CN108559729B

CN108559729B - Fam49基因及其编码蛋白的应用

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Publication number: CN108559729B
Application number: CN201810114416.4A
Authority: CN
Inventors: 王皞鹏; 尚婉婧; 姜勇
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2038-02-05
Also published as: CN108559729A

Abstract

本发明提供了FAM49基因及其编码蛋白的应用，具体涉及FAM49基因、FAM49蛋白、FAM49基因或蛋白的表达载体、促进或抑制FAM49基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或促进或抑制FAM49B蛋白与Rac蛋白或Rac‑GTP的结合的试剂或试剂盒在调控T细胞活性、TCR信号传导、CD69的表达、Erk蛋白的磷酸化、PAK的磷酸化、或细胞骨架蛋白actin的聚集中的应用。本发明有助于通过调节其功能来增强T细胞抗肿瘤能力，改善现有T细胞疗法的效果。

Description

FAM49基因及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫领域以及HIV感染的治疗，具体涉及一种增强T细胞反应活性的方法及治疗癌症和HIV感染的应用。

背景技术

T细胞激活在维持人体自身稳态上具有重要意义。免疫系统是机体抵御外来入侵微生物，执行免疫应答和免疫功能，维持机体内稳态的重要系统。免疫反应分为固有免疫和适应性免疫。固有免疫是抵抗病原微生物入侵的第一道防线。适应性免疫分为抗体介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫。T细胞在适应性免疫中发挥重要作用，而T细胞的激活则是免疫学中的关键问题之一。当T细胞活化失调时，会引起多种免疫性疾病。如果T细胞过于容易被激活，可导致T细胞攻击人体自身，引发自身免疫疾病，如类风湿性关节炎和一型糖尿病；如果T细胞失活或受到免疫抑制，会导致人体受病原体感染，增加患疾病和癌症的风险^(1，2)。现在已知的T细胞激活需要两个信号，一个是展示在抗原提呈细胞(APC)表面的抗原。展示在APC上的抗原肽-MHC复合体和T细胞表面的TCR结合后，会激活一组酪氨酸激酶(PTKs)。激活的LCK激酶会催化TCR结构域中的ITAMs的酪氨酸残基磷酸化，从而招募70KD的激酶ZAP-70到TCR：CD3复合体上⁽³⁾。 ZAP-70被Lck进一步激活，ZAP-70的激活对下游信号传导至关重要，它可以磷酸化连接因子LAT，继而募集结合分子与信号分子。T细胞的激活可以引起多种下游反应，其中一种是激活磷脂酶C-γ(PLC-γ)：活化的PLC-γ分解二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)。IP3可增加胞内钙浓度，而DAG可活化蛋白激酶C(PKC)和ERK激酶。这些激活的激酶能够进一步激活NFkB、NFAT、AP-1等一系列细胞转录因子，促进IL-2转录。AP-1激活会上调CD69的表达⁽⁴⁾。但是T细胞激活的分子机制仍存在很多未知，而对关键调节因子的研究有助于本发明更好的理解T细胞的信号传导。

T细胞在肿瘤免疫疗法中发挥重要作用。肿瘤免疫可以分为两个方面，一方面通过增强机体的免疫应答，或在宿主体内输入工程化的免疫细胞/效应分子从而抑制肿瘤生长和杀伤肿瘤；另一方面是通过提高肿瘤的免疫原性以增强其被免疫系统识别的能力。近年来，免疫疗法成为治疗癌症的重要方法之一。上世纪90 年代，陈列平教授发现肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与T细胞上受体PD-1结合，能够抑制T细胞的活性，使本应攻击肿瘤细胞的免疫细胞停止了工作。基于这一原理，研究者通过单克隆抗体，拮抗PD-1与PD-L1之间的结合，从而唤醒T细胞的抗肿瘤活性，实现了利用患者自身的免疫系统来攻克癌细胞。2014年，PD-1抗体获得美国FDA批准上市，用于多种癌症的治疗⁽⁵⁾。2017年，全球共有五个 PD-1/PD-L1新药上市，包括Opidivo(BMS)，Keytruda(MSD)，Tecentriq(Roche)， Imfinizi(Astrazeneca)和Bavencio(Merck KGaA/Pfizer)。另一种免疫疗法是通过过继疗法输回工程化的T细胞。2015年，Nature Medicine刊登的一项研究发现，增加T细胞受体(TCR)亲和性，能提高T细胞对肿瘤NY-ESO-1和LAGE-1抗原的识别能力。在晚期骨髓瘤患者中，高达60％的患者表达这两种抗原。通过对20 位已接受了自身干细胞移植的癌症病人中注入其自身的工程化T细胞，发现16位患者的症状得到明显的缓解⁽⁶⁾。2017年，HHMI的Garcia课题组在两名不同的直肠癌患者体内，用单细胞测序的方法，找到能被T细胞受体结合的共通肿瘤抗原 (U2AF2蛋白)，这个研究为同一种免疫疗法应用于不同患者提供了可能⁽⁷⁾。 CAR-T疗法是肿瘤免疫治疗中的关键方法，其核心是使得效应T细胞能够特异性识别肿瘤相关抗原。现在大多数是针对表达在B淋巴细胞上的CD19抗原，对急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤展现出较好的疗效。2017年，美国FDA正式批准CAR-T疗法的上市。

尽管肿瘤免疫治疗取得了一系列令人鼓舞的成就，仍然面对很多挑战，尤其是对T细胞活性调节的分子机制掌握甚少，限制了T细胞在肿瘤免疫治疗上的应用，比如部分患者对CAR-T等免疫疗法无响应。因此寻找新的，能够调控T细胞活性的关键分子，并通过调节其功能来增强T细胞抗肿瘤能力，有助于改善现有 T细胞疗法的效果。

T细胞激活信号途径中，能够调控细胞活性的因子，有望成为小分子药物作用的靶点，应用于肿瘤免疫和免疫缺陷疾病。

FAM49B，曾被报道作为一个抑癌基因，在口腔鳞癌(OSCC)的唾液中⁽⁸⁾和胰管腺癌细胞⁽⁹⁾中高表达。同时，FAM49B也在自身免疫性疾病多发性硬化(MS) 患者的外周血细胞(PBMC)中高表达⁽¹⁰⁾。自身免疫性疾病，往往是由于T细胞的过度活化，攻击人体自身组织和器官造成的⁽¹¹⁾。细胞骨架，包括微丝骨架纤维、微小管和中间丝，是细胞的机械支持和细胞构架的组成，调控细胞骨架的蛋白也参与T细胞的激活，是T细胞激活的关键蛋白之一^(12，13)。然而，FAM49B在T细胞激活途径中功能和作用机制是未知的。

参考文献：

1.Kaplan RC，et al.(2011)T cell activation and senescence predictsubclinical carotid artery disease in HI V-infected women.The Journal ofinfectious diseases 203(4)：452-463.

2.Lueg G，et al.(2015)Clinical relevance of specific T-cell activationin the blood and cerebrospinal fluid of patients with mild Alzheimer′sdisease.Neurobiology of aging 36(1)：81-89.

3.Chan AC，Iwashima M，Turck CW，& Weiss A(1992)ZAP-70：a 70kd protein-tyrosine kinase that associates with the TCR zeta chain.Cell71(4)：649-662.

4.Smith-Garvin JE，Koretzky GA，& Jordan MS(2009)T cellactivation.Annual review of immunology 27：591-619.

5.Mahoney KM & Atkins MB(2014)Prognostic and predictive markers forthe new immunotherapies.Oncology 28Suppl 3：39-48.

6.Rapoport AP，et al.(2015)NY-ESO-1-specific TCR-engineered T cellsmediate sustained antigen-specific antitumor effects in myeloma.Naturemedicine 21(8)：914-921.

7.Gee MH，et al.(2017)Antigen Identification for Orphan T CellReceptors Expressed on Tumor-Infiltrating Lymphocytes.Cell.

8.Collado-Romero M，et al.(2012)An in vivo proteomic study of theinteraction between Salmonella Typhimurium and porcine ileum mucosa.Journalof proteomics 75(7)：2015-2026.

9.Chattaragada MS，et al.(2017)FAM49B，a novel regulator ofmitochondrial function and integrity that suppresses tumormetastasis.Oncogene.

10.Gilli F，et al.(2011)Loss of bFaking signals during inflammation：afactor affecting the development and disease course of multiplesclerosis.Archives of neurology 68(7)：879-888.

11.Bluestone JA，Bour-Jordan H，Cheng M，& Anderson M(2015)T cells inthe control of organ-specific autoimmunity.J Clin Invest 125(6)：2250-2260.

12.Billadeau DD，Nolz JC，& Gomez TS(2007)Regulation of T-cellactivation bythe cytoskeleton. Nature reviews.Immunology 7(2)：131-143.

13.Burkhardt JK，Carrizosa E，& Shaffer MH(2008)The actin cytoskeletonin T cell activation.Annual review of immunology 26：233-259.

发明内容

本发明的目的是提供一种新的能够调控T细胞活性的基因和蛋白。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

FAM49基因、FAM49蛋白、FAM49基因或蛋白的表达载体、促进或抑制 FAM49基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或促进或抑制FAM49蛋白与 Rac蛋白或Rac-GTP结合的试剂或试剂盒在调控T细胞活性、TCR信号传导、 CD69的表达、Erk蛋白的磷酸化、PAK的磷酸化、或细胞骨架蛋白actin的聚集中的应用。

FAM49基因、FAM49蛋白、FAM49基因或蛋白的表达载体、促进或抑制 FAM49基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或促进或抑制FAM49蛋白与 Rac蛋白或Rac-GTP结合的试剂或试剂盒在制备用于调控T细胞活性、TCR信号传导、CD69的表达、Erk蛋白的磷酸化、PAK的磷酸化、或细胞骨架蛋白actin 的聚集的试剂或试剂盒中的应用。

FAM49基因、FAM49蛋白、FAM49基因或蛋白的表达载体、促进或抑制 FAM49基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或促进或抑制FAM49蛋白与 Rac蛋白或Rac-GTP结合的试剂或试剂盒在制备用于诊断或治疗T细胞、CD69、 Erk、PAK、或actin相关的疾病的试剂或试剂盒中的应用。

优选地，所述的T细胞相关的疾病为HIV感染或免疫性疾病。

FAM49基因、FAM49蛋白、FAM49基因或蛋白的表达载体、促进或抑制 FAM49基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或促进或抑制FAM49蛋白与 Rac蛋白或Rac-GTP结合的试剂或试剂盒在制备肿瘤免疫疗法所用的试剂或试剂盒中的应用。

优选地，所述的FAM49蛋白与Rac蛋白的结合位点为Arg161、Ala192，、 Arg165、Asn154和Pro150中的至少一个。

优选地，所述的FAM49基因为FAM49A基因及FAM49B基因中的至少一种。

优选地，所述的FAM49蛋白为FAM49A蛋白及FAM49B蛋白中的至少一种。

所述的FAM49A基因的序列为SEQIDNO：2。

所述的FAM49B基因的序列为SEQIDNO：1。

所述的FAM49A蛋白的序列为SEQIDNO：4。

所述的FAM49B蛋白的序列为SEQIDNO：3。

促进或抑制CD69的表达、Erk蛋白的磷酸化、PAK的磷酸化、或细胞骨架蛋白actin的聚集的试剂或试剂盒在调控T细胞活性、制备用于调控T细胞活性的试剂或试剂盒、制备用于诊断或治疗T细胞相关的疾病的试剂或试剂盒、或制备肿瘤免疫疗法所用的试剂或试剂盒中的应用。

本发明通过使用最新的、功能强大的全基因组CRISPR文库筛选首次发现， FAM49B是T细胞激活的负调控因子。FAM49B缺失的T细胞，会导致其过度激活，提高CD69(T细胞激活标记分子)的表达，Erk蛋白的磷酸化(T细胞激活信号途径中的分子)和提高细胞骨架蛋白actin的聚集。

本发明进而提出问题，FAM49B是通过什么途径导致T细胞过度激活的。通过免疫共沉淀和质谱联用，以及GST pull down实验，本发明发现，FAM49调控 T细胞的激活是通过直接和小G蛋白Rac1相互作用，进而调控PAK的磷酸化和细胞骨架蛋白actin的聚集。为了确定参与FAM49B和Rac相互作用的重要位点，本发明采用分子对接(moleculardocking)的方法，模拟FAM49B与Rac相互作用的结构，预测了参与的位点。从这些位点中，本发明验证得出，FAM49B-R161D的点突变会阻碍与Racl蛋白的结合，丧失提高F-actin聚集的能力。同时，包括Arg161在内，Ala192，Arg165，Asn154and Pro150这些位点的突变也会导致FAM49B抑制T细胞激活功能的丧失。通过使用小分子药物 EHT1864，FRAX597和cytoD，分别用于抑制Rac的激活，PAK的磷酸化活性和actin的聚集，都成功抑制了在FAM49B缺失的T细胞中过度激活的现象。

本发明在Jurkat T细胞中对FAM49B的功能和分子机制进行了研究。本发明揭示FAM49B是一个新的T细胞激活的负调控因子，FAM49B基因的敲除会显著增强T细胞的活性。通过构建靶向FAM49B基因的sgRNA(载体为PX330， Addgene质粒#42230)，利用电转的方式导入到Jurkat T细胞中，本发明发现 sgRNA阳性(FAM49B KO)的细胞相对于sgRNA阴性的T细胞会被过度激活，表现为CD69(图1A)。进而本发明构建FAM49B敲除的Jurkat细胞系，通过使用PX330质粒(Addgene质粒#42230)，将靶向FAM49B的sgRNA克隆进PX330 质粒，再使用biorad电转仪将质粒电转进Jurkat细胞中。通过FACS分选多个单个细胞至96孔板中。20天长出细胞群后，用western blot鉴定FAM49B被敲除的单克隆。本发明用FAM49B敲除的T细胞和western blot的技术，检测TCR 下游的一些关键分子的磷酸化水平，其中包括了LCK，CD3zeta，ZAP70，LAT， SLP76，PLCγ1，ERK等分子，发现FAM49B的敲除会影响TCR signaling中的激活途径(图1B)。

本发明中FAM49B调控T细胞的活性是通过调节细胞骨架蛋白实现的。通过免疫共沉淀-质谱联用和T细胞激活的功能性实验(CD69)，本发明发现FAM49 调控T细胞的激活可能是直接和小G蛋白Rac1相互作用实现的。通过在E.coli (Transetta)大肠杆菌中表达并体外纯化Rac1，激活形式的Rac1-G12V和FAM49B 蛋白，使用GST pull down实验，证明了FAM49B与Rac-G12V有直接的相互作用(图2D)。在T细胞信号途径中，Rac下游的直接作用的分子包括PAK。本发明发现在FAM49B的敲除会提高PAK的磷酸化水平和增加细胞骨架蛋白actin 的聚集(图2F，G，H)。为了确定参与FAM49B和Rac相互作用的重要位点，本发明采用molecular docking的方法，模拟FAM49B与Rac相互作用的结构，预测了参与的位点(图2B)。从这些位点中，本发明验证得出，FAM49B-R161D 的点突变Arg161会阻碍与Rac1蛋白的结合，丧失提高F-actin聚集的能力(图 2D，2H)。同时，包括Arg161在内，Ala192，Arg165，Asn154and Pro150这些位点的突变也会导致FAM49B抑制T细胞激活功能的丧失(图2C)。通过使用小分子药物EHT1864，FRAX597和cytoD，分别用于抑制Rac的激活，PAK的磷酸化活性和actin的聚集，都成功抑制了在FAM49B缺失的T细胞中过度激活的现象(图2I)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的研究证明，FAM49B是一个新的调控T细胞激活和细胞蛋白骨架的蛋白。通过在敲除的T细胞里补回FAM49A的表达，与FAM49B相似，同样可以抑制T细胞的激活(CD69的表达水平相比KO细胞降低)(图1C)。通过调控FAM49A或者FAM49B的表达水平，例如在未来的研究中，直接使用针对 FAM49A或者FAM49B的小分子抑制剂，可能在T细胞相关的HIV感染以及肿瘤免疫疗法中发挥功效。FAM49B的敲除会增强T细胞的活性，其作用机制是通过调节T细胞骨架，进而调控细胞激活。使用小分子药物抑制FAM49B的合成或FAM49B与Rac蛋白的结合和使用CRSIPR敲除或者shRNA/siRNA/miRNA 敲减FAM49族基因表达，会提高T细胞的激活水平，从而增强T细胞介导的肿瘤杀伤反应。

本发明揭示了FAM49B通过和Rac-GTP相互作用，维持了正常T细胞的激活；而FAM49B敲除的细胞中，更多的Rac-GTP和PAK结合，提高actin的聚集，从而影响细胞骨架，进而使T细胞被过度激活。

附图说明

图1为FAM49B是T细胞的一个负调控因子实验结果图；FACS检测FAM49B 的敲除使得T细胞被过度激活(CD69表达水平升高)(A)；anti-TCR抗体(克隆号：C305)激活后，在5min到90min内，FAM49B敲除的T细胞中，western blot检测pLCK(Y394)，pZAP70(Y493)，pLAT(Y191)，pSLP76(S376)， pPLCγl(Y783)的磷酸化水平升高(B)。在J.FAM49B细胞里表达FAM49A 或者FAM49B可以抑制CD69的表达(C)。

图2为FAM49B通过改变细胞骨架调控T细胞的激活实验结果图；FAM49B调控T细胞的激活是通过和Rac相互作用，调控细胞骨架，进而调控细胞激活。 FAM49B和活化的Rac-G12V相互作用，FAM49B-R161D的点突变会阻碍与Rac1 蛋白的结合(A)；FAM49B与Rac相互作用的重要氨基酸包括：Arg161，Ala192， Arg165.Asn154and Pro150，这些位点的突变导致FAM49B抑制T细胞激活功能的丧失(B)；在FAM49B敲除的T细胞中，western blot检测Rac-GTP的含量增多，说明激活形式的Rac含量升高(C)。PAK是Rac下游的分子，参与T 细胞激活和骨架调控。在FAM49B敲除的T细胞中，PAK的磷酸化水平明显升高，说明PAK活化形式的分子增多(D)；而FAM49B-R161D丧失抑制PAK 和Erk磷酸化的功能(E)。FAM49B缺失会提高骨架蛋白的构成F-actin水平，阻碍与Rac相互作用和PAK磷酸化的FAM49B-R161D，会丧失抑制F-actin水平的能力(F)。流式细胞检测显示，与FAM49B缺陷细胞相比，野生型细胞中 F-actin水平降低了20％以上(H)；当加入小分子抑制剂FRAX597(PAK抑制剂)，EHT 1864(Rac抑制剂)和细胞松弛素D(肌动蛋白聚合抑制剂)都可显著阻断这种抑制作用(I)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。以下所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例中所述的FAM49A基因的序列为SEQIDNO：2。FAM49B基因的序列为SEQIDNO：1。FAM49A蛋白的序列为SEQIDNO：4。FAM49B蛋白的序列为 SEQIDNO：3。

实施例1：FAM49B和FAM49A是T细胞的负调控因子

sgRNA质粒的构建：

首先，找到真核表达载体设计的5’-GGN(19)GG的序列设计gRNA。本发明的gRNA序列是以下三条gRNA序列(FAM49B-sgRNA)：

A(5’-3’)：GTAGTGTATGCAGAGTCATGC(SEQIDNO：7)；

B(5’-3’)：GGTGCAGTTGTTCCACTAGT(SEQIDNO：8)；

C(5’-3’)：GAGAATATGGGGTACTTGTTA(SEQIDNO：9)。

对于PX330载体(Addgene，48138)，使用Bbs1(NEB，R3539S)酶切载体。插入PX300质粒的oligo两端带有AAAC和CACC末端(Oligo序列见表格 1)。经过从95℃开始到25℃的梯度降温，将oligo退火。再将oligo与载体用 T4连接酶(NEB，M0202S)连接，转化到DH5α感受态细胞(Vazyme，C502-03) 中，冰上孵育15min，42℃水浴热激1min，离心后全部涂板，挑取克隆测序。所得的PX330-sgRNA(又称sgRNA-pX330-GFP)质粒用于下文所述FAM49B缺陷型Jurkat细胞系(J.FAM49B)的构建。

表格1.靶向FAM49B的sgRNA序列(由铂尚生物技术上海有限公司合成)：

	正向引物(5’-3’)	反向引物(5’-3’)
			A	CACCGTAGTGTATGCAGAGTCATGC	AAACGCATGACTCTGCATACACTAC
B	CACCGGTGCAGTTGTTCCACTAGT	AAACACTAGTGGAACAACTGCACC
			C	CACCGAGAATATGGGGTACTTGTTA	AAACTAACAAGTACCCCATATTCTC

在Jurkat细胞中电转pX330-sgRNA

通过将针对FAM49B的sgRNA(sgRNA-pX330-GFP质粒，sgRNA的序列为 sgRNA构建中所描述的FAM49B-sgRNA序列)瞬时表达到Jurkat细胞中来产生 FAM49B缺陷型细胞系。根据Genepulser(Bio-Rad)中的方案，用 sgRNA-pX330-GFP质粒对Jurkat细胞(ATCC，货号：TIB-152)进行电穿孔(在电转前1-2天，将Jurkat细胞的培养液RPMI 1640(5％FBS+PSG)更换成无双抗的培养液。电转时用Opti-MEM重悬细胞(40million/mL，300u1)，将15ug 的质粒加入重悬的细胞中，并将其转入0.4cm电击杯，用Bio-Rad电转仪电转，得到转染sgRNA的Jurkat细胞。

Jurkat细胞的激活以及CD69检测：

用anti-TCR抗体(Millipore货号05-919，克隆号：C305，lug/mL)激活上述转染sgRNA的Jurkat细胞，具体的操作步骤是：通过将100ul anti-TCR (1ug/mL)抗体，加入到0.1百万个Jurkat细胞(100ul)中，在37℃培养箱过夜培养后，收细胞并检测CD69表达上调水平。CD69检测的具体步骤如下：离心收获激活后的细胞，重悬在抗体APC anti-humanCD69(biolegend，310910，稀释比例为1：500)的FACS buffer中(含有5％FBS，2mM EDTA的PBS)。孵育一段时间(4℃，30min)后，用FACS缓冲液洗去未结合的抗体，重悬细胞。使用流式细胞仪检测CD69表达水平的变化。在转染sgRNA的Jurkat细胞中， CD69的表达水平上升(图1A)，表明T细胞被过度激活。

为了排除sgRNA的脱靶效应，构建FAM49B缺陷型Jurkat细胞系，并将FAM49B 重新表达其中，验证是否能挽救FAM49B的缺陷表型。

FAM49B缺陷型Jurkat细胞系(J.FAM49B)的构建：

通过将针对FAM49B的sgRNA(所用质粒为sgRNA构建中所描述的 sgRNA-pX330-GFP质粒，sgRNA的序列为sgRNA构建中所描述的B序列)瞬时表达到Jurkat细胞中来产生FAM49B缺陷型细胞系。根据Genepulser(Bio-Rad) 中的方案，用sgRNA-pX330-GFP质粒对Jurkat细胞进行电穿孔(在电转前1-2 天，将Jurkat细胞的培养液RPMI 1640(5％FBS+PSG)更换成无双抗的培养液。电转时用Opti-MEM重悬细胞(40million/mL，300ul)，将15ug的质粒加入重悬的细胞中，并将其转入0.4cm电击杯，用Bio-Rad电转仪电转。为了获得单克隆，将GFP阳性细胞通过BD FACSAria III单细胞分选到96孔板中。扩增数周后，通过蛋白质印迹筛选每个克隆的FAM49B的表达，得到FAM49B缺陷型细胞系。

慢病毒的包装及感染：

用WT FAM49B(质粒cDNA序列由无锡青兰生物有限公司合成， SEQIDNO：1)，WTFAM49A(质粒cDNA序列由无锡青兰生物有限公司合成， SEQIDNO：2)，FAM49B-R161D(通过WTFAM49B的点突变克隆得到，克隆的引物见表格2中的四条引物，克隆至质粒pHR-pEF-EGFP(Addgene#67952) 中。具体克隆方法：使用的PCR体系1：10ul 5×PCRbuffer，1ul 2.5mMdNTP mixture，1ul 10uM FAM49B-FOR，1ul 10uM R161D-REV，1ul模板(WT FAM49B，50ng/u1)，1ul Phusion polymerase；PCR体系2：10ul 5×PCR buffer， 1ul 2.5mM dNTPmixture，1ul 10uM R161D-FOR，1ul 10uMFAM49B-REV， 1ul模板(WT FAM49B，50ng/ul)，1ulPhusion polymerase(所用PCR试剂除 ddH₂O，均为Takara，R050A试剂盒提供)，PCR的程序为：95℃5min，95℃ 30s，58℃30s，72℃60s(34cycles)，72℃5min，12℃保持。然后通过Gibson Assembly Master mix酶体系(NEB，E2611S)连接在pHR-pEF-EGFP质粒中，转化和挑取单克隆测序的方法和上述sgRNA质粒构建相同。将上述表达 FAM49的慢病毒质粒转化DH5α感受态细胞(Vazyme，C502-03)中，37℃恒温培养16h，挑取单克隆至200mL含有相应抗生素(氨苄200ug/mL)的LB培养基中，37℃摇过夜，用质粒中提试剂盒(MN，740420)进行质粒中提。将中提的质粒稀释到500ng/uL，将其与慢病毒包装质粒pMD2.G(Addgene质粒#12259)和pCMVdR8.92(Addgene质粒#8455)通过脂质体转染法(脂转法)共转到 293LX细胞(TaKaRa货号#632180)中。脂转前一天，铺2.2x10⁵293LX细胞于 6孔板中，加入2.5mL DMEM培养液(10％FBS，无双抗)。24小时后将(500ng) 质粒和(550ng)慢病毒包装质粒和3ul脂转体系(Mirusbio，MIR 2305)加入293LX 细胞中。继续培养48小时后，收集包含慢病毒的上清液，离心后分装冻存于-80℃，供以后实验使用。感染细胞时，把含有慢病毒与FAM49B缺陷型Jurkat细胞共培养，将病毒和细胞按照1∶2的比例感染，37℃培养箱放置3天，期间可加入RPMI1640(5％FBS，双抗，Life Invitrogen，C22400500CP)的培养基，产生重建的FAM49B缺陷型细胞系(J.FAM49B)。J.FAM49B细胞用于下文中FAM49B 敲除细胞的信号通路研究。

表格2：FAM49B和FAM49B突变体的引物序列(由铂尚生物技术上海有限公司合成)：

为了探索FAM49B对于T细胞信号通路的具体作用，利用蛋白印迹技术，检测了一系列的信号传递事件。

T细胞内信号分子磷酸化水平的检测：

取一定量的FAM49B缺陷型细胞系(J.FAM49B)，用RPMI 1640(Life Invitrogen，C22400500CP)重悬到20million/ml，37摄氏度静置60分钟后，利用C305在不同的时间点对200ulT细胞进行刺激(C305腹水，1∶2000浓度，分别在如图1.B中所示，激活0，2，5，15，45，90min)，最后利用200ul 2XNP40裂解液(1％NP40，20mM Tris-HCL，150mM Nacl，1tablet蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Life Invitrogen，88668)将反应终止。离心后，取出上清，进行蛋白印迹分析，结果显示，在FAM49B缺陷型细胞系中，下游的磷酸化事件持续时间都会有延长和不同程度地增强，包括Lck pTyr394，Zap70pTyr493，LAT，pTyr191， SLP76pS376，PLCgamma，pTyr783和pERK(图1B)。结果表明，FAM49B作为T细胞的负调控因子能够抑制T细胞早期的信号传导。

为了探索FAM49A在T细胞激活中的功能，我们将FAM49A导回J.FAM49B 细胞中。验证FAM49A的功能：

通过在敲除的T细胞里补回FAM49A的表达，与FAM49B相似，同样可以抑制T细胞的激活(CD69的表达水平相比KO细胞降低)(图1C)。具体实验步骤是：用上文慢病毒的包装中WT FAM49B和WT FAM49A得到的病毒，按照1∶2的比例感染Jurkat细胞。第一天，加入1mL1X10⁶的病毒液到2X10⁶的 J.FAM49B细胞中，细胞重悬于RPMI 1640培养基中。第三天，对分别感染了 WT FAM49B和WT FAM49A的J.FAM49B细胞进行激活。激活的具体操作见上文中“Jurkat细胞的激活以及CD69检测”，除加入的细胞不同，步骤相同。结果表明(图1C)，FAM49A和FAM49B都能够抑制CD69的表达，是T细胞激活的负调控因子。

实施例2：FAM49B通过改变细胞骨架调控T细胞的激活

接下来使用免疫共沉淀和质谱联用(IP-MS)来鉴定FAM49B的结合配偶体。 FAM49B在任一末端用FLAG-mNeon标记(图2A)具体的方法是，通过亚克隆 (使用引物具体序列见表格2所示)：将mNeon序列通过PCR克隆下来(PCR 体系：10ul 5×PCR buffer，1μl 2.5mMdNTP mixture，1ul 10uM Forward oligo， 1μl 10μM Reverse oligo，1μl模板(50ug/ul，模板为无锡青兰公司常规方法合成mNeonGreen，SEQIDNO：30，其对应蛋白序列为SEQIDNO：31)，1μ l Phusion polymerase)(所用PCR试剂除ddH₂O，均为Takara，R050A试剂盒提供)，然后通过Gibson Assembly Master mix酶体系(NEB，E2611S)连接在 FAM49B(SEQIDNO：1)的N端或者C端。样品在50摄氏度连接2小时，最后转化至测序(和上述sgRNA质粒的构建中转化测序步骤相同)。有趣的是，N 端标记完全消除了FAM49B功能，而C端标记的FAM49B大部分保持了FAM49B 的抑制功能。因此，使用N端标记的FAM49B作为FAM49B相关蛋白的阴性对照。本发明推断，介导其抑制功能的FAM49B相关蛋白可能与C端标记的 FAM49B相互作用，但不与N端标记的FAM49B相互作用。用C标记的FAM49B (但不是N-标记的或天然的FAM49B)选择性免疫沉淀的蛋白质之一是小G蛋白Rac。

表格3：用于构建N-tag和C-tag的引物序列(由铂尚生物技术上海有限公司合成)：

蛋白对接方法：

为了研究FAM49B蛋白和小G蛋白Rac是如何相互作用的，本发明应用生物信息学和结构预测的方法：FAM49B的同源模型由MPI生物信息库提供的 MODELLER构建而成，并以3P8C来源的Sra-1作为模版。Rac1的结构参照2NZ8 中PDB得到。FAM49B和Rac1的分子对接由HADDOCK网站构建。在本设计中，FAM49B的150，161氨基酸作为激活位点，其它位点由HADDOCK自动生成。在本设计中，Rac1的64氨基酸位点作为激活位点，12-14，25-39，57-67，123-132不作为对接上的位点。分子对接结果显示(图2B)，FAM49B中150-166氨基酸上的α-螺旋在Rac1形成的复合物中起重要作用。其中，Arg161位点靠近Rac1 GTP结合区域，并且这个氨基酸带有正电荷，和GTP的负电性形成离子相互作用。另外， FAM49B上Pro150与Rac1上Tyr64位点形成疏水作用。Arg165，分别和Rac1上 Glu31和Tyr32形成盐桥和阳离子相互作用。FAM49B上其它的位点，Met147， Asn154，Glu182，Ala192，Glu193也促进和Rac1的相互作用。经T细胞激活验证(验证方法同实施例1中：Jurkat细胞的激活以及CD69检测)，FAM49B上氨基酸Arg161，Ala192，Arg165，Asn154and Pro150，这些位点的突变会使FAM49B丧失抑制T细胞激活的功能(图2C)。

FAM49B蛋白和Rac蛋白的纯化：

FAM49B基因(同上文中WT FAM49B，无锡青兰合成的序列)和 FAM49B-R161D(是上文中FAM49B-R161D的构建所得)亚克隆(质粒构建方法和上述实施例2中N端FAM49B的构建相同，所用引物不同，所用引物见表格3中)至商业质粒pET23b(Novagen/EMD Biosciences)中；Rac基因(由无锡青兰生物公司合成cDNA序列，序列为SEQIDNO：5)和Rac-G12V基因(模板为 Rac，SEQIDNO：5，引物序列见表格4，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，构建方法相同，引物不同)构建至商业质粒pEGX(Novagen/EMD Biosciences)中(所有表达质粒的构建步骤和上文WT FAM49B质粒构建方法完全一致，所用引物不同，引物序列见表格4)。转化到菌株BL21transetta(全式金，CD801)中，挑取单克隆至3mL Amp LB培养基中，37摄氏度过夜摇菌。第二天，将3mL的菌液加入1L的LB培养基中。测得OD值为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG (生工，R0391)诱导蛋白表达，加入IPTG后，立即改变培养温度至16℃；培养过夜。第三天，用Lysis buffer(50mM Tris，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌液，用压力破碎仪(永联生物)进行破碎，2-4min；n；收集破碎的上清，加入Ni-beads (Thermo Fisher Scientific，90101)和上清结合1h，4摄氏度。然后用elution buffer (50mM Tris，200mM NaCl，250mMimidazole，pH 8.0)收集蛋白，分别得到 GST-Rac、GST-Rac-G12V、his-FAM49b和his-FAM49b(R161D)蛋白。纯化的蛋白通过AKTA(GE health)进行分子筛纯化，按照superdex20010/300GL推荐的纯化程序进行分子筛，分子筛的buffer为50mM HEPES，150mM NaCl，

PH＝8。得到的蛋白分装，放置于-80摄氏度保存。

表格4：用于构建FAM49B，Rac和Rac-G12V的表达质粒的引物(由铂尚生物技术上海有限公司合成)：

体外蛋白相互作用检测：

通过使用GST pull-down试验，将GST-Rac(上述蛋白纯化步骤所得，20uM)， GST-Rac-G12V(上述蛋白纯化步骤所得，20uM)分别与his-FAM49b(上述蛋白纯化步骤所得，20uM)和his-FAM49b(R161D)(上述蛋白纯化步骤所得， 20uM)蛋白共同孵育，最后加入预先用GST结合缓冲液(50mM Hepes pH 8， 100mM(NH4)₂SO₄，150mM MgSO₄，1mM EDTA，0.7％NP40)。清洗的GST-beads (Thermo Fisher Scientific，16100)，4℃预处理1小时后，用GST结合缓冲液漂洗3次，95℃煮沸10min。样品在4℃下以最大速度离心3分钟，将上清液转移至干净的管中。通过蛋白质印迹分析样品，发现FAM49B与Rac1在体外直接相互作用，与WTRac1相比，选择性地与活性Rac1结合的亲和力更高(图2D)。

检测Rac-GTP含量的和F-actin水平：

Rac以活跃的GTP结合和非活动的GDP结合形式存在，并且在T细胞信号传导中起关键作用。通过RAC GTP免疫共沉淀的实验(Cytosketelon#BK035)，将上述FAM49B缺陷型Jurkat细胞和野生型Jurkat细胞重悬在无血清培养基 RPMI1640(Life Invitrogen，C22400500CP)中，放在37摄氏度60分钟，然后将细胞密度调整到20million/ml，体积为250微升，接着将细胞放在37℃，在不同的时间点(0min，2min，30min)加入等体积的C305(250ul，1∶8000终浓度)，保证两株细胞系在同一时间点的刺激时间相同。刺激结束后将细胞迅速转移到冰上，然后800rcf，4℃离心1min30s，除去上清之后迅速加入kit(Cytosketelon#BK035)中的1ml预冷的裂解液(含蛋白酶抑制剂Bimake， B14001)，裂解时间为2min，然后10000rcf，4℃离心1min。取上清900微升，加入kit中的10ul PAK-PBDbeads，4℃旋转结合60min。剩余100ul用于细胞裂解液中蛋白的对照。同时需要准备阳性对照(GTPgammarS(Cytosketelon#BK035) 处理过的样品)和阴性对照(GDP(Cytosketelon#BK035)处理过的样品)，在上清900微升中加入90微升loading buffer(Cytosketelon#BK035)，然后迅速加入10微升的GTPgammarS(Cytosketelon#BK035)或者是GDP(Cytosketelon#BK035)，将样品放在室温旋转15min后，加入100微升stopbuffer(Cytosketelon#BK035)，最后加入10ul PAK-PBD beads(Cytosketelon#BK035)， 4℃旋转结合60min。Pull down结束之后，3000rcf，4度离心1min，除去上清，然后加入500微升的wash buffer(Cytosketelon#BK035)，3000rcf，4℃离心3min，除去上清后加入60微升protein loading buffer(全式金，DL101-02)洗脱，样品用于western检测分析。本发明发现FAM49B缺陷会增强Rac-GTP水平，特别是在TCR刺激后2分钟(图2E)，表明FAM49B抑制Rac的激活。通过对激酶PAK磷酸化水平的检测，显示出FAM49B缺陷的细胞PAK磷酸化水平会显着升高(图2F)，而FAM49B-R161D丧失抑制PAK磷酸化的能力(图2G)

使用鬼笔环肽染色检测细胞内的F-肌动蛋白水平，取等量细胞，用PBS清洗一遍后，除去上清，加入4％PFA室温固定10min，然后用细胞染色缓冲液(4A Biotech，FXP005)清洗两遍，然后用0.1％triton破膜5min，用细胞染色缓冲液清洗两遍之后，加入1：1000稀释的Alexa647-Phalloidin(ThermoFisher，A22287)，室温避光染色20min，最后用细胞染色缓冲液清洗三遍之后，用于流式细胞检测。结果显示，与FAM49B缺陷细胞相比，野生型Jurkat细胞中F-actin水平降低了 20％以上(图2H)综上所述，这些结果表明FAM49B-Rac1复合物抑制Rac1活性和PAK磷酸化，影响肌动蛋白的水平。

使用小分子药物后，检测FAM49B在T细胞中对于Rac和PAK的活性以及肌动蛋白聚合的影响。小分子药物提前过夜处理，同时激活T细胞。具体方法是将细胞调整为0.2million每个孔，每个孔内加入200ul RPMI1640，同时，加入终浓度为1uM FRAX597，50uMEHT 1864，4uM细胞松弛素D。在37度培养箱过夜培养后，检测T细胞的激活程度(操作步骤见Jurkat细胞的激活以及CD69检测)。结果显示，在FAM49B缺陷型细胞中，将FAM49B重构到细胞中可以显著抑制T细胞活化。当加入小分子抑制剂FRAX597(PAK抑制剂)，EHT 1864 (Rac抑制剂)和细胞松弛素D(肌动蛋白聚合抑制剂)都可显著阻断这种抑制作用(图2I)。这些结果都表明FAM49B可以调节肌动蛋白细胞骨架并影响T 细胞刺激后的TCR信号。

本实施例中用于补回敲除细胞内FAM49B的基因序列为(SEQIDNO：1)：

atggggaatcttcttaaagttttgacatgcacagaccttgagcaggggccaaattttttccttgattttgaaaatgcccagccta cagagtctgagaaggaaatttataatcaggtgaatgtagtattaaaagatgcagaaggcatcttggaggacttgcagtcatac agaggagctggccacgaaatacgagaggcaatccagcatccagcagatgagaagttgcaagagaaggcatggggtgc agttgttccactagtaggcaaattaaagaaattttacgaattttctcagaggttagaagcagcattaagaggtcttctgggagc cttaacaagtaccccatattctcccacccagcatctagagcgagagcaggctcttgctaaacagtttgcagaaattcttcattt cacactccggtttgatgaactcaagatgacaaatcctgccatacagaatgatttcagctattatagaagaacattgagtcgtat gaggattaacaatgtaccggcagaaggagaaaatgaagtaaataatgaattggcaaatcgaatgtctttgttttatgctgagg caactccaatgctgaaaaccttgagtgatgccacaacaaaatttgtatcagagaataaaaatttaccaatagaaaataccaca gattgtttaagcacaatggctagtgtatgcagagtcatgctggaaacaccggaatacagaagcagatttacaaatgaagagacagtgtcattctgcttgagggtaatggtgggtgtcataatactctatgaccacgtacatccagtgggagcatttgctaaaacttc caaaattgatatgaaaggttgtatcaaagttcttaaggaccaacctcctaatagtgtggaaggtcttctaaatgctctcaggtac acaacaaaacatttgaatgatgagactacctccaagcaaattaaatccatgctgcaa

FAM49A的基因序列为(SEQIDNO：2)：

atgggaaacctgctcaaagtccttaccagggaaattgaaaactatccacactttttcctggattttgaaaatgctcagcctaca gaaggagagagagaaatctggaaccagatcagcgccgtccttcaggattctgagagcatccttgcagacctgcaggctta caaaggcgcaggcccagagatccgagatgcaattcaaaatcccaatgacattcagcttcaagaaaaagcttggaatgcgg tgtgccctcttgttgtgaggctaaagagattttacgagttttccattagactagaaaaagctcttcagagtttattggaatctctga cttgtccaccctacacaccaacccaacacctggaaagggaacaggccctggcaaaggagtttgccgaaattttacattttac ccttcgattcgatgagctgaagatgaggaacccggctattcagaatgacttcagctactacagaagaacaatcagtcgcaac cgcatcaacaacatgcacctagacattgagaatgaagtcaataatgagatggccaatcgaatgtccctcttctatgcagaag ccacgccaatgctgaaaacccttagcaatgccacaatgcactttgtctctgaaaacaaaactctgccaatagagaacaccac agactgcctcagcacaatgacaagtgtctgtaaagtcatgctggaaactccggagtacagaagtaggtttacgagtgaaga gaccctgatgttctgcatgagggtgatggtgggagtcatcatcctctatgaccatgtccaccctgtgggagctttctgcaaga catccaagarcgatatgaaaggctgcataaaagttttgaaggagcaggccccagacagtgtggaggggctgctaaatgcc ctcaggttcactacaaagcacttgaacgatgaatcaacttccaaacagattcgagcaatgcttcag

FAM49B的氨基酸序列为(SEQIDNO：3)：

MGNLLKVLTCTDLEQGPNFFLDFENAQPTESEKEIYNQVNVVLKDAEGILEDL QSYRGAGHEIREAIQHPADEKLQEKAWGAVVPLVGKLKKFYEFSQRLEAALR GLLGALTSTPYSPTQHLEREQALAKQFAEILHFTLRFDELKMTNPAIQNDFSY YRRTLSRMRINNVPAEGENEVNNELANRMSLFYAEATPMLKTLSDATTKFVS ENKNLPIENTTDCLSTMASVCRVMLETPEYRSRFTNEETVSFCLRVMVGVIIL YDHVHPVGAFAKTSKIDMKGCIKVLKDQPPNSVEGLLNALRYTTKHLNDETT SKQIKSMLQ

FAM49A的氨基酸序列为(SEQIDNO：4)：

MGNLLKVLTREIENYPHFFLDFENAQPTEGEREIWNQISAVLQDSESILADLQA YKGAGPEIRDAIQNPNDIQLQEKAWNAVCPLVVRLKRFYEFSIRLEKALQSLL ESLTCPPYTPTQHLEREQALAKEFAEILHFTLRFDELKMRNPAIQNDFSYYRRT ISRNRINNMHLDIENEVNNEMANRMSLFYAEATPMLKTLSNATMHFVSENKT LPIENTTDCLSTMTSVCKVMLETPEYRSRFTSEETLMFCMRVMVGVIILYDHV HPVGAFCKTSKIDMKGCIKVLKEQAPDSVEGLLNALRFTTKHLNDESTSKQIR AMLQ

Rac的基因序列(SEQIDNO：5)：

caggccatcaagtgtgtggtggtgggagacggagctgtaggtaaaacttgcctactgatcagttacacaaccaatgcatttc ctggagaatatatccctactgtctttgacaattattctgccaatgttatggtagatggaaaaccggtgaatctgggcttatggga tacagctggacaagaagattatgacagattacgccccctatcctatccgcaaacagttggagaaacgtacggtaaggatata acctcccggggcaaagacaagccgattgccgatgtgttcttaatttgcttttcccttgtgagtcctgcatcatttgaaaatgtcc gtgcaaagtggtatcctgaggtgcggcaccactgtcccaacactcccatcatcctagtgggaactaaacttgatcttaggga tgataaagacacgatcgagaaactgaaggagaagaagctgactcccatcacctatccgcagggtctagccatggctaagg agattggtgctgtaaaatacctggagtgctcggcgctcacacagcgaggcctcaagacagtgtttgacgaagcgatccga gcagtcctctgcccgcctcccgtgaagaagaggaagagaaaatgcctgctgttg

Rac的氨基酸序列(SEQIDNO：6)：

QAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFPGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNL GLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTVGETYGKDITSRGKDKPIADVFLICFSLVSP ASFENVRAKWYPEVRHHCPNTPIILVGTKLDLRDDKDTIEKLKEKKLTPITYP QG

LAMAKEIGAVKYLECSALTQRGLKTVFDEAIRAVLCPPPVKKRKRKCLLL mNeonGreen的碱基序列(SEQIDNO：30)：

GTGTCCAAGGGCGAGGAGGACAACATGGCCTCTCTGCCAGCTACCCACGA GCTGCACATCTTCGGATCTATCAACGGCGTGGACTTTGATATGGTGGGAC AGGGAACCGGAAACCCAAACGACGGATACGAGGAGCTGAACCTGAAGTC TACAAAGGGCGATCTGCAGTTCAGCCCTTGGATCCTGGTGCCACACATCG GATACGGCTTTCACCAGTACCTGCCCTACCCTGACGGAATGTCTCCTTTCC AGGCCGCTATGGTGGATGGAAGCGGCTACCAGGTGCACCGGACAATGCA GTTTGAGGACGGCGCCTCCCTGACCGTGAACTACCGCTACACATACGAGG GATCTCACATCAAGGGCGAGGCCCAGGTGAAGGGAACCGGCTTCCCAGCT GATGGACCCGTGATGACCAACAGCCTGACAGCCGCTGACTGGTGCAGGTC CAAGAAGACATACCCAAACGATAAGACCATCATCAGCACCTTCAAGTGGT CCTACACCACAGGAAACGGCAAGAGGTACAGAAGCACCGCCAGGACCAC ATACACATTTGCTAAGCCCATGGCCGCTAACTACCTGAAGAACCAGCCTA TGTACGTGTTCCGGAAGACCGAGCTGAAGCACTCCAAGACAGAGCTGAAC TTCAAGGAGTGGCAGAAGGCTTTTACCGACGTGATGGGCATGGATGAGCT GTACAAG

mNeonGreen的氨基酸序列(SEQIDNO：31)：

VSKGEEDNMASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTK GDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFED GASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTY PNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDVMGMDELYK

。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> FAM49基因及其编码蛋白的应用

<130> 11

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggggaatc ttcttaaagt tttgacatgc acagaccttg agcaggggcc aaattttttc 60

cttgattttg aaaatgccca gcctacagag tctgagaagg aaatttataa tcaggtgaat 120

gtagtattaa aagatgcaga aggcatcttg gaggacttgc agtcatacag aggagctggc 180

cacgaaatac gagaggcaat ccagcatcca gcagatgaga agttgcaaga gaaggcatgg 240

ggtgcagttg ttccactagt aggcaaatta aagaaatttt acgaattttc tcagaggtta 300

gaagcagcat taagaggtct tctgggagcc ttaacaagta ccccatattc tcccacccag 360

catctagagc gagagcaggc tcttgctaaa cagtttgcag aaattcttca tttcacactc 420

cggtttgatg aactcaagat gacaaatcct gccatacaga atgatttcag ctattataga 480

agaacattga gtcgtatgag gattaacaat gtaccggcag aaggagaaaa tgaagtaaat 540

aatgaattgg caaatcgaat gtctttgttt tatgctgagg caactccaat gctgaaaacc 600

ttgagtgatg ccacaacaaa atttgtatca gagaataaaa atttaccaat agaaaatacc 660

acagattgtt taagcacaat ggctagtgta tgcagagtca tgctggaaac accggaatac 720

agaagcagat ttacaaatga agagacagtg tcattctgct tgagggtaat ggtgggtgtc 780

ataatactct atgaccacgt acatccagtg ggagcatttg ctaaaacttc caaaattgat 840

atgaaaggtt gtatcaaagt tcttaaggac caacctccta atagtgtgga aggtcttcta 900

aatgctctca ggtacacaac aaaacatttg aatgatgaga ctacctccaa gcaaattaaa 960

tccatgctgc aa 972

<210> 2

<211> 969

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgggaaacc tgctcaaagt ccttaccagg gaaattgaaa actatccaca ctttttcctg 60

gattttgaaa atgctcagcc tacagaagga gagagagaaa tctggaacca gatcagcgcc 120

gtccttcagg attctgagag catccttgca gacctgcagg cttacaaagg cgcaggccca 180

gagatccgag atgcaattca aaatcccaat gacattcagc ttcaagaaaa agcttggaat 240

gcggtgtgcc ctcttgttgt gaggctaaag agattttacg agttttccat tagactagaa 300

aaagctcttc agagtttatt ggaatctctg acttgtccac cctacacacc aacccaacac 360

ctggaaaggg aacaggccct ggcaaaggag tttgccgaaa ttttacattt tacccttcga 420

ttcgatgagc tgaagatgag gaacccggct attcagaatg acttcagcta ctacagaaga 480

acaatcagtc gcaaccgcat caacaacatg cacctagaca ttgagaatga agtcaataat 540

gagatggcca atcgaatgtc cctcttctat gcagaagcca cgccaatgct gaaaaccctt 600

agcaatgcca caatgcactt tgtctctgaa aacaaaactc tgccaataga gaacaccaca 660

gactgcctca gcacaatgac aagtgtctgt aaagtcatgc tggaaactcc ggagtacaga 720

agtaggttta cgagtgaaga gaccctgatg ttctgcatga gggtgatggt gggagtcatc 780

atcctctatg accatgtcca ccctgtggga gctttctgca agacatccaa gatcgatatg 840

aaaggctgca taaaagtttt gaaggagcag gccccagaca gtgtggaggg gctgctaaat 900

gccctcaggt tcactacaaa gcacttgaac gatgaatcaa cttccaaaca gattcgagca 960

atgcttcag 969

<210> 3

<211> 324

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Gly Asn Leu Leu Lys Val Leu Thr Cys Thr Asp Leu Glu Gln Gly

1 5 10 15

Pro Asn Phe Phe Leu Asp Phe Glu Asn Ala Gln Pro Thr Glu Ser Glu

20 25 30

Lys Glu Ile Tyr Asn Gln Val Asn Val Val Leu Lys Asp Ala Glu Gly

35 40 45

Ile Leu Glu Asp Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ala Gly His Glu Ile Arg

50 55 60

Glu Ala Ile Gln His Pro Ala Asp Glu Lys Leu Gln Glu Lys Ala Trp

65 70 75 80

Gly Ala Val Val Pro Leu Val Gly Lys Leu Lys Lys Phe Tyr Glu Phe

85 90 95

Ser Gln Arg Leu Glu Ala Ala Leu Arg Gly Leu Leu Gly Ala Leu Thr

100 105 110

Ser Thr Pro Tyr Ser Pro Thr Gln His Leu Glu Arg Glu Gln Ala Leu

115 120 125

Ala Lys Gln Phe Ala Glu Ile Leu His Phe Thr Leu Arg Phe Asp Glu

130 135 140

Leu Lys Met Thr Asn Pro Ala Ile Gln Asn Asp Phe Ser Tyr Tyr Arg

145 150 155 160

Arg Thr Leu Ser Arg Met Arg Ile Asn Asn Val Pro Ala Glu Gly Glu

165 170 175

Asn Glu Val Asn Asn Glu Leu Ala Asn Arg Met Ser Leu Phe Tyr Ala

180 185 190

Glu Ala Thr Pro Met Leu Lys Thr Leu Ser Asp Ala Thr Thr Lys Phe

195 200 205

Val Ser Glu Asn Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asn Thr Thr Asp Cys Leu

210 215 220

Ser Thr Met Ala Ser Val Cys Arg Val Met Leu Glu Thr Pro Glu Tyr

225 230 235 240

Arg Ser Arg Phe Thr Asn Glu Glu Thr Val Ser Phe Cys Leu Arg Val

245 250 255

Met Val Gly Val Ile Ile Leu Tyr Asp His Val His Pro Val Gly Ala

260 265 270

Phe Ala Lys Thr Ser Lys Ile Asp Met Lys Gly Cys Ile Lys Val Leu

275 280 285

Lys Asp Gln Pro Pro Asn Ser Val Glu Gly Leu Leu Asn Ala Leu Arg

290 295 300

Tyr Thr Thr Lys His Leu Asn Asp Glu Thr Thr Ser Lys Gln Ile Lys

305 310 315 320

Ser Met Leu Gln

<210> 4

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Gly Asn Leu Leu Lys Val Leu Thr Arg Glu Ile Glu Asn Tyr Pro

1 5 10 15

His Phe Phe Leu Asp Phe Glu Asn Ala Gln Pro Thr Glu Gly Glu Arg

20 25 30

Glu Ile Trp Asn Gln Ile Ser Ala Val Leu Gln Asp Ser Glu Ser Ile

35 40 45

Leu Ala Asp Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Ala Gly Pro Glu Ile Arg Asp

50 55 60

Ala Ile Gln Asn Pro Asn Asp Ile Gln Leu Gln Glu Lys Ala Trp Asn

65 70 75 80

Ala Val Cys Pro Leu Val Val Arg Leu Lys Arg Phe Tyr Glu Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Leu Glu Lys Ala Leu Gln Ser Leu Leu Glu Ser Leu Thr Cys

100 105 110

Pro Pro Tyr Thr Pro Thr Gln His Leu Glu Arg Glu Gln Ala Leu Ala

115 120 125

Lys Glu Phe Ala Glu Ile Leu His Phe Thr Leu Arg Phe Asp Glu Leu

130 135 140

Lys Met Arg Asn Pro Ala Ile Gln Asn Asp Phe Ser Tyr Tyr Arg Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ser Arg Asn Arg Ile Asn Asn Met His Leu Asp Ile Glu Asn

165 170 175

Glu Val Asn Asn Glu Met Ala Asn Arg Met Ser Leu Phe Tyr Ala Glu

180 185 190

Ala Thr Pro Met Leu Lys Thr Leu Ser Asn Ala Thr Met His Phe Val

195 200 205

Ser Glu Asn Lys Thr Leu Pro Ile Glu Asn Thr Thr Asp Cys Leu Ser

210 215 220

Thr Met Thr Ser Val Cys Lys Val Met Leu Glu Thr Pro Glu Tyr Arg

225 230 235 240

Ser Arg Phe Thr Ser Glu Glu Thr Leu Met Phe Cys Met Arg Val Met

245 250 255

Val Gly Val Ile Ile Leu Tyr Asp His Val His Pro Val Gly Ala Phe

260 265 270

Cys Lys Thr Ser Lys Ile Asp Met Lys Gly Cys Ile Lys Val Leu Lys

275 280 285

Glu Gln Ala Pro Asp Ser Val Glu Gly Leu Leu Asn Ala Leu Arg Phe

290 295 300

Thr Thr Lys His Leu Asn Asp Glu Ser Thr Ser Lys Gln Ile Arg Ala

305 310 315 320

Met Leu Gln

<210> 5

<211> 630

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

caggccatca agtgtgtggt ggtgggagac ggagctgtag gtaaaacttg cctactgatc 60

agttacacaa ccaatgcatt tcctggagaa tatatcccta ctgtctttga caattattct 120

gccaatgtta tggtagatgg aaaaccggtg aatctgggct tatgggatac agctggacaa 180

gaagattatg acagattacg ccccctatcc tatccgcaaa cagttggaga aacgtacggt 240

aaggatataa cctcccgggg caaagacaag ccgattgccg atgtgttctt aatttgcttt 300

tcccttgtga gtcctgcatc atttgaaaat gtccgtgcaa agtggtatcc tgaggtgcgg 360

caccactgtc ccaacactcc catcatccta gtgggaacta aacttgatct tagggatgat 420

aaagacacga tcgagaaact gaaggagaag aagctgactc ccatcaccta tccgcagggt 480

ctagccatgg ctaaggagat tggtgctgta aaatacctgg agtgctcggc gctcacacag 540

cgaggcctca agacagtgtt tgacgaagcg atccgagcag tcctctgccc gcctcccgtg 600

aagaagagga agagaaaatg cctgctgttg 630

<210> 6

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Ala Ile Lys Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys Thr

1 5 10 15

Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Pro Gly Glu Tyr Ile

20 25 30

Pro Thr Val Phe Asp Asn Tyr Ser Ala Asn Val Met Val Asp Gly Lys

35 40 45

Pro Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr Asp

50 55 60

Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Thr Val Gly Glu Thr Tyr Gly

65 70 75 80

Lys Asp Ile Thr Ser Arg Gly Lys Asp Lys Pro Ile Ala Asp Val Phe

85 90 95

Leu Ile Cys Phe Ser Leu Val Ser Pro Ala Ser Phe Glu Asn Val Arg

100 105 110

Ala Lys Trp Tyr Pro Glu Val Arg His His Cys Pro Asn Thr Pro Ile

115 120 125

Ile Leu Val Gly Thr Lys Leu Asp Leu Arg Asp Asp Lys Asp Thr Ile

130 135 140

Glu Lys Leu Lys Glu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Thr Tyr Pro Gln Gly

145 150 155 160

Leu Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Ala Val Lys Tyr Leu Glu Cys Ser

165 170 175

Ala Leu Thr Gln Arg Gly Leu Lys Thr Val Phe Asp Glu Ala Ile Arg

180 185 190

Ala Val Leu Cys Pro Pro Pro Val Lys Lys Arg Lys Arg Lys Cys Leu

195 200 205

Leu Leu

210

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 7

gtagtgtatg cagagtcatg c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 8

ggtgcagttg ttccactagt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 9

gagaatatgg ggtacttgtt a 21

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 10

gtggagcaag gcaggtggac agtggatccg ccaccatggg gaatcttc 48

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 11

gccagtaacg ttaggggggg gggcggccgc ttacaggtcc tcctcgct 48

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 12

tgatttcagc tattatagag atacattgag tcgtatgagg a 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 13

tcctcatacg actcaatgta tctctataat agctgaaatc a 41

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 14

agcaaggcag gtggacagtg gatccgccac catggggaat cttc 44

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 15

cgcctccact gcccccaccg ctgccgcctt gcagcatgga tttaatttgc 50

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 16

ggtgggggca gtggaggcgg aagcggagtg tccaagggcg agg 43

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 17

gtcgtggtcc ttgtagtcgc cgtcgtggtc cttgtagtcc ttgtacagct catccatgc 59

<210> 18

<211> 73

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 18

gttgcaggtg ggagttgcgg ccgctcactt gtcgtcgtcg tccttgtagt cgatgtcgtg 60

gtccttgtag tcg 73

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 19

ctacaaggac cacgacatcg actacaagga cgacgacgac aaggtgtcca agggcgagg 59

<210> 20

<211> 75

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 20

caaggcaggt ggacagtgga tccgccacca tggactacaa ggaccacgac ggcgactaca 60

aggaccacga catcg 75

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 21

taagaagatt ccccataccg ctgccgccct tgtacagctc atccatg 47

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 22

tgtacaaggg cggcagcggt atggggaatc ttcttaaagt tttgac 46

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 23

gttgcaggtg ggagttgcgg ccgctcattg cagcatggat ttaatttgc 49

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 24

ctggtggaca gcaaatgggt cgggatccac aggccatcaa gtgtgtgg 48

<210> 25

<211> 70

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 25

gtcgacggag ctcgaattcg gatcccaggg cccctggaac agaacttcca gcaacagcag 60

gcattttctc 70

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 26

ggaagttctg ttccaggggc ccctgggatc ccaggccatc aagtgtgtgg 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 27

cgagtcgacc cgggaattcc ggggatccca acagcaggca ttttctcttc 50

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 28

gtgtgtggtg gtgggagacg tagctgtagg taaaacttgc c 41

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 29

ggcaagtttt acctacagct acgtctccca ccaccacaca c 41

<210> 30

<211> 705

<212> DNA

<213> Branchiostoma lanceolatum

<400> 30

gtgtccaagg gcgaggagga caacatggcc tctctgccag ctacccacga gctgcacatc 60

ttcggatcta tcaacggcgt ggactttgat atggtgggac agggaaccgg aaacccaaac 120

gacggatacg aggagctgaa cctgaagtct acaaagggcg atctgcagtt cagcccttgg 180

atcctggtgc cacacatcgg atacggcttt caccagtacc tgccctaccc tgacggaatg 240

tctcctttcc aggccgctat ggtggatgga agcggctacc aggtgcaccg gacaatgcag 300

tttgaggacg gcgcctccct gaccgtgaac taccgctaca catacgaggg atctcacatc 360

aagggcgagg cccaggtgaa gggaaccggc ttcccagctg atggacccgt gatgaccaac 420

agcctgacag ccgctgactg gtgcaggtcc aagaagacat acccaaacga taagaccatc 480

atcagcacct tcaagtggtc ctacaccaca ggaaacggca agaggtacag aagcaccgcc 540

aggaccacat acacatttgc taagcccatg gccgctaact acctgaagaa ccagcctatg 600

tacgtgttcc ggaagaccga gctgaagcac tccaagacag agctgaactt caaggagtgg 660

cagaaggctt ttaccgacgt gatgggcatg gatgagctgt acaag 705

<210> 31

<211> 235

<212> PRT

<213> Branchiostoma lanceolatum

<400> 31

Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr His

1 5 10 15

Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val

20 25 30

Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu

35 40 45

Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro

50 55 60

His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met

65 70 75 80

Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His

85 90 95

Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg

100 105 110

Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly

115 120 125

Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala

130 135 140

Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile

145 150 155 160

Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr

165 170 175

Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala

180 185 190

Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu

195 200 205

Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe

210 215 220

Thr Asp Val Met Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

Claims

1.抑制FAM49B 基因或蛋白表达或活性的试剂或试剂盒、或用于FAM49B 定点突变的试剂或试剂盒在制备用于调控T细胞活性的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的FAM49B 基因的序列为SEQ ID NO：1；所述的FAM49B 蛋白的序列为SEQ ID NO：3；所述的FAM49B 定点突变为 R161D、A192L、R165D、N154D 和P150R 中的至少一个；所述的调控T 细胞活性为增强T 细胞活性。