CN110714008A - 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 - Google Patents
核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110714008A CN110714008A CN201910985414.7A CN201910985414A CN110714008A CN 110714008 A CN110714008 A CN 110714008A CN 201910985414 A CN201910985414 A CN 201910985414A CN 110714008 A CN110714008 A CN 110714008A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- crispr
- sequence
- plasmid
- iss
- oligo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 claims description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 abstract description 19
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000003584 silencer Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 description 5
- 108700024715 Survival of Motor Neuron 1 Proteins 0.000 description 5
- 102000047185 Survival of Motor Neuron 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150113275 Smn gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 101150015424 dmd gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加BsmBI质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。本发明采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达发挥作用，一次性转染即可，是治疗相关遗传性疾病最有潜力的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设计一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法。
背景技术
SMN2基因外显子7列入对于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）病人的重要性：研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1 （survival of motor neuron 1, SMN1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（inverted duplication）产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的SMN蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T（C6T），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了外显子7的列入 (exon 7 inclusion)。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作SMNΔ7）基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。
CRISPR/Cas9精准靶向编辑基因改善基因功能的相关研究：随着生物技术的飞速发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（Science），频繁报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（Duchennemuscular dystrophy, DMD）基因治疗的论文，以DMD动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助AAV载体运载基因编辑的CRISPR/Cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的DMD基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在SMA小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。
在人类体内表达SMN蛋白有两个基因，SMN1和SMN2，但是起主要作用的SMN1基因突变失去功能后，由于SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因，少量SMN有功能蛋白，目前最有效的方法是ASO反义寡核苷酸，精准靶向互补内含子7第10-27序列，比如16年在美国上市的寡核苷酸药物Spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子ISS序列，从而显著促进外显子7列入比例，但是ASO半衰期较短，必须持续性给药。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加商业化质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。
上述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F（100um） 2uL，sgRNA R（100um） 2uL，10×T4ligation buffer 2uL，T4 PNK 1 uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃退火30min，然后95℃退火5min，每分钟降1~6℃，梯度退至20℃火；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 1~3uL，T4 ligase 1~3uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物2~8uL，与100uL感受态细胞混匀，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120 uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入3~8mL（含1/1000氨苄）LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后送公司测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
其中，构建的CRISPR重组质粒选用：
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
步骤（2）中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明采用CRISPR case 9sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，一次性转染即可。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明中进行PCR测序时的示意图；
图3为本发明中sgRNAqingqin精准靶向编辑ISS序列从而显著促进SMN2外显子7列入比例的示意图；
图4为在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒促进SMN2外显子7列入比例的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法，sgRNAqingqin oligo构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向SMN2内含子7剪接沉默子ISS序列（图1A红色斜体），该沉默子附近恰好存在CRISPR能够识别的NGG对应序列（图1A 下划线序列），而且通过基因组序列查重，设计的sgRNAqingqin序列（图1A黑色方框内）在人类基因组内是唯一的，也就是特异性序列。本发明的步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列（图1C），两端加商业化质粒酶切位点（图1B BsmBI），构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功（图1D）。
本发明的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNA Purification试剂盒将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F（100um）2uL，sgRNA R（100um） 2uL，10×T4ligation buffer 2uL，T4 PNK 1uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃ 退火30min，95℃ 退火5min，每分钟降3℃，梯度退火至20℃；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 4uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 2uL，T4 ligase 2uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物4uL，与100uL top 10感受态混匀，冰浴10min，42℃热激90s（将质粒转入感受态细胞），冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入约5mL（含1/1000氨苄） LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后送公司测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列，即鉴定目标sgRNA序列是否插入载体。
下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
转染HEK293细胞，用puromycin筛选稳定株，提DNA进行PCR（图2A）测序，证明sgRNA2系统发挥了case9对SMN2基因组有编辑的作用，箭头向后有碱基的缺失或者插入（图2B），从PAM位点向下游有套峰的出现，通过TA克隆蓝白斑筛选，单克隆测序，结果表明基因编辑的部位恰好是我们设计的sgRNA NGG下游SMN2 剪接沉默子（ISS）区域（图2C和图2D），以上证明本发明构建的重组质粒精准靶向编辑成功。而且通过PCR电泳，加入3ul DdeI酶切过夜，2%琼脂糖凝胶电泳检测，灰度值统计学分析，按照以下公式:
统计学分析结果显示exon7列入比例提高约10%，差异具有统计学意义（图3A和图3B），SMN2基因外显子7列入比例提高了近10个百分点，而且，在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒从而显著促进SMN2全长基因的表达（图4A和图4B）。
本发明sgRNAqingqin构建的CRISPR重组质粒可以精准靶向编辑ISS序列（删除、插入及突变），可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7的列入，该方法从基因组水平编辑，从决定蛋白表达最根本的基因组水平纠正，并且重组质粒可以整合到基因组中持续表达。
本发明关键点是设计的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向编辑ISS序列，从而显著促进SMN2基因外显子7的例如比例。对于通过改变sgRNAqingqin序列中的某个或者少量碱基也能起到相同作用，所以碱基和该序列排序以及重复率也应视为本发明的保护范围。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加BsmBI质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃ 酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F 2uL，sgRNA R 2uL，10×T4 ligation buffer2uL，T4 PNK 1 uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃ 退火30min，然后95℃ 退火5min，每分钟降1~6℃，梯度退火至20℃；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 1~3uL，T4 ligase 1~3uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物2~8uL，与100uL感受态细胞混匀，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120 uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入3~8mL LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，构建的CRISPR重组质粒选用：
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
4.根据权利要求2所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，步骤（2）中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910985414.7A CN110714008A (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910985414.7A CN110714008A (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110714008A true CN110714008A (zh) | 2020-01-21 |
Family
ID=69211785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910985414.7A Pending CN110714008A (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110714008A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113430198A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-09-24 | 中南大学 | 基于crispr增加smn蛋白表达的方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170145394A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-05-25 | The Regents Of The University Of California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
| CN109295053A (zh) * | 2017-07-25 | 2019-02-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 通过诱导剪接位点碱基突变或多聚嘧啶区碱基置换调控rna剪接的方法 |
-
2019
- 2019-10-17 CN CN201910985414.7A patent/CN110714008A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170145394A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-05-25 | The Regents Of The University Of California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
| CN109295053A (zh) * | 2017-07-25 | 2019-02-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 通过诱导剪接位点碱基突变或多聚嘧啶区碱基置换调控rna剪接的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIN-JING LI等: "Disruption of splicing-regulatory elements using CRISPR/Cas9 to rescue spinal muscular atrophy in human iPSCs and mice", 《NATIONAL SCIENCE REVIEW》 * |
| ZHANGLAB: "LentiCRISPR lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA", 《LENTIVIRAL CRISPR TOOLBOX》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113430198A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-09-24 | 中南大学 | 基于crispr增加smn蛋白表达的方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP4137161A1 (en) | Method and drug for treating hurler syndrome | |
| JP7696694B2 (ja) | 修飾されたガイドｒｎａ | |
| JP2021182934A (ja) | アルファ１アンチトリプシン欠乏症の治療のための材料および方法 | |
| CN107177591A (zh) | 利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途 | |
| JP2000515362A (ja) | トランス―スプライスにより生成される治療用分子 | |
| US20230287419A1 (en) | DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY-RELATED EXONIC SPLICING ENHANCER, sgRNA AND GENE EDITING TOOL, AND APPLICATIONS | |
| CN110331171A (zh) | 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法 | |
| CN115820728A (zh) | 一种基因编辑的方法和用途 | |
| CN103028119A (zh) | 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用 | |
| CN115161321B (zh) | ssc-miR-30c-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用 | |
| CN110714008A (zh) | 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 | |
| CN114058619B (zh) | Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用 | |
| Weng et al. | Improvement of muscular atrophy by AAV–SaCas9-mediated myostatin gene editing in aged mice | |
| CN116064672A (zh) | 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因 | |
| CN118063584A (zh) | 促肿瘤焦亡蛋白、靶向her2免疫促肿瘤焦亡蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN115068611B (zh) | ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用 | |
| JPWO2021138247A5 (zh) | ||
| CN115698303A (zh) | 体外转录物mrna和包含其的药物组合物 | |
| US20200354741A1 (en) | Gene-editing systems for modifying a scn9a or scn10a gene and methods of use thereof | |
| CN111549058B (zh) | 一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法 | |
| CN118652889B (zh) | 一种环状核酶系统及其应用 | |
| CN114480396B (zh) | 反义寡核苷酸在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型药物中的应用 | |
| CN111944845A (zh) | 靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备 | |
| WO2022257010A1 (zh) | 基于crispr增加smn蛋白表达的方法及其应用 | |
| TWI838812B (zh) | 用於治療法布瑞氏症之組合物及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200121 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |