CN105879060B - 以成纤维激活蛋白α为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以成纤维激活蛋白α为靶点肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体CpVR‑FAP、重组腺病毒Ad‑FAP和重组痘病毒MVA‑FAP疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合或联合环磷酰胺在制备抗肿瘤疫苗中的用途。

Description

以成纤维激活蛋白α为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗
技术领域
本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体CpVR-FAP、重组腺病毒Ad-FAP和重组痘病毒MVA-FAP疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
背景技术
成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)就是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)表面的一种抗原分子,属于丝氨酸蛋白酶家族,具有胶原酶和二肽基肽酶活性，在肿瘤宿主界面基质的降解和重建中发挥着重要作用,参与肿瘤的生长、浸润和转移，FAPα选择性表达于90％以上恶性上皮性肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤等)的基质，胚胎组织、愈合创面及生理性重建的器官中，而在正常成体组织中一般无表达。这些特点使FAPα成为肿瘤发生，发展和治疗等领域中的一个新靶点。
近年来,CAFs及FAPα作为一种适用于肿瘤靶向治疗的靶标正倍受关注。目前国内外策略有：(1)利用对人源抗FAPα抗体昔洛珠单抗Sibrotuzumab进行的免疫疗法(2)靶向FAPα的DNA疫苗和基因治疗(3)改构的FAPα底物药物来抑制酶活性以及FAPα酶激活式靶向前体药物。(4)针对FAP基因的修饰导致FAP基因沉默。
因为FAP全长具有肽水解酶活性，该活性与肿瘤的生长和转移有直接的联系，如果用其全长来设计疫苗可能存在安全隐患，可能会迫使肿瘤生长加速，根据国内外文献的报道采取FAP酶活突变体作为抗原，在保证水解酶活性缺失的情况下尽量保存长度以提高免疫原性。因此本发明采用的FAP丝氨酸蛋白激酶催化功能缺失的突变体来设计疫苗。该催化区域的关键结构是由氨基酸序列第624位的丝氨酸(Ser624)，702位的天冬氨酸(Asp702)和734位的组氨酸(His734)构成的催化三联体，其中Ser624对FAPα活性发挥至关重要，若将其转变为丙氨酸，FAPα水解活性将消失；基于这点本发明采用酶活缺失的点突变体作为抗原设计疫苗，可以确保疫苗的安全性和效率，避免抗原大量表达加速肿瘤生长不利于治疗。
从发现FAPα到现在已用其进行了一些的疫苗研究工作，并有一些肿瘤免疫治疗策略(CAR-T)已经进入临床研究阶段，但对于疫苗来说大多数都处于临床前探索，并且因为治疗的肿瘤模型都是小鼠肿瘤，所以目前抗原选择都是鼠源FAPα，采用人源FAPα作为疫苗治疗小鼠肿瘤还没被报道过，因为人鼠同源性较高(90％)，预测CTL结合抗原肽两个种属之间有十分相似，所以本发明采取人源FAPα作为疫苗设计靶点，这样更有利于向将来临床治疗提供直接的数据，如果人源FAPα引起的CTL[7]可以杀伤小鼠肿瘤CAF，那么杀伤人肿瘤CAF的可能性就越高，治疗人类肿瘤的可行性也就越高。目前肿瘤疫苗进入临床的基因疫苗主要是DNA疫苗，重组腺病毒疫苗和重组痘病毒疫苗，DNA载体疫苗由于免疫原性较弱，病毒载体系统是最有效的基因转运方法，其基因转运效率通常在90％以上，因此目前的基因治疗临床试验中77％以上都是使用病毒载体。
随着FAPα作为一种极具潜力的抗肿瘤靶标分子正受到关注，我们有必要在这里总结一下FAPα作为一种微环境抗原相对于肿瘤相关抗原的优势有哪些，总结起来有五点：(1)90％以上的上皮性肿瘤间质中FAPα呈阳性表达，正常组织仅限于创伤愈合和胚胎组织少量表达；(2)FAPα阳性成纤维细胞是肿瘤基质的主要构成成分，抗原靶位十分丰富；(3)间质成纤维细胞是非转化细胞，与肿瘤细胞相比其基因组较稳定,避免出现抗原丢失和治疗耐受的风险；(4)FAPα阳性基质细胞主要围绕癌巢的肿瘤血管内皮细胞分布，这为以FAPα为靶标的细胞毒性药物选择性富集在肿瘤血管周围提供了有利条件；(5)以表达FAPα为标志的CAF和肿瘤微环境具有很强的免疫抑制功能，针对FAPα可以有效地减少CAF，从而破坏肿瘤微环境，一方面减少微环境的屏障和供养肿瘤的功能，另一方面又可以有效地降级肿瘤微环境起到的抑制作用，为联合免疫治疗排除了免疫抑制因素方面的威胁和障碍。总结起来可以说FAPα作为靶点，靶向精确，广谱性高，过程稳定，方便富集，针对微环境抑制和保护，可以说一石二鸟，所以本发明选择FAPα作为肿瘤疫苗设计的靶抗原。
发明内容
本发明首先以FAPα为靶点进行肿瘤基因疫苗的研究，分别构建DNA载体疫苗(CpVR-FAP)和腺病毒载体疫苗(Ad-FAP)，采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫(DNAprime-rAd boost)免疫策略，通过免疫小鼠检测FAPα基因疫苗的免疫原性及抗肿瘤活性，结果表明：小鼠可产生针对FAPα的特异性细胞免疫反应和体液免疫反应(见图九、图十、图十一)，该疫苗具有一定的保护力和抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组比较，CpVR-FAP DNA疫苗组肿瘤生长抑制率为22％，CpVR-FAP/Ad-FAP疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为23％(见图十二和图十三)。联合环磷酰胺后小鼠肿瘤生长抑制率提高至87％(见图十六和图十七)。
本发明之后又以FAPα为靶点构建了痘病毒载体疫苗(MVA-FAP)，采用DNA初免-重组痘病毒加强免疫(DNA prime-MVAboost)免疫策略，通过免疫小鼠检测FAPα基因疫苗的免疫原性及抗肿瘤活性，结果表明：小鼠同样可产生针对FAPα的特异性细胞免疫反应(见图十八、图十九、图二十)，该疫苗具有一定的保护力和抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组比较，CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为19％(见图二十一和图二十二)。Prime-boostc策略联合环磷酰胺后小鼠肿瘤生长抑制率提高至90％(见图二十五和图二十六)。
附图说明
图一、二.DNA载体及重组DNA载体疫苗图谱。图一为CpVR载体图谱；图二为重组质粒CpVR-FAP图谱；
图三—五.重组腺病毒载体图谱及制备流程。图三为AdMaxTM腺病毒载体及重组病毒制备流程；图四为穿梭载体pDC316图谱；图五为重组穿梭载体pDC316-FAP图谱；
图六—八.MVA重组原理及相关载体图谱。图六为MVA重组示意图；图七为穿梭载体pSC11图谱；图八为重组穿梭载体pSC11-FAP图谱，FAP结构基因表达框架重组到MVA的TK基因中，基因表达的启动子采用P7.5。
图九—十一.以不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋巴细胞的特异性CTL杀伤活性检测和IFN-γ分泌性T细胞检测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并用特异性抗原肽(H-2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为靶细胞，采用CFSE荧光标记法检测免疫鼠的CTL应答(图九)。同时用ELISPOT法检测T细胞释放IFN-γ的能力(图十)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肽。小鼠免疫前和每一针免疫后一周进行采血，获得血清用FAPα的蛋白包被，通过ELISA的方法检测免疫后小鼠产生的特异性抗体(图十一)。
图十二、十三.不同形式FAP基因疫苗对4T1肿瘤细胞体内生长的免疫预防作用。Balb/C小鼠经PBS对照组、Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP在间隔2周免疫三次后一周，接种4T1肿瘤细胞，测量肿瘤大小(图十二)至24天，处死统计瘤重情况(图十三)。
图十四、十五.不同形式FAP基因疫苗疫苗诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应比较。用特异性抗原肽(H-2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为靶细胞，采用CFSE荧光标记法检测免疫鼠的CTL应答(图十四)。同时用ELISPOT法检测T细胞释放IFN-γ的能力(图十五)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肽。
图十六、十七.不同形式FAP基因疫苗联合环磷酰胺对4T1肿瘤细胞体内生长的预防作用。在给Balb/C小鼠皮下接种4T1肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、环磷酰胺(CY)、CpVR-FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP、CpVR-FAP/CY、CpVR-FAP/Ad-FAP/CY疫苗，测量肿瘤大小(A)至22天，测量瘤重情况(B)。
图十八—二十.以不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋巴细胞的特异性CTL杀伤活性检测和IFN-γ分泌性T细胞检测。小肽混合物与P815靶细胞混合后与不同比例皮细胞混合，采用CFSE荧光标记法检测免疫鼠的CTL应答(图十八)。同时用ELISPOT法检测T细胞释放IFN-γ的能力(图十九)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肽。小鼠免疫前和每一针免疫后一周进行采血，获得血清用FAPα的蛋白包被，通过ELISA的方法检测免疫后小鼠产生的特异性抗体(图二十)。
图二十一、二十二.不同形式FAP基因疫苗对4T1肿瘤细胞体内生长的免疫预防作用。Balb/C小鼠经PBS对照组、MVA-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP在间隔2周免疫三次后一周，接种4T1肿瘤细胞，测量肿瘤大小(图二十一)至24天，处死统计瘤重情况(图二十二)。
图二十三、二十四.不同形式FAP基因疫苗疫苗诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应比较。小鼠脾淋巴细胞的特异性CTL杀伤活性检测和IFN-γ分泌性T细胞检测。用特异性抗原肽(H-2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为靶细胞，采用CFSE荧光标记法检测免疫鼠的CTL应答(图二十三)。同时用ELISPOT法检测T细胞释放IFN-γ的能力(图二十四)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肽。
图二十五、二十六.不同形式FAP基因疫苗联合环磷酰胺对4T1肿瘤细胞体内生长的治疗作用。在给Balb/C小鼠皮下接种4T1肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、环磷酰胺(CY)、CpVR-FAP/MVA-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY疫苗，测量肿瘤大小(图二十五)至22天，测量瘤重情况(图二十六)。
具体实施方式
一.上述片段FAPα的制备方法和条件
1.FAPα的制备
FAPα含有2281个碱基，GenBank号为NM_004460(SEQ ID NO:1)。根据其的序列设计了一对引物，人肠癌患者样本cDNA中中扩增出了FAPα的基因片段，序列为SEQ NO:1所示的碱基序列。
具体方法如下：
1)pGEM-T-FAP的构建、酶切鉴定及序列分析将肠癌患者样本cDNA的扩增FAPα的PCR产物与pGEM-T-easy载体进行连接得到含有FAPα的pGEM-T-FAP质粒。经序列分析证实正确。
二.重组疫苗的获得方法及相应的条件
1.DNA载体疫苗
1)CpVR-FAP的构建
CpVR载体含有CpG基序，CMV启动子，卡那霉素抗性基因，内含子A和BGH PolyA翻译终止信号等常规部件组成，共4913bp，图谱见图一。
以pGEM-T-FAP为模板，以F3和F4为引物通过PCR扩增序列(SEQ ID NO:1)，正向引物F3引入BgllI和SalI的酶切位点，反向引物F4引入了KpnI、SalI和BamHI的酶切位点。
将上述制得的PCR产物和载体经BgllI和BamHI双酶切后用胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收基因片段和载体片段，双酶切后具有相同粘性末端这一性质将所回收的目的基因片段和载体片段，以T4 DNA连接酶，在16℃下连接过夜。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌Top10(invitrogen公司),涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h，1,2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，用BgllI和BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒CpVR-FAP，图谱见图二。
2.重组腺病毒疫苗(Ad-FAP)的获得
腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列(ITR)，是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号(ψ)介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号(ψ)的约0.5kb的序列是顺式作用元件，即必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒(或细胞)反式补足。
本实验中采用的腺病毒系统是AdMaxTM Adenovirus载体系统(Microbix公司)，该系统是位点特异性重组系统，位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶只能催化特异性位点间的重组,不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。据此，位点特异性重组又称保守重组，该重组过程不需RecA酶参与。目前应用较多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系统，其中Cre、FLP和BP均为特异性重组酶，属重组酶λ整合酶家族，它们催化的反应类型、靶位点及重组机制十分相似，loxP、FRT和attBP为特异性位点，也有相似的结构。AdMaxTM Adenovirus载体应用的是Cre/loxP系统，Cre基因表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为38kDa，它是位点特异性重组发生所需的特异性重组酶,其识别位点被称为loxP(locus of crossing-over P1)，为一段34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的不对称间隔序列(又称为核心序列)组成5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′。loxP位点碱基重排后形成十字形的结构，核心序列形成一单链环，它为Cre重组酶切割的底物，也是DNA识别与重组的位点，对称的13bp反向重复序列是Cre重组酶结合的序列。
AdMaxTM Adenovirus载体系统是由穿梭载体和骨架载体(pBHGloxΔE1,3Cre)构成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。将穿梭载体与骨架载体共转染包装细胞株293，骨架载体所携带的Cre基因开始表达，介导两个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架载体上的细菌内复制元件、抗性基因以及Cre基因，同时完成目的基因的插入。由于骨架载体虽然携带有大部分的腺病毒基因组DNA却缺少形成有感染能力腺病毒颗粒所必需的包装信号(ψ)，而穿梭载体则含有ψ，因此只有在两个载体之间发生了重组，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重组腺病毒颗粒；另外，骨架载体缺失E1基因，因此需要转染组成型表达E1蛋白的293细胞。将骨架载体和穿梭载体(本研究选用的穿梭载体为pDC316，图谱见图四)共转染293细胞，利用293细胞中的E1蛋白，10左右天就可以产生出含有外源基因的重组腺病毒噬斑(见图三)，挑取噬斑，进行PCR(反应条件为：95℃30s、53℃30s、72℃1min，进行30个循环)鉴定，选取正确的克隆进行大量扩增、纯化和滴度测定。
1)穿梭重组质粒pDC316-FAP的获得
将pGEM-T-S8用BglII/SalI双酶切后回收得到FAPα目的片段，将pDC316用BglII/SalI双酶切后回收作为载体，利用BglII/SalI具有相同粘性末端的性质，将回收目的基因片段和载体片段进行用T4DNA连接酶，16度连接过夜。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h，1,2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，用BglII/SalI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒pDC316-FAP(图谱见图五)质粒。
2)Ad-FAP重组病毒的获得
将pBHGloxΔE1,3Cre和pDC316-FAP共转染293细胞后，经过四轮筛选、扩增、纯化后，获得含有FAPα片段的重组腺病毒Ad-FAP。
3.重组MVA疫苗(MVA-FAP)的获得改良安卡拉痘苗(MVA，Modified VacciniaAnkara)具有安全性高、外源基因容量大等优点使其得以广泛应用于肿瘤免疫治疗中。MVA含有胸苷激酶基因(TK)(参见图六)；pSC11(参见图七)是它的穿梭质粒，具有多克隆酶切位点可以插入外源基因、具有胸苷激酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以与MVA进行同源重组，同时含有lacZ基因，可以用于重组MVA(rMVA)的蓝斑筛选。
1)穿梭重组质粒pSC11-FAP的获得
将CpVR-FAP和pSC11经SalI/KpnI双酶切后回收，将回收目的基因片段FAPα和pSC11载体片段用T4DNA连接酶，16度连接过夜。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌Top10(invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，用SalI/KpnI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒pSC11-FAP(见图八)。
2)MVA-FAP重组病毒的获得
首先以滴度0.05pfu/cell的MVA感染tk-ts13细胞(购自ATCC，ATCC号为CRL-1632TM，是不含有TK基因的BHK-21的突变株)。感染2小时后，利用Lipofection2000(INVITROGEN)的方法将pSC11-FAP转染到感染了MVA的tk-ts13细胞中。MVA在tk-ts13细胞内复制的过程中，由于pSC11-FAP具有与MVA的TK基因同源的TKL和TKR，所以有一定比例的MVA病毒与pSC11-FAP发生重组，结果FAPα和LacZ阅读框架被重组到MVA病毒基因组中，形成MVA-FAP重组病毒。以上被感染细胞培养三天后，收集细胞，裂解细胞，超声波处理，3000rpm离心10min除去细胞残渣保留上清。取一定量上清，作为种毒，在6孔板中将病毒依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，感染tk-ts13细胞2h。将等体积的在42℃下预温的2％低熔点琼脂糖和2×DMEM-10/BrdU(BrdU，5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可掺入到野生型MVA中，产生致死性突变，从而可以使野生型MVA逐渐减少)培养基混匀，每孔加入3ml培养基，在室温下凝固，在37℃下于含5％CO2的培养箱中培养48h。铺上层选择性培养基，成分比下层琼脂多了1/120体积的4％X-gal。培养过夜，挑选蓝色单斑，反复冻融三次裂解释放病毒，进行下一轮的筛选，步骤相同，如此进行4轮以上筛选，最后直至得到只含重组病毒MVA-FAP的克隆株。经过扩增纯化，获得大量的重组病毒MVA-FAP。
三.疫苗免疫效果
1.FAPα疫苗免疫效果
1.1FAPα疫苗的免疫原性
本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨FAPα的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗共免疫诱导小鼠的免疫应答。实验将Balb/C小鼠按表1进行分组，1组在第0、2、4周注射PBS；2组在第0、2周注射PBS,第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗；考察DNA疫苗单独免疫的免疫效果、以及重组腺病毒的免疫增强作用。
表1 FAP疫苗免疫原性
Figure GDA0002363820230000111
1.1.1细胞免疫—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，刺激脾细胞产生IFN-γ的能力
末次免疫后两周处死小鼠，取脾并分离淋巴细胞。以从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并以用FAP特异性抗原肽混合物标记的P815细胞(购自ADCC)，按一定比例混合上述效应细胞和靶细胞，采用CFSE荧光标记法最后通过流式检测淋巴细胞对靶细胞的杀伤情况，用来表征所述疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。
本发明根据SYFPEITHI算法(www.syf-peithi.de)预测生存素的H-2Dd MHCI限制性表位肽，选择与H-2Dd MHCI的结合常数值较高的抗原肽F105-113(LSPDRQFVY),F275-283(VGPQEVPVP)and F542-550(GGPCSQSVR),作为抗原肽进行上述实验。
实验结果由图九可以看出，与PBS对照组相比，Ad-FAP组未检测到FAP特异性CTL(p＞0.05)；CpVR-FAP组在效靶比为100∶1时可检测到CTL应答并且统计学意义(p＜0.05)；CpVR-FAP/Ad-FAP组在注射了两针DNA疫苗后又注射了一针重组腺病毒疫苗Ad-FAP加强免疫，结果在效靶比为100∶1、50∶1时均检测到了特异性CTL应答(p＜0.05)，与CpVR-FAP组比较CTL应答也明显提高(p＜0.05)。
图十是以用FAP特异的限制性表位肽与相应数目的各个疫苗组脾细胞孵育，检测不同的疫苗诱导小鼠产生FAP特异性IFN-γ的情况。由图可以看出与PBS对照组和其他疫苗组但不加抗原肽刺激(R10)相比,Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，均产生了FAP特异性的IFN-γ，产生的IFN-γ水平依次升高，联用组加肽实验组与不加肽刺激的对照组之间相比具有统计学意义(P<0.05)，CpVR-FAP/Ad-FAP相对于CpVR-FAP组也有明显的提高(P<0.05)。
1.1.2体液免疫—ELISA检测特异性抗体
每次免疫后1周，对小鼠进行眼静脉取血，加上免疫前取血共四次，将所分离血清用于特异性抗体检测。FAP蛋白包被ELISA板，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验组中取1∶125稀释(稀释液为PBS配制的1％的牛奶)的免疫血清作为第一抗体，加入1:3000稀释的HRP标记抗鼠二抗，之后加入TMB显色液显色，每孔加入50ul 2M H2SO4终止后马上用酶标仪在450nm处读数并记录数据。由图十一可以看出各组产生了针对FAP的特异性抗体，每次免疫后抗体水平均被增强，CpVR-FAP/Ad-FAP与CpVR-FAP组刺激产生抗体滴度水平相当。
由上述体液免疫和细胞免疫结果可以看出单独应用CpVR-FAP基因疫苗可以诱导小鼠产生针对FAPα的特异性抗体和CTL免疫应答。重组腺病毒疫苗在两针针DNA疫苗免疫后进行加强免疫可明显提高CpVR-FAP疫苗免疫组的CTL应答水平和IFN-γ分泌能力，起到了加强免疫的作用。
1.2FAPα疫苗的肿瘤保护性
1.2.1预防性
根据前面的结果可知FAPα基因疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫，本节采用FAPα的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗进行模型小鼠肿瘤的预防实验，以考察生存素基因疫苗以及prime-boost免疫方式是否可以在小鼠体内诱导产生保护性抗肿瘤免疫应答。
表2 FAP疫苗预防分组
Figure GDA0002363820230000131
将Balb/C小鼠按表2随机分为4组(10只/组)。1组在第0、2、4周注射PBS；2组在第0、2周注射PBS,第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗；所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右侧背下部皮下接种4T1肿瘤细胞，考察成瘤时间和肿瘤大小的变化.
1.2.1.1肿瘤生长的抑制作用
实验结果表明，与PBS免疫组相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/Ad-FAP免疫组的模型小鼠肿瘤生长明显减慢.图十二、图十三为预防实验各组肿瘤体积变化和瘤重情况，由图可以看出Ad-FAP免疫组与PBS对照组比较，肿瘤生长也有明显变化；CpVR-FAP以及CpVR-FAP/Ad-FAP免疫组与PBS组比较，小鼠肿瘤的生长缓慢，二者有显著差异(在接种肿瘤后16-24天，p<0.001)；与CpVR-FAP单独免疫组比较，CpVR-FAP/Ad-FAP共免疫组肿瘤生长没有明显缓慢。
1.2.1.2细胞免疫—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，刺激脾细胞产生IFN-γ的能力
末次免疫后两周处死小鼠，取脾并分离淋巴细胞。以从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并以用FAP特异性抗原肽混合物标记的P815细胞(购自ADCC)，按一定比例混合上述效应细胞和靶细胞，采用CFSE荧光标记法最后通过流式检测淋巴细胞对靶细胞的杀伤情况，用来表征所述疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。
实验结果图十四可以看出，与PBS对照组相比，Ad-FAP组未检测到FAP特异性CTL(p＞0.05)；CpVR-FAP与CpVR-FAP/Ad-FA组在效靶比为100∶1时可检测到CTL应答并且统计学意义(p＜0.05)；与CpVR-FAP组比较CTL应答没有明显提高(p＞0.05)。图十五是以用FAP特异的限制性表位肽与相应数目的各个疫苗组脾细胞孵育，检测不同的疫苗诱导小鼠产生FAP特异性IFN-γ的情况。由图可以看出与PBS对照组和其他疫苗组但不加抗原肽刺激(R10)相比,CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，均产生了FAP特异性的IFN-γ，产生的IFN-γ水平依次升高，联用组加肽实验组与不加肽刺激的对照组之间相比具有统计学意义(P<0.05)，CpVR-FAP/Ad-FAP相对于CpVR-FAP组也有所提高，但不具有统计学意义(P大于0.05)
1.2.2prime-boost策略联合环磷酰胺的预防性作用
Balb/C小鼠随机分为6组，攻瘤前第5,3,1周按照下表的顺序进行免疫，第0天于小鼠右后背部皮下接种2×104 4T1细胞，肿瘤接种后第3,10,17天每只小鼠腹腔注射1mg环磷酰胺(CY).肿瘤接种后第22天，处死全部实验小鼠，剥瘤称取瘤重，取脾检测疫苗在荷瘤小鼠体内产生的细胞免疫反应。实验设计如下：
表3：联合疫苗免疫情况分组
Figure GDA0002363820230000151
1.2.2.1肿瘤生长的抑制作用
图十六为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。相对于CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，CpVR-FAP/CY组、CpVR-FAP/AD-FAP/CY组均能更明显抑制肿瘤的生长(p<0.01；p<0.0001)；CpVR-FAP/AD-FAP/CY与CpVR-FAP/CY二组相比较，肿瘤生长速度也有所减慢，并且具有统计学意义(p<0.05)，CY与疫苗联合应用能起到协同和累加的效果。图十七为治疗各个组肿瘤质量的变化情况。相对于CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，CpVR-FAP/CY组与CpVR-FAP/AD-FAP/CY组抑制肿瘤的水平明显更强且具有统计学意义(P<0.05)，具体数据如下：PBS group＝1.211±0.5315g,CpVR-FAP group＝0.8±0.4586g,CpVR-FAP/Ad-FAP group＝0.8013±0.3978g,CY group＝0.3788±0.1011g,CpVR-FAP/CY group＝0.2438±0.0778g,CpVR-FAP/Ad-FAP/CY group＝0.1623±0.0703g,瘤重的数据与肿瘤生长曲线的结果相对应，联合疫苗组的抑瘤率相对于CpVR-FAP/Ad-FAP组提高了53％，再次证明联合疫苗展现出良好的协同作用。
1.3MVA-FAP疫苗的免疫原性
本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨FAPα的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗共免疫诱导小鼠的免疫应答。实验将Balb/C小鼠按表1进行分组，1组在第0、2、4周注射PBS；2组在第0、2周注射PBS,第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗；考察DNA疫苗单独免疫的免疫效果、以及重组腺病毒的免疫增强作用。
表4 MVA-FAP疫苗免疫原性
Figure GDA0002363820230000161
1.3.1细胞免疫水平检测
本组实验中主要通过体外检测CD8+细胞数目和ELISPOT来评价疫苗刺激产生细胞免疫水平。IFN-γ分泌性T细胞方面检测：处理好免疫的小鼠脾细胞，加入全长FAPα蛋白作为刺激剂，培养基R10作对照，结果显示如图十八。由图可以看出，除PBS组外，与未加刺激对照相比，各实验组刺激后T细胞分泌IFN-γ有显著提高。即各组都产生了针对FAPα特异性IFN-γ细胞免疫反应。而且prime-boost免疫策略的实验组产生分泌性IFN-γ高于DNA疫苗免疫组(P<0.05)，符合我们的预期。同时将各组脾细胞进行CD3、CD8表面分子抗体的荧光染色，孵育一段时间后用Cell Staining buffer洗两次，最后在重悬送去流式检测CD8+细胞在脾细胞的比例，结果如图十九所示，可以看出prime-boost疫苗组刺激产生CD8+T比例高于DNA疫苗免疫组。1.3.2体液免疫—特异性FAPα抗体检测每次免疫后1周，对小鼠进行眼静脉取血，加上免疫前取血共四次，将所分离血清用于特异性抗体检测。FAP蛋白包被ELISA板，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验组中取1∶125稀释(稀释液为PBS配制的1％的牛奶)的免疫血清作为第一抗体，加入1:3000稀释的HRP标记抗鼠二抗，之后加入TMB显色液显色，每孔加入50ul 2M H2SO4终止后马上用酶标仪在450nm处读数并记录数据。由图二十可以看出DNA疫苗组和prime-boost组产生了针对FAP的特异性抗体，每次免疫后抗体水平均被增强，CpVR-FAP/Ad-FAP与CpVR-FAP组刺激产生抗体滴度水平相当。
由上述体液免疫和细胞免疫结果可以看出单独应用CpVR-FAP基因疫苗可以诱导小鼠产生针对FAPα的特异性抗体和CTL免疫应答。重组MVA-FAP在两针针DNA疫苗免疫后进行加强免疫可明显提高CpVR-FAP疫苗免疫组的CTL应答水平和IFN-γ分泌能力，起到了加强免疫的作用。
1.4prime-boost疫苗的肿瘤保护性
1.4.1预防性
根据前面的结果可知FAPα基因疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫，本节采用FAPα的DNA疫苗和重组痘病毒疫苗进行模型小鼠肿瘤的预防实验，以考察生存素基因疫苗以及prime-boost免疫方式是否可以在小鼠体内诱导产生保护性抗肿瘤免疫应答。
表5 MVA-FAP疫苗预防分组
Figure GDA0002363820230000171
将Balb/C小鼠按表2随机分为4组(10只/组)。1组在第0、2、4周注射PBS；2组在第0、2周注射PBS,第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗；所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右侧背下部皮下接种4T1肿瘤细胞，考察成瘤时间和肿瘤大小的变化.
1.4.1.1肿瘤生长的抑制作用
实验结果表明，与PBS免疫组相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/MVA-FAP免疫组的模型小鼠肿瘤生长明显减慢.图二十一和图二十二为预防实验各组肿瘤体积变化和瘤重情况，由图二十一和二十二可以看出MVA-FAP免疫组与PBS对照组比较，肿瘤生长无明显变化；CpVR-FAP以及CpVR-FAP/Ad-FAP免疫组与PBS组比较，小鼠肿瘤的生长缓慢，二者有显著差异(在接种肿瘤后22-24天，p<0.001)；与CpVR-FAP单独免疫组比较，CpVR-FAP/MVA-FAP共免疫组肿瘤生长没有明显缓慢。
1.4.1.2细胞免疫—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，刺激脾细胞产生IFN-γ的能力
我们通过体外检测CTL和ELISPOT来评价疫苗产生抗肿瘤细胞免疫水平。体外CTL杀伤检测：用FAPα特异性抗原肽混合物标记的P815细胞作为靶细胞，被免疫小鼠中分离的脾细胞作为效应细胞，按照效靶比50:1混合上述脾细胞和靶细胞，共孵育一段时间后流式检测靶细胞被杀伤的比例。结果如图二十三所示；ELISPOT检测疫苗组脾细胞与FAP蛋白孵育刺激后产生IFN-γ的水平，结果Prime-boost组相对于PBS虽然展现了一定特异性的CTL杀伤作用和刺激T细胞分泌IFN-γ能力(图二十四)，但是相对于DNA疫苗组，Prime-boost组的杀伤能力和IFN-γ分泌能力没有得到显著的提高。
1.4.2治疗性FAP疫苗的抑瘤效果
因为前期的工作基础可以确定预防性疫苗的抗肿瘤效果，而治疗性疫苗的意义通常要高于预防性疫苗，所以这次我们直接把Balb/C小鼠随机分为7组检测疫苗治疗4T1的能力，其治疗效果在之前是评价过的，第0天于小鼠右后背部皮下接种2×104 4T1细胞，攻瘤后第2,9,16天按照下表的顺序进行免疫，每次疫苗免疫前一天每只小鼠腹腔注射1mg环磷酰胺(CY)。肿瘤接种后第25天，处死全部实验小鼠，剥瘤称取瘤重，取脾处理计数检测疫苗在荷瘤小鼠体内产生的免疫反应。实验设计如下：
Table 6治疗性疫苗免疫程序
Figure GDA0002363820230000191
1.4.2.1肿瘤生长的抑制作用
图二十五和二十六为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。因为组数稍多，肿瘤生长曲线放在一起比较乱，所以分为两组展示，结果显示相对于CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP组，CpVR-FAP/CY组、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY组均能更明显抑制肿瘤的生长(p<0.01；p<0.001)；CpVR-FAP/MVA-FAP/CY与CpVR-FAP/CY二组相比较，肿瘤生长速度也有所减慢，并且具有统计学意义(p<0.05)，CY与FAP疫苗联合应用能起到协同和累加的效果。
从上述治疗性和预防性实验结果可以看出，CpVR-FAP，以及CpVR-FAP prime-Ad-FAP/MVA-FAP boost策略能明显抑制4T1模型小鼠肿瘤的生长，但DNA疫苗和prime-boost策略之间没有显著性差异，CpVR-FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP，CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗与环磷酰胺联合应用不但能显著抑制模型小鼠肿瘤的生长而且相对与单独疫苗组具有协同作用。因此，我们认为环磷酰胺与FAP疫苗联合应用与二者单独应用相比对模型鼠肿瘤的保护力和抗肿瘤能力有明显提高。
Figure IDA0001001382770000011
Figure IDA0001001382770000021

Claims (13)

1.一种序列为SEQ ID NO:1的DNA片段在制备用于进行抗肿瘤免疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗或树突状细胞疫苗中的用途。
2.一种重组质粒CpVR-FAP，其特征在于所述重组质粒骨架载体为CpVR，在所述CpVR的多克隆位点中插入序列为SEQ ID NO:1的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的重组质粒CpVR-FAP，其中所述插入的多克隆位点为BgllI/BamHI。
4.一种重组腺病毒Ad-FAP，其特征在于在腺病毒中插入序列为SEQ ID NO:1的DNA片段。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒Ad-FAP，其中所述腺病毒载体构架为pBHGloxΔE1,3Cre。
6.根据权利要求4或5所述的重组腺病毒Ad-FAP，其中所述插入的多克隆位点为BglII/SalI。
7.一种重组改良安卡拉痘病毒MVA-FAP，其特征在于在所述重组改良安卡拉痘病毒中插入权利要求1中所述的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的重组改良安卡拉痘病毒MVA-FAP，其中所述痘病毒载体构架为改良安卡拉痘苗病毒MVA。
9.根据权利要求7或8所述的重组改良安卡拉痘病毒MVA-FAP，其中所述插入的多克隆位点为SalI/KpnI。
10.一种疫苗组合物，包括权利要求2中的重组质粒CpVR-FAP及权利要求4中的重组腺病毒Ad-FAP和/或权利要求7中的重组痘病毒MVA-FAP。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中采用CpVR-FAP初免，Ad-FAP和/或MVA-FAP加强的免疫策略。
12.一种药物组合物，包括如权利要求2所述的重组质粒和/或权利要求4所述的重组腺病毒和/或权利要求7所述的重组痘病毒和/或权利要求10所述的疫苗组合物和化疗药物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述化疗药物选自环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、顺铂和奥沙利铂。
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