CN109797167B - 一种靶向敲除人乳头瘤病毒urr基因的质粒、系统、制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒、系统、制剂及制备方法，所述的质粒包括能够与人乳头瘤病毒URR基因结合的sgRNA、Cas9和表达载体PX330。本发明的质粒转染到细胞中，特异性的诱导相应HPV亚型阳性细胞的HPV致癌元件移码突变，失去致癌特性，甚至直接由于DSB过多导致细胞凋亡，达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。本发明的制剂可实现对HPV阳性肿瘤细胞的有效杀伤以及HPV阳性肿瘤的有效治疗，并且本发明的制剂制备简单、成本低。

Description

一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒、系统、制剂及制 备方法

技术领域

本发明属于CRISPR基因治疗领域，具体涉及一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒、系统、制剂及制备方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染是全球范围最常见的性传播疾病之一。流行病学研究表明，约80％的女性在一生中至少会感染一次HPV，而男性的几率约50％。其中，低危型HPV持续感染可引起皮肤、生殖器和肛周疣的发生，而高危型HPV持续感染则会导致宫颈癌、外阴癌、阴道癌及阴茎癌、肛周癌等恶性肿瘤，同时也会增加HIV感染的机会。近年来，随着社会经济的发展，我国HPV感染逐渐泛滥，且有年轻化趋势，已成为一个严重的社会公共卫生问题。

目前少数发达国家主要通过接种多价疫苗来预防HPV感染。但即使是最先进的九价疫苗也无法完全覆盖不同种族人群的全部感染型别。同时，很大一部分已经存在HPV感染的人群无法接受疫苗的接种；而不断突变的病毒致病基因也给预防性疫苗的应用带来了挑战。此外，HPV疫苗价格昂贵，在中国及其他发展中国家推行全民HPV疫苗接种，在经济、依从性和效果上均难以保障。最重要的一点是，HPV作为一种致瘤性病毒，目前尚无有效的治疗性抗体或药物，导致已经存在HPV感染的人群既无法接受疫苗的接种，亦无药物来清除HPV，只能定期筛查随访。长期反复的筛查给广大患者带来了严重的心理压力及经济负担，部分人群甚至失访。一旦出现高危HPV持续感染并引起相应癌变时需手术治疗。以宫颈癌为例，发现癌前病变进行宫颈锥切会引起宫颈机能不全，导致流产、早产；并且一旦进展为宫颈浸润癌则需手术切除子宫，使患者完全丧失生育功能。因此，HPV感染作为一种威胁人类健康的重大传染性疾病，亟需开发有效的治疗手段，改变HPV感染人群“无保护、难治疗、重负担”的临床现状。在此背景下，随着对基因功能研究的深入，临床把抗病毒治疗方向转向个体化基因编辑领域。基因编辑工具运用于抗病毒治疗的首要问题是明确治疗靶点。

HPV属于乳头多瘤空泡病毒科，无外包膜，其核心是由含有遗传信息的闭合环状双链DNA组成，双链呈高度螺旋化，由早期区(E)、晚期区(L)和上游调控区(URR)组成。其中，L区和URR区分别承担自身免疫原性和自身复制启始作用，而E区编码区是HPV致病的关键功能结构域，其生物学特征变化是导致宫颈癌的分子基础。确切证据表明，HPV整合入宿主基因组形成持续感染是宫颈癌发生发展的必要条件，整合后HPVE6、E7癌蛋白的持续异常表达，是宫颈癌发生发展的关键因素，而驱动E6E7癌蛋白持续高表达主要受HPV上游调控序列URR的调控。

HPV URR以两个E2蛋白结合位点为界分成3个区域：5’区、3’区和中央区。5’区包含晚期转录产物的转录终止位点、多聚腺苷酸化位点和转录调控蛋白E2结合位点。3’区包含病毒的复制子(replication origin)，该元件在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用，RepOri长度约100bp，是一个相对保守的区域，含E1和E2蛋白结合位点，以及其他病毒复制必需元件。E1蛋白和E2蛋白与Rep Ori结合形成前起始复合物并起始病毒DNA的复制。中央区为增强子区域，全长约400bp，两端分别是E2蛋白的结合位点，包含了多种转录因子结合位点，如特异蛋白1(specificity protein 1，SP1)、细胞核因子1(nuclear factor-1，NF-1)及阴阳因子1(yin-yang factor 1，YY1)等，这些转录因子通过与URR结合调节启动子的活性，从而影响致癌基因E6、E7的表达。另一方面，整合后的URR可以在独立于细胞周期本身的复制周期，开始独立复制，同时带动其两端侧翼序列的人基因组共同复制，导致人基因组重排，结构变异，最终促进癌变。因此URR区是HPV致癌的关键因素。

因此，在明确HPV致癌关键元件的前提下，可利用基因编辑工具定向切除致癌元件，清除病毒达到逆转癌变的效果。目前的基因编辑技术主要包括ZFN、TALEN和CRISPR。但是研究发现，ZFN和TALEN设计困难，构建工艺复杂，而CRISPR系统操纵简单、编辑功能强大、通用性更广。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术由细菌和古细菌中存在的II型CRISPR/Cas9获得性免疫系统经人工改造而成。该系统的主要特点是在guide RNA的指导下，Cas核酸酶靶向识别并降解外源DNA。该系统已在多种病毒(如HPV、HIV、HBV、EBV等)中证实了其的强大切割效率，因而，CRISPR系统在病毒持续性感染的治疗中具有巨大潜能。

CRISPR/Cas9发挥作用的主要机制是产生DNA双链断裂(DNA double-strandbreaks,DSBs)。DSB是细胞内严重的致命性损伤，DSB产生可立即启动宿主细胞的自我修复机制。主要的修复机制有两种：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)(Chapman,J R等，2012，Molecular cell.47：497-510)。同源重组可以利用以另一条姐妹染色单体或其他的DNA模板进行修复，是一种高保真的修复方式；非同源末端连接在整个细胞周期中具有活性，并且具有更高的修复能力，因为不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或广泛的DNA合成。这种修复方式虽然能避免DNA断裂造成的DNA降解对细胞生存的影响，但是极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，进而造成框移突变，最终下调基因的功能。若DSB产生过多或修复不及时，则对细胞中造成致命性损伤，细胞凋亡。因此，应用Cas9靶向切割HPV URR，可通过在特异的DNA位点上诱导产生DSB，再借助细胞利用NHEJ方式修复DSB时造成框移突变，甚至直接诱导病变细胞死亡，另一方面，通过靶向rep ori直接阻碍HPV在细胞中的复制，降低HPV拷贝数，达到彻底清除病毒或病变细胞的目的(图1)。

同时，要实现有效的基因治疗，基因载体是一个重要组成部分。由于CRISPR/Cas9质粒较大，为高度亲水的大分子，表面携带负电荷，难以通过被动扩散的方式穿过细胞膜，因此需要基因载体来递送治疗基因。相对于病毒载体而言，非病毒纳米载体由于免疫原性低、无基因容量限制等优势，在CRISPR/Cas9质粒的递送中广受关注，研究者制备了诸如人工病毒颗粒、脂包被纳米粒、金纳米粒、阳离子聚合物等载体，均有效地实现了CRISPR/Cas9质粒的递送和基因编辑。

理想的基因载体要容易制备，具有复合质粒的能力，还能保护质粒免受各种酶的降解，携带质粒进入细胞后，要能跨越一系列生理屏障，通过内涵体/溶酶体逃逸和基因释放来实现递送质粒的作用。因此，虽然阳离子聚合物种类繁多，对于特定的细胞体系，并不是所有的阳离子聚合物都能适用。

PAMAM(聚酰胺胺)是一种常用的树状聚合物和基因载体，但其只有在高代数才能具有好的基因转染效率。而高代数PAMAM合成困难，价格昂贵。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒、系统、制剂及制备方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒，所述的质粒包括能够与人乳头瘤病毒URR基因结合的sgRNA、Cas9和表达载体PX330。

本发明中，所述的质粒能够特异性敲除高危型人乳头瘤病毒URR基因。

本发明中，所述的质粒能够特异性诱导人乳头瘤病毒亚型阳性细胞的凋亡增加和促进增殖抑制。所述特异性指HPV亚型阳性细胞的特异性，以HPV16URR基因为例，靶向HPV16URR基因的CRISPR/Cas9，仅能特异性的诱导HPV16阳性的细胞(如SiHa)的凋亡增加和增殖抑制，对HPV18阳性的细胞(如HeLa)和HPV阴性的细胞(如HEK293等)无促进凋亡和抑制增殖的作用。

根据一种实施方式，所述的质粒能够靶向敲除人乳头瘤病毒16的URR基因，所述的sgRNA的序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少80％及以上的同源性。该实施方式的质粒能够特异性的敲除高危型HPV16的URR致癌基因，所述特异性指HPV亚型的特异性是指仅能特异性的敲除HPV16URR基因，对HPV18以及其他HPV亚型的URR基因无敲除作用。

根据另一种实施方式，所述的质粒能够靶向敲除人乳头瘤病毒18的URR基因，所述的sgRNA的序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％及以上的同源性。该实施方式的质粒能够特异性的敲除高危型HPV18的URR致癌基因，所述特异性指HPV亚型的特异性是指仅能特异性的敲除HPV18URR基因，对HPV16以及其他HPV亚型的URR基因无敲除作用。

本发明中，所述的质粒通过将所述的sgRNA和所述的Cas9克隆到所述的表达载体PX330上制得。

本发明利用构建的靶向高危型HPV URR癌基因的CRISPR/Cas9表达质粒，通过将表达质粒转染到细胞中，特异性的诱导相应HPV亚型阳性细胞的HPV致癌元件移码突变，失去致癌特性，甚至直接由于DSB过多导致细胞凋亡，达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。

本发明的另一个目的是提供一种由所述的靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒转染到细胞后表达出来的CRISPR/Cas9-URR系统。

本发明的第三个目的是提供一种能够治疗人乳头瘤病毒亚型阳性肿瘤的制剂，所述的制剂包括活性成分，所述的活性成分为所述的靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒。

申请人偶然发现通过将PAMAM与5-氨基-1-戊醇以及1,4-丁二醇二丙烯酸酯按某种比例共聚，并采用1,3-丙二胺封端的方式可以得到廉价且具有高转染效率的产物。该产物还可进一步制备为半固体制剂，便于直接使用。

因此，本发明优选地，所述的制剂还包括载体，所述的载体为酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物，所述的酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物的结构通式为

其中，

m为0～50，n为0～20，x为0～50，y为0～20。

进一步优选地，所述的活性成分和所述的载体的质量比为1:50～1000。

本发明在低代数PAMAM-0的基础上，引入另一种阳离子聚合物，聚(β-氨基酯)，通过共聚得到一类全新的酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物(PAMAM-C32)，用于HPV16/18阳性肿瘤细胞的CRISPR/Cas9质粒递送。

进一步优选地，所述的酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物中PAMAM基团的质量百分数为0.0001～50％。

进一步优选地，所述的载体的制备方法包括如下步骤：

(1)将PAMAM、5-氨基-1-戊醇以及1,4-丁二醇二丙烯酸酯在有机溶剂的存在下，在80～100℃下反应20～30h制得中间产物，其中，所述的PAMAM的结构式为

(2)将所述的中间产物和1,3-丙二胺在有机溶剂的存在下反应30～40h制得所述的载体。

本发明中，载体的合成路线见图12。

更为优选地，所述的PAMAM、所述的5-氨基-1-戊醇以及所述的1,4-丁二醇二丙烯酸酯的投料摩尔比为0.01～0.2：0.8～1：1。

更为优选地，所述的中间产物和所述的1,3-丙二胺的投料摩尔比为4～6:1。

优选地，所述的制剂还包括半固体基质。

进一步优选地，所述的半固体基质为触变胶或乳膏。

进一步优选地，所述的活性成分和所述的载体的总质量与所述的半固体基质的质量比为1:40～100。

优选地，所述的制剂还包括溶剂，所述的溶剂为水或枸橼酸缓冲液。

本发明的第四个目的是提供一种所述的制剂的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)将载体溶解于溶剂中，然后加入所述的活性成分得到复合物溶液；

(2)将所述的复合物溶液与半固体基质混合均匀得到所述的制剂。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的质粒转染到细胞中，特异性的诱导相应HPV亚型阳性细胞的HPV致癌元件移码突变，失去致癌特性，甚至直接由于DSB过多导致细胞凋亡，达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。

本发明的制剂可实现对HPV阳性肿瘤细胞的有效杀伤以及HPV阳性肿瘤的有效治疗，并且本发明的制剂制备简单、成本低。

附图说明

图1为CRISPR/Cas9结合并敲除高危型HPV URR基因作用示意图。

图2为实施例中应用靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9诱导SiHa细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的SiHa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的SiHa细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9(同时含有Cas9和靶向URR的sgRNA)转染后的SiHa细胞凋亡率。

图3为实施例中应用靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9未能诱导HeLa细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的HeLa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的HeLa细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9(同时含有Cas9和靶向URR的sgRNA)共转染后的HeLa细胞凋亡率。

图4为实施例中应用靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9未能诱导HEK293细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的HEK293细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的HEhK293细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9转染后的HEK293细胞凋亡率。

图5为实施例中应用靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9质粒转染SiHa细胞后进行的T7E1酶切实验。图中Blank代表未处理的SiHa酶切结果，Vector代表转染了空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)质粒后的酶切结果，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9转染后的酶切结果。

图6为实施例中应用靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9质粒转染SiHa细胞后HPV16mRNA表达水平降低。图中Blank代表未处理的SiHa细胞HPV16E6/E7表达水平，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的SiHa细胞HPV16E6/E7表达水平，E6代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9转染后的SiHa细胞HPV16E6mRNA表达水平，E7代表靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9转染后的SiHa细胞HPV16E7mRNA表达水平。

图7为实施例中应用靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9诱导HeLa细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的HeLa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的HeLa细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9(同时含有Cas9和靶向HPV 18URR的sgRNA)转染后的HeLa细胞凋亡率。

图8为实施例中应用靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9未能诱导SiHa细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的SiHa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的SiHa细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9(同时含有Cas9和靶向HPV 18URR的sgRNA)共转染后的SiHa细胞凋亡率。

图9为实施例中应用靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9未能诱导HEK293细胞凋亡增加。图中Blank代表未处理的HEK293细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的HEK293细胞凋亡率，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9转染后的HEK293细胞凋亡率。

图10为实施例中应用靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9质粒转染HeLa细胞后进行的T7E1酶切实验。图中Blank代表未处理的HeLa酶切结果，Vector代表转染了空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)质粒后的酶切结果，CRISPR/Cas9-URR代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9转染后的酶切结果。

图11为实施例中应用靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9质粒转染HeLa细胞后HPV18mRNA表达水平降低。图中Blank代表未处理的HeLa细胞HPV18E6/E7表达水平，Vector代表空载体(仅含有Cas9，不含有sgRNA)转染后的HeLa细胞HPV18E6/E7表达水平，E6代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9转染后的HeLa细胞HPV18E6mRNA表达水平，E7代表靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9转染后的HeLa细胞HPV18E7mRNA表达水平。

图12为超支化聚合物PAMAM-C32的合成路线图。

图13为PAMAM和PAMAM-C32的核磁共振氢谱图。

图14为不同阳离子聚合物以不同比例与GFP复合后对SiHa(左)和Hela(右)细胞的转染效率。

图15为不同阳离子聚合物以不同比例与HPV16质粒复合后对SiHa(左)和与HPV18质粒复合后对Hela(右)细胞的杀伤能力。

图16为不同制剂对SiHa移植瘤的治疗效果：肿瘤生长抑制曲线(上)，肿瘤组织HE切片(中)和肿瘤组织HPV E7免疫组化照片(下)。

图17为不同制剂对HeLa移植瘤的治疗效果：肿瘤生长抑制曲线(上)，肿瘤组织HE切片(中)和肿瘤组织HPV E7免疫组化照片(下)。

具体实施方式

以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

本实施例中使用的引物设计均使用Primer3Plus在线引物设计工具(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)完成，由苏州金唯智生物科技有限公司合成；qRT-PCR试剂采用

Premix Ex Taq^TM，购自宝生物工程(大连)有限公司(货号为Code No.RR420A)。

实施例1、靶向HPV16/18URR的CRISPR/Cas9质粒表达载体的构建

(1)本实施例的DNA序列分别为：HPV16和HPV18URR碱基序列(NCBI数据库RefSeq:NC_001526.2和NC_001357.1)。利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对HPV16/18URR设计sgRNA并通过细胞实验筛选出效果最优的sgRNA。

挑选的HPV16URR序列为：

TAATTCATGTATAAAACTAAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.1)。

挑选的HPV18URR序列为：

AGGGAGTAACCGAAAACGGTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.2)。

其中，大写字母为与靶DNA结合的序列，小写字母部分为scaffold，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。

(2)CRISPR/Cas9-URR的表达载体构建方法参考引文中的构建方法完成构建(Conget al.Science.2013Jan 3.)：

将SEQ ID NO.1所示的sgRNA和Cas9序列克隆到表达载体PX330上，构建针对HPV16URR的真核表达载体质粒，构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。

将SEQ ID NO.2所示的sgRNA和Cas9序列克隆到表达载体PX330上，构建针对HPV18URR的真核表达载体质粒，构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。

载体序列(SEQ ID NO.7)见下，其中sgRNA序列替换其中的“nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn”序列，即可得到目标质粒：

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实施例2、CRISPR/Cas9-URR转染后诱导细胞凋亡

CRISPR/Cas9-URR质粒转染到细胞后表达出来的靶向HPV16/18URR的CRISPR/Cas9-URR系统，可以迅速的识别HPV16/18URR序列，发挥切割作用。切割后细胞主要通过不受细胞周期限制的NHEJ途径快速修复，从而引入小片段的插入或缺失(indel)，导致移码突变，最终使得URR功能丧失(驱动E6E7癌基因转录)，HPV16/18E6E7癌蛋白的表达受到抑制。另一方面，由于URR的拷贝数可高达50个拷贝，均可被sgRNA识别并被Cas9切割，从而可产生多个DSB，DSB修复不及时并积累会诱发细胞程序性死亡机制，直接清除携带HPV的病变细胞。以上均可导致HPV感染细胞表现为增殖能力下降，凋亡增加。另一方面，针对HPV16URR设计的sgRNA仅能特异性的识别并结合HPV16URR序列，不能识别其他亚型如HPV18的URR序列。因此，针对HPV16URR设计的sgRNA仅能引起HPV16阳性细胞的凋亡(如SiHa细胞)，而对HPV18阳性的细胞(如HeLa细胞)和HPV阴性的细胞(如HEK293细胞)等无此作用。针对HPV18URR设计的sgRNA同理仅能特异性的识别并结合HPV18URR序列。

具体操作方法是：

(1)细胞培养

HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa、HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK293用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。

(2)质粒转染

24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2ugCRISPR/Cas9-URR，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的空载体(2μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培养。

(3)细胞凋亡的检测

转染48小时后，常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用南京凯基生物的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：KGA-107)中的Binding Buffer重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟。Beckman公司的CytoFLEX流式细胞仪检测细胞凋亡。

试验结果显示，针对HPV16URR设计的sgRNA质粒，转入CRISPR/Cas9-URR的SiHa细胞凋亡明显增加，凋亡率达到35％左右，而转入等量空载体的SiHa细胞的凋亡未见明显增加(见图2)；转染CRISPR/Cas9-URR的HeLa和HEK293细胞的凋亡都未见明显增加(见图3和图4)。针对HPV18URR设计的sgRNA质粒，转入CRISPR/Cas9-URR的HeLa细胞凋亡明显增加，凋亡率达到38％左右，而转入等量空载体的SiHa细胞的凋亡未见明显增加(见图7)；转染CRISPR/Cas9-URR的SiHa和HEK293细胞的凋亡都未见明显增加(见图8和图9)。

实施例3、CRISPR/Cas9-URR的sgRNA的切割效率验证

Cas9在细胞内发挥作用后切割形成的DSBs，可以迅速的诱导细胞进行自我NHEJ修复。但是NHEJ这种易错的修复方式极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，此时，若将这种已经过剪切又经细胞错误修复的碱基序列与未处理的正常的(野生型的)碱基序列混合后退火延伸，即可形成一种在剪切位点处存在错配的特殊的杂交双链(与修复后的碱基插入或缺失相对应)。这种杂交双链可被T7Endonuclease I识别并在错配处切断。

因此，细胞转染CRISPR/Cas9-URR后，将这所有细胞的总基因组DNA提取出来，即可得到既含有切割后修复的DNA序列也含有未被处理的野生型序列的混合产物。再经PCR扩增，得到切割后修复的DNA序列和野生型序列的混合PCR产物，将此混合产物纯化后直接退火延伸，即可形成杂交双链，再应用T7Endonuclease I进行酶切处理，就能识别并切断杂交双链，通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨。

具体实施方案如下：

(1)细胞的培养

细胞的融合度达90％以上时，常规0.25％胰酶消化，接种到6孔板中，每孔种植细胞量约5×10⁵个，继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(2)质粒的转染

细胞培养过夜后，相差显微镜下观察细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％以上，即可进行质粒转染。每孔转染2ug CRISPR/Cas9-URR，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的空载体(共计2μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养。

(3)基因组DNA的提取

转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟,弃除培养基，PBS洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)提取细胞基因组DNA，测量DNA浓度。

(4)引物的设计

分别根据HPV16/18URR基因序列设计引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分切开的两个小片段)。本实施例中与URR sgRNA相对应的引物序列为：

HPV16URR-F:gcgtgccaaatccctgtttt(SEQ ID NO.3)

HPV16URR-R:agttgtttgcagctctgtgc(SEQ ID NO.4)

HPV18 URR-F：ttgctgtgcaaccgatttcg(SEQ ID NO.5)

HPV18 URR-R：agtgttcagttccgtgcaca(SEQ ID NO.6)

(5)PCR反应

以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的

PCR SuperMix(货号：AS111-02)。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。

(6)T7Endonuclease I酶切反应及凝胶电泳

本实验使用的T7Endonuclease I以及配套的10×NEB Buffer 2购自New EnglandBiolabs公司(货号：M0302S)。操作步骤如下：

取200ng纯化PCR产物进行如下反应：

反应体系：

退火条件：

退火反应完成后，此时再加入T7Endonuclease I 1μL，震荡混匀后，37℃孵育20分钟完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被T7Endonuclease I切断，出现一大一小两条条带，说明CRISPR/Cas9-URR在细胞内分别成功的切割HPV16 URR基因序列(结果见图5)和HPV18 URR基因序列(结果见图10)。

实施例4、qRT-PCR明确CRISPR/Cas9-URR对HPV 16/18E6/E7mRNA转录水平的影响

(1)样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离：每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

(2)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制均在冰上进行)

试剂	使用量	终浓度
			SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)	10μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4μl	0.2μM<sup>*1</sup>
			PCR Reverse Primer(10μM)	0.4μl	0.2μM<sup>＊1</sup>
DNA模板(＜100ng)<sup>＊2</sup>	2μl
			灭菌水	7.2μl
Total	20μl

应用Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System进行Real Time PCR反应，反应程序采用两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒

靶向HPV16URR的CRISPR/Cas9质粒转染SiHa细胞后HPV16mRNA表达水平结果见图6，靶向HPV18URR的CRISPR/Cas9质粒转染HeLa细胞后HPV18mRNA表达水平结果见图11。

实施例5、载体超支化聚合物PAMAM-C32的合成

第一步先合成带有双键末端的中间产物：分别称取0.01mol PAMAM-0、0.09mol 5-氨基-1-戊醇以及0.1mol 1,4-丁二醇二丙烯酸酯，加1mL DMF，90℃搅拌反应24h；停止反应，用10mL DMF稀释反应液，再滴入6-10倍体积的乙醚中进行沉淀，洗两遍，用低速离心机离心得沉淀，干燥得0.0043mol中间产物；

第二步再合成1,3-丙二胺封端后的终产物PAMAM-C32：将上述0.0043mol中间产物用5mL DMF溶解，加入5倍摩尔比的1,3-丙二胺，室温反应36h；停止反应，将反应液滴入相应体积的乙醚中进行沉淀，再次洗两遍后，用低速离心机离心得沉淀，干燥后得最终产物PAMAM-C32 0.0039mol。

从PAMAM和PAMAM-C32的核磁共振氢谱图(见图13)可以看到：化学位移值处在4.062ppm属于1,4-丁二醇二丙烯酸酯上-COOCH2-的氢信号峰，1.529-1.322ppm处为5-氨基-1-戊醇上亚甲基-CH2-的氢信号峰，在3.314ppm处产生了新峰，是来自于PAMAM上-CONH2-CH2-的-CH2-氢信号峰，说明超支化PBAE聚合物的合成成功。

实施例6、超支化聚合物PAMAM-C32对HPV16/18阳性肿瘤细胞的转染效率及杀伤能力

以绿色荧光蛋白质粒(GFP)为模型，验证PAMAM-C32对SiHa细胞(HPV16阳性)和HeLa细胞(HPV18阳性)的转染能力。将0.015g PAMAM-C32或其它阳离子聚合物(如PBAE、四代树枝状聚合物PAMAM-4、PEI)溶于1mL pH5.5的枸橼酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液与GFP按照不同质量比混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得PAMAM-C32-GFP复合物溶液。加入至融合度80％左右的SiHa和HeLa细胞培养皿中，36h后将细胞消化下来以2000rpm×5min离心收集，加入300μL PBS使细胞充分分散，再用流式细胞仪检测其转染效率。从图14可以看到，PAMAM-C32对两种细胞的转染能力最强，说明PAMAM-C32能将GFP快速有效的递送到细胞内，经溶酶体逃逸之后在细胞核大量表达绿色荧光蛋白。

将0.015g PAMAM-C32或其它阳离子聚合物(如PBAE、四代树枝状聚合物PAMAM-4、PEI)溶于1mL pH5.5的枸橼酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液分别与针对HPV16URR的质粒和针对HPV18URR的质粒按照不同质量比混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得质粒-PAMAM-C32复合物溶液，加入至融合度80％左右的SiHa和HeLa细胞培养皿中，36h后终止培养后，弃去孔内培养基，加入DMSO，置于酶标仪板上，振荡10s，在490nm处测定其紫外吸光度值，计算细胞的存活率，验证质粒对细胞的杀伤能力。从图15可以看到，PAMAM-C32与对应质粒复合后对两种细胞的杀伤能力最强。

实施例7、基于HPV16质粒-PAMAM-C32复合物的触变胶制剂对SiHa移植瘤的治疗效果

将0.015g PAMAM-C32溶于1mL pH5.5的枸橼酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液与0.00003g针对HPV16URR的质粒混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得HPV16质粒-PAMAM-C32复合物溶液1mL；

600mg胶粉，在600-700rpm时加入10ml水(6％)，在1500-2000rpm搅拌20min后，再加入等体积上述HPV16质粒-PAMAM-C32复合物溶液，混合均匀后即得触变胶制剂。

另培养SiHa细胞至足够数量，消化细胞，用PBS洗两遍，再将细胞分散在PBS里，在裸鼠颈背部侧后皮下注射1E7个细胞，观察裸鼠出瘤情况。将植瘤成功的裸鼠随机分组，当肿瘤体积长至50-100mm³时，开始瘤周注射不同制剂，包括生理盐水(Saline)、纯质粒(ZL)、GFP-PAMAM-C32复合物的触变胶制剂(ZJ-1)、HPV16质粒-PAMAM-C32复合物的触变胶制剂(ZJ-2)，质粒的剂量为20μg每只老鼠。其中，GFP-PAMAM-C32复合物的触变胶制剂的制备方法与HPV16质粒-PAMAM-C32复合物的触变胶制剂的制备方法相同，区别仅在于采用GFP替代HPV16质粒。

每隔两天给药一次，将第一次给药记为第0天，共给四次药，测量老鼠肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式为：体积＝长×宽×宽×0.5；第20天处死小鼠，剥离肿瘤，将每组的肿瘤组织各取一部分用PBS洗净后存放至4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，做病理切片，包括HE和免疫组化染色。

从肿瘤生长曲线图16可以看到：单独给予质粒时，肿瘤体积始终在变大，质粒组明显没有抑制肿瘤生长的作用，说明质粒不能被肿瘤细胞所摄取，而GFP-PAMAM-C32复合物组因为GFP无基因编辑能力，也不能抑制肿瘤生长，只有HPV16质粒与PAMAM-C32形成的复合物制剂才能有效的抑制肿瘤的生长，说明载体能将HPV16质粒递送至肿瘤细胞内，再释放出HPV16质粒对相应基因组进行编辑，引起肿瘤细胞的凋亡，进而影响肿瘤组织的生长。HE染色结果也表现出了相同的趋势：只有HPV16质粒与PAMAM-C32形成的复合物制剂才能引起肿瘤细胞大片的凋亡。免疫组化结果也证实，经过治疗后，HPV16E7蛋白在肿瘤细胞上的表达相较于其它组有明显的较少，即该基因被成功编辑。

实施例8、基于HPV18质粒-PAMAM-C32复合物的乳膏剂制剂对HeLa移植瘤的治疗效果

将0.015g PAMAM-C32溶于1mL pH5.5的枸橼酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液与0.00003g针对HPV18URR的质粒混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得HPV18质粒-PAMAM-C32复合物溶液1mL；

油相(十八醇0.9375g、液状石蜡1g、白凡士林1.5g)，水相(平平加-O 0.25g、甘油0.5g、2ml枸橼酸缓冲液)，在85℃融化后，将油相滴入水相，冷却可得白色乳膏7mL，再加入等体积上述HPV18质粒-PAMAM-C32复合物溶液搅匀即得乳膏剂制剂。

HeLa移植瘤造模、给药方案与后续处理均与实施例7SiHa移植瘤相同，但质粒采用HPV18质粒。从肿瘤生长曲线和HE染色结果(图17)可以看到，与实施例7结果类似，只有HPV18质粒与PAMAM-C32形成的复合物制剂才能有效的抑制肿瘤的生长、引起肿瘤细胞大片的凋亡。免疫组化结果也证实，经过治疗后，HPV18E7蛋白在肿瘤细胞上的表达相较于其它组有明显的较少，即该基因被成功编辑。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州鼓润医疗科技有限公司

<120> 一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒、系统、制剂及制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

taattcatgt ataaaactaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

agggagtaac cgaaaacggt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

gcgtgccaaa tccctgtttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

agttgtttgc agctctgtgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

ttgctgtgca accgatttcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

agtgttcagt tccgtgcaca 20

<210> 7

<211> 8487

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 360

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 420

gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 480

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 540

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 600

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 660

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 720

ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 780

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 840

gggggggggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 900

atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 960

ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc1020

gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg1080

tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta gctgagcaag aggtaagggt1140

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta cctggagcac ctgcctgaaa1200

tcactttttt tcaggttgga ccggtgccac catggactat aaggaccacg acggagacta1260

caaggatcat gatattgatt acaaagacga tgacgataag atggccccaa agaagaagcg1320

gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat1380

cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag tacaaggtgc ccagcaagaa1440

attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag aagaacctga tcggagccct1500

gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg aagagaaccg ccagaagaag1560

atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag atcttcagca acgagatggc1620

caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc ttcctggtgg aagaggataa1680

gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac gaggtggcct accacgagaa1740

gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac agcaccgaca aggccgacct1800

gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc cggggccact tcctgatcga1860

gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac1920

ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat1980

cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat ctgatcgccc agctgcccgg2040

cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg agcctgggcc tgacccccaa2100

cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg cagctgagca aggacaccta2160

cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac cagtacgccg acctgtttct2220

ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac atcctgagag tgaacaccga2280

gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga tacgacgagc accaccagga2340

cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct gagaagtaca aagagatttt2400

cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac ggcggagcca gccaggaaga2460

gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac ggcaccgagg aactgctcgt2520

gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc ttcgacaacg gcagcatccc2580

ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg cggcaggaag atttttaccc2640

attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg accttccgca tcccctacta2700

cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg atgaccagaa agagcgagga2760

aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag ggcgcttccg cccagagctt2820

catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac gagaaggtgc tgcccaagca2880

cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg accaaagtga aatacgtgac2940

cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag aaaaaggcca tcgtggacct3000

gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg aaagaggact acttcaagaa3060

aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa gatcggttca acgcctccct3120

gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag gacttcctgg acaatgagga3180

aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca ctgtttgagg acagagagat3240

gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac gacaaagtga tgaagcagct3300

gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg aagctgatca acggcatccg3360

ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag tccgacggct tcgccaacag3420

aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt aaagaggaca tccagaaagc3480

ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt gccaatctgg ccggcagccc3540

cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg gacgagctcg tgaaagtgat3600

gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc agagagaacc agaccaccca3660

gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc gaagagggca tcaaagagct3720

gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc cagctgcaga acgagaagct3780

gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg gaccaggaac tggacatcaa3840

ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag agctttctga aggacgactc3900

catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg ggcaagagcg acaacgtgcc3960

ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg cagctgctga acgccaagct4020

gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag agaggcggcc tgagcgaact4080

ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc cggcagatca caaagcacgt4140

ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac gagaatgaca agctgatccg4200

ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc gatttccgga aggatttcca4260

gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc4320

cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg gaaagcgagt tcgtgtacgg4380

cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag agcgagcagg aaatcggcaa4440

ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac tttttcaaga ccgagattac4500

cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag acaaacggcg aaaccgggga4560

gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg aaagtgctga gcatgcccca4620

agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc ttcagcaaag agtctatcct4680

gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag gactgggacc ctaagaagta4740

cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg gtggtggcca aagtggaaaa4800

gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg gggatcacca tcatggaaag4860

aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc aagggctaca aagaagtgaa4920

aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc gagctggaaa acggccggaa4980

gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac gaactggccc tgccctccaa5040

atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag ctgaagggct cccccgagga5100

taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac tacctggacg agatcatcga5160

gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac gctaatctgg acaaagtgct5220

gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag caggccgaga atatcatcca5280

cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc aagtactttg acaccaccat5340

cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac gccaccctga tccaccagag5400

catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag ctgggaggcg acaaaaggcc5460

ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag taagaattcc tagagctcgc5520

tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg5580

ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt5640

gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc5700

aagggggagg attgggaaga gaatagcagg catgctgggg agcggccgca ggaaccccta5760

gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca5820

aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc5880

tgcctgcagg ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac5940

cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg6000

tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg6060

ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg6120

ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt6180

tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt6240

tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta6300

tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa6360

atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt6420

tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc6480

cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac6540

aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac6600

gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa6660

tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt6720

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc6780

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc6840

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa6900

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg6960

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag7020

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc7080

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta7140

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg7200

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca7260

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac7320

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat7380

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg7440

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata7500

aatctggagc cggtgagcgt ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta7560

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa7620

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag7680

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg7740

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact7800

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg7860

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc7920

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata7980

ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta8040

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc8100

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg8160

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac8220

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg8280

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt8340

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct8400

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg8460

ccttttgctg gccttttgct cacatgt 8487

Claims (10)

1.一种靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒，其特征在于：所述的质粒通过将sgRNA和Cas9克隆到表达载体PX330上制得；所述的质粒能够靶向敲除人乳头瘤病毒16的URR基因，所述的sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；或，所述的质粒能够靶向敲除人乳头瘤病毒18的URR基因，所述的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒，其特征在于：所述的质粒能够特异性诱导人乳头瘤病毒亚型阳性细胞的凋亡增加和促进增殖抑制。

3.一种重组细胞，其特征在于：由权利要求1至2中任一项所述的靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒转染到细胞后表达形成。

4.一种能够治疗人乳头瘤病毒亚型阳性肿瘤的制剂，其特征在于：所述的制剂包括活性成分，所述的活性成分为权利要求1至2中任一项所述的靶向敲除人乳头瘤病毒URR基因的质粒；所述的制剂还包括载体，所述的载体为酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物，所述的酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物的结构通式为

其中，

上述结构式中的m为0～50，n为0～20，x为0～50，y为0～20；

所述的活性成分和所述的载体的质量比为1:50～1000。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述的酰胺-氨-β-氨基酯超支化聚合物中PAMAM基团的质量百分比为0.0001～50％。

6.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述的载体的制备方法包括如下步骤：

(1)将PAMAM、5-氨基-1-戊醇以及1,4-丁二醇二丙烯酸酯在有机溶剂的存在下，在80～100℃下反应20～30h制得中间产物，其中，所述的PAMAM的结构式为

(2)将所述的中间产物和1,3-丙二胺在有机溶剂的存在下反应30～40h制得所述的载体。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述的PAMAM、所述的5-氨基-1-戊醇以及所述的1,4-丁二醇二丙烯酸酯的投料摩尔比为0.01～0.2：0.8～1：1；所述的中间产物和所述的1,3-丙二胺的投料摩尔比为4～6:1。

8.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述的制剂还包括半固体基质，所述的半固体基质为触变胶或乳膏；所述的活性成分和所述的载体的总质量与所述的半固体基质的质量比为1:40～100。

9.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述的制剂还包括溶剂，所述的溶剂为水或枸橼酸缓冲液。

10.一种如权利要求4至9中任一项所述的制剂的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：

(1)将载体溶解于溶剂中，然后加入所述的活性成分得到复合物溶液；

(2)将所述的复合物溶液与半固体基质混合均匀得到所述的制剂。

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