CN113430198A

CN113430198A - 基于crispr增加smn蛋白表达的方法及其应用

Info

Publication number: CN113430198A
Application number: CN202110638830.7A
Authority: CN
Inventors: 梁德生; 周妙金; 胡志青; 邬玲仟
Original assignee: Central South University
Current assignee: Shanghai Pingpu Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: CN113430198B

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入细胞内或小鼠体内，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，进而增加全长SMN的mRNA与蛋白表达。利用基因编辑技术精确编辑SMN2基因TSL2位点，编辑后的细胞能持续转录、翻译，蛋白增加的阳性克隆率达44％。

Description

基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9在基因水平精确缺失调控元件，从而提高SMN蛋白水平的方法及其应用。

背景技术

SMA是一类由于脊髓前角运动神经元变性导致的对称性肌无力和肌萎缩的神经肌肉疾病，是一种婴儿期最常见的常染色体隐性遗传性疾病之一，主要表现为肢体近端肌无力，随病情加重，躯体运动功能下降或丧失，出现吞咽和自主呼吸困难，最终因呼吸肌麻痹而死亡。SMA在人群中的发病率约为1/6000-1/10000。携带率为1/40～1/50^[1]，在我国人群携带率约为1/43^[2]。通常根据疾病严重程度及发病年龄主要将SMA分为5个亚型，其中SMA-I型约占50％，患者在出生时或在出生6个月内发病，全身严重肌无力，不能独坐，婴儿无法正常抬头，常在20个月之前由于呼吸肌麻痹导致死亡^[3]。SMA属于严重致死、致残的遗传性疾病，给患者家庭及社会都带来了巨大的负担。

SMA的致病基因是编码运动神经元存活蛋白(Survival Motor Neuron,SMN)的SMN1基因，人的SMN基因定位于5q11.2-5q13.3^[4]，且有两个高度同源的拷贝，靠近端粒端的称为SMN1/SMNt，而靠近着丝粒的称为SMN2/SMNc，二者在编码序列上仅相差1个碱基且编码相同的蛋白，在SMN1基因7号外显子第6位碱基为C，而SMN2为T，由于该碱基的不同，导致SMN2产生了选择性剪接，仅产生约10％左右的有活性的SMN蛋白^[5]。SMN2基因的缺失虽然不会致病，但临床统计表明SMN2拷贝数与疾病的严重程度成反比^[6]，而且几乎所有的SMA病人中都含有至少一个拷贝的SMN2基因，因而SMN2是SMA的理想治疗靶点。2005年Elizabeth发现，SMN蛋白“C端”氨基酸序列的特异性不重要，但必需具备一定的长度^[7]。SMN1基因的“C端”由7号外显子编码16个氨基酸，SMN2由于发生外显子跳跃，其“C端”则由8号外显子编码4个氨基酸，当用氨基糖甙类药物(G418)处理后，可使SMN2通读第1个终止密码子，SMN2的“C端”则可由8号外显子编码9个氨基酸。Christopher等发现用G418处理SMA I型患者的成纤维细胞可使SMN蛋白水平显著增加，且G418处理的SMA小鼠活动能力得到显著改善^[8]。构建通读的SMA模型小鼠，小鼠的存活时间大大延长^[9]。这些研究进一步说明SMN蛋白“C端”氨基酸序列并非特异但需具备一定的长度。

由于人SMN2基因7号外显子两侧存在较弱的5’剪接位点，导致7号外显子在剪接的时候被跳跃，使得90％的转录产物缺失7号外显子，产生截短的不稳定的SMN蛋白，在7号外显子末端存在一个RNA的二级结构(terminalstem loop 2,TSL2)，TSL2通过阻碍RNA剪接复合体中U1 snRNP的结合，进而抑制5’剪接位点的剪接活性^[10]。构建包含SMN2基因6号外显子至8号外显子基因组序列和TSL2不同位点突变的miniSMN质粒转染HeLa细胞，研究人员发现使TSL2更稳定的点突变会导致包含7号外显子的miniSMN-mRNA(该miniSMA-mRNA仅包含SMN2基因6号至8号外显子的外显子序列)转录水平显著减少，而破坏TSL2结构的点突变可使包含7号外显子的miniSMN-mRNA转录水平增加^[10,11]，虽然点突变可以使miniSMN-mRNA转录水平增加，但这种miniSMN-mRNA不能有效翻译成功能性SMN蛋白，且由于SMA受累的运动神经元是终末细胞，在这些终末细胞中不能发生同源重组，无法实现精确碱基诱变，难以开展SMA治疗。更重要的是，本报道是针对外源构建的质粒进行研究的，并没有针对机体本身存在的基因组内SMN2基因TSL2位点进行相关研究，且目前针对基因组TSL2位点没有合适的工具能实现点突变。

另外有研究发现小分子homocarbonyltopsentin(PK4C9)通过结合GAGTAAG序列(该序列与TSL2有部分重复)，从而阻碍了TSL2的形成或改变TSL2的构象，可以使全长SMNmRNA(FL-SMN mRNA)的水平增加，研究人员用终浓度为40μM的PK4C9对SMA病人成纤维细胞系GM03813C进行处理48小时，发现GM03813C中SMN蛋白水平提高了1.5倍^[11]。这意味着该小分子必须达到一定的药物浓度才能发挥功能；同时该小分子的靶点仅为7个碱基，脱靶的风险较高；并且要维持SMN蛋白水平增加该小分子必须终身反复给药。

因此，亟需研发安全有效、经济实用的且能持续增加SMN蛋白表达的方法，并探究其在SMA治疗中的应用。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的是提供一种基因编辑TSL2位点来增加功能性SMN蛋白的表达，从而缓解或治疗脊髓性肌萎缩症。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种增加SMN蛋白表达的方法，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入细胞内或小鼠体内，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，进而增加全长SMN的mRNA与蛋白表达。

优选的，将系统导入细胞内或小鼠体内的方式有电穿孔、脂质体转染、病毒转导、纳米材料转染等，能够实现导入细胞或小鼠体内的方式都可以。

优选的，所述的增加功能性SMN蛋白表达的方法为非治疗性、非诊断性的方法。

一种sgRNA，其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

一种质粒，所述质粒能表达出靶向TSL2位点的sgRNA；后将质粒导入细胞内或小鼠体内，能对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑。

优选的，所述质粒能表达出在TSL2位点上下游100bp内包含CRISPR/Cas9 PAM序列的sgRNA，即包含5’-NGG-3’或5’-NNGRRT-3’序列的sgRNA。

优选的，所述质粒能表达出如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示sgRNA。

优选的，所述质粒的序列号如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQID NO.31所示。

一种编辑的iPSC，其TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失。

优选的，所述编辑的iPSC的TSL2的茎环结构的茎部“ATTCCTT”或“AAGGAGT”处发生插入、缺失、插入和缺失。

优选的，所述iPSCs其序列为：GGTGCTCACATTAAGGAGTAAGTCTGC(SEQ ID NO.26)或GGTGCTCACATTCCTTAAGGAGTAAGTCTGC(SEQ ID NO.27)。

所述编辑的iPSC的构建方法，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入iPSC，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其产生插入、缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定。

所述iPSC来源于SMA病人的尿液中分离的细胞，重编程而成。

优选的，所述iPSC还可以是其衍生的神经上皮祖细胞(iNEP)、运动神经元祖细胞(iMNP)或运动神经元(iMNs)。

一种定向分化细胞，所述定向分化细胞为NEP、MNP或iMNs，所述定向分化细胞由上述编辑的iPSCs定向分化得到。

在本发明中，只要能够表达出靶向TSL2位点的sgRNA都可以作为本申请的方案选择之一。

如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA3、如SEQ ID NO.4所示的SasgRNA2或如SEQ ID NO.28-31所示的质粒在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂中的应用。

一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂，含有如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA3、如SEQ IDNO.4所示的SasgRNA2或如SEQ ID NO.28-31所示的质粒。

一种表达构建物，其能表达出sgRNA，所述sgRNA为如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA1或如SEQ IDNO.4所示的SasgRNA2。

优选的，所述表达构建物为病毒载体。

进一步优选的，所述病毒载体为AAV载体。

进一步优选的，所述病毒载体为AAV9载体。

一种试剂盒，所述试剂盒含有对TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失的sgRNA或表达构建物；优选的，对TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失的sgRNA为如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA1、如SEQ IDNO.4所示的SasgRNA2、如SEQ ID NO.28-31所示的质粒或如权利要求13所述的表达构建物。

如上述试剂盒在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂中的应用。

一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物组合物，包含上述编辑的iPSC，或由编辑的iPSCs定向分化得到定性分化细胞。

下面对本发明做进一步的解释：

目前国际上尚无通过编辑TSL2位点来增加功能性SMN蛋白水平的研究报道。有研究在构建的miniSMN基因TSL2位点上引入点突变，发现使TSL更稳定的点突变会导致包含7号外显子的miniSMN-mRNA转录水平显著减少，而破坏TSL2结构的点突变可使包含7号外显子的miniSMN-mRNA转录水平增加，但这种miniSMN-mRNA不能有效翻译成功能性SMN蛋白，同时由于SMA受累的运动神经元是终末细胞，在终末细胞中不能发生同源重组，无法实现点诱变。但本发明人发现其可以发生缺失或插入。而另一研究采用小分子药物PK4C9通过结合SMN2基因7号外显子的GAGTAAG这7个碱基序列(该序列与TSL2有部分重复)，从而阻碍了TSL2的形成，由于该小分子的靶点仅为7个碱基，其非特异性作用于基因组其他位点的可能性高。研究人员用终浓度为40μM的PK4C9对SMA病人成纤维细胞系GM03813C进行处理48小时可使GM03813C中SMN蛋白水平提高了1.5倍，这意味着该小分子必须达到一定的药物浓度才能发挥功能；并且要维持SMN蛋白水平必须终身反复给予该小分子药物。

因此本发明针对机体本身存在的SMN2基因TSL2位点进行缺失或插入，以期实现长期稳定增加全长SMN的转录本，提高功能性SMN蛋白的表达，最终实现SMA的基因治疗。

本发明通过利用CRISPR/Cas9特异性编辑TSL2位点，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，虽然插入或缺失或插入和缺失为随机产生，但在我们的研究中所获得的编辑克隆中有91％以上的克隆功能性SMN蛋白的表达水平均显著增加，且未检测到脱靶。且动物实验显示，使用AAV携带SaCas9编辑TSL2位点，显著增加小鼠的运动能力与存活时间。因而本发明建立了一种有效、安全且高效的SMA原位基因治疗技术。

本发明的有益效果为：

利用基因编辑技术精确编辑SMN2基因TSL2位点，从而破坏TSL2结构或使其不稳定的策略，具有以下优势：(1)利用CRISPR/Cas9在基因水平对TSL2(ATTCCTTAAATTAAGGAGT)进行编辑(尤其是产生的突变发生在序列“ATTCCTT”或“AAGGAGT”)，编辑后的细胞能持续转录、翻译功能性SMN蛋白，避免了长期反复给药；(2)本研究FL-SMN mRNA与SMN蛋白增加的阳性克隆率达44％，是一种有效且高效的方法；(3)本研究中所使用的sgRNA在所获得的阳性克隆中并未检测到脱靶，是一种安全的编辑方法。综上，本发明是一种有效、安全、高效的治疗方法。

附图说明

图1为退火反应流程图；

图2为sgRNA测序鉴定结果；

其中，A.SpsgRNA1测序结果；B.SpsgRNA2测序结果；C.SasgRNA1测序结果；D.SasgRNA2测序结果；图中sgRNA1与sgRNA2为特异性识别序列，SpsgRNA Scaffold为SpCas9的sgRNA骨架序列，SasgRNA Scaffold为SaCas9的sgRNA骨架序列；

图3为T7EI检测sgRNA对靶位点的切割效率

M为Marker(Takara 20bp DNA Ladder)；Control为未转染sgRNA组；

图4为SpsgRNA1编辑后阳性克隆鉴定及其SMN蛋白表达检测；

A.核转后单细胞克隆分析结果；B.随机挑选3个单细胞克隆进行T-A克隆后Sanger测序，WT：野生型SMN2，Δ表示缺失，×表示T-A克隆测序的reads数；C.RT-qPCR对所有发生编辑的单细胞克隆检测FL-SMN mRNA，**为P<0.01，***为P<0.001，****为P<0.0001，ns为nosignificant；D.Western blot检测所有发生编辑的单细胞克隆SMN的表达水平，hiPSCs为正常人iPSCs作为阳性对照，SMA-iPSCs为SMA病人特异性iPSCs作为阴性对照，β-actin为内参蛋白；

图5为阳性克隆潜在脱靶位点测序检测

PCR扩增随机挑选的3个阳性克隆C4、C5、C20与SMA-iPSCs的5个潜在脱靶位点后Sanger测序结果。

图6为iPSCs定向分化iMNs示意图；

图7为iPSCs定向分化iMNs的细胞形态与标志物检测；

其中分化第6天为OTX2与SOX1阳性的神经上皮祖细胞，分化第12天为OLIG-2阳性的运动神经元祖细胞，第18天为SMI32与ISL1阳性的早期运动神经元，第28天为ChAT阳性的成熟运动神经元。

图8为iMNs阶段检测全长SMN的转录与蛋白水平

A.RT-qPCR检测FL-SMN mRNA水平，****为P<0.0001；B.RT-qPCR检测缺失7号外显子的SMN转录本(Δ7-SMN mRNA)水平，**为P<0.01，****为P<0.0001；C.WB检测iMNs阶段SMN蛋白的水平，hiMNs为正常人iPSCs分化而来的iMNs，作为阳性对照。

图9为TUNEL检测Camptothecin处理后运动神经元凋亡情况；

免疫荧光检测Camptothecin/DMSO处理分化第24天运动神经元的凋亡情况，其中DMSO为Camptothecin溶剂，作为阴性对照。红色荧光表示TUNEL阳性，DAPI染核；

图10为在体编辑TSL2位点结果分析；

A.髓鞘注射AAV9-SasgRNA1显著改善SMA小鼠的运动能力与疾病表型，HET为杂合SMA小鼠，tSMA为注射AAV9-SasgRNA1的SMA小鼠，SMA为注射AAV9-SasgRNA-scramble的SMA小鼠；B.髓鞘注射AAV9-SasgRNA1的SMA小鼠体重变化，横坐标为出生后的天数，纵坐标为小鼠体重，检测时间为18天，HET为杂合SMA小鼠，tSMA为注射AAV9-SasgRNA1的SMA小鼠，SMA为注射AAV9-SasgRNA-scramble的SMA小鼠；C.显微注射SpsgRNA1至SMA模型小鼠受精卵，F0代小鼠Sanger测序显示在TSL位点发生了编辑。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

(1)sgRNA构建

1.1设计靶向TSL2位点sgRNA，并合成sgRNA1-F/R与sgRNA2-F/R进行退火，具体序列如表1所示：

表1需用到的引物序列

退火的反应体系为：

退火条件流程见图1。

1.2从Addgene购买SpCas9质粒(编号：42230)与SaCas9质粒(编号：61591)，Cas9质粒有不同的，目的都是表达出Cas9蛋白，但不同Cas9质粒的大小有差别，AAV病毒装载的质粒大小是有限制的，Sacas9相对于Spcas9会小一些，所以直接做体内实验用AAV包装的时候就选用SaCas9。

利用BbsI酶切42230，酶切体系如下：

37℃孵育2-3小时。

用BsaI酶切61519质粒，酶切体系如下：

37℃孵育2-3小时。

1.3将退火产物连入酶切的42230或61591载体，反应体系下：

22℃孵育2小时。

22℃孵育2小时。

转化的具体步骤为：

1.3.1从-80℃取出DH5α感受态，置于冰上解冻5 min；

1.3.2将上述10μL连接产物与50μL DH5α感受态轻柔混合，冰上静置30min；

1.3.3同时打开水浴箱，温度设置为42℃；

1.3.4将混合物置于水浴箱中热激90s，然后冰上静置2min；

1.3.5在超净台内加入100μL不含抗生素的LB溶液，置于37℃摇床上，180rpm培养45min；

1.3.6在超净台内将液体全部涂布在含氨苄抗性的固体LB平板上，37℃恒温培养过夜；

1.3.7第二天挑取五个白色单个菌落于含氨苄的液体LB培养基中，做好标记，置于37℃摇床上，220rpm培养7h；

1.3.8将菌液送生物公司测序，测序结果如图2所示；

1.3.9构建出SpsgRNA1(SEQ ID NO.1),其测序结果见图2A，包含sgRNA1序列和骨架序列SpsgRNA Scaffold；SpsgRNA2(SEQ ID NO.2)测序结果见(图2B)，包含sgRNA2序列和骨架序列SpsgRNA Scaffold；SasgRNA1(SEQ ID NO.3)测序结果见图2C，包含sgRNA1序列和骨架序列SasgRNA Scaffold；和SasgRNA2(SEQ ID NO.4)测序结果见图2D，包含sgRNA2序列和骨架序列SasgRNA Scaffold。

(2)SpsgRNA1、SpsgRNA2和SasgRNA1、SasgRNA2质粒的中量抽提

2.1取50mL离心管，在超净台中将菌液吸至离心管中，加入30mL含氨苄的液体LB，置于37℃摇床上，220rpm培养12h。

2.2使用OMEGA公司的E.Z.N.A Plasmid Midi Kit，按照说明书抽提质粒，做好标记。

2.3用Nanodrop 1000测定质粒浓度，标记于管壁，-20℃保存用于后续实验。

(3)最优sgRNA筛选

3.1转染前一天，将HEK-293T用0.05％Trypsin-EDTA消化、计数后，接种入6孔细胞培养板中，每个孔接种7×10⁵个HEK293T细胞，共接种6个孔，十字摇匀，放入37℃细胞培养箱中培养。

3.2待细胞长至汇合度为70％时，弃去旧培养基。每孔加入2mL新的培养基；

3.3换液2h后，取出jetPRIME试剂盒(内含buffer和jetPRIME试剂)室温平衡；

3.4第1个EP管加入200μL buffer、2μg GFP质粒；第2-5个EP管加入200μL buffer、2μg前述构建的4个质粒(SpsgRNA1、SpsgRNA2和SasgRNA1、SasgRNA2)，混匀后，每管分别加入8μL jetPRIME试剂，再次混匀后室温静置10min；

3.5将EP管中的液体轻轻加入细胞培养液中，摇匀，做好标记。放入细胞培养箱37℃培养；

3.6 12-16h后更换新鲜培养基；

3.7转染72h后收集细胞于抽屉gDNA，使用F2/R1扩增后，随后用T7核酸内切酶I(T7EI)检测每条sgRNA的切割活性；T7EI，是一种结构特异性酶，可以识别并切割不完全配对DNA。当形成异源双链DNA时，DNA分子的两条链被切割形成较小的两个片段。而同源DNA双链则不被T7EI切割，通过片段灰度值可以计算出CRISPR/Cas9切割效率，计算公式为：切割效率(％)＝100×(1-(1-fraction cleaved)1/2)；

3.8在PCR产物中加入2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃静置30分钟；

3.9颠倒混匀，以17000g，4℃离心10分钟，弃上清，加30μL预冷的75％乙醇；

3.10反复颠倒10次，以17000g，4℃离心5分钟，吸弃上清；

3.11置超净工作台内风干，加入15μL ddH₂O溶解；

3.12纯化后的PCR产物进行退火，退火体系如下：

退火反应条件如图1所示；

3.13退火完成后，往PCR管中加入0.5μL T7EI进行酶切，37℃酶切40分钟；

3.14配置浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶，在150V恒压条件电泳70分钟，分子成像仪扫胶，灰度分析，可分析出CRISPR/Cas9切割效率，结果见图3。

可见，所构建的sgRNAs均能对TSL2位点进行编辑，但编辑效率不同，其中SpsgRNA1与SasgRNA1效率较高，分别为30.14％和26.29％，而SpsgRNA2与SasgRNA2的效率分别为20.66％和20.61％。

(4)sgRNA核转SMA病人特异性iPSCs(SMA-iPSCs)

SMA-iPSCs来源于SMA病人的尿液中分离的细胞，重编程获得。重编程的方法是现有的，类似参考文献12中报道的方法。

4.1核转前一天，用稀释的Matrigel包被12孔板的4个孔；

4.2SMA-iPSCs培养至汇合率达70％-80％时(通常为在Matrigel包被的12孔板或6孔板上培养第3天或第4天)，更换新鲜的mTeSR Plus培养基，并添加终浓度为10nM的Y27632。将细胞放入培养箱中继续培养2h；

4.3 2h后，取出核转试剂盒Amaxa Human Stem Cell Nucleofector StarterKit，取一个灭菌EP管，加入18μL Supplement 1和82μL Solution 2，轻轻混匀，静置15min；

4.4静置的同时，将待打靶的SMA-iPSCs培养基吸弃，用1×DPBS洗4-5次，加入适量的TrypLE Select，37℃消化5min，每隔2min轻轻晃动培养皿；

4.5在倒置显微镜下观察到大部分细胞变圆时，将TrypLE Select消化液吸弃，加入3mL mTeSRplus培养基终止消化；

4.6取一15mL离心管，将细胞悬液转移至离心管中；

4.7用红细胞血球计数板计数，细胞总数需大于10⁶个；

4.8 175g离心5min；

4.9离心的同时，将核转的质粒8μg SpsgRNA1加入到4.3的核转溶液中，轻轻混匀，室温静置5min；

4.10离心后，吸弃15mL离心管中的上清液体，并点离去除管壁上残留的液体，用EP管中的核转液重悬离心管内的细胞沉淀，用中tip吸取加了质粒的核转溶液将细胞重悬，将细胞转移至专用的核转电击杯中，重悬和转移细胞是要避免起泡的产生，若产生气泡，可以将核转杯底部轻轻敲击桌子，以使细胞破裂；

4.11打开核转仪，选择程序B016，将核转杯放至核转仪中，开始核转；

4.12核转完成后立即向核转杯内加入500μL mTeSR Plus培养基，静置5min；

4.13吸弃包被孔板用的Matrigel；

4.14接种细胞悬液；加入10μM的Y27632；

4.15摇匀，放入细胞培养箱内静置，核转12-16h后换液(使用含10μM Y27632的mTeSR Plus培养基)；

4.16核转24h后使用普通mTeSR Plus培养基换液。

(5)单细胞克隆获得

5.1单细胞接种前一天，用Matrigel铺1个6cm细胞培养皿；

5.2取出核转后的细胞，用1×DPBS润洗细胞一次，加TrypLE Select至没过细胞，37℃消化不超过5min；

5.3吸弃TrypLE Select，用1mL mTeSR Plus培养基轻轻吹打细胞2-3次，使细胞完全脱落。计数，将细胞用Clone R培基重悬300-500个细胞接种至6cm细胞培养皿中。

5.4培养月10-14天，待6cm细胞培养皿中的细胞长至半个显微镜视野时，Matrigel包被48孔细胞培养板过夜。

5.5吸弃孔板中的Matrigel，每孔加入适量mTeSR Plus培养基至没过板底。

5.6在显微镜下选择6cm细胞培养皿中生长状态较好的单细胞克隆，用小Tip将其挑至48孔细胞培养板内，做好标记，每孔接种一个克隆；放入细胞培养箱中培养。每两天换液。

(6)克隆鉴定与SMN表达检测

6.1抽提所提取的单细胞克隆，用引物F1/R1扩增进行PCR扩增，送生物公司进行Sanger测序检测单细胞克隆的是否发生编辑，结果见图4A所示，在所挑取的25个单克隆中，有12个单细胞克隆发生了编辑，在细胞内发生非同源末端连接(Non-Homologous EndJoining,NHEJ)；对于发生编辑的克隆，随机挑取了3个阳性单细胞克隆(C4、C5和C20)的PCR产物进行T连转化后，挑不少于20个单菌落进行测序以分析每个单细胞克隆中3个SMN2基因TSL位点发生编辑的具体情况，结果见图4B，单细胞克隆C4有9个单菌落存在9个碱基缺失，有15个单菌落为未编辑的序列(wildtype,WT)，表明单细胞克隆C4含有1个拷贝9个碱基缺失的TSL2和2个为未编辑的拷贝；在单细胞克隆C5测序结果中有8个单菌落存在5个碱基缺失，有15个单菌落为未编辑的序列(WT)，意味着单细胞克隆C5含有1个拷贝5个碱基缺失的TSL2和2个为未编辑的拷贝；在单细胞克隆C20的测序结果中有10个单菌落存在9个碱基缺失，有16个单菌落为5个碱基缺失，意味着单细胞克隆C20中TSL2为1个拷贝9碱基缺失和2个拷贝5碱基缺失。

6.2通过RT-qPCR检测全长SMN的mRNA(FL-SMN mRNA)、缺失7号外显子的SMN mRNA(Δ7-SMN mRNA)水平，结果图4C，显示在所获得的12个编辑克隆中，有11个单细胞克隆全长SMN mRNA水平显著高于对照组SMA-iPSCs中全长SMN mRNA的水平。

6.3通过Western blot检测全长SMN蛋白水平，结果见图4D。与全长SMN mRNA检测结果对应，所获得的12个编辑克隆中除了C22克隆外，其余的11个单细胞克隆全长SMN蛋白水平都明显高于SMA-iPSCs中全长SMN蛋白的水平。表明SMN2基因TSL2位点发生插入、缺失或插入和缺失后可以显著提高全长SMN mRNA水平和SMN蛋白水平。且修正效率达44％。

(7)CRISPR潜在脱靶位点检测

利用CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)预测SpsgRNA1潜在脱靶位点，发现在人类基因组中，SpsgRNA1不存在小于3个碱基错配的靶点，3个碱基错配的靶点仅有5个，因而，针对这5个靶点分别设置引物OT-1F/1R、OT2F/2R、OT3F/3R、OT4F/4R、OT5F/5R，对随机挑取的3个阳性克隆(C4、C5和C22)与未进行编辑的SMA-iPSCs分别进行扩增后送Sanger测序，测序结果图5所示。

结果显示，在这5个潜在脱靶位点上，随机挑取的3个阳性克隆(C4、C5和C22)与未编辑的SMA-iPSCs序列一样，表明在预测的脱靶位点处未发生脱靶。

(8)iPSCs定向分化为iMNs

如图6所示，通过添加不同的化学小分子，使用MN诱导分化培养基(50％DMEM/F12，50％Neurobasal Medium，0.5×N2，0.5×B27，0.1mM ascorbic acid)将iPSCs经神经上皮祖细胞(NEP),运动神经元祖细胞(MNP),最终分化出成熟的iMNs。再分化的每个阶段，通过免疫荧光检测细胞表明标志物^[12]。定向分化过程其步骤如下：

8.1用Matrigel包被12孔细胞培养板，将iPSCs用Accutase或dispase(1mg/mL)消化后，以1:6的比例接种于包被好的孔中，用mTeSR plus培养1-2天；

8.2将培养基换成MN诱导培养基，同时添加终浓度为3μM CHIR99021，2μM DMH1，2μM SB421542，此时标记为Day0；

8.3隔天换液，培养过程中可以发现，细胞克隆团慢慢变得较为松散不如iPSCs致密，到Day5时候预铺Matrigel室温包被过夜，同时包被放有24孔板爬片的孔板；

8.4分化Day6时，用dispase(1mg/mL)消化细胞3-5min，用大tip吸取DMEM/F12轻轻将细胞吹下，转移到15mL离心管中，150g室温离心5min；

8.5小心的弃去上清，用MN诱导培养基重悬细胞，以1:4-1:6比例将细胞接种于Matrigel包被过夜的12孔板和放有爬片的24孔板中，同时添加终浓度为1μM CHIR99021，2μM DMH1，2μM SB431542，0.1μM RA，0.5μMPur；

8.6隔天换液，到Day11时候预铺Matrigel室温包被过夜，同时包被放有24孔板爬片的孔板；

8.7Day12时，12孔板中的细胞用dispase(1mg/mL)消化细胞3-5min，用大tip吸取DMEM/F12轻轻将细胞吹下，转移到15mL离心管中，<175g(本实验中为150g)室温离心5min，接种在爬片上的细胞进行免疫荧光检测Day12时的细胞表面标志物OLIG-2；

8.8小心的弃去上清，用MN诱导培养基重悬细胞，以1:4-1:6比例将细胞接种于Matrigel包被过夜的孔板中，同时添加终浓度为0.5μM RA，0.1μMPur；

8.9隔天换液，到Day17时候预铺Matrigel室温包被过夜，同时包被放有24孔板爬片的孔板；

8.10 Day18天时，12孔板中的用Accutase消化细胞3-5min，用大tip吸取DMEM/F12轻轻将细胞吹下，转移到15mL离心管中，175g室温离心5min，接种在爬片上的细胞进行免疫荧光检测Day18时的细胞表面标志物MNX1；

8.11小心的弃去上清，用MN诱导培养基重悬细胞，以1:2-1:3比例将细胞接种于Matrigel包被过夜的12孔板和放有爬片的24孔板中，同时添加终浓度为0.5μM RA，0.1μMPur，0.1μM DAPT；

8.12隔天换液，到Day24-28天时可获得大量的ChAT+的运动神经元细胞，接种在爬片上的细胞进行免疫荧光检测Day24时的细胞表面标志物。

将SMA-iPSCs、正常人iPSCs(hiPSCs)和编辑克隆C4、C5和C20分别定向分化为SMA-iMNs、hiMNs、C4-iMNs、C5-iMNs和C20-iMNs，如图6所示为分化过程中细胞形态与标志物检测结果，显示分化过程表达OTX2与SOX1的神经元上皮细胞(NEP)、OLIG-2阳性的运动神经元祖细胞(MNPs)、SMI32与ISL1阳性的早期运动神经元和ChAT阳性的成熟运动神经元，表明成功分化出运动神经元细胞。

(9)在iMNs阶段检测SMN表达情况

9.1通过RT-qPCR检测全长SMN的mRNA(FL-SMNmRNA)、缺失7号外显子的SMN mRNA(Δ7-SMN mRNA)水平。结果显示编辑克隆分化来的运动神经元C4-iMNs、C5-iMNs与C20-iMNs中FL-SMN mRNA的转录水平显著高于SMA-iPSCs分化来的运动神经元(SMN-iMNs)(图8A)，而Δ7-SMN mRNA则低于SMA-iMNs(图8B)。

9.2通过Western blot检测全长SMN蛋白水平。结果如果8C所示，C4-iMNs与C20-iMNs中的全长SMN蛋白水平显著高于SMA-iMNs。以上结果表明SMN2基因TSL2位点发生插入、缺失或插入和缺失后可以显著提高运动神经元中全长SMN mRNA水平和SMN蛋白水平。

(10)iMNs功能改善情况检测检测

在SMA患者中，运动神经元主要因内质网应激而导致凋亡，因而在iMNs分化第24天，我们通过添加浓度为10μM喜树碱(Camptothecin)处理成熟运动神经元21小时来诱导内质网应激，随后用TUNEL对运动神经元进行免疫荧光检测细胞凋亡情况^[13]。结果如图9所示，当只添加DMSO溶剂时，未编辑的SMA-iMNs与编辑克隆分化来的运动神经元(C4-iMNs与C20-iMNs)中TUNEL阳性的细胞都很少，表明凋亡水平较低，当喜树碱处理之后，SMA-iMNs的TUNEL阳性细胞显著增加，且远多于C4-iMNs与C20-iMNs中TUNEL阳性细胞，表明喜树碱诱导内质网应激之后，运动神经元的凋亡增加，且编辑克隆分化来的iMNs能有效抵抗喜树碱引起的内质网应激。该结果表明SMN2基因TSL2位点发生插入、缺失或插入和缺失后可以显著提高运动神经元对内质网应激的抵抗能力。

(11)AAV携带SaCas9进行体内基因治疗研究

11.1将SasgRNA中效率较高的SasgRNA1包装携带SasgRNA1的AAV9病毒；

11.2将病毒分装后保存于-80℃；

11.3本发明所治疗的SMA模型小鼠为从Jackson Lab引进(Stock No.007952)，在子代小鼠出生当天，剪取一点鼠尾，进行基因型鉴定，并对每只幼鼠做好标记，此时记为P0天；

11.4在P1天，通过腰椎L5-L6对SMA模型小鼠进行髓鞘注射AAV9-SasgRNA1，注射的体积为5μL，注射病毒滴度为1×10¹⁰vg，对照组SMA小鼠注射等体积等滴度的AAV9-sgRNA-scramble，记录实验组与对照组的存活时间。

结果显示：在注射后的第10天，AAV9-SasgRNA1组小鼠的体重显著高于AAV9-sgRNA-scramble组(图A、B)，同时运动能力也得到改善，AAV9-SasgRNA-scramble小鼠在出生后第11天死亡，而实验组小鼠存活与携带者在实验观察期18天内均存活(图10B)。

(12)显微注射SpCas9编辑TSL2

12.1取出生3～6周的雌性小鼠，腹腔注射促性腺激素PMSG，48小时后注射hCG后，立即与雄鼠合笼；

12.2第二天清晨，检查有阴道栓的雌鼠用于回收胚胎；

12.3在显微注射仪下将质粒注射入原核；

12.4将注射后的胚胎转移至假孕鼠子宫中；

112.5待子一代小鼠出生后，用F1/R1扩增后测序检测是否发生编辑，每只编辑的小鼠单独建系。

通过受精卵显微注射SpsgRNA1，F0代小鼠用F1/R1进行PCR扩增后进行Sanger测序，结果显示显微注射SpsgRNA1也能有效编辑TSL2，产生了indels(图10C)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法及其应用

<130> 13

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtgctcacat tccttaaatt agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgc 97

<210> 2

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcagacttac tccttaattt agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgc 97

<210> 3

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtgctcacat tccttaaatt agttttagta ctctggaaac agaatctact aaaacaaggc 60

aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgaga 97

<210> 4

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcagacttac tccttaattt agttttagta ctctggaaac agaatctact aaaacaaggc 60

aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgaga 97

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caccgtgctc acattcctta aatta 25

<210> 6

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<213> 人工合成

<400> 6

aaactaattt aaggaatgtg agcac 25

<210> 7

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caccgcagac ttactcctta attta 25

<210> 8

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<400> 8

aaactaaatt aaggagtaag tctgc 25

<210> 9

<211> 24

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<400> 9

gctgatgctt tgggaagtat gtta 24

<210> 10

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<213> 人工合成

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caccttcctt ctttttgatt ttgtc 25

<210> 11

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<213> 人工合成

<400> 11

tggaccacca ataattcccc 20

<210> 12

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atgccagcat ttccatataa tagcc 25

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<213> 人工合成

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aaaatgtctt gtgaaacaaa atgc 24

<210> 14

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aatcaaaaag aaggaaggtg ctca 24

<210> 15

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cctttcaact ttctaacatc tgaact 26

<210> 16

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<213> 人工合成

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atggctaagg cttccaacag g 21

<210> 17

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tgcccaaggg acatacctta c 21

<210> 18

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<213> 人工合成

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agaggtcagg aaggtgacca 20

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

tctgtggagg ggtcgtagag 20

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agtcagccca acccattcag 20

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工合成

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catgcctgaa ctcccactgt 20

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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acgttagcag gagaaacgga 20

<210> 23

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ccttaccaag gtcgtaccca c 21

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工合成

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agggctgtgt ttcttctgga 20

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ggggaattaa ggttgcaggt 20

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<211> 27

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<213> 人工合成

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ggtgctcaca ttaaggagta agtctgc 27

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ggtgctcaca ttccttaagg agtaagtctg c 31

<210> 28

<211> 8487

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg tgctcacatt ccttaaatta gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 360

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 420

gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 480

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 540

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 600

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 660

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 720

ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 780

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 840

gggggggggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 900

atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 960

ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc 1020

gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg 1080

tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta gctgagcaag aggtaagggt 1140

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta cctggagcac ctgcctgaaa 1200

tcactttttt tcaggttgga ccggtgccac catggactat aaggaccacg acggagacta 1260

caaggatcat gatattgatt acaaagacga tgacgataag atggccccaa agaagaagcg 1320

gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat 1380

cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag tacaaggtgc ccagcaagaa 1440

attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag aagaacctga tcggagccct 1500

gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg aagagaaccg ccagaagaag 1560

atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag atcttcagca acgagatggc 1620

caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc ttcctggtgg aagaggataa 1680

gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac gaggtggcct accacgagaa 1740

gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac agcaccgaca aggccgacct 1800

gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc cggggccact tcctgatcga 1860

gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac 1920

ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat 1980

cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat ctgatcgccc agctgcccgg 2040

cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg agcctgggcc tgacccccaa 2100

cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg cagctgagca aggacaccta 2160

cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac cagtacgccg acctgtttct 2220

ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac atcctgagag tgaacaccga 2280

gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga tacgacgagc accaccagga 2340

cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct gagaagtaca aagagatttt 2400

cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac ggcggagcca gccaggaaga 2460

gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac ggcaccgagg aactgctcgt 2520

gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc ttcgacaacg gcagcatccc 2580

ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg cggcaggaag atttttaccc 2640

attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg accttccgca tcccctacta 2700

cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg atgaccagaa agagcgagga 2760

aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag ggcgcttccg cccagagctt 2820

catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac gagaaggtgc tgcccaagca 2880

cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg accaaagtga aatacgtgac 2940

cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag aaaaaggcca tcgtggacct 3000

gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg aaagaggact acttcaagaa 3060

aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa gatcggttca acgcctccct 3120

gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag gacttcctgg acaatgagga 3180

aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca ctgtttgagg acagagagat 3240

gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac gacaaagtga tgaagcagct 3300

gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg aagctgatca acggcatccg 3360

ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag tccgacggct tcgccaacag 3420

aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt aaagaggaca tccagaaagc 3480

ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt gccaatctgg ccggcagccc 3540

cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg gacgagctcg tgaaagtgat 3600

gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc agagagaacc agaccaccca 3660

gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc gaagagggca tcaaagagct 3720

gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc cagctgcaga acgagaagct 3780

gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg gaccaggaac tggacatcaa 3840

ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag agctttctga aggacgactc 3900

catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg ggcaagagcg acaacgtgcc 3960

ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg cagctgctga acgccaagct 4020

gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag agaggcggcc tgagcgaact 4080

ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc cggcagatca caaagcacgt 4140

ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac gagaatgaca agctgatccg 4200

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gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc 4320

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cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag agcgagcagg aaatcggcaa 4440

ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac tttttcaaga ccgagattac 4500

cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag acaaacggcg aaaccgggga 4560

gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg aaagtgctga gcatgcccca 4620

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<210> 29

<211> 8487

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

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cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag agcgagcagg aaatcggcaa 4440

ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac tttttcaaga ccgagattac 4500

cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag acaaacggcg aaaccgggga 4560

gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg aaagtgctga gcatgcccca 4620

agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc ttcagcaaag agtctatcct 4680

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tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg 6060

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cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 7260

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taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 7440

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aatctggagc cggtgagcgt ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 7560

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atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 7680

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 7740

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accagctgga ccagagcttc atcgacacct acatcgacct gctggaaacc cggcggacct 1440

actatgaggg acctggcgag ggcagcccct tcggctggaa ggacatcaaa gaatggtacg 1500

agatgctgat gggccactgc acctacttcc ccgaggaact gcggagcgtg aagtacgcct 1560

acaacgccga cctgtacaac gccctgaacg acctgaacaa tctcgtgatc accagggacg 1620

agaacgagaa gctggaatat tacgagaagt tccagatcat cgagaacgtg ttcaagcaga 1680

agaagaagcc caccctgaag cagatcgcca aagaaatcct cgtgaacgaa gaggatatta 1740

agggctacag agtgaccagc accggcaagc ccgagttcac caacctgaag gtgtaccacg 1800

acatcaagga cattaccgcc cggaaagaga ttattgagaa cgccgagctg ctggatcaga 1860

ttgccaagat cctgaccatc taccagagca gcgaggacat ccaggaagaa ctgaccaatc 1920

tgaactccga gctgacccag gaagagatcg agcagatctc taatctgaag ggctataccg 1980

gcacccacaa cctgagcctg aaggccatca acctgatcct ggacgagctg tggcacacca 2040

acgacaacca gatcgctatc ttcaaccggc tgaagctggt gcccaagaag gtggacctgt 2100

cccagcagaa agagatcccc accaccctgg tggacgactt catcctgagc cccgtcgtga 2160

agagaagctt catccagagc atcaaagtga tcaacgccat catcaagaag tacggcctgc 2220

ccaacgacat cattatcgag ctggcccgcg agaagaactc caaggacgcc cagaaaatga 2280

tcaacgagat gcagaagcgg aaccggcaga ccaacgagcg gatcgaggaa atcatccgga 2340

ccaccggcaa agagaacgcc aagtacctga tcgagaagat caagctgcac gacatgcagg 2400

aaggcaagtg cctgtacagc ctggaagcca tccctctgga agatctgctg aacaacccct 2460

tcaactatga ggtggaccac atcatcccca gaagcgtgtc cttcgacaac agcttcaaca 2520

acaaggtgct cgtgaagcag gaagaaaaca gcaagaaggg caaccggacc ccattccagt 2580

acctgagcag cagcgacagc aagatcagct acgaaacctt caagaagcac atcctgaatc 2640

tggccaaggg caagggcaga atcagcaaga ccaagaaaga gtatctgctg gaagaacggg 2700

acatcaacag gttctccgtg cagaaagact tcatcaaccg gaacctggtg gataccagat 2760

acgccaccag aggcctgatg aacctgctgc ggagctactt cagagtgaac aacctggacg 2820

tgaaagtgaa gtccatcaat ggcggcttca ccagctttct gcggcggaag tggaagttta 2880

agaaagagcg gaacaagggg tacaagcacc acgccgagga cgccctgatc attgccaacg 2940

ccgatttcat cttcaaagag tggaagaaac tggacaaggc caaaaaagtg atggaaaacc 3000

agatgttcga ggaaaagcag gccgagagca tgcccgagat cgaaaccgag caggagtaca 3060

aagagatctt catcaccccc caccagatca agcacattaa ggacttcaag gactacaagt 3120

acagccaccg ggtggacaag aagcctaata gagagctgat taacgacacc ctgtactcca 3180

cccggaagga cgacaagggc aacaccctga tcgtgaacaa tctgaacggc ctgtacgaca 3240

aggacaatga caagctgaaa aagctgatca acaagagccc cgaaaagctg ctgatgtacc 3300

accacgaccc ccagacctac cagaaactga agctgattat ggaacagtac ggcgacgaga 3360

agaatcccct gtacaagtac tacgaggaaa ccgggaacta cctgaccaag tactccaaaa 3420

aggacaacgg ccccgtgatc aagaagatta agtattacgg caacaaactg aacgcccatc 3480

tggacatcac cgacgactac cccaacagca gaaacaaggt cgtgaagctg tccctgaagc 3540

cctacagatt cgacgtgtac ctggacaatg gcgtgtacaa gttcgtgacc gtgaagaatc 3600

tggatgtgat caaaaaagaa aactactacg aagtgaatag caagtgctat gaggaagcta 3660

agaagctgaa gaagatcagc aaccaggccg agtttatcgc ctccttctac aacaacgatc 3720

tgatcaagat caacggcgag ctgtatagag tgatcggcgt gaacaacgac ctgctgaacc 3780

ggatcgaagt gaacatgatc gacatcacct accgcgagta cctggaaaac atgaacgaca 3840

agaggccccc caggatcatt aagacaatcg cctccaagac ccagagcatt aagaagtaca 3900

gcacagacat tctgggcaac ctgtatgaag tgaaatctaa gaagcaccct cagatcatca 3960

aaaagggcaa aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat 4020

cctacccata cgatgttcca gattacgctt acccatacga tgttccagat tacgcttacc 4080

catacgatgt tccagattac gcttaagaat tcctagagct cgctgatcag cctcgactgt 4140

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 4200

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 4260

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 4320

agagaatagc aggcatgctg gggaggtacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 4380

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 4440

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 4500

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 4560

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tgctcacatt ccttaaatta 4620

gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 4680

caacttgttg gcgagatttt tgcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 4740

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 4800

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat 4860

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 4920

tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 4980

accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 5040

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 5100

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 5160

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 5220

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta tctcgggcta ttcttttgat 5280

ttataaggga ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 5340

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 5400

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 5460

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 5520

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 5580

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 5640

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 5700

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 5760

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 5820

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 5880

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 5940

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 6000

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 6060

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 6120

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 6180

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 6240

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 6300

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 6360

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 6420

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 6480

ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 6540

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 6600

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 6660

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 6720

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 6780

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 6840

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 6900

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 6960

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 7020

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 7080

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 7140

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 7200

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 7260

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 7320

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 7380

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 7440

cacatgt 7447

<210> 31

<211> 7447

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggc gttgacattg attattgact agttattaat 180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 600

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 720

tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggtgccac catggcccca aagaagaagc 780

ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccaagcggaa ctacatcctg ggcctggaca 840

tcggcatcac cagcgtgggc tacggcatca tcgactacga gacacgggac gtgatcgatg 900

ccggcgtgcg gctgttcaaa gaggccaacg tggaaaacaa cgagggcagg cggagcaaga 960

gaggcgccag aaggctgaag cggcggaggc ggcatagaat ccagagagtg aagaagctgc 1020

tgttcgacta caacctgctg accgaccaca gcgagctgag cggcatcaac ccctacgagg 1080

ccagagtgaa gggcctgagc cagaagctga gcgaggaaga gttctctgcc gccctgctgc 1140

acctggccaa gagaagaggc gtgcacaacg tgaacgaggt ggaagaggac accggcaacg 1200

agctgtccac caaagagcag atcagccgga acagcaaggc cctggaagag aaatacgtgg 1260

ccgaactgca gctggaacgg ctgaagaaag acggcgaagt gcggggcagc atcaacagat 1320

tcaagaccag cgactacgtg aaagaagcca aacagctgct gaaggtgcag aaggcctacc 1380

accagctgga ccagagcttc atcgacacct acatcgacct gctggaaacc cggcggacct 1440

actatgaggg acctggcgag ggcagcccct tcggctggaa ggacatcaaa gaatggtacg 1500

agatgctgat gggccactgc acctacttcc ccgaggaact gcggagcgtg aagtacgcct 1560

acaacgccga cctgtacaac gccctgaacg acctgaacaa tctcgtgatc accagggacg 1620

agaacgagaa gctggaatat tacgagaagt tccagatcat cgagaacgtg ttcaagcaga 1680

agaagaagcc caccctgaag cagatcgcca aagaaatcct cgtgaacgaa gaggatatta 1740

agggctacag agtgaccagc accggcaagc ccgagttcac caacctgaag gtgtaccacg 1800

acatcaagga cattaccgcc cggaaagaga ttattgagaa cgccgagctg ctggatcaga 1860

ttgccaagat cctgaccatc taccagagca gcgaggacat ccaggaagaa ctgaccaatc 1920

tgaactccga gctgacccag gaagagatcg agcagatctc taatctgaag ggctataccg 1980

gcacccacaa cctgagcctg aaggccatca acctgatcct ggacgagctg tggcacacca 2040

acgacaacca gatcgctatc ttcaaccggc tgaagctggt gcccaagaag gtggacctgt 2100

cccagcagaa agagatcccc accaccctgg tggacgactt catcctgagc cccgtcgtga 2160

agagaagctt catccagagc atcaaagtga tcaacgccat catcaagaag tacggcctgc 2220

ccaacgacat cattatcgag ctggcccgcg agaagaactc caaggacgcc cagaaaatga 2280

tcaacgagat gcagaagcgg aaccggcaga ccaacgagcg gatcgaggaa atcatccgga 2340

ccaccggcaa agagaacgcc aagtacctga tcgagaagat caagctgcac gacatgcagg 2400

aaggcaagtg cctgtacagc ctggaagcca tccctctgga agatctgctg aacaacccct 2460

tcaactatga ggtggaccac atcatcccca gaagcgtgtc cttcgacaac agcttcaaca 2520

acaaggtgct cgtgaagcag gaagaaaaca gcaagaaggg caaccggacc ccattccagt 2580

acctgagcag cagcgacagc aagatcagct acgaaacctt caagaagcac atcctgaatc 2640

tggccaaggg caagggcaga atcagcaaga ccaagaaaga gtatctgctg gaagaacggg 2700

acatcaacag gttctccgtg cagaaagact tcatcaaccg gaacctggtg gataccagat 2760

acgccaccag aggcctgatg aacctgctgc ggagctactt cagagtgaac aacctggacg 2820

tgaaagtgaa gtccatcaat ggcggcttca ccagctttct gcggcggaag tggaagttta 2880

agaaagagcg gaacaagggg tacaagcacc acgccgagga cgccctgatc attgccaacg 2940

ccgatttcat cttcaaagag tggaagaaac tggacaaggc caaaaaagtg atggaaaacc 3000

agatgttcga ggaaaagcag gccgagagca tgcccgagat cgaaaccgag caggagtaca 3060

aagagatctt catcaccccc caccagatca agcacattaa ggacttcaag gactacaagt 3120

acagccaccg ggtggacaag aagcctaata gagagctgat taacgacacc ctgtactcca 3180

cccggaagga cgacaagggc aacaccctga tcgtgaacaa tctgaacggc ctgtacgaca 3240

aggacaatga caagctgaaa aagctgatca acaagagccc cgaaaagctg ctgatgtacc 3300

accacgaccc ccagacctac cagaaactga agctgattat ggaacagtac ggcgacgaga 3360

agaatcccct gtacaagtac tacgaggaaa ccgggaacta cctgaccaag tactccaaaa 3420

aggacaacgg ccccgtgatc aagaagatta agtattacgg caacaaactg aacgcccatc 3480

tggacatcac cgacgactac cccaacagca gaaacaaggt cgtgaagctg tccctgaagc 3540

cctacagatt cgacgtgtac ctggacaatg gcgtgtacaa gttcgtgacc gtgaagaatc 3600

tggatgtgat caaaaaagaa aactactacg aagtgaatag caagtgctat gaggaagcta 3660

agaagctgaa gaagatcagc aaccaggccg agtttatcgc ctccttctac aacaacgatc 3720

tgatcaagat caacggcgag ctgtatagag tgatcggcgt gaacaacgac ctgctgaacc 3780

ggatcgaagt gaacatgatc gacatcacct accgcgagta cctggaaaac atgaacgaca 3840

agaggccccc caggatcatt aagacaatcg cctccaagac ccagagcatt aagaagtaca 3900

gcacagacat tctgggcaac ctgtatgaag tgaaatctaa gaagcaccct cagatcatca 3960

aaaagggcaa aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat 4020

cctacccata cgatgttcca gattacgctt acccatacga tgttccagat tacgcttacc 4080

catacgatgt tccagattac gcttaagaat tcctagagct cgctgatcag cctcgactgt 4140

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 4200

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 4260

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 4320

agagaatagc aggcatgctg gggaggtacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 4380

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 4440

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 4500

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 4560

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg cagacttact ccttaattta 4620

gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 4680

caacttgttg gcgagatttt tgcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 4740

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 4800

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat 4860

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 4920

tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 4980

accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 5040

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 5100

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 5160

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 5220

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta tctcgggcta ttcttttgat 5280

ttataaggga ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 5340

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 5400

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 5460

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 5520

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 5580

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 5640

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 5700

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 5760

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 5820

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 5880

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 5940

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 6000

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 6060

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 6120

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 6180

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 6240

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 6300

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 6360

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 6420

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 6480

ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 6540

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 6600

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 6660

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 6720

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 6780

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 6840

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 6900

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 6960

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 7020

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 7080

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 7140

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 7200

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 7260

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 7320

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 7380

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 7440

cacatgt 7447

Claims

1.一种基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法，其特征在于，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入细胞内或小鼠体内，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，进而增加全长SMN的mRNA与蛋白表达。

2.一种sgRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。

3.一种质粒，其特征在于，所述质粒能表达出靶向TSL2位点的sgRNA；后将质粒导入细胞内或小鼠体内，能对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑；优选的，所述质粒能表达出在TSL2位点上下游100bp内包含CRISPR/Cas9 PAM序列的sgRNA，即包含5’-NGG-3’或5’-NNGRRT-3’序列的sgRNA。

4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒能表达出如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示sgRNA。

5.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自序列如SEQ ID NO.28、SEQID NO.29、SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31所示的质粒。

6.一种编辑的iPSC，其特征在于，其TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失。

7.根据权利要求6所述的编辑的iPSC，其特征在于，其在TSL2的茎环结构的茎部“ATTCCTT”或“AAGGAGT”发生插入、缺失、插入和缺失。

8.根据权利要求7所述的编辑的iPSC，其特征在于，所述iPSCs其序列为：GGTGCTCACATTAAGGAGTAAGTCTGC(SEQ ID NO.26)或GGTGCTCACATTCCTTAAGGAGTAAGTCTGC(SEQ ID NO.27)。

9.构建如权利要求6-8任一项所述的编辑的iPSC的方法，其特征在于，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入iPSC，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其产生插入、缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，得到编辑的iPSC。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述iPSC还可以是其衍生的神经上皮祖细胞、运动神经元祖细胞或运动神经元。

11.一种定向分化细胞，其特征在于，所述定向分化细胞为NEP、MNP或iMNs，所述定向分化细胞由如权利要求6-8任一项所述的编辑的iPSC定向分化得到。

12.如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA3、如SEQ ID NO.4所示的SasgRNA2或如SEQ ID NO.28-31所示的质粒在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂中的应用。

13.一种表达构建物，其特征在于，其能表达出sgRNA，所述sgRNA为如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA1或如SEQ IDNO.4所示的SasgRNA2；优选的，所述表达构建物为病毒载体；进一步优选的，所述病毒载体为AAV载体。

14.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有对TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失的sgRNA或表达构建物；优选的，对TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失的sgRNA为如SEQ ID NO.1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO.2所示的SpsgRNA2、如SEQ ID NO.3所示的SasgRNA1、如SEQ ID NO.4所示的SasgRNA2、如SEQ ID NO.28-31所示的质粒或如权利要求13所述的表达构建物。

15.如权利要求14所述的试剂盒在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂中的应用。

16.一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求6-8任一项所述的编辑的iPSC，或如权利要求11所述的定向分化细胞。