE-FLAG抗体的流式图；
图18为本发明实施例7中不同细胞株对靶细胞T47D的杀伤效果对比图；
图19为本发明实施例7中不同细胞株对靶细胞MDA-MB231-ROBO1的杀伤效果对比图；
图20为本发明实施例1中不同sgRNA对PD-1基因组外显子体外切割效率的对比图；
图21为本发明实施例7中采用实时无标记动态细胞分析技术RTCA实时监测不同细胞株对靶细胞H1299的杀伤效果对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在某次具体的实施方式中，第一方面，本发明提供含有靶向PD-1同源臂的嵌合抗原受体表达盒，所述表达盒按照5’至3’方向依次包括启动子元件、嵌合抗原受体表达元件和终止子元件；所述表达盒的上游和/或下游连有靶向PD-1的同源臂。
在可选的实施方式中，所述同源臂靶向PD-1的外显子。
优选地，靶向PD-1的第1外显子或第2外显子。
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1。
优选地，所述启动子元件选自EF-1α、CMV、SV40或CAG；所述终止子元件选自WRPE或BGH。
第二方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包括(a)或(b)：
(a)含有前述实施方式任一项所述表达盒的重组质粒；优选地，所述重组质粒的原始质粒包括pCS质粒、pLVTHM质粒或pLV质粒；
(b)含有前述实施方式任一项所述表达盒或者(a)所述重组质粒的转化细胞；优选地，所述转化细胞的原始细胞包括NK细胞、JM110菌株细胞或大肠杆菌DH5α细胞中的至少一种；更优选地为NK92细胞。
第三方面，本发明提供定点敲入嵌合抗原受体表达基因的基因编辑试剂，所述基因编辑试剂包括，(a)前述实施方式任一项所述的表达盒或前述实施方式所述的生物材料，和(b)，
所述(b)包括(b1)独立的Cas核酸酶和sgRNA；或者(b2)Cas核酸酶和sgRNA形成的RNP复合物；所述sgRNA靶向的基因位点与同源臂相同。
优选地，所述Cas核酸酶选自Cas9、Cas12a或Cas12a Ultra。
在可选的实施方式中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:11中任一项所示。
优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述表达盒的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述表达盒的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述表达盒的制备方法，所述制备方法包括选取含有嵌合抗原受体表达盒的质粒载体，进行步骤(a)和步骤(b)：
(a)对紧邻启动子元件的上游酶切位点进行酶切后，在含有上游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入上游同源臂的重组质粒载体a；
(b)对紧邻终止子元件的下游酶切位点进行酶切后，在含有下游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入下游同源臂的重组质粒载体b；
当步骤(a)和步骤(b)均执行时，执行顺序不分先后。
优选地，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述紧邻启动子元件的上游酶切位点为ClaI，所述上游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的下游引物。
优选地，所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述紧邻终止子元件的下游酶切位点为KpnI，所述下游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的下游引物。
第五方面，本发明提供定点敲入嵌合抗原受体表达基因的方法，所述方法包括，将前述实施方式所述的基因编辑试剂与目标编辑细胞混匀，电转化后培养得到定点敲入嵌合抗原受体表达基因的转化细胞。
优选地，所述目标编辑细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞。
第六方面，本发明提供免疫细胞，所述免疫细胞的PD-1基因组中插入有前述实施方式所述的嵌合抗原受体表达盒。
优选地，所述免疫细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞。
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1。
优选地，所述免疫细胞的PD-1基因组的第1外显子或第2外显子中插入有靶向ROBO1的嵌合抗原受体表达盒。
第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前述实施方式所述的免疫细胞和药物学可接受的辅料。
第八方面，本发明提供前述实施方式所述免疫细胞或所述药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用；
所述癌症为ROBO1高表达的肿瘤，优选为乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血来源的NK细胞、脐带血来源的NK细胞、NK92细胞系和其他NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK92细胞系，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞系，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92”是指“在NK92细胞基础上，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术于PD-1位点定点敲入鼠源ROBO1 CAR的细胞”,其具体制备过程参照下述实施例。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的CAR-NK细胞”,其具体制备过程参照申请号为“CN201811394153.3”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”的专利。
除非特别指明，本文中的“PD1-KO ROBO1 CAR-NK”是指“在ROBO1 CAR-NK细胞基础上，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PD-1后获得的加强型CAR-NK细胞”,其具体制备过程参照专利号为“CN202111035901.0”，发明名称为“细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用”的专利。
除非特别指明，本文中的“MDA-MB231-ROBO1”指通过以慢病毒转染方式获得人ROBO1基因过量表达的MDA-MB231肿瘤细胞。
实施例1同源臂及sgRNA设计
针对人基因组PD-1位点，利用CRISPR/Cas9技术，以Cas9蛋白与PD-1sgRNA形成的RNP蛋白复合物，实现PD-1基因位点的定点切割，并通过外源添加单链ssDNA(singlestrand DNA,ROBO1 CAR expression cassette ssDNA)模板，实现ROBO1 CAR expressioncassette的定点敲入，本发明使用的ROBO1 CAR的scFV为鼠源抗体。在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到PD-1基因序列(Gene ID：5133)，人基因组PD-1基因的CDS由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5所示的人PD-1基因的5个外显子组成。使用CCTop-CRISPR/Cas9target online predictor网站(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043)在人PD-1基因的第一个外显子exon1(SEQ ID NO:1)和第二个外显子exon2(SEQ ID NO:2)内设计并挑选了6个特异性位点作为sgRNA的靶序列(sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～SEQ IDNO:11所示，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:8的sgRNA靶向第二外显子，核苷酸序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:11的sgRNA靶向第一外显子)，体外切割效率图如图20所示，M为2K Plus的Marker，标号第1～8的泳道按顺序分别对应：PD-1基因组第一个外显子片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:9的sgRNA剪切产物、核苷酸序列如SEQ ID NO:10的sgRNA剪切产物、核苷酸序列如SEQ ID NO:11的sgRNA剪切产物、PD-1基因组第二个外显子片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:7的sgRNA剪切产物、核苷酸序列如SEQ ID NO:6的sgRNA剪切产物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8的sgRNA剪切产物，图中可以看到，第七泳道的sgRNA1(SEQ IDNO:6)切割原PD-1基因组效率最高，最终优先选择sgRNA1(SEQ ID NO:6)对应的位点作为敲入位点，实验设计示意图如图1所示，如图所示，PD-1敲除位点，即ROBO1 CAR敲入位点位于hPD-1基因组的第二个外显子，sgRNA的Spacer序列为SEQ ID NO:6，5’-CACGAAGCTCTCCGATGTGT-3’。ROBO1 CAR表达启动子为EF-1α，终止子为WRPE。在ROBO1CARexpression cassette两边添加同源臂，上游同源臂序列SEQ ID NO:12，下游同源臂序列SEQ ID NO:13。
实施例2重组载体构建
利用载体ROBO1-1942-3-FRBM进行用于制备ssDNA的载体的构建，嵌合抗原受体部分的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。ROBO1-1942-3-FRBM载体示意图如图2所示，经过酶切位点分析，在EF-1α启动子上游存在一个单一的酶切位点ClaI，在WPRE终止子下游存在一个单一的酶切位点KpnI酶切位点。因此，可在ClaI位点插入上游同源臂序列并引入BspQI酶切位点序列，在KnpI位点处插入下游同源臂序列并引入Nb.BsmI酶切位点序列。
具体实验步骤如下：
(1)设计引物扩增PD-1上游和下游同源臂如图3所示，引物序列如下(其中，加粗部分为ClaI酶切位点，加下划线部分为BspQI酶切位点，加粗且斜体部分为Nb.BsmI酶切位点，加双下划线部分为KnpI酶切位点)：
PD1-LB-F(即F1):
PD1-LB-R(即R1):
PD1-RB-F(即F2):
PD1-RB-R(即R2):
(2)在该质粒中ClaI酶切位点会发生甲基化，因此将此质粒转化至JM110菌株感受态中，抽提质粒后，进行ClaI单酶切，将载体线性化，利用同源重组酶，将线性化载体以及F1和R1 PCR扩增产物片段进行同源重组，将上游同源臂克隆至载体中，转化大肠杆菌感受态DH5α中，提取质粒，并测序。对测序通过后的质粒进行KpnI单酶切，将载体线性化，利用同源重组酶，将线性化载体以及F2和R2 PCR扩增产物片段进行同源重组，将下游同源臂克隆至载体中，重组后的重组质粒如图4所示，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单克隆，提取质粒，挑选测序正确的进行下一步。
实施例3ssDNA制备
(1)抽提质粒：将上述步骤构建完成的质粒转化至DH5α感受态中，按照QIAGENPlasmid Mega and Giga Kit说明书进行质粒大量抽提。
(2)酶切：按照如下方式配置酶切体系。50μl体系：10×NEB Buffer 3.1，5μl；BspQI，1.5μl；Nb.BsmI，1.5μl；质粒DNA，50μg；ddH2O，补足至50μl。按照如下程序进行酶切：50℃，6.5h；65℃，6.5h；4℃，Hold。
(3)脱盐、电泳回收：酶切反应结束后，将酶切产物转移到脱盐柱中，冰浴保存90min；冰浴结束后，从脱盐柱中吸出反应液，每管加入ddH2O补至200μl，每管加入40μlNaOH溶液，混匀后室温放置10min；变性结束后，加入Loading Buffer，混匀后琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的ssDNA条带并测量ssDNA浓度。分析载体上BspQI和Nb.BsmI酶切位点，电泳结果理论应出现如图5的条带分布，目的ssDNA为从上往下第二条。实际同一个样品跑了14条泳道，第一条泳道为5k的Maker，结果如图6所示，均成功得到第二条条带。
(4)ssDNA纯化：将胶回收的ssDNA转移至1.5ml离心管中，每管加入1/10体积乙酸钠(3M)，再加入4倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-80℃保存30min，13000rpm，4℃离心1h；除去上清，加入500μl预冷的70％乙醇清洗沉淀，4℃离心5min；小心去除上清液，ssDNA沉淀在室温干燥后，加入适量的RNase-Free水溶解，取出1μl ssDNA，稀释10倍后测定浓度。
以下实施例以NK92细胞为例验证于PD-1位点定点敲入ROBO1 CAR后的免疫细胞的功能。
实施例4电穿孔转染NK92细胞
(1)预先在T75培养瓶中加入20～25ml MEM-α-Full培养基，CO2恒温培养箱中预热，从4℃冰箱中取出电转液A液和B液(Celetrix，12-0104)至室温环境，并取60μl电转缓冲液A与60μl电转缓冲液B混合，将其标记为电转缓冲液C，室温放置。
(2)将Cas9蛋白(南京金斯瑞生物科技有限公司订购，NLS-Cas9-EGFP等)、PD-1sgRNA混合，孵育10min；加入ROBO1 CAR ssDNA，孵育2min；加入60μl电转缓冲液C混匀。
(3)取适量NK92细胞至50ml离心管中，400g离心5min，弃上清；加入20ml PBS重悬细胞沉淀，400g离心5min，弃上清；加入适量PBS重悬细胞沉淀，吹打均匀后细胞计数。
(4)取适量细胞至1.5ml离心管中，400g离心5min，弃上清，加入60μl电转缓冲液C，吹打重悬。
(5)将步骤(2)和(4)中的溶液轻柔混合，并在温室条件下孵育10min；转移至120μl电极管(Celetrix，12-0104)中，进行电转操作(Celetrix电转仪：CTX-1500A-LE)。
(6)电转结束后，转移所有样品至含预热培养基的T75培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养。
实施例5细胞的流式分选及分析
(1)待电转后的细胞培养稳定后进行多克隆流式细胞分选，步骤如下：
取10ml PBS至15ml离心管中，加入200μl FBS后混匀。转移待分选细胞至50ml离心管中，400g离心5min，弃上清。加入20ml的PBS清洗细胞沉淀并进行计数，400g离心5min，弃上清。加入适量的PBS重悬细胞沉淀，加入PE-Flag抗体，室温避光染色20min。加入20ml PBS清洗细胞，洗去未结合的抗体。400g离心5min，弃去上清，并重复一次。加入适量的PBS+2％FBS分选液重悬细胞沉淀，用40μm滤网过滤细胞悬液，转移至分选管中，冰上放置，等待上机分选。上机分选，在PE通道中，筛选阳性细胞并收集。分选后的置于37℃，5％CO2培养箱进行培养。
(2)待分选后的细胞培养稳定后利用流式细胞分析仪对细胞表面Flag(即ROBO1CAR)表达进行检测，步骤如下：
取适量细胞至1.5ml离心管中，400g离心5min，弃上清。加入1ml的PBS清洗细胞沉淀，400g离心5min，弃上清。加入100μl的PBS重悬细胞沉淀，加入PE-Flag抗体，室温避光染色20min。加入1ml PBS清洗细胞，洗去未结合的抗体。400g离心5min，弃去上清，并重复一次。加入100μl的PBS重悬细胞沉淀，上机检测。
(3)经过2～3轮分选后，待PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92细胞阳性率至90％以上后进行单克隆流式细胞分选，具体分选步骤参照多克隆细胞流式分选步骤，以96孔板培养皿进行细胞收集，每孔收1个细胞。分选结束后置于37℃，5％CO2培养箱进行培养，最终收获单克隆细胞株，分选得到的阴性样本和阳性细胞群分别如图7～8所示。
实施例6PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞株鉴定
(1)ROBO1 CAR于NK92细胞PD-1位点定点敲入的DNA水平鉴定，方案如下：
PCR扩增引物设计，在上游同源臂的上游基因组DNA上设计U-F引物，在EF-1α启动子上设计U-R引物，扩增上游片段。在EF-1α启动子设计M-F引物，在ROBO1 CAR上设计M-R引物，扩增ROBO1 CAR敲入片段。在WRPE终止子上设计D-F引物，在下游同源臂的下游基因组DNA上设计D-R引物，扩增下游片段。具体引物设计位置方案如图9所示。具体引物序列如下：
U-F：5’-CCACTGTCTTGCTGGAAAATGT-3’(SEQ ID NO:18)。
U-R：5’-TACCAGTGTGCAGATCTTG-3’(SEQ ID NO:19)。
M-F：5’-TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC-3’(SEQ ID NO:20)。
M-R：5’-GCCTTGCCTCTGAAATTCT-3’(SEQ ID NO:21)。
D-F：5’-CGAGTCGGATCTCCCTTTGG-3’(SEQ ID NO:22)。
D-R：5’-GGCACAAAGGTCAGGGGTTA-3’(SEQ ID NO:23)。
按照如下方式配置PCR反应体系：50μl体系：GoldPfu PCR SuperMix(-dye)(Transgene,AS401-01)，25μl；10×DMSO，5μl；F引物，1.5μl；R引物，1.5μl；基因组DNA，300ng；ddH2O，补足至50μl。
按照如下程序进行PCR反应：95℃，3min；(95℃，20s；55℃，20s；72℃，1min)×31个循环；72℃，5min；4℃，Hold。
PCR产物进行电泳，结果如图10所示，并测序验证。上游的测序结果如图11所示，左边黄色部分是原基因组的PD-1序列，右边蓝色部分为插入的PD-1左同源臂序列；中间ROBO1CAR段的测序结果如图12所示，左边黄色部分为EF-1α启动子序列，右边蓝色部分为ROBO1CAR序列；下游的测序结果如图13所示，左边黄色部分为插入的PD-1右同源臂序列，右边蓝色部分为原基因组的PD-1序列。可以看出此单克隆细胞为PD-1位点定点插入ROBO1 CAR的细胞。
(2)验证ROBO1 CAR在PD-1位点的敲入为纯合子亦或是杂合子。若为杂合子，则另一条染色体上的PD-1基因未被敲除。方案如下：
在上下游同源臂的两侧设计扩增PD-1基因片段的引物，引物序列如下：
PD-1-F:5’-CAGGGAGACCCAAGTCAGAG-3’(SEQ ID NO:24)。
PD-1-R:5’-GGCACAAAGGTCAGGGGTTA-3’(SEQ ID NO:25)。
按如下方式配置PCR反应体系：50μl体系：GoldPfu PCR SuperMix(-dye)(Transgene,AS401-01)，25μl；10×DMSO，5μl；F引物，1.5μl；R引物，1.5μl；基因组DNA，300ng；ddH2O，补足至50μl。
按如下程序进行PCR反应：95℃，3min；(95℃，20s；55℃，20s；72℃，40s)×31个循环；72℃，5分钟；4℃，hold。
PCR产物进行电泳，并测序，电泳图如图14所示，测序图如图15所示，可以看出，测序红色圈出部分有套峰，说明PD-1的基因序列发生了变化，后续可通过PCR进一步确定是否完成定点敲入以及敲入效果。
备注：PCR酶的扩增效率为1kb/30s，设置的延伸时间为40s。若ROBO1 CAR以纯合方式敲入PD-1基因位点，则40s的延伸时间不足以扩增4kb长度的片段。若ROBO1 CAR以杂合子方式敲入PD-1基因位点，则能够扩增出另一条染色体上PD-1基因片段。
(3)流式监测PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞中ROBO1 CAR的表达。具体步骤参照上述第5部分，结果如图16～17所示，可以看出图16中R2门的PE-Flag阳性细胞占总细胞数的98％以上，且细胞未分群，较为单一，符合ROBO1 CAR阳性单克隆细胞株的特征。
实施例7PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞株对靶细胞的杀伤
验证PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞株与ROBO1 CAR-NK(申请号CN201811394153.3)和PD1-KO ROBO1 CAR-NK(申请号CN202111035901.0)细胞株进行功能上的比较。具体地，提前一天将不同的靶细胞(T47D、MDA-MB231-ROBO1和H1299)以4.5万个/孔均匀铺在96孔板中，待细胞贴壁完全后，T47D和MDA-MB231-ROBO1按照0.05:1和0.1:1的效靶比，将效应细胞NK92、ROBO1 CAR-NK、PD1-KO ROBO1 CAR-NK、PD1-KO-ROBO1CAR-KI-NK92铺于靶细胞上，16小时后，用CCK8检测OD值，计算杀伤率。H1299按照1:1、0.5:1和0.25:1的效靶比，将效应细胞NK92、ROBO1 CAR-NK、PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92铺于靶细胞上，利用实时无标记动态细胞分析技术RTCA(仪器：安捷伦，xCELLigence RTCA TP)实时监测，计算杀伤率。结果如图18～19、21所示，在对T47D和MDA-MB231-ROBO1的杀伤中，PD1-KO-ROBO1CAR-KI-NK92单克隆细胞株杀伤效果比ROBO1 CAR-NK好；与PD1-KO ROBO1CAR-NK相比，PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92对T47D的杀伤效较好，对MDA-MB231-ROBO1的杀伤效果两者相当。在对H1299的杀伤中，PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92单克隆细胞株杀伤效果比ROBO1 CAR-NK好，在0.5:1的低效靶比下，PD1-KO-ROBO1 CAR-KI-NK92对H1299的杀伤效果明显优于ROBO1CAR-NK。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.含有靶向PD-1同源臂的嵌合抗原受体表达盒，其特征在于，所述表达盒按照5’至3’方向依次包括启动子元件、嵌合抗原受体表达元件和终止子元件；
所述表达盒的上游和/或下游连有靶向PD-1的同源臂。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述同源臂靶向PD-1的外显子；
优选地，靶向PD-1的第1外显子或第2外显子；
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1；
优选地，所述启动子元件选自EF-1α、CMV、SV40或CAG；所述终止子元件选自WRPE或BGH。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括(a)或(b)：
(a)含有权利要求1或2所述表达盒的重组质粒；优选地，所述重组质粒的原始质粒包括pCS质粒、pLVTHM质粒或pLV质粒；
(b)含有权利要求1或2所述表达盒或者(a)所述重组质粒的转化细胞；
优选地，所述转化细胞的原始细胞包括NK细胞、JM110菌株细胞或大肠杆菌DH5α细胞中的至少一种。
4.定点敲入嵌合抗原受体表达基因的基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂包括，(a)权利要求1或2所述的表达盒或权利要求3所述的生物材料，和(b)，
所述(b)包括(b1)独立的Cas核酸酶和sgRNA；或者(b2)Cas核酸酶和sgRNA形成的RNP复合物；
所述sgRNA靶向的基因位点与同源臂相同；
优选地，所述Cas核酸酶选自Cas9、Cas12a或Cas12a Ultra。
5.根据权利要求4所述的基因编辑试剂，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO:6～SEQ ID NO:11中任一项所示；
优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述表达盒的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述表达盒的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
6.权利要求1或2所述表达盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括选取含有嵌合抗原受体表达盒的质粒载体，进行步骤(a)和步骤(b)：
(a)对紧邻启动子元件的上游酶切位点进行酶切后，在含有上游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入上游同源臂的重组质粒载体a；
(b)对紧邻终止子元件的下游酶切位点进行酶切后，在含有下游同源臂扩增引物的扩增体系中扩增获得插入下游同源臂的重组质粒载体b；
当步骤(a)和步骤(b)均执行时，执行顺序不分先后；
优选地，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述紧邻启动子元件的上游酶切位点为ClaI，所述上游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的下游引物；
优选地，所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述紧邻终止子元件的下游酶切位点为KpnI，所述下游同源臂扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的下游引物。
7.定点敲入嵌合抗原受体表达基因的方法，其特征在于，所述方法包括，将权利要求4或5所述的基因编辑试剂与目标编辑细胞混匀，电转化后培养得到定点敲入嵌合抗原受体表达基因的转化细胞；
优选地，所述目标编辑细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞。
8.免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的PD-1基因组中插入有权利要求1或2所述的嵌合抗原受体表达盒；
优选地，所述免疫细胞包括NK细胞或T细胞，进一步优选为NK细胞；
优选地，所述嵌合抗原受体靶向ROBO1；
优选地，所述免疫细胞的PD-1基因组的第1外显子或第2外显子中插入有靶向ROBO1的嵌合抗原受体表达盒。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求8所述的免疫细胞和药物学可接受的辅料。
10.权利要求8所述免疫细胞或权利要求9所述药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用；
所述癌症包括存在ROBO1高表达的癌细胞的癌症；
优选地，所述癌症包括乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
CN202310641667.9A 2023-05-31 2023-05-31 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用 Pending CN116732097A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310641667.9A CN116732097A (zh) 2023-05-31 2023-05-31 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310641667.9A CN116732097A (zh) 2023-05-31 2023-05-31 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116732097A true CN116732097A (zh) 2023-09-12

Family

ID=87914419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310641667.9A Pending CN116732097A (zh) 2023-05-31 2023-05-31 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116732097A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3476865B1 (en) Method for constructing pd-1 gene-modified humanized animal model and use thereof
CN107354156B (zh) 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法
CN110117657B (zh) 环状RNA hsa_circ_0004872在胃癌诊断中的应用
CN109517820B (zh) 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
CN110484615B (zh) lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用
CN108359692B (zh) 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统
US20230105008A1 (en) Methods and compositions for identifying castration resistant neuroendocrine prostate cancer
CN111549072A (zh) Vista基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用
CN112899237A (zh) Cdkn1a基因报告细胞系及其构建方法和应用
CN110129318B (zh) 长链非编码rna pralr及其表达质粒和用途
CN112226438B (zh) 一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用
CN109609551A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法
CN114457110A (zh) 一种敲除fut8基因的方法
CN110317878B (zh) 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用
CN116732097A (zh) 于pd-1位点定点敲入robo1 car的细胞及其制备方法和应用
WO2022167009A1 (zh) 靶向Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN110117658B (zh) 环状RNA hsa_circ_0004872用于胃癌治疗的新用途
CN114134174B (zh) 一种LncRNA TUG1靶向调控hsa-miR-4638-3p的方法
CN113355362B (zh) 化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途
CN110511933B (zh) 一种大鼠长链非编码lncRNA-lncMSTRG10078及其抵抗细胞损伤的应用
CN113528522A (zh) miR-339-增强子-靶基因网络激活模型及其应用
CN109136377B (zh) 成人t细胞白血病的治疗药物及诊断试剂盒
CN114364799A (zh) 编辑造血干/祖细胞中bcl11a基因的方法
CN107082811B (zh) 一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination