CN110714008A - 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加BsmBI质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。本发明采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达发挥作用，一次性转染即可，是治疗相关遗传性疾病最有潜力的方法。

Description

核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设计一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法。
背景技术
SMN2基因外显子7列入对于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）病人的重要性：研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1 （survival of motor neuron 1, SMN1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（inverted duplication）产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的SMN蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T（C6T），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了外显子7的列入 (exon 7 inclusion)。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作SMNΔ7）基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。
CRISPR/Cas9精准靶向编辑基因改善基因功能的相关研究：随着生物技术的飞速发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（Science），频繁报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（Duchennemuscular dystrophy, DMD）基因治疗的论文，以DMD动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助AAV载体运载基因编辑的CRISPR/Cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的DMD基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在SMA小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。
在人类体内表达SMN蛋白有两个基因，SMN1和SMN2，但是起主要作用的SMN1基因突变失去功能后，由于SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因，少量SMN有功能蛋白，目前最有效的方法是ASO反义寡核苷酸，精准靶向互补内含子7第10-27序列，比如16年在美国上市的寡核苷酸药物Spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子ISS序列，从而显著促进外显子7列入比例，但是ASO半衰期较短，必须持续性给药。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加商业化质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。
上述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F（100um） 2uL，sgRNA R（100um） 2uL，10×T4ligation buffer 2uL，T4 PNK 1 uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃退火30min，然后95℃退火5min，每分钟降1~6℃，梯度退至20℃火；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 1~3uL，T4 ligase 1~3uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物2~8uL，与100uL感受态细胞混匀，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120 uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入3~8mL（含1/1000氨苄）LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后送公司测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
其中，构建的CRISPR重组质粒选用：
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
步骤（2）中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明采用CRISPR case 9sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，一次性转染即可。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明中进行PCR测序时的示意图；
图3为本发明中sgRNAqingqin精准靶向编辑ISS序列从而显著促进SMN2外显子7列入比例的示意图；
图4为在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒促进SMN2外显子7列入比例的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法，sgRNAqingqin oligo构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向SMN2内含子7剪接沉默子ISS序列（图1A红色斜体），该沉默子附近恰好存在CRISPR能够识别的NGG对应序列（图1A 下划线序列），而且通过基因组序列查重，设计的sgRNAqingqin序列（图1A黑色方框内）在人类基因组内是唯一的，也就是特异性序列。本发明的步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列（图1C），两端加商业化质粒酶切位点（图1B BsmBI），构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功（图1D）。
本发明的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNA Purification试剂盒将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F（100um）2uL，sgRNA R（100um） 2uL，10×T4ligation buffer 2uL，T4 PNK 1uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃ 退火30min，95℃ 退火5min，每分钟降3℃，梯度退火至20℃；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 4uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 2uL，T4 ligase 2uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物4uL，与100uL top 10感受态混匀，冰浴10min，42℃热激90s（将质粒转入感受态细胞），冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入约5mL（含1/1000氨苄） LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后送公司测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列，即鉴定目标sgRNA序列是否插入载体。
下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
转染HEK293细胞，用puromycin筛选稳定株，提DNA进行PCR（图2A）测序，证明sgRNA2系统发挥了case9对SMN2基因组有编辑的作用，箭头向后有碱基的缺失或者插入（图2B），从PAM位点向下游有套峰的出现，通过TA克隆蓝白斑筛选，单克隆测序，结果表明基因编辑的部位恰好是我们设计的sgRNA NGG下游SMN2 剪接沉默子（ISS）区域（图2C和图2D），以上证明本发明构建的重组质粒精准靶向编辑成功。而且通过PCR电泳，加入3ul DdeI酶切过夜，2%琼脂糖凝胶电泳检测，灰度值统计学分析，按照以下公式:
Figure 937050DEST_PATH_IMAGE001
。
统计学分析结果显示exon7列入比例提高约10%，差异具有统计学意义（图3A和图3B），SMN2基因外显子7列入比例提高了近10个百分点，而且，在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒从而显著促进SMN2全长基因的表达（图4A和图4B）。
本发明sgRNAqingqin构建的CRISPR重组质粒可以精准靶向编辑ISS序列（删除、插入及突变），可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7的列入，该方法从基因组水平编辑，从决定蛋白表达最根本的基因组水平纠正，并且重组质粒可以整合到基因组中持续表达。
本发明关键点是设计的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向编辑ISS序列，从而显著促进SMN2基因外显子7的例如比例。对于通过改变sgRNAqingqin序列中的某个或者少量碱基也能起到相同作用，所以碱基和该序列排序以及重复率也应视为本发明的保护范围。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加BsmBI质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）BsmBI酶切Lenti CRISPR空载：Restrietion Enzyme 1uL，质粒DNA 5 ug，10×buffer 5 uL，补灭菌去离子水至50 uL，55℃ 酶切30min，然后80℃，酶切20min；
（2）将步骤（1）的酶切产物纯化备用；
（3）目标Oligo sgRNA退火：sgRNA F 2uL，sgRNA R 2uL，10×T4 ligation buffer2uL，T4 PNK 1 uL，补灭菌去离子水至20uL，37℃ 退火30min，然后95℃ 退火5min，每分钟降1~6℃，梯度退火至20℃；
（4）将步骤（3）退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释；
（5）链接反应：步骤（1）的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL，步骤（4）的Oligo sgRNA 1~3uL，10×T4 ligation buffer 1~3uL，T4 ligase 1~3uL，补灭菌去离子水至20 uL，4℃过夜链接；
（6）取步骤（5）的链接产物2~8uL，与100uL感受态细胞混匀，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴30min，加入LB液体培养基200uL，200rpm 搅拌45min，取120 uL 涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；
（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管，加入3~8mL LB液培，37℃，200rpm 过夜摇菌；
（8）质粒提取：提取质粒，OD值检测质粒浓度，然后测序；
（9）对测序结构进行分析，鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，构建的CRISPR重组质粒选用：
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
4.根据权利要求2所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，其特征在于，步骤（2）中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
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