CN115698303A

CN115698303A - 体外转录物mrna和包含其的药物组合物

Info

Publication number: CN115698303A
Application number: CN202180022541.2A
Authority: CN
Inventors: 申英基; 崔俊英; 金娜英; 孙元乐; 李永进
Original assignee: SNU R&DB Foundation; Abion Inc
Current assignee: SNU R&DB Foundation; Abion Inc
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2023-02-03
Also published as: EP4123029A1; AU2021239762A1; WO2021187883A1; BR112022018376A2; KR102462990B1; KR20210115958A; JP2023518734A; MX2022011487A; EP4123029A4

Abstract

本发明涉及用于目标基因的细胞内表达的RNA体外转录物mRNA和包含其的用于疫苗的药物组合物。当注射到动物细胞中时，包括根据本发明的目标基因的体外转录物mRNA允许目标蛋白在动物细胞中大量表达，并且因此可以用作针对自身免疫疾病、传染病、癌症或肿瘤相关疾病、炎性疾病等的基因疫苗。

Description

体外转录物MRNA和包含其的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于目标基因的细胞内表达的体外转录物mRNA，更具体地，涉及用于目标基因的细胞内表达的RNA体外转录物mRNA以及包括其的用于疫苗的药物组合物。

背景技术

基因疗法和基因疫苗是已经被证明并广泛应用于制药领域的技术，并且不仅可用于治疗遗传疾病，还可用于治疗自身免疫疾病、传染病、癌症或肿瘤相关疾病、炎症疾病等。

基于报道已经开始开发基因疫苗，当编码靶基因的DNA和RNA直接注射到动物体内时，靶基因在活体动物中表达，从而可能实现免疫(Wolff J.A.et al.Science,247:1465-8,1990)。

在基因治疗或基因疫苗接种中，DNA和DNA可用作基因给药的核酸分子，并且众所周知，DNA比RNA更稳定和更容易处理。然而，在DNA的情况下，当由于在不期望的位置将施用的DNA片段插入患者基因组而发生基因损伤时，可能会出现潜在风险。此外，可能出现不需要的抗DNA抗体，而且，通过DNA施用和随后的转录/翻译表达的肽或蛋白质的表达水平受到限制，这是不希望的。调节DNA转录的特定转录因子的存在或不存在对施用的DNA的表达水平具有主要影响，并且在没有特定转录因子时，DNA转录不能产生足够量的RNA，因此，翻译和产生的肽或蛋白质的量也有限。

另一方面，当RNA用于基因给药时，RNA不需要转录，因此蛋白质可以直接在细胞质中合成，而不需要像DNA一样进入细胞核，因此不必担心插入细胞染色体导致不期望的遗传损伤。此外，RNA的半衰期比DNA短，不会诱导长期遗传修饰(Sayour E.J.et al.,J.Immunother.Cancer 2015；3:13,2015)。当普通RNA疫苗被递送到细胞中时，它在短时间内被激活，从而表达靶蛋白，并在几天内被酶反应破坏，并且对表达的靶抗原(蛋白)的特异性免疫应答仍然存在。

此外，当RNA用于基因给药时，RNA仅通过细胞膜而不需要通过核膜起作用，因此即使以比DNA少的量使用，RNA也能够表达与DNA相同量的靶蛋白。此外，由于RNA本身具有更高的免疫增强特性，因此即使当以比DNA少的量施用时，也可表现出相同的免疫效果。

此外，RNA可以在体外大量生产，因此即使在小规模GMP生产设施中也可以安全生产，并且RNA转录物可以仅合成与诱导病毒或微生物的中和抗体相关联的表位基因，然后在体外转录的方式生产。在过去，以这种方式生产大量RNA需要大量的费用和复杂的技术，但由于与体外转录反应相关的试剂，特别是依赖于DNA的RNA聚合酶的改进，现在可以在1-2周内使用少量DNA模板生产大量RNA。

基因疫苗是通过使用各种载体向动物接种待表达蛋白质的基因(DNA或RNA)来表达靶抗原的系统。有趣的是，该基因表达的蛋白质量在实践中与免疫原性不成正比。即使在表达的抗原量增加时，也不一定意味着抗原的免疫原性也成比例增加。一般来说，当基因疫苗注射到动物中时，基因疫苗(DNA或RNA)以各种方式传递到动物肌肉细胞并感染它们。由于如此感染的肌肉细胞被抗原特异性T细胞裂解，因此实际抗原表达期或抗原量与体外细胞培养实验中预测的不同。因此，需要进一步研究，以准确了解基因疫苗如何通过有限的表达水平和时间诱导免疫应答。实际上，从体外细胞培养研究中获得的结果往往与从体内动物实验中获得的结论不一致。原因是，在接种基因疫苗后，参与免疫反应的天然免疫受体的物种特异性表达和抗原识别模式存在差异，并且天然免疫受体按细胞类型的表达水平也存在差异。它没有解释基于α病毒的自复制RNA疫苗仅仅由于高抗原表达水平而具有高抗原性免疫原性，而是表明可能还有另一个影响因素(Park J.H.et al.,J.Bacteriol.&Virol.,46:115,2016)。

因此，为了通过目标基因诱导优异的免疫应答，通过施用的RNA在动物细胞中表达的蛋白质量、施用的RNA转录物的构建、免疫所需的适当RNA剂量以及使用化合物如鱼精蛋白的最佳RNA修饰被认为是重要的(Park J.H.et al.,J.Bacteriol.&Virol.,46:115,2016)。

因此，本发明人做出了巨大努力，开发了一种在动物细胞中稳定表达目标基因的方法，并确定，当使用包含目标基因、与目标基因两端连接的5’-UTR和3’-UTR、连接到5’-UTR的5’帽、和含有20至400个与3’-UTR连接的腺嘌呤的聚(A)尾的体外转录物mRNA将目标基因递送至动物细胞时，可在动物细胞中以优异的表达效率产生目标蛋白，从而最终形成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供用于在动物细胞中稳定表达目的基因的体外转录物mRNA。

本发明的另一个目的是提供用于制备体外转录物mRNA的DNA模板。

本发明的另一个目的是提供包含体外转录物mRNA的用于疫苗的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明提供了一种体外转录物mRNA，包含：(a)编码目标肽或目标蛋白的RNA序列插入部分；(b)与编码所述目标肽或所述目标蛋白的RNA序列两端连接的5’-UTR和3’-UTR；(c)连接到5’-UTR的5’帽；和(d)含有20至400个与3’-UTR连接的腺嘌呤的聚(A)尾。

另外，本发明提供一种用于体外转录物mRNA制备的模板DNA，包含：(a)具有对应于RNA体外转录物mRNA的DNA序列的部分；和(b)RNA聚合酶结合的启动子，用于对应于所述体外转录物mRNA的DNA序列的转录。

此外，本发明提供一种包含体外转录物mRNA的用于疫苗的药物组合物。

此外，本发明提供预防或治疗疾病的方法，包括施用体外转录物mRNA。

此外，本发明提供体外转录物mRNA在预防或治疗疾病中的应用。

此外，本发明提供体外转录物mRNA在预防或治疗疾病中的用途。

附图说明

图1显示了根据本发明的体外转录物mRNA和模板DNA的配置；

图2显示了根据本发明通过从模板质粒DNA体外转录合成体外转录物mRNA的过程；

图3显示了根据体外转录物mRNA的聚(A)尾的长度确认目标蛋白的表达水平的结果；

图4显示了根据体外转录物mRNA的聚(A)尾的末端形状确认目标蛋白表达水平的结果；

图5显示根据体外转录物mRNA的聚(A)尾部中是否混合非A残基来确认目标蛋白的表达水平的结果；

图6示出了根据体外转录物mRNA的帽类型确认目标蛋白的表达水平的结果；和

图7A显示了通过用修饰的核苷酸替换体外转录物mRNA的核苷酸来确认目标蛋白的表达水平的结果，并且图7B显示了通过使用修饰的核苷酸替换非A残基混合聚(A)尾部的非A残基来确定目标蛋白表达水平的结果。

具体实施方式

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的术语在本领域中是公知的并且是典型的。

尽管传统的基因治疗已经提供了提高mRNA稳定性和翻译活性的手段，但诸如基于RNA的平台的低稳定性等问题仍然存在。因此，有必要开发一种用于提高mRNA稳定性和翻译活性的平台，以便在体内提供编码蛋白的更好表达水平，并且本发明提出一种体外转录物mRNA，包含：(a)编码目标肽或目标蛋白的RNA序列插入部分；(b)与编码所述目标肽或所述目标蛋白的RNA序列两端连接的5’-UTR和3’-UTR；(c)连接到5’-UTR的5’帽；和(d)含有20至400个与3’-UTR连接的腺嘌呤的聚(A)尾(图1)。与具有A₃₃C₁₈、A₀和A₃₀尾的mRNA相比，通过本发明的方法构建的具有包含120个腺嘌呤的聚(A)尾(A₁₂₀)的体外转录物mRNA稳定地在施用其的动物细胞中显示出高表达水平的目的蛋白。

因此，本发明的一个方面涉及体外转录物mRNA，包含：(a)编码目标肽或目标蛋白的RNA序列插入部分；(b)与编码所述目标肽或所述目标蛋白的RNA序列两端连接的5’-UTR和3’-UTR；(c)连接到5’-UTR的5’帽；和(d)含有20至400个与3’-UTR连接的腺嘌呤的聚(A)尾。

在本发明中，目标基因可以是编码治疗活性蛋白或肽、佐剂蛋白、抗原、肿瘤抗原、致病性抗原、动物抗原、病毒抗原、原生动物抗原、细菌抗原、过敏抗原、自身免疫抗原、过敏原、抗体、免疫刺激蛋白或肽或抗原特异性T细胞受体的基因。

在本发明中，5’帽是位于mRNA的5’起始位点的组分。帽结构启动蛋白质合成并用于保护mRNA免受核酸酶的作用。5’帽也会影响翻译。在翻译启动期间，5’帽与elF4E(真核生物翻译启动因子4E)结合，从而将40S核糖体亚单位连接到mRNA。

在本发明中，5’帽可以是Cap-1或ARCA(反-反向帽模拟)。

在本发明中，当通过共转录封帽方法构建转录物以同时进行封帽和转录时，使用mMESSAGE mMACHINE^TM T7 ULTRA转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)合成ARCA-RNA。

此外，当执行转录后封帽方法时，使用MEGAscript^TM T7转录试剂盒(ThermoFisherScientific)合成未封帽的RNA。

在本发明中，为了确定用于向动物细胞传递目标基因的体外转录物mRNA平台及其表达的最适5’帽，合成不含帽、Cap-0、Cap-1或ARCA的体外转录物mRNA，并比较293T细胞中目标蛋白的表达水平，从而表明ACRA和Cap-1的表达效率最大(图6)。然而，在通过降低GTP比率和增加类似于ARCA的帽类似物比率同时进行体外转录和封帽的方法中，可以合成未封帽的RNA。这能够诱导先天免疫，因此Cap-1(使用酶的转录后封帽系统)被确定更适合于体外转录物mRNA平台。

在本发明中，优选在目标基因的起始密码子上游添加Kozak序列，并且目标基因具有针对宿主细胞的密码子优化序列。

聚(A)尾是位于本发明体外转录物mRNA 3’端的组分。与5’帽一起，聚(A)尾用于保护mRNA免受酶降解，当其长度不足时，已知mRNA的稳定性恶化。聚(A)尾也会影响翻译。PABP(聚(A)-结合蛋白)是结合聚(A)尾的蛋白，在翻译启动期间与elF4G(真核生物翻译起始因子4g)结合，从而将40S核糖体亚单位连接到mRNA。

在本发明中，聚(A)尾可含有20至400个腺嘌呤，优选30至200个腺嘌嘌，更优选60至150个腺嘌嘧啶，更优选100至130个腺嘌吟。

在本发明的实施例中，为了比较取决于聚(A)尾长度变化的mRNA翻译效率，合成具有常规A₃₃C₁₈尾以及分别含有0、30和120个腺嘌呤的A₀、A₃₀和A₁₂₀尾的模板DNA，然后将通过体外转录产生的mRNA引入293T细胞，并比较目标蛋白的表达水平。因此，在A₀尾中未观察到IgM-D4表达，并且证实A₁₂₀尾的表达最好，依次为A₃₀尾和A₃₃C₁₈尾(图3)。

在本发明中，聚(A)尾可以被配置为使得至少一种选自尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的非腺嘌呤核苷酸插入多个腺嘌呤之间。这里，非腺嘌呤核苷酸插入2至20个、优选4至15个、更优选6至12个、最优选8至10个腺嘌呤之间，但本发明不限于此。

在本发明的实施例中，为了比较非A残基混合尾的翻译效率，构建具有原始A₁₂₀尾、A₁₂₀-G混合尾、A₁₂₀-C混合尾和A₁₂₀-U混合尾中的每一个的模板DNA。使用每个模板合成体外转录物mRNA，并以与实施例3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。因此，证实U－混合尾的mRNA表达效率最高。

在本发明中，聚(A)尾的末端可以是腺嘌呤。

由于线性化的DNA模板在体外转录时使用，因此产生的mRNA的聚(A)尾的末端可以用残基A终止，或者可以包括限制性酶识别位点，这取决于用于模板质粒DNA线性化的限制性酶。

为了比较取决于聚(A)尾的末端形状的翻译程度，基于用NheI或SapI限制性酶线性化的模板合成非完整或完整末端mRNA，并比较目标蛋白的表达水平。因此，确定具有末端仅以A终止的尾的mRNA的表达效率较高(图4)。

在本发明中，体外转录物mRNA序列的全部或部分尿嘧啶(U)可以被修饰的U取代，并且修饰的UTP可以是伪UTP或N1-甲基伪UTP。

在本发明中，聚(A)尾可以被配置为使得修饰的U插入多个腺嘌呤之间。

在本发明的实施例中，为了确定适用于向动物细胞递送目标基因的体外转录物mRNA平台的修饰核苷酸及其表达，合成包括修饰的CTP或UTP的体外转录物mRNA，并比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，证实mRNA的U被仅使用修饰的UTP修饰的U 100％替代的mRNA的蛋白表达效率最高(图7)。此外，由于判断其与具有优异蛋白质表达效率的U-混合尾一起使用能够表现出协同效应，因此比较了使用修饰的UTP的混合尾的结果，发现U-混合尾中的蛋白表达最高。

本发明的另一方面涉及用于体外转录物mRNA制备的模板DNA，包含(a)具有对应于RNA体外转录物mRNA的DNA序列的部分和(b)RNA聚合酶结合的启动子，用于对应于所述体外转录物mRNA的DNA序列的转录。

在本发明中，启动子可选自T7启动子、T3启动子和SP6启动子。

在本发明中，模板DNA可以包含连接到聚(A)尾的限制性酶识别位点。

限制性酶识别位点优选为经配置以在用限制性酶处理时用腺嘌呤(A)终止体外转录物mRNA的聚(A)尾末端的序列，并且限制性酶优选为NheI或SapI。

为了构建本发明的体外转录物mRNA，由于mRNA是通过一般的体外转录反应产生的，所以所有生产过程都在体外进行。具体地说，由于RNA是通过T7、SP6或T3 RNA聚合酶在体外合成的，使用其末端酶切后线性化的DNA作为模板，因此不需要直接处理用于制造普通活疫苗或死疫苗的活病毒或微生物。此外，必须用于生产重组疫苗(重组蛋白)的酵母、大肠杆菌或昆虫细胞的培养是不必要的。

本发明的另一方面涉及包含体外转录物mRNA的用于疫苗的药物组合物。

可以将目标的基因插入本发明的体外转录物mRNA中，其实例可以包括分别编码治疗活性蛋白或肽、佐剂蛋白、抗原、肿瘤抗原、致病性抗原、动物抗原、病毒抗原、原生动物抗原、细菌抗原、过敏性抗原、自身免疫抗原、过敏原、抗体、免疫刺激蛋白或肽、和抗原特异性T细胞受体的基因，并且根据插入的基因类型，本发明的体外转录物mRNA可用于自身免疫疾病、传染病、癌症或肿瘤相关疾病、炎症疾病等的基因疫苗中。

本发明的另一方面涉及预防或治疗疾病的方法，包括施用体外转录物mRNA。

本发明的另一方面涉及体外转录物mRNA用于预防或治疗疾病的应用。

本发明的另一方面涉及体外转录物mRNA在预防或治疗疾病中的用途。

体外转录物mRNA平台是一种创新的疫苗生产技术，完全恢复目前的疫苗生产方法。最近，有许多新的病毒爆发案例已经存在了一段时间，但突然引起了问题，例如新的突变病毒，如MERS病毒、新冠肺炎等或寨卡病毒。然而，实际上不可能总是为所有这些感染源准备好疫苗。体外转录物mRNA是唯一最符合危机应对疫苗接种条件的生产平台。在mRNA的生产中，即使只有极少量的模板DNA，也有可能在1至2周内生产出300,000剂量的RNA，相当于该国的基本量。这是因为mRNA的体外生产不需要生物反应器，也因为本发明的体外转录物mRNA平台是唯一能够通过综合处理所有相关基因而生产疫苗的疫苗生产平台，而无需直接对感染源作出反应。

通过以下实例可以更好地理解本发明。这些实例仅被阐述以说明本发明，而不应被解释为限制本发明的范围，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

实施例1:模板DNA的构建

构建作为体外转录物mRNA产生模板所必需的模板质粒DNA(模板pDNA)。所使用的目标蛋白的基因是番茄荧光蛋白基因。

为了将目标蛋白的基因插入到模板pDNA中，使用包括番茄荧光蛋白基因(SEQ IDNO:1)作为模板的pTdTomato-N1载体通过PCR扩增目标蛋白的基因。

在设计引物时，将目标蛋白的基因两端的20bp用作退火位点，并使用设计用于将EcoRI识别序列-Kozak序列和HindIII识别序列添加到两端的PCR引物。

正向引物：5’at gaattc gccacc atggtgagcaagggcgagga 3’(SEQ ID NO:3)反向引物：5’at aagctt ttacttgtacagctcgtcca 3’(SEQ ID NO:4)

PCR后，使用MEGAquick-spin^TM plus片段DNA纯化试剂盒(iNtRON)鉴定和纯化通过电泳扩增的番茄荧光蛋白基因。接下来，使用限制性内切酶EcoRI和HindIII(ThermoFisher)切割体外转录模板pDNA(SEQ ID NO:2)和番茄荧光蛋白DNA，使用MEGAquick-spin^TM plus片段DNA纯化试剂盒纯化，然后使用T4连接酶(Enzynomics)进行连接。

连接后，将质粒转化为DH5α竞争性细胞，然后在37℃下孵育过夜，然后从孵育的菌落中分离pDNA，并通过测序服务(Cosmo Genetech)鉴定模板pDNA序列。

实施例2:mRNA的体外合成

使用实施例1中构建的模板质粒DNA作为模板并使用T7 RNA聚合酶体外合成体外转录物mRNA(转录物mRNA)。

具体地，通过使用NheI或SapI限制性酶(ThermoFisher Scientific)在聚(A)尾下游进行切割，线性化模板质粒DNA，并使用MEGAquick-Spin^TM plus片段DNA纯化试剂盒(Intron)纯化以获得模板DNA，之后使用由此获得的模板DNA进行体外转录(图2)。

当通过共转录封帽方法构建转录物以同时进行封帽和转录时，使用mMESSAGEmMACHINE^TM T7 ULTRA超转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)合成ARCA-RNA。

当进行转录后封帽方法时，使用MEGAscript^TM T7转录试剂盒(ThermoFisherScientific)合成未封帽的RNA。实验按照试剂盒的方案进行，实验方法如下。

具体而言，将试剂盒溶液添加到1μg线性化模板DNA中，如下面表1或表2所示，并制备最终体积为20μL的混合溶液。当使用修饰的核苷酸如5-甲基-CTP、伪UTP和N1-甲基伪-UTP(TriLink)时，考虑到浓度，核苷酸100％被修饰的核苷酸取代。

[表1]

使用mMESSAGE mMACHINE^TM T7超转录试剂盒进行ARCA-RNA合成反应的混合溶液组合物

线性化模板DNA	1μL
		T7酶混合物	2μL
10X T7反应缓冲液	2μL
		T7 2X NTP/ARCA	10μL
无核酸酶水	高达20μL

[表2]

使用MEGAscript^TM T7转录试剂盒进行无帽的RNA合成反应的混合溶液组合物

线性化模板DNA	1μg
		T7酶混合物	2μL
10X反应缓冲液	2μL
		酶混合物	2μL
75mM ATP溶液	2μL
		75mM CTP溶液	2μL
75mM GTP溶液	2μL
		75mM UTP溶液	10μL
无核酸酶水	高达20μL

将上述制备的混合溶液在37℃下反应过夜，加入1μL DNase，并在37℃下反应15分钟，最后，使用氯化锂*纯化合成的体外转录RNA(SEQ ID NO:5)。

当用Cap-0和Cap-1封帽合成的未封帽的RNA时，根据制造商的方案，分别使用ScriptCap^TM M7G封帽系统套件(CELLSCRIPT)和ScriptCap^TM Cap-1封帽系统试剂盒(CELLSCRIPT)进行实验。实验方法如下。

具体而言，将55μg未封帽的RNA稀释至68.5μL或67μL的最终体积，在65℃下反应10分钟，然后在冰上冷却，并且制备预混物，如下表3和表4所示。

[表3]

ScriptCap^TM M7G封帽系统试剂盒的预混料，用于Cap-0封帽

10X ScriptCap封帽缓冲液	10μL
		10mM GTP	10μL
2mM SAM	5μL
		ScriptGuard RNase抑制剂	2.5μL
ScriptCap封帽酶(10U/mL)	4μL
		总体积	31.5μL

[表4]

ScriptCap^TM Cap-1封帽系统试剂盒的预混料，用于Cap-1封帽

10X ScriptCap封帽缓冲液	10μL
		10mM GTP	10μL
20mM SAM	2.5μL
		ScriptGuard RNase抑制剂	2.5μL
ScriptCap 2’-O-甲基转移酶(100U/mL)	4μL
		ScriptCap封帽酶(10U/mL)	4μL
总体积	33μL

将未封帽的RNA添加到制备的预混料溶液中，并在37℃下反应30分钟，然后使用氯化锂(LiCl)纯化Cap-0-和Cap-1-RNA。

LiCl纯化方法的实施方式为：将7.5M LiCl溶液(ThermoFisher)、无核酸酶纯化水和RNA溶液以1:1:1混合得到的混合溶液在-20℃下反应30分钟，然后以13000rpm离心15分钟，然后除去上清液，并添加70％乙醇，随后以13000rpm离心5分钟，之后除去上清液，然后在无核酸酶的纯化水中裂解RNA颗粒，从而获得纯化的RNA。

实施例3:将mRNA导入哺乳动物细胞并表达目标蛋白

将293T细胞(ATCC CRL-3216)接种到6孔板中70-80％的融合率，然后在DMEM/HIGHGLUCOSE(HyClone^TM)培养基中孵育过夜。将实施例2中获得的2.5μg体外转录物mRNA和5μLLipofectamine TM2000(ThermoFisher Scientific，USA)与200μL Opti-MEM^TM(ThermoFisher Scientific,USA)混合，然后在室温下反应10分钟，然后将两种溶液混合以提供混合溶液，然后在室温反应5分钟。

将在6孔板中孵育的293T细胞的细胞培养基替换为不含血清或抗生素的DMEM/HIGH GLUCOSE(HyClone^TM)培养基，然后向其中添加混合溶液。4小时后，用含有10％胎牛血清(HyClone^TM)和1％抗生素(HyClone^TM)的培养基替换培养基，然后孵育24小时。孵育24小时后，用DPBS洗涤细胞，加入含有蛋白酶抑制剂(Roche,Basel,Swiss)的RIPA缓冲液(Biosesang,Korea)，并在4℃下裂解30分钟。细胞裂解后，以13000rpm离心30分钟，然后分离上清液，并通过BCA测定定量蛋白质。用5XSDS-PAGE样品缓冲液添加定量的每个裂解液样品，并在100℃下煮沸10分钟。通过SDS-PAGE对蛋白进行大小分类，转移到PVDF膜，加入10ml5％BSA+5％脱脂乳(在含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液中)，并在4℃下反应过夜。此后，向其中加入10ml 1:5000稀释的抗PA-D4抗体(ABION,Seoul,South Korea，稀释缓冲液，5％脱脂乳，磷酸盐缓冲液，含0.1％吐温-20)，随后在室温下反应3小时。在用0.1％吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤后，将HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(ThermoFisher Scientific,MA,USA)加入膜中，随后在室温下反应1小时。最后，进行洗涤，然后使用EZ-Western LumiFemto溶液(DOGEN,Seoul,South Korea)进行显影，由此鉴定体外转录物mRNA表达的目的蛋白带。

实施例4:使用实时荧光分析的表达确认方法

将293T细胞(ATCC CRL-3216)接种到6孔板中70-80％的融合率，然后孵育过夜。将实施例2中获得的2.5μg体外转录物mRNA和5μLLipofectamine TM2000(ThermoFisherScientific，USA)与200μLOpti-MEM^TM(ThermoFisher Scientific,USA)混合，在室温下反应10分钟，然后将两种溶液混合以获得混合溶液，随后在室温下进行反应5分钟。

将在6孔板中培养的293T细胞的细胞培养基替换为不含血清或抗生素的DMEM/HIGH GLUCOSE(HyClone^TM)培养基，然后向其中添加混合溶液。将细胞培养板置于IncuCyte^TM(Sartorius,Germany)中，每小时测量红色荧光。4小时后，用含有10％胎牛血清(HyClone^TM)和1％抗生素(HyClone^TM)的培养基替换培养基，然后培养48小时。

实施例5:体外转录mRNA聚(A)尾的优化

聚(A)尾是位于本发明体外转录物mRNA的3’端的组分。与5’帽一起，聚(A)尾用于保护mRNA免受酶降解，当其长度不足时，已知mRNA的稳定性恶化。聚(A)尾也会影响翻译。PABP(聚(A)-结合蛋白)是一种结合聚(A)尾的蛋白，在翻译启动期间与elF4G(真核生物翻译起始因子4g)结合，从而将40S核糖体亚单位连接到mRNA。

以确定用于将目标基因递送至动物细胞及其表达的体外转录物mRNA平台的最佳聚(A)尾，通过体外转录产生各种类型的mRNA，这取决于：1)聚(A)尾的长度，2)其末端的形状，以及3)是否混合非A残基，并比较目标蛋白的表达水平。

1)聚(A)尾的长度

为了比较取决于聚(A)尾长度变化的mRNA翻译效率，构建具有常规A₃₃C₁₈尾以及分别含有0、30和120个腺嘌呤的A₀、A₃₀和A₁₂₀尾的模板DNA。使用每种模板DNA，以与实施例2相同的方式通过进行体外转录和Cap-1封帽来合成mRNA，并以与实施方案3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，如图3所示，在A₀尾中未观察到IgM-D4表达，并且证实表达对于A₁₂₀尾最好，依次为A₃₀尾和A₃₃C₁₈尾。这被认为是因为随着尾长度的增加，由于二烯基化，尾消失所需的时间增加，从而导致相对较高的稳定性，并且蛋白PABP随着尾长度增加更好地结合，从而提高翻译效率。

2)末端的形状

由于线性化的DNA模板在体外转录时使用，因此产生的mRNA的聚(A)尾部的末端可以用残基A终止，或者可以包括限制性酶识别位点，这取决于用于模板质粒DNA线性化的限制性酶。

为了比较取决于聚(A)尾末端的形状的翻译程度，基于用NheI或SapI限制性酶线性化的模板合成非完整或完整末端mRNA，并以与实施例3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，如图4所示，证实具有末端仅以A终止的尾的mRNA的表达效率更高。这被认为是因为与完整的聚(A)尾不同，包括部分限制性酶识别位点的非完整尾不能恰当地阻断3’->5’核酸外切酶。

3)混合非腺嘌呤NT(非A残基)

为了比较非A-残基混合尾的翻译效率，参考报道TENT4A或4B包含在A-尾中的非A残基干扰去烯基酶作用的出版物，构建具有原始A₁₂₀-尾、A₁₂₀-G-混合尾、A₁₂₀-C-混合尾和A₁₂₀-U-混合尾的模板DNA。使用每个模板合成体外转录物mRNA，并以与实施例3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，证实U-混合尾mRNA的表达效率最好。在G-和C-混合尾和原始尾的情况下，在实时荧光检测结果中一致观察到原始尾的表达效率最差，但在Western印迹结果中不一致地获得该结果。然而，在所有实验中，A₁₂₀-U-混合尾的表达效率最高，并且当非A残基存在于聚(A)尾中时，去烯基酶作用被抑制，基于此，确定U非常有效地抑制酶作用。

实施例6:体外转录mRNA 5’端帽的优化

5’帽是位于mRNA 5’起始位点的组分。与聚(A)尾一样，已知5’帽在防止mRNA降解中起作用。5’帽也会影响翻译。在翻译启动期间，5’帽与elF4E(真核生物翻译启动因子4E)结合，从而将40S核糖体亚单位连接到mRNA。

为了确定用于将目标基因递送至动物细胞及其表达的体外转录物mRNA平台的最佳5’帽，合成分别具有无帽、Cap-0、Cap-1和ARCA的体外转录物mRNA，并以与实施例3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，如图6所示，证实ACRA和Cap-1的表达效率最大。然而，在通过降低GTP比率和增加帽类似物比率同时进行体外转录和封帽的方法中，如ARCA，可以合成未封帽的RNA。由于这能够诱导先天免疫，Cap-1(使用酶的转录后封帽系统)被确定为更适合于体外转录mRNA平台。

实施例6:用修饰的核苷酸替代优化体外转录物mRNA

众所周知，使用修饰的核苷酸能够避开宿主的固有免疫传感器并增加翻译活性。

为了确定适用于体外转录物mRNA平台的修饰的核苷酸，以将目标基因传递给动物细胞并进行表达，体外转录物mRNA包括修饰CTP(5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(TriLink BioTechnologies))、修饰的UTP(伪尿苷-5'-三磷酸酯(TriLink Bio-Technologies(TriLinkBio Technologies))，并且合成N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸酯(TriLink BioTechnologies)，并以与实施例3相同的方式比较293T细胞中目标蛋白的表达水平。

因此，如图7所示，证实其中mRNA的U被仅使用修饰的UTP修饰的U 100％取代的mRNA显示出最高的蛋白质表达效率。此外，由于将其与实施例4的混合尾中具有优异蛋白质表达效率的U-混合尾一起使用被判断为表现出协同效应，因此比较了使用修饰的UTP的混合尾的结果，并且发现如预期的那样，使用修饰的U的U-混尾中的蛋白表达最高。认为修饰的UTP在稳定mRNA结构中起重要作用。

【工业适用性】

根据本发明，当将包括根据本发明的目标基因的体外转录物mRNA引入动物细胞中时，大量的目标蛋白可在动物细胞中表达，因此本发明的体外转录体mRNA可用于治疗自身免疫性疾病、传染病、癌症或肿瘤相关疾病以及炎症疾病等的基因疫苗中。

尽管上面已经详细公开了本发明的具体实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅是优选的示例性实施例，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。本领域普通技术人员可以容易地使用本发明的简单修改或改变，并且所有这些修改或改变可以被认为包括在本发明的范围内。

【自由文本的序列表列表】

随附电子文件。

<110> ABION株式会社

首尔大学校产学协力团

<120> 体外转录物MRNA和包含其的药物组合物

<130> PP-B2580

<160> 5

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 番茄荧光蛋白基因（Tomato fluorecent proein gene）

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggtcatcaaa gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60

ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180

atcctgtccc cccagttcat gtacggctcc aaggcgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240

cccgattaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

gaggacggcg gtctggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cacgctgatc 360

tacaaggtga agatgcgcgg caccaacttc ccccccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480

gagatccacc aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagacc 540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcaactg cccggctact actacgtgga caccaagctg 600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg ctccgagggc 660

cgccaccacc tgttcctggg gcatggcacc ggcagcaccg gcagcggcag ctccggcacc 720

gcctcctccg aggacaacaa catggccgtc atcaaagagt tcatgcgctt caaggtgcgc 780

atggagggct ccatgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 840

tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 900

tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac ggctccaagg cgtacgtgaa gcaccccgcc 960

gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 1020

aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcacg 1080

ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 1140

aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 1200

aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 1260

aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta cgtggacacc 1320

aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc 1380

gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc atggacgagc tgtacaagta a 1431

<210> 2

<211> 1610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 体外转录模板pDNA（in vitro transcription template pDNA）

<400> 2

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 60

gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 120

tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 180

ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 240

ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 300

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 360

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 420

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 480

ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat taattcgagc 540

tcggtaccca gcttgcttgt tctttttgca gaagctcaga ataaacgctc aactttggca 600

gatcaattcc ccatcatcga tgaattcgcc accatgaaat tcagctgggt catgttcttc 660

ctgatggcag tggttacagg ggtcaattca gagaagatca agctgaatgc caagatgaat 720

atcctgatcc gggacaagag attccactac gataggaaca acatcgccgt gggcgccgac 780

gagagcgtgg tgaaggaggc ccacagagaa gtgattaact cttctaccga gggactgctg 840

ctgaacattg acaaggacat ccggaagatc ctgagcggct atatcgtgga gatcgaggat 900

accgagggcc tgaaagaagt gatcaatgac agatacgaca tgctgaacat cagcagcctg 960

cggcaggatg gcaagacctt tatcgacttc aaaaaataca atgataagct gccactgtac 1020

atcagcaacc ccaactataa ggtgaacgtg tacgccgtga caaaggagaa taccatcatc 1080

aatccttccg agaacggcga taccagcacc aatggcatta agaagattct gattttcagc 1140

aaaaagggat acgaaatcgg ctgaaagctt gatctggtta ccactaaacc agcctcaaga 1200

acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta cactttacaa aatgttgtcc 1260

cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga aagtttcttc acattctaaa 1320

aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa 1380

aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaataaa aaaaaaacga 1440

agagctagct taagtattct atagtgtcgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 1500

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 1560

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1610

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> primer

<400> 3

atgaattcgc caccatggtg agcaagggcg agga 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> primer

<400> 4

ataagctttt acttgtacag ctcgtcca 28

<210> 5

<211> 1815

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 番茄荧光蛋白基因的体外转录（in vitro transcripti of Tomatofluorecent protein gene）

<400> 5

gggcgaauua auucgagcuc gguacccagc uugcuuguuc uuuuugcaga agcucagaau 60

aaacgcucaa cuuuggcaga ucaauucccc aucaucgaug aauucgccac cauggugagc 120

aagggcgagg aggucaucaa agaguucaug cgcuucaagg ugcgcaugga gggcuccaug 180

aacggccacg aguucgagau cgagggcgag ggcgagggcc gccccuacga gggcacccag 240

accgccaagc ugaaggugac caagggcggc ccccugcccu ucgccuggga cauccugucc 300

ccccaguuca uguacggcuc caaggcguac gugaagcacc ccgccgacau ccccgauuac 360

aagaagcugu ccuuccccga gggcuucaag ugggagcgcg ugaugaacuu cgaggacggc 420

ggucugguga ccgugaccca ggacuccucc cugcaggacg gcacgcugau cuacaaggug 480

aagaugcgcg gcaccaacuu cccccccgac ggccccguaa ugcagaagaa gaccaugggc 540

ugggaggccu ccaccgagcg ccuguacccc cgcgacggcg ugcugaaggg cgagauccac 600

caggcccuga agcugaagga cggcggccac uaccuggugg aguucaagac caucuacaug 660

gccaagaagc ccgugcaacu gcccggcuac uacuacgugg acaccaagcu ggacaucacc 720

ucccacaacg aggacuacac caucguggaa caguacgagc gcuccgaggg ccgccaccac 780

cuguuccugg ggcauggcac cggcagcacc ggcagcggca gcuccggcac cgccuccucc 840

gaggacaaca acauggccgu caucaaagag uucaugcgcu ucaaggugcg cauggagggc 900

uccaugaacg gccacgaguu cgagaucgag ggcgagggcg agggccgccc cuacgagggc 960

acccagaccg ccaagcugaa ggugaccaag ggcggccccc ugcccuucgc cugggacauc 1020

cugucccccc aguucaugua cggcuccaag gcguacguga agcaccccgc cgacaucccc 1080

gauuacaaga agcuguccuu ccccgagggc uucaaguggg agcgcgugau gaacuucgag 1140

gacggcgguc uggugaccgu gacccaggac uccucccugc aggacggcac gcugaucuac 1200

aaggugaaga ugcgcggcac caacuucccc cccgacggcc ccguaaugca gaagaagacc 1260

augggcuggg aggccuccac cgagcgccug uacccccgcg acggcgugcu gaagggcgag 1320

auccaccagg cccugaagcu gaaggacggc ggccacuacc ugguggaguu caagaccauc 1380

uacauggcca agaagcccgu gcaacugccc ggcuacuacu acguggacac caagcuggac 1440

aucaccuccc acaacgagga cuacaccauc guggaacagu acgagcgcuc cgagggccgc 1500

caccaccugu uccuguacgg cauggacgag cuguacaagu aaaagcuuga ucugguuacc 1560

acuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag cuacauaaua ccaacuuaca 1620

cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau cugcuccuaa uaaaaagaaa 1680

guuucuucac auucuaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa 1740

aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa aaaauaaaaa 1800

aaaauaaaaa aaaaa 1815

Claims

1.体外转录物mRNA，包含：

(a)编码目标肽或目标蛋白的RNA序列插入部分；

(b)与编码所述目标肽或所述目标蛋白的RNA序列两端连接的5’-UTR和3’-UTR；

(c)连接到5’-UTR的5’帽；和

(d)含有20至400个与3’-UTR连接的腺嘌呤的聚(A)尾。

2.根据权利要求1所述的体外转录物mRNA，其中所述聚(A)尾包含30至200个腺嘌呤。

3.根据权利要求1所述的体外转录物mRNA，其中所述聚(A)尾被配置为使得至少一种选自尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的非腺嘌呤核苷酸插入多个腺嘌呤之间。

4.根据权利要求3所述的体外转录物mRNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸插入2至20个腺嘌呤之间。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的体外转录物mRNA，其中所述聚(A)尾的末端是腺嘌呤。

6.根据权利要求1所述的体外转录物mRNA，其中所述5’帽为Cap-1或ARCA(反-反向帽模拟)。

7.根据权利要求1所述的体外转录物mRNA，其中所述体外转录物mRNA序列中的全部或部分尿嘧啶(U)被修饰的U取代。

8.根据权利要求7所述的体外转录物mRNA，其中所述修饰的UTP是伪UTP或N1-甲基伪UTP。

9.根据权利要求3所述的体外转录物mRNA，其中所述聚(A)尾被配置为使得所述修饰的U插入多个腺嘌呤之间。

10.根据权利要求9所述的体外转录物mRNA，其中所述修饰的UTP是伪UTP或N1-甲基伪UTP。

11.根据权利要求1所述的体外转录物mRNA，其中所述目标肽或所述目标蛋白是治疗活性蛋白或肽、佐剂蛋白、抗原、肿瘤抗原、致病性抗原、动物抗原、病毒抗原、原生动物抗原、细菌抗原、过敏性抗原、自身免疫抗原、过敏原、抗体、免疫刺激蛋白或肽、或抗原特异性T细胞受体。

12.一种用于体外转录物mRNA制备的模板DNA，包含：

(a)具有对应于权利要求1至11中任一项所述的RNA体外转录物mRNA的DNA序列的部分；和

(b)RNA聚合酶结合的启动子，用于对应于所述体外转录物mRNA的DNA序列的转录。

13.根据权利要求12所述的模板DNA，其中所述启动子选自T7启动子、T3启动子和SP6启动子。

14.根据权利要求12所述的模板DNA，包含与包含在具有对应于体外转录物mRNA的DNA序列的部分中的聚(A)尾连接的限制性酶识别位点。

15.用于疫苗的药物组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的体外转录物mRNA。